一种马克斯克鲁维酵母菌冻干菌剂的制备方法及其用途
技术领域
[0001] 本
发明涉及一种马克斯克鲁维酵母菌冻干菌剂的制备方法及其用途，属于酵母菌制品的生产领域。
背景技术
[0002] 马克斯克鲁维酵母作为一种广泛存在于
发酵乳中的酵母，不仅可以发酵乳糖，更能对半乳糖进行利用，发酵过程中可以单独或与乳酸菌一起用于发酵乳品，赋予了产品独特的
风味及营养特性。目前，国内外对于马克斯克鲁维酵母菌的应用，主要集中在新型乳制品的研发和酯类、
羧酸、醇类、乙酸异戊酯等风味物质的制备方面。新疆天润
生物科技股份有限公司
申请的发明
专利<一种优质酵母菌及其奶啤饮料的制备>(专利号ZL201010256427.X)公布了采用马克斯克鲁维酵母(保藏登记号CGMCCNO.3781)生产奶啤的技术。
[0003] 在欧洲，
食品安全局已将马克斯克鲁维酵母列入食品和
饲料添加的安全生物制剂范围，表明了马克斯克鲁维酵母的安全性和重要价值。在国内，研究者已经认识到马克斯克鲁维酵母的商业化价值，但严重缺乏相关马克斯克鲁维酵母冻干菌粉的研究，极度不利于马克斯克鲁维酵母高活性菌剂的工业化应用。新疆天润生物科技股份有限公司申请的发明专利<一种优质酵母菌及其奶啤饮料的制备>(专利号ZL201010256427.X)，采用马克斯克鲁维酵母生产奶啤时，需要不断扩培酵母菌种用于生产，存在菌种制备环节多，操作复杂，菌种易污染的问题，由于菌种制备的
水平不同，也容易造成菌种
质量的
波动，由此造成奶啤产品品质的波动，不利于大规模奶啤生产的品质控制。
[0004]
真空冷冻干燥技术是将湿物料或溶液在较低的
温度下冻结成固态，然后在真空条件下使其中的水分不经液态直接
升华成气态，最终使物料脱水的干燥技术。酵母菌可通过这种干燥技术保持较高的生理特性及生物活性，并可直接投入食品发酵生产中。鉴于马克斯克鲁维酵母优良特性及其广泛使用，对马克斯克鲁维酵母进行冻干菌剂的研究是十分有价值的。酵母菌株的不同导致菌株对干燥的耐性产生差异。制备活性干酵母菌剂应该有高浓度的酵母菌体和最佳保护剂，冷冻干燥所得酵母菌菌剂才能够保持较高的活性。因此，为了确保酵母菌干粉的存活率和发酵性能，制备过程中需要注意提高菌
体细胞浓度，筛选最佳的冷冻干燥保护剂成分组合。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于，提供一种马克斯克鲁维酵母菌冻干菌剂的制备方法及其用途，所述方法中涉及的马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus var.marxianus)，已于2010年4月27日保藏于中国
微生物菌种管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏号：CGMCC NO.3781，菌株编号：A3，地址：中国北京市朝阳区白辰西路1号院3号，邮编100101；本发明是在专利号ZL201010256427.X的
基础上，对马克斯克鲁维酵母菌的进一步研究，所述的马克斯克鲁维酵母菌高
密度培养液中活菌数可达3.2×108cfu/mL以上，比YEPD培养基中培养结果至少高1.1个数量级；发酵菌液经离心后收集菌泥，加入
冷冻保护剂溶液，采用真空冷冻干燥技术制备冻干菌剂，其保护剂成分为麦芽糖和
脱脂奶粉，可使冷冻干燥活菌率达到75％以上。该菌剂制备工艺简单，制备所得冻干菌剂具有含菌量高、保存时间长，使用方便、无污染、对环境友好等特点，可用于奶啤、奶酪的发酵以及乳
清酒、果醋、果汁等的
酿造。在奶制品的发酵中，酒味醇香、产气性能好、发酵性能稳定。
