一种蜡样芽孢杆菌MA23、菌剂及制备方法和应用
阅读：1048发布：2020-05-30
专利汇可以提供一种蜡样芽孢杆菌MA23、菌剂及制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种蜡样芽孢杆菌菌株MA23(Bacillus cereusMA23)，保藏于中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16015，还公开了利用MA23菌株制备的菌剂、制备方法和应用，本发明蜡样芽孢杆菌MA23可用于防治农业 植物 病害，具有高效、广谱的杀菌活性。，下面是一种蜡样芽孢杆菌MA23、菌剂及制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种蜡样芽孢杆菌菌株MA23(Bacillus cereusMA23)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16015。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，活性成分为权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌MA23菌体及其胞外代谢产物。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述的菌剂为液态菌剂。
4.一种权利要求2或3所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
步骤1、菌种活化：
将低温保存的蜡样芽孢杆菌MA23接种到营养琼脂平板培养基上进行活化培养，然后挑取单菌落，接种到营养琼脂斜面培养基上进行扩增培养，最后用10mL无菌水将菌体洗脱，所得洗脱液作为种子培养的接种液；
步骤2、种子液的制备：
向种子培养基中接种步骤1所得的接种液；
步骤3、发酵培养：
将步骤2得到的种子液接种到发酵培养基中；
步骤4、液体菌剂制备：
将步骤3得到的发酵液与添加剂混匀溶解后制成微生物菌剂。
5.根据权利要求4所述的微生物菌剂制备方法，其特征在于，所述步骤1中活化培养具体为28～32℃下培养20～24h；扩增培养具体为：28～32℃下培养20～24h；洗脱用无菌水为
10mL。
6.根据权利要求4所述的微生物菌剂制备方法，其特征在于，所述步骤2中种子培养基和接种液的体积比为1:0.5％～1:5％，在28～32℃且初始pH值为5.5～7.5的条件下震荡培养14～20h，得到种子液，种子培养基的组分及其质量百分比为：葡萄糖1.0％～2.0％，蛋白胨9.0％～10.0％，NaCl 4％～6％，酵母膏5.0％～6.0％，余量为水，以上各组分的重量百分比总和为100％。
7.根据权利要求4所述的微生物菌剂制备方法，其特征在于，所述步骤3中发酵培养基和种子液的体积比为1:1％～1:12％，在28～32℃且初始pH值在5.5～7.5条件下进行搅拌状态下的液体发酵，直至发酵液中芽孢产生率不低于90％且菌体浓度不低于1010CFU/mL；发酵培养基的组分及其质量百分比为：葡萄糖30％～40％，蛋白胨1.0％～2.0％，可溶性淀粉
8.0％～10.0％，NaNO3 0.4％～0.6％，CaCO3 1.4％～1.6％，MgSO4 1.0％～3.0％，K2HPO41.0％～3％，MnSO4 0.3％～0.4％，余量为水，以上各组分的重量百分比总和为
100％。
8.权利要求2所述的微生物菌剂的使用方法，其特征在于，所述步骤4中添加剂中各组分分别与发酵液的比例为：几丁质0.05％～0.8％，Vc-Na 0.05％～5％，羧甲基纤维素钠
0.1％～3.0％，CaCl2 0.15％～5.0％。
9.权利要求2所述的微生物菌剂的使用方法，其特征在于，将微生物菌剂按1:10～1:
100的体积比例用水稀释，将稀释后的液体菌剂对植物进行全株喷雾或注干防治。
10.权利要求2所述的微生物菌剂在农业植物病害上的应用。