[0006] 本发明所述的一种马克斯克鲁维酵母菌冻干菌剂的制备方法，该方法中涉及的马克斯克鲁维酵母菌Kluyveromyces marxianus var.marxianus，已于2010年4月27日保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏号：CGMCC NO.3781，菌株编号：A3，具体操作按下列步骤进行：
[0007] 高密度培养：
[0008] a、
种子液体的制备：将马克斯克鲁维酵母菌划线于YEPD培养基平板上，放置温度28-30℃
培养箱中培养1-2天，挑取饱满的菌种再次划线于YEPD培养基平板上，放置温度28-
30℃培养箱中培养1-2天后再将菌种接入YEPD液体培养基中，温度28-30℃，160-180r/min摇瓶培养过夜，得到种子液；
[0009] b、发酵培养基的配制：称取
蔗糖67.37g，酵母浸粉29.7g，玉米浆15.61g，
磷酸二氢
钾4.13g，
硫酸镁0.3g，溶于1L蒸馏水中，混合均匀后，温度121℃灭菌20min；
[0010] c、高密度发酵培养：将步骤a制得的种子液接入步骤b灭菌冷却后的发酵培养基中，接种量为3×106cfu/mL，培养的温度28-30℃，160-180r/min，摇瓶培养16h后终止发酵，得到高密度的马克斯克鲁维酵母菌发酵菌液；
[0011] 真空冷冻干燥法制备冻干菌剂：
[0012] d、离心浓缩：将步骤c制得的高密度马克斯克鲁维酵母菌发酵菌液在温度4℃，6000r/min的条件下离心15min，倒掉上清液，得到马克斯克鲁维酵母菌活性菌泥；
[0013] e、保护剂的制备：配制浓度为20-100g/L的麦芽糖，温度121℃灭菌20min；配制30-120g/L浓度的脱脂奶粉，温度115℃，灭菌15min，再将配制的两种保护剂冷却后按体积比1:
1进行混合，得到复合保护剂；
[0014] f、真空冷冻干燥：将步骤d制备的马克斯克鲁维酵母菌活性菌泥与步骤e得到的复合保护剂按体积比1:1充分混合，置于温度-80℃
冰箱中预冻3h后，在冷阱温度-40℃，真空度10帕下真空冷冻干燥24h，即得到马克斯克鲁维酵母的冻干菌剂。
[0015] 所述方法获得的马克斯克鲁维酵母的冻干菌剂在制备发酵
食品添加剂中的用途。
[0016] 本发明提供一种马克斯克鲁维酵母菌冻干菌剂的制备方法及其用途，所述方法中涉及的马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus var.marxianus)，已于2010年4月27日保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏号：CGMCC NO.3781，菌株编号：A3，地址：中国北京市朝阳区白辰西路1号院3号，邮编100101。
[0017] 本发明所述的一种马克斯克鲁维酵母菌冻干菌剂制备方法及其用途，该菌剂中种子液体培养是本领域技术人员的常用操作，其中用到的YEPD培养基平板和液体YEPD培养基也均为本领域技术人员在种子活化时的常用培养基，均采用标准配方配制。
[0018] 为了取得很好的种子活化效果，本发明对常规甘油温度-80℃保存的马克斯克鲁维酵母菌种进行两次平板活化，两次平板活化后再进行液体YEPD培养基中摇瓶培养过夜，从而得到所需种子液，因为经过了两次平板活化，所以能够确保甘油的完全去除，菌种完全恢复，有利于后期实验。
[0019] 本发明所述为一种马克斯克鲁维酵母菌的制备方法及其用途，其有益效果如下：本发明的重点是对高密度发酵培养基配方进行了研究改进，发酵时所用的马克斯克鲁维酵母菌高密度发酵培养基，其培养基配方的组分及其用量是通过大量实验方案设计和数据分析后优选而得的，采用此技术发酵活菌数可达3.2×108cfu/mL以上，比YEPD培养基中培养结果高1.1个数量级，对马克斯克鲁维酵母菌的生长繁殖非常有利。
[0020] 本发明所述方法获得的马克斯克鲁维酵母的冻干菌剂只包含麦芽糖和脱脂奶粉，具有成分简单，成本低，无毒害，冻干保护效果好等优点，能使冻干菌剂活菌率达到75％以上。
[0021] 本发明提供的马克斯克鲁维酵母菌的冻干菌剂具有存活率高、保存时间长，成本低，使用方便、无污染、对环境友好等特点。
[0022] 本发明提供的马克斯克鲁维酵母的冻干菌剂可用于奶啤、奶酪的发酵；
乳清酒、果醋、果汁的酿造；同时可利于风味物质乙酸乙酯的生产。
具体实施方式
[0024] 高密度培养：
[0025] a、种子液体的制备:将马克斯克鲁维酵母菌划线于YEPD培养基平板上，放置温度28℃培养箱中培养1天，挑取饱满的菌种再次划线于YEPD培养基平板上，放置温度28℃培养箱中培养1天后再将菌种接入YEPD液体培养基中，温度28℃，160r/min摇瓶培养过夜，得到种子液；
[0026] b、发酵培养基的配制：称取蔗糖67.37g，酵母浸粉29.7g，玉米浆15.61g，磷酸二氢钾4.13g，
硫酸镁0.3g，溶于1L蒸馏水中，混合均匀后，温度121℃灭菌20min；
[0027] c、高密度发酵培养：将步骤a制得的种子液接入步骤b灭菌冷却后的发酵培养基中，接种量为3×106cfu/mL，培养的温度28℃，160r/min，摇瓶培养16h后终止发酵，得到高密度的马克斯克鲁维酵母菌发酵菌液，培养液中活菌数可达3.22×108cfu/mL；
[0028] 真空冷冻干燥法制备冻干菌剂：
[0029] d、离心浓缩：将步骤c制得的高密度马克斯克鲁维酵母菌发酵菌液在温度4℃，6000r/min的条件下离心15min，倒掉上清液，得到马克斯克鲁维酵母菌活性菌泥，菌体离心收得率为83.5％；
[0030] e、保护剂的制备：配制浓度为20g/L的麦芽糖，温度121℃灭菌20min；配制浓度30g/L的脱脂奶粉，温度115℃，灭菌15min，再将配制的两种保护剂冷却后按体积比1:1进行混合，得到复合保护剂；
[0031] f、真空冷冻干燥：将步骤d制备的马克斯克鲁维酵母菌活性菌泥与步骤e得到的复合保护剂按体积比1:1充分混合，置于温度-80℃冰箱中预冻3h后，在冷阱温度-40℃，真空度10帕下真空冷冻干燥24h，即得到马克斯克鲁维酵母的冻干菌剂，菌体存活率为75.12％。
[0032] 实施例2
[0033] 高密度培养：
[0034] a、种子液体的制备:将马克斯克鲁维酵母菌划线于YEPD培养基平板上，放置温度30℃培养箱中培养2天，挑取饱满的菌种再次划线于YEPD培养基平板上，放置温度30℃培养箱中培养2天后再将菌种接入YEPD液体培养基中，温度30℃，180r/min摇瓶培养过夜，得到种子液；
[0035] b、发酵培养基的配制：称取蔗糖67.37g，酵母浸粉29.7g，玉米浆15.61g，磷酸二氢钾4.13g，硫酸镁0.3g，溶于1L蒸馏水中，混合均匀后，温度121℃灭菌20min；
[0036] c、高密度发酵培养：将步骤a制得的种子液接入步骤b灭菌冷却后的发酵培养基中，接种量为3×106cfu/mL，培养的温度30℃，180r/min，摇瓶培养16h后终止发酵，得到高8
密度的马克斯克鲁维酵母菌发酵菌液，培养液中活菌数可达3.32×10cfu/mL；
[0037] 真空冷冻干燥法制备冻干菌剂：
[0038] d、离心浓缩：将步骤c制得的高密度马克斯克鲁维酵母菌发酵菌液在温度4℃，6000r/min的条件下离心15min，倒掉上清液，得到马克斯克鲁维酵母菌活性菌泥，菌体离心收得率为83.5％；
[0039] e、保护剂的制备：配制浓度为50g/L的麦芽糖，温度121℃灭菌20min；配制浓度80g/L的脱脂奶粉，温度115℃，灭菌15min，再将配制的两种保护剂冷却后按体积比1:1进行混合，得到复合保护剂；