一种蜡样芽孢杆菌MA23、菌剂及制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于农业微生物技术领域，涉及一种蜡样芽孢杆菌MA23，本发明还涉及上述一种蜡样芽孢杆菌MA23的菌剂，本发明还涉及上述一种蜡样芽孢杆菌MA23的菌剂制备方法，本发明还涉及上述一种蜡样芽孢杆菌MA23的菌剂应用。
背景技术
[0002] 植物病害是指植物在其生命过程中受寄生物侵害或不良环境影响，在生理、细胞和组织结构上发生一系列病理变化的过程，致使外部形态不正常，进而引起产量降低、品质变劣或生态环境遭到破坏的现象。目前在农业生产中侵染性植物病害主要包括：细菌性病害、真菌性病害、病毒病及线虫病害。在所有侵染性病害中，细菌性病害是一类较难防治的病害，约有10％的植物病害属于细菌性病害；而真菌性病害数量最为繁多，约占所有病害数量的70％以上。
[0003] 植物病害是当前危害农业生产最主要的影响因素之一。其种类繁多，发生和危害情况复杂。根据1984年对全国43个城市的调查，仅农业植物真菌病害就有5500多种，而且就其调查范围和农业种类来看，这也只是农业植物病害中的一部分。植物病害发生严重时，不仅造成农作物严重减产、农产品品质下降，严重影响国民经济和人民生活。同时，带有危险性病害的农产品无法出口，直接影响外贸创汇。其中，少数带病的农产品，人畜食后会造成中毒，而有些顽固性病害，难以根除。
[0004] 我国对植物病害防治的总方针是：“预防为主、综合防治”。防治方法主要包括：农业防治、物理防治、化学防治和生物防治。化学防治主要利用各种化学物质及其加工产品控制有害生物，因其具有防效高、见效快等特点被广泛应用。但长期使用化学农药，易污染环境、使土质退化、病原菌产生抗药性、防效降低等问题。此外，化学农药极易造成人畜中毒。因此，减少化学农药、化肥、化学添加剂的使用量，创建良好的生态环境已成为当前全社会的广泛共识。与传统的化学防治相较，生物防治具有特异性强、防止持久、无残留、安全、不污染环境、易于同其他植物保护措施协调配合并节约能源等特点，可满足保护环境、保护生物多样性、提升农产品品质及农业可持续发展的要求。
[0005] 蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是一种能产生抗逆性芽孢的革兰氏阳性菌。芽孢杆菌可以产生内生芽孢，具有抗逆能力强、繁殖速度快、营养要求简单、易定植等特点，是当前全球应用较为广泛的生防细菌之一。美国已经有4株芽孢杆菌生防菌株获得美国环境保护署 (United States Environmental Protection Agency，EPA)商品化或有限商品化生产应用许可。大量研究表明：蜡样芽孢杆菌对生态条件具有较强的适应性，是土壤中的优势菌，对植物根际有促生和防病等功效。此外，很多蜡样芽孢杆菌是一些谷类作物、蔬菜及树木的内生菌，可在植物体内定植，促进植物生长，减少病虫害，且不会对寄主植物产生任何危害。因此，筛选对于病原菌具有抑制作用的蜡样芽孢杆菌是防治有关植物病害的最有效方法之一。
发明内容
[0006] 本发明的第一目的是提供一种蜡样芽孢杆菌MA23，具有高效、广谱杀菌活性的特点。
[0007] 本发明的第二目的还在于提供基于蜡样芽孢杆菌菌株MA23的微生物菌剂。
[0008] 本发明的第三目的还在于提供基于蜡样芽孢杆菌菌株MA23的微生物菌剂的制备方法。
[0009] 本发明的第四目的还在于提供基于蜡样芽孢杆菌菌株MA23的微生物菌剂的使用方法。
[0010] 本发明的第五目的还在于提供基于蜡样芽孢杆菌菌株MA23的微生物菌剂在防治植物病害上的应用。
[0011] 本发明所采用的技术方案是，一种蜡样芽孢杆菌菌株MA23(Bacillus cereusMA23)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16015。
[0012] 本发明所采用的另一技术方案是，一种微生物菌剂，活性成分为蜡样芽孢杆菌MA23 菌体及其胞外代谢产物，菌剂为液态菌剂。
[0013] 本发明所采用的第三个技术方案是，一种微生物菌剂的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
[0014] 步骤1、菌种活化：
[0015] 将低温保存的蜡样芽孢杆菌MA23接种到营养琼脂平板培养基上进行活化培养，然后挑取单菌落，接种到营养琼脂斜面培养基上进行扩增培养，最后用1无菌水将菌体洗脱，所得洗脱液作为种子培养的接种液；
[0016] 步骤2、种子液的制备：
[0017] 向种子培养基中接种步骤1所得的接种液；
[0019] 将步骤2得到的种子液接种到发酵培养基中；
[0020] 步骤4、液体菌剂制备：
[0021] 将步骤3得到的发酵液与添加剂混匀溶解后制成微生物菌剂。
[0022] 本发明所采用的第三个技术方案的特点还在于，
[0023] 步骤1中活化培养具体为28℃～32℃下培养20～24h；扩增培养具体为：于28℃～ 32℃下培养20～24h；无菌水为10mL。
[0024] 步骤2中种子培养基和接种液的体积比为1:0.5％～1:5％，在28～32℃且初始pH值为 5.5～7.5的条件下震荡培养14～20h，得到种子液，种子培养基的组分及其质量百分比为：葡萄糖1.0％～2.0％，蛋白胨9.0％～10.0％，NaCl 4％～6％，酵母膏5.0％～6.0％，余量为水，以上各组分的重量百分比总和为100％。
[0025] 步骤3中发酵培养基和种子液的体积比为1:1％～1:12％，在28～32℃且初始pH值在 5.5～7.5条件下进行搅拌状态下的液体发酵，直至发酵液中芽孢产生率不低于90％且10
菌体浓度不低于10 CFU/mL；发酵培养基的组分及其质量百分比为：葡萄糖30％～40％，蛋白胨 1.0％～2.0％，可溶性淀粉8.0％～10.0％，NaNO3 0.4％～0.6％，CaCO3 1.4％～
1.6％，MgSO4 1.0％～3.0％，K2HPO4 1.0％～3％，MnSO4 0.3％～0.4％，余量为水，以上各组分的重量百分比总和为100％。
菌体浓度不低于10 CFU/mL；发酵培养基的组分及其质量百分比为：葡萄糖30％～40％，蛋白胨 1.0％～2.0％，可溶性淀粉8.0％～10.0％，NaNO3 0.4％～0.6％，CaCO3 1.4％～
1.6％，MgSO4 1.0％～3.0％，K2HPO4 1.0％～3％，MnSO4 0.3％～0.4％，余量为水，以上各组分的重量百分比总和为100％。
[0027] 本发明所采用的第四个技术方案是，微生物菌剂的使用方法，其将微生物菌剂按1:10～ 1:100的体积比例用水稀释，将稀释后的液体菌剂于农业植物进行全株喷雾或注干防治。
[0028] 本发明所采用的第五个技术方案是，微生物菌剂在农业植物病害上的应用。
[0029] 本发明的有益效果是：本发明蜡样芽孢杆菌MA23和微生物菌剂能用于广谱高效防治多种病原菌引起的农业植物病害，为农业植物病害提供了一种生物防治的新途径。其有益效果在于：1、对果树细菌性病害(如溃疡病)的平均抑菌率达到了78％以上，对果树常见真菌性病害(如：灰霉病、黑斑病、干腐病、枯萎病等)的抑菌率达到了67.98％～93.98％；2、抑菌谱广，对于多种植物(包括单子叶植物和双子叶植物)的常见真菌病害都有较好的抑制作用；3、无污染，无毒害，无残留，对环境友好，对于减少农产品损失和提高产品质量具有显著效果，可显著提高经济效益；4、本发明制备方法简单、成本低廉、易于推广应用。附图说明
[0030] 图1是根据本发明一种蜡样芽孢杆菌MA23的16S rDNA序列构建的系统发育树；
[0031] 图2是本发明一种蜡样芽孢杆菌MA23发酵液对猕猴桃溃疡病病原菌的牛津杯抑菌圈效果图；
[0032] 图3是本发明一种蜡样芽孢杆菌MA23菌剂对猕猴桃溃疡病的温室防治效果图；
[0033] 图4是本发明一种蜡样芽孢杆菌MA23菌剂对猕猴桃溃疡病的田间防治效果图；
[0034] 图5是本发明一种蜡样芽孢杆菌MA23对病原真菌的平板对峙效果图。其中，A：甘薯干腐对照；B：梨黑斑对照；C：苹果黑斑对照；D：番茄灰霉病对照；E：郁金香腐烂病对照；F：棉花枯萎病对照；a：甘薯干腐病对峙实验；b：梨黑斑对峙实验；c：苹果黑斑病对峙实验；d：番茄灰霉病对峙实验；e：郁金香腐烂病对峙实验；f：棉花枯萎病对峙实验。
具体实施方式
[0035] 下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
[0036] 本发明一种蜡样芽孢杆菌MA23，已于2018年6月29日提交中国微生物局菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.16015，生物学命名Bacillus cereus，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0037] 利用上述蜡样芽孢杆菌MA23生产的微生物菌剂，其活性成分为蜡样芽孢杆菌MA23 菌体及其胞外代谢产物。
[0038] 上述微生物菌剂可为液态菌剂。
[0039] 上述微生物菌剂的制备方法，具体步骤如下：
[0040] 步骤1、菌种活化：
[0041] 将低温保存的蜡样芽孢杆菌MA23接种到营养琼脂平板培养基上进行活化培养，于 28～32℃下培养20～24h；然后挑取单菌落，接种到营养琼脂斜面培养基上进行扩增培养，于28～32℃下培养20～24h；最后用10mL无菌水将菌体洗脱，所得洗脱液作为种子培养的接种液；
[0042] 步骤2、种子液的制备：
[0043] 向种子培养基中接种步骤1所得的接种液，所用种子培养基和接种液的体积比为 1:0.5％～1:5％，在28～32℃且初始pH值为5.5～7.5的条件下震荡培养14～20h，得到种子液；
[0044] 其中，所用种子培养基的组分及其质量百分比为：葡萄糖1.0％～2.0％，蛋白胨9.0％～ 10.0％，NaCl 4％～6％，酵母膏5.0％～6.0％，余量为水，以上各组分的重量百分比总和为 100％。
[0045] 步骤3、发酵培养：
[0046] 将步骤2得到的种子液接种到发酵培养基中，所用发酵培养基和种子液的体积比为1:1％～1:12％，在28～32℃且初始pH值在5.5～7.5条件下进行搅拌状态下的液体发酵，10
直至发酵液中芽孢产生率不低于90％且菌体浓度不低于10 CFU/mL；
直至发酵液中芽孢产生率不低于90％且菌体浓度不低于10 CFU/mL；
[0047] 其中，所用发酵培养基的组分及其质量百分比为：葡萄糖30％～40％，蛋白胨1.0％～ 2.0％，可溶性淀粉8.0％～10.0％，NaNO3 0.4％～0.6％，CaCO3 1.4％～1.6％，MgSO4 1.0％～ 3.0％，K2HPO4 1.0％～3％，MnSO4 0.3％～0.4％，余量为水，以上各组分的重量百分比总和为100％。
[0048] 步骤4、液体菌剂制备：
[0049] 将步骤3得到的发酵液与添加剂混匀溶解后制成微生物菌剂，所用添加剂中各组分与发酵液的比例为：几丁质0.05％～0.8％，Vc-Na 0.05％～5％，羧甲基纤维素钠0.1％～3.0％， CaCl2 0.15％～5％。
[0050] 上述制备方法中步骤1中所述的低温是指通常用于保存菌种所用的温度，本领域技术人员根据常识可知。
[0051] 上述制备方法中步骤1所述的营养琼脂平板培养基或营养琼脂斜面培养基的制备方法都是本领域技术人员熟知的，制备方法可参照国标GB/T 4789.28-2003进行制备。
[0052] 上述制备方法中步骤4所述的几丁质、Vc-Na、羧甲基纤维素钠以及CaCl2均为食品级。
[0053] 上述蜡样芽孢杆菌MA23在防治溃疡病、灰霉病、黑斑病、干腐病等植物病害上的应用。上述蜡样芽孢杆菌MA23对7种病原菌抑菌率达到了67.98％～93.98％，表现了较广的抑菌谱。
[0054] 本发明菌剂的使用方法：将上述所得的微生物菌剂按1:10～1:100的体积比例用水稀释，将稀释后的液体菌剂对植物进行全株喷雾或注干防治。
[0055] 本发明一种蜡样芽孢杆菌MA23的筛选分离过程：
[0056] 蜡样芽孢杆菌MA23由发明人从秦岭野生银杏树组织中分离得到。2008年发明人自太白山自然保护区内采集野生银杏组织样本，然后将所采样品以蒸馏水清洗干净后进行表面除菌，用经过灭菌处理的枝剪、解剖刀及打孔器将经过表面消毒的叶片、树皮打孔成约1cm2的小块，根、茎、枝则切成约0.5cm～1cm左右的小段，采用三步法对组织块表面消毒(如表1所示)。
[0057] 表1组织块消毒及处理时间对照表
[0058]
[0059]
[0060] 将经过表面消毒的组织块用无菌研钵研磨，并用4层无菌纱布过滤。滴加200μL滤汁与MEA培养基平板上，涂布均匀后于28℃培养3～15天，分别进行细菌、真菌和放线菌的分离纯化，并以常见的7种植物病原菌为靶标菌进行拮抗菌的筛选：甘薯干腐病(Fusarium oxysporum f.sp.batatas)、梨黑斑病(Alternaria alternata(Fries)Keiseler)、苹果黑斑病 (Alternaria alternata)、番茄灰霉病(Botrytis cinerea Pers.)、郁金香腐烂病(Trichoderma virens)、棉花枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.vesinfectum)和猕猴桃溃疡病(Pseudomonas syringae pv.Actinidiae，Psa)，从中筛选出一株对各供试病原菌均具有明显抑菌效果的菌株，定名为蜡样芽孢杆菌MA23。
[0061] 本发明一种蜡样芽孢杆菌MA23的特征：
[0062] (1)形态特征
[0063] 在营养琼脂培养基上，培养初期菌落为乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落稍隆起，表面湿润，直径1～2mm；培养后期菌落呈淡黄色，边缘不规则，表面干燥有褶皱；在液体培养基中静置培养，表面形成白色菌膜。菌体细胞为杆状，末端方形，呈短链或长链状，大小约1.1×3.5μm；产芽孢，芽孢为柱状，中生或近中生，孢囊无明显膨胀。
[0064] (2)16S rDNA序列测定
[0065] 用于扩增细菌16S rDNA的引物为：
[0066] Primer A:5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；
[0067] Primer H:5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′；
[0068] PCR扩增反应条件为：95℃2min；95℃1min；50℃2min，72℃2.5min，共35 次循环；72℃延伸5min。PCR扩增产物以1.5％的琼脂糖凝胶电泳检查，并以QIAEX II Gel Extraction System(Qiagen)回收纯化后进行序列测定，采用NCBI(National Coalition Building Institute)中FASTA程序对所测DNA序列与Bacillus cereus的16S rDNA进行同源性比较，并利用Clustal 2.0及MEGA 6.0软件进行系统发育分析，结果表明，蜡样芽孢杆菌MA23与 Bacillus cereus的16S rDNA核苷酸序列的同源性均在99％以上。
[0069] (3)生理生化特征
[0070] 参考《伯杰氏细菌系统手册(第九版英文)》(G.M.加里蒂等，斯普林格纽约公司， 2004年)所述方法对蜡样芽孢杆菌菌株MA23进行生理生化检测。结果如表2所示，蜡样芽孢杆菌菌株MA23的生理生化特征与文献所述蜡样芽孢杆菌生理生化特征基本一致。同时，如图1所示，16S rDNA序列同源比对及所构建的系统发育树进一步确认生理生化鉴定结果，鉴定该菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。
[0071] 表2蜡样芽孢杆菌菌株MA23生理生化鉴定结果
[0072]
[0073]
[0074] 注：+：阳性反应；－：阴性反应
[0075] 下面以具体实施例来进一步解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量。
[0076] 实施例1
[0077] MA23微生物菌剂的制备方法，具体步骤如下：
[0078] 步骤1、菌种活化：将低温保存的蜡样芽孢杆菌MA23接种在营养琼脂平板培养基上进行活化培养，在30℃下培养20h；然后挑取单菌落接种于营养琼脂斜面培养基上进行扩增培养，在30℃下培养20h；再用无菌水将菌体洗脱，获得的洗脱液作为种子培养的接种液。
[0079] 本实施例蜡样芽孢杆菌菌株MA23保存在-80℃的环境中。
[0080] 营养琼脂平板培养基及营养琼脂斜面培养基的pH值为7.0～7.4，且组分及其质量百分比均为：蛋白胨1.0％，牛肉膏0.5％，NaCl0.5％，琼脂2.0％，余量为水，制备方法可参照国标GB/T 4789.28-2003进行制备。
[0081] 步骤2、种子液的制备：在500mL三角瓶中装入种子培养基200mL，高压湿热灭菌，待冷却至室温后，加入步骤1中制备得到的接种液1mL，此时，所用种子培养基和接种液的体积比为1:0.5％；在摇床上进行震荡培养，转速250rpm，并在28℃且初始pH值为7.0 的条件下培养12h，得种子液。
[0082] 其中，所用种子培养基的组分及其质量百分比为：葡萄糖1.0％，蛋白胨10.0％，NaCl 5.0％，酵母膏5.0％，余量为水。种子培养基的制备方法为：按照上述质量百分比称取葡萄糖、蛋白胨、NaCl和酵母膏混合后，再加水即得。
[0083] 步骤3、发酵培养：在20L发酵罐中加入14L发酵培养基，将700mL步骤2得到的种子液接入发酵培养基中，此时，所用发酵培养基和种子液的体积比为1:5％，在28℃且初始pH值为7.0条件下进行搅拌状态下的液体发酵，搅拌转速为200rpm，罐压0.015～0.04 Mpa，通气条件分别为：0～5h，6.3m3/h；6～12h，10.5m3/h；12h后，25m3/h进行培养。 24h以后，每隔4h从发酵罐中取样镜检，对视野内的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢产生率；直至发酵液中芽孢产生率不低于90％且菌体浓度不低于1010CFU/mL。通常，发酵时间为48～96h。
[0084] 所用发酵培养基的组分及其质量百分比为：葡萄糖32.0％，蛋白胨1.4％，可溶性淀粉 9.0％，NaNO3 0.5％，CaCO3 1.5％，MgSO4 2.0％，K2HPO4 2.0％，MnSO4 0.35％，余量为水。发酵培养基的制备方法为：按照上述质量百分比称取葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉、NaNO3、 CaCO3、MgSO4、K2HPO4、和MnSO4，混合后，再加水即可。
[0085] 步骤4、液体菌剂制备：将步骤3得到的100mL发酵液与添加剂混匀溶解后制成微生物菌剂。其中，所用添加剂为：几丁质0.8％，Vc-Na 5％，羧甲基纤维素钠1.0％，CaCl2 0.5％。几丁质、Vc-Na、羧甲基纤维素钠以及CaCl2均为食品级。
[0086] 实施例2
[0087] 微生物菌剂的制备方法，具体步骤如下：
[0088] 步骤1、菌种活化：
[0089] 将低温保存的蜡样芽孢杆菌菌株MA23接种在营养琼脂平板培养基上进行活化培养，在30℃下培养24h；然后挑取单菌落接种于营养琼脂斜面培养基上进行扩增培养，在30℃下培养20h；再用无菌水将菌体洗脱，获得的洗脱液作为种子培养的接种液。
[0090] 本实施例蜡样芽孢杆菌菌株MA23保存在-80℃的环境中。
[0091] 营养琼脂平板培养基及营养琼脂斜面培养基的pH值为7.0～7.4，且组分及其质量百分比均为：蛋白胨1.0％，牛肉膏0.5％，NaCl 0.5％，琼脂2.0％，余量为水，制备方法可参照国标GB/T 4789.28-2003进行制备。
[0092] 步骤2、种子液的制备：
[0093] 在250mL三角瓶中分别装入种子培养基100mL，高压湿热灭菌，待冷却至室温后，分别加入步骤1中制备得到的接种液1mL，此时，所用种子培养基和接种液的体积比为1:1％；在摇床上进行震荡培养，转速250rpm，并在30℃且初始pH值为7.5的条件下培养16h，得种子液。
[0094] 其中，所用种子培养基的组分及其质量百分比为：葡萄糖1.0％，蛋白胨10.0％，NaCl 5.0％，酵母膏5.0％，余量为水。种子培养基的制备方法为：按照上述质量百分比称取葡萄糖、蛋白胨、NaCl、酵母膏，加水混合即得。
[0095] 步骤3、发酵培养：
[0096] 在10L发酵罐中加入7L发酵培养基，将350mL步骤2得到的种子液接入发酵培养基中，此时，所用发酵培养基和种子液的体积比为1:5％，在30℃且初始pH值7.5条件下进行搅拌状态下的液体发酵，搅拌转速为180rpm，罐压0.02～0.06Mpa，通气条件分别为： 0～5h，6.8m3/h；6～12h，10.5m3/h；12h后，20m3/h进行培养。24h以后，每隔4h从发酵罐中取样镜检，对视野内的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢产生率；直至发酵液中芽孢产生率不小于90％且菌体浓度不低于1010CFU/mL。通常，发酵时间为48～96h。
[0097] 所用发酵培养基的组分及其质量百分比为：葡萄糖32.0％，蛋白胨1.4％，可溶性淀粉 9.0％，NaNO3 0.5％，CaCO3 1.5％，MgSO4 2.0％，K2HPO4 2.0％，MnSO4 0.35％，余量为水。发酵培养基的制备方法为：按照上述质量百分比称取葡萄糖、蛋白胨、可溶性淀粉、NaNO3、 CaCO3、MgSO4、K2HPO4、和MnSO4，混合后，再加水即可。
[0098] 步骤4、液体菌剂制备：
[0099] 将步骤3得到的100mL发酵液与添加剂混匀溶解后制成微生物菌剂。其中，所用添加剂为：几丁质0.4％，Vc-Na 3.0％，羧甲基纤维素钠0.5％，CaCl2 3.0％。几丁质、Vc-Na、羧甲基纤维素钠以及CaCl2均为食品级。
[0100] 本发明微生物菌剂的使用方法：将微生物菌剂按1:10～1:100的体积比例用水稀释，然后将稀释后的液体微生物菌剂进行喷雾。
[0101] 本发明微生物菌剂在防治猕猴桃溃疡病病害上的应用。
[0102] 实例3
[0103] 牛津杯抑菌圈实验
[0104] 以猕猴桃溃疡病病原菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae，Psa)作为指示菌进行牛津杯抑菌圈实验。上述病原菌由发明人从致病的猕猴桃枝干中分离、鉴定及保藏。
[0105] 步骤1、将培养2天的Psa斜面用10mL无菌水逐步稀释到10-3，制备成菌悬液备用。
[0106] 步骤2、将200mL固体Psa培养基溶解并冷却至55℃左右，加入1mL步骤1所得菌悬液并充分混匀，量取20mL该培养基，加入生测培养皿中，待其凝固。
[0107] 步骤3、将无菌牛津杯均匀放入步骤2所制培养基上，取200μL10倍稀释的MA23 发酵液至牛津杯中，并以无菌水作为对照。
[0108] 步骤4、步骤3所得培养物在28℃下培养36h，观察并测量抑菌圈大小。
[0109] 实验结果如表3所示：蜡样芽孢杆菌MA23的10倍稀释发酵液对猕猴桃溃疡病病原菌的抑菌圈平均直径为28.4mm，对照无抑菌圈(如图2所示)。说明蜡样芽孢杆菌MA23对猕猴桃溃疡病病原菌具有显著的抑制作用。
[0110] 表3MA23发酵液对猕猴桃溃疡病病原菌的牛津杯抑菌圈效果
[0111]
[0112] 实例4
[0113] 液体菌剂对猕猴桃溃疡病的温室防治实验
[0114] 以丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.Actinidiae，Psa)作为靶标菌进行猕猴桃溃疡病的温室防治实验。上述病原菌由发明人从致病的猕猴桃枝干中分离、鉴定及保藏。
[0115] 步骤1、选择5～6个叶片的猕猴桃幼苗进行温室培养，用浓度为106CFU/mL的病原菌 Psa菌液喷洒接种幼苗。
[0116] 步骤2、2天后用菌剂100倍稀释液对幼苗进行喷施防治，并设置清水对照组。
[0117] 步骤3、两周后统计病斑，计算清水对照组与活性物质喷施组的发病率。
[0118] 统计结果如表4所示：经本发明微生物菌剂喷施防治的猕猴桃幼苗溃疡病的发病率明显低于对照组。对照组猕猴桃幼苗叶面出现猕猴溃疡病病斑，有些叶面出现萎缩，整株长势较弱；而经本发明微生物菌剂处理后的猕猴桃幼苗叶面极少出现溃疡病病斑，没有出现叶面萎缩现象，整株长势良好(如图3所示)。说明蜡样芽孢杆菌MA23可以抑制猕猴桃溃疡病病原菌的侵染和生长，达到有效防治猕猴桃溃疡病的效果。
[0119] 表4蜡样芽孢杆菌MA23菌剂对猕猴桃溃疡病的温室防治效果
[0120]
[0121] 实例5
[0122] 蜡样芽孢杆菌MA23液体菌剂对猕猴桃溃疡病的田间防治实验
[0123] 本实验在西安市灞桥区南郑村进行，分别以全株喷雾和注干施药的方法进行防效验证，所选猕猴桃品种为徐香。
[0124] 1)喷雾防治试验
[0125] 用微生物菌剂100倍稀释液进行全株喷施，并设清水对照，每组处理20株，间隔7 天喷药一次，连续4次。分别于施药前和最后一次施药7天后调查各组发病情况，并计算防效。
[0126] 2)注干防治试验
[0127] 在距离树干基部10～30cm处向下倾斜45度角钻孔到植株木质部，将活性粗提物菌剂100倍稀释液装入输液袋(装量为500mL)挂置在高于钻孔0.5～1.0米处，将输液针头插入孔中进行输液。设清水对照，每组处理20株，分别于施药前和施药30天后调查各组发病情况，并计算防效。
[0128] 3)防效统计
[0129] 病情指数及防治效果计算公式如下：
[0130]
[0131]
[0132] 4)猕猴桃溃疡病分级标准如表5所示：
[0133] 表5猕猴桃溃疡病分级
[0134]
[0135] 5)实验结果如表6所示：
[0136] 表6液体菌剂对猕猴桃溃疡病的田间防治实验结果
[0137]
[0138] 结果显示：全株喷雾防治实验中，菌剂100倍稀释液的防治效率为71.2％，注干法防治实验中，菌剂100倍稀释液的防治效率为81.6％(如图4所示)，从上述实验结果可以看出本发明微生物菌剂对猕猴桃溃疡病具有显著的防治效果，其中注干法防治效果优于全株喷雾防治方法。
[0139] 实施例8
[0140] 真菌平板对峙实验
[0141] 采用平板对峙法检测本发明微生物菌剂对6种不同农作物病原真菌的抑制作用，包括：甘薯干腐病(Fusarium oxysporum f.sp.batatas)、梨黑斑病(Alternaria alternata(Fries)Keiseler)、苹果黑斑病(Alternaria alternata)、番茄灰霉病(Botrytis cinerea Pers.)、郁金香腐烂病 (Trichoderma virens)、棉花枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.vesinfectum)。具体步骤如下：
[0142] 步骤1、用直径5mm打孔器切取平板培养1天的同质等量的MA23菌块及各供试病原菌菌丝接种于PDA平板中。将供试病原菌丝块接种于平板正中心，将3块MA23菌块等距接种于病原菌丝块圆周上，并设置不接种MA23菌块的平板对照，各供试病原菌分别重复5次。
[0143] 步骤2、接种4天后测量MA23及供试病原两接种点连线上病原菌的菌落半径，计算供试菌株对病原菌的生长抑制率。
[0144] 步骤3、测定结果(见表7、图5)显示，MA23对上述6种植物病原真菌均具有显著的抑制作用，说明本发明蜡样芽孢杆菌MA23具有广谱的抗菌活性。
[0145] 表7微生物菌剂对6种不同农作物病原真菌的抑制作用
[0146]
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