[0040] f、真空冷冻干燥：将步骤d制备的马克斯克鲁维酵母菌活性菌泥与步骤e得到的复合保护剂按体积比1:1充分混合，置于温度-80℃冰箱中预冻3h后，在冷阱温度-40℃，真空度10帕下真空冷冻干燥24h，即得到马克斯克鲁维酵母的冻干菌剂，菌体存活率为76.32％。
[0041] 实施例3
[0042] 高密度培养：
[0043] a、种子液体的制备:将马克斯克鲁维酵母菌划线于YEPD培养基平板上，放置温度29℃培养箱中培养2天，挑取饱满的菌种再次划线于YEPD培养基平板上，放置温度29℃培养箱中培养2天后再将菌种接入YEPD液体培养基中，温度29℃，170r/min摇瓶培养过夜，得到种子液；
[0044] b、发酵培养基的配制：称取蔗糖67.37g，酵母浸粉29.7g，玉米浆15.61g，磷酸二氢钾4.13g，硫酸镁0.3g，溶于1L蒸馏水中，混合均匀后，温度121℃灭菌20min；
[0045] c、高密度发酵培养：将步骤a制得的种子液接入步骤b灭菌冷却后的发酵培养基中，接种量为3×106cfu/mL，培养的温度29℃，170r/min，摇瓶培养16h后终止发酵，得到高密度的马克斯克鲁维酵母菌发酵菌液，培养液中活菌数可达3.28×108cfu/mL；
[0046] 真空冷冻干燥法制备冻干菌剂：
[0047] d、离心浓缩：将步骤c制得的高密度马克斯克鲁维酵母菌发酵菌液在温度4℃，6000r/min的条件下离心15min，倒掉上清液，得到马克斯克鲁维酵母菌活性菌泥，菌体离心收得率为83.5％；
[0048] e、保护剂的制备：配制浓度为100g/L的麦芽糖，温度121℃灭菌20min；配制浓度120g/L的脱脂奶粉，温度115℃，灭菌15min，再将配制的两种保护剂冷却后按体积比1:1进行混合，得到复合保护剂；
[0049] f、真空冷冻干燥：将步骤d制备的马克斯克鲁维酵母菌活性菌泥与步骤e得到的复合保护剂按体积比1:1充分混合，置于温度-80℃冰箱中预冻3h后，在冷阱温度-40℃，真空度10帕下真空冷冻干燥24h，即得到马克斯克鲁维酵母的冻干菌剂，菌体存活率为76.87％。
[0050] 实施例4(对照)
[0051] 对照组将离心后菌泥与灭菌蒸馏水混合均匀，灭菌蒸馏
水体积与复合保护剂溶液相同，置于温度-80℃冰箱中预冻3h后，在冷阱温度-40℃，真空度10帕下真空冷冻干燥24h，得到马克斯克鲁维酵母菌的冻干粉。
[0052] 实施例5
[0053] 将实施例1-3中所得马克斯克鲁维酵母的冻干菌剂与对照通过平板计数法检测活菌数，添加复合保护剂的马克斯克鲁维酵母菌活菌率可达75％以上，只添加蒸馏水的对照组活菌率为6.82％，结果表明添加冻干保护剂能够显著提高冻干后的菌剂活菌数。
[0054] 实施例6
[0055] 以奶啤生产为例：
[0056] 将常规方法制备的酸奶200kg、水700kg、菠萝汁50kg、果胶1.5kg、羟甲基
纤维素钠1.5kg、蔗糖酯1.3kg、单甘脂1.2kg、白糖10㎏、蜂蜜5㎏、果葡糖浆5㎏斤，乳酸1.2㎏混合，搅拌均匀，预热到60℃均质，巴氏灭菌，降温到20℃，形成发酵基液；
[0057] 将实施例1-3中任意一种所得马克斯克鲁维酵母的冻干菌剂称取10g，溶解到200g灭菌后降温至20℃的脱脂奶中，混合搅拌均匀，形成酵母菌液；
[0058] 将得到的酵母菌液全部倒入发酵基液中，温度在20℃，发酵20小时，灌装到玻璃瓶中密封，
温度控制在35℃，发酵4小时，经灭菌制得奶啤饮料。
[0059] 采用本发明所述方法获得的马克斯克鲁维酵母的冻干菌剂生产奶啤具有工艺简单，品质稳定，易于控制，便于扩大生产的优点。
