一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚糖酶的方法
专利汇可以提供一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚糖酶的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种利用蛋白酶缺失 微 生物 生产壳聚糖酶的方法，所述的蛋白酶缺失微生物是枯草芽孢杆菌WB800，包括以下步骤：S1：将所述枯草芽孢杆菌WB800接种于活化培养基平板，置于 培养箱 内倒置培养以活化菌株；S2：挑取步骤S1活化后的单菌落接种于 种子 培养基，置于摇床震荡培养至种子液的OD600达到0.6~1.0；S3：将步骤S2中的种子液接入 发酵 培养基中，置于摇床震荡培养；S4：将步骤S3发酵后的产物进行离心，收集上清液，获得壳聚糖酶的粗酶液。本发明采用的枯草芽孢杆菌WB800属于微生物发酵和酶工程技术领域长期使用的安全菌株，无毒无害；另外，发酵周期短，发酵液壳聚糖酶活 力 达到45U/mL，离心分离获得的粗酶液可直接应用于壳寡糖的生产。，下面是一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚糖酶的方法专利的具体信息内容。
1.一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚糖酶的方法，所述的蛋白酶缺失微生物是枯草芽孢杆菌WB800，保藏于江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心，CICIM编号为B0132，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1：菌种活化
将所述枯草芽孢杆菌WB800接种于活化培养基平板，置于培养箱内倒置培养以活化菌株；
S2：种子培养
挑取步骤S1活化后的单菌落接种于种子培养基，置于摇床震荡培养至种子液的OD600 达到0.6 1.0；
~
S3：发酵产酶
将步骤S2中的种子液接入发酵培养基中，置于摇床震荡培养；
S4：离心分离
将步骤S3发酵后的产物进行离心，收集上清液，获得壳聚糖酶的粗酶液。
2.根据权利要求1所述的一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚糖酶的方法，其特征在于：所述种子液按体积百分比1.5 3% 的接种量接入所述发酵培养基中。
~
3.根据权利要求1所述的一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚糖酶的方法，其特征在于，步骤S1中所述活化培养基的配方为：胰蛋白胨8 12g/L，酵母提取物3 7g/L，氯化钠7~ ~ ~
11g/L，琼脂粉15 20g/L，用氢氧化钠调节所述活化培养基的pH为7.2 7.6。
~ ~
4.根据权利要求1所述的一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚糖酶的方法，其特征在于，步骤S2中所述种子培养基的配方为：胰蛋白胨8 12g/L，酵母提取物3 7g/L，氯化钠7~ ~ ~
11g/L，用氢氧化钠调节所述种子培养基的pH，使其达到7.2 7.6。
~
5.根据权利要求1所述的一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚糖酶的方法，其特征在于，步骤S3中所述发酵培养基的配方为：壳寡糖20 30g/L，胰蛋白胨9 11g/L，酵母提取物4~ ~ ~
6g/L，氯化钠9 11g/L，用氢氧化钠调节所述发酵培养基的pH，使其达到7.2 7.6。
~ ~
6.根据权利要求5所述的一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚糖酶的方法，其特征在于：所述壳寡糖是聚合度为2 10的壳聚糖部分水解的产物。
~
7.根据权利要求1 6中任意一项权利要求所述的一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚~
糖酶的方法，其特征在于：步骤S1中，所述菌种活化的培养温度为35 39℃，时间为12 24h。
~ ~
8.根据权利要求1 6中任意一项权利要求所述的一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚~
糖酶的方法，其特征在于：步骤S2中，所述种子培养的温度为35 39℃，时间为12 16h，转速~ ~
为180 220 r/min。
~
9.根据权利要求1 6中任意一项权利要求所述的一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚~
糖酶的方法，其特征在于：步骤S3中，所述发酵产酶的温度为35 39℃，时间为25 30h，转速~ ~
为180 220 r/min。
~
10.根据权利要求1 6中任意一项权利要求所述的一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳~
聚糖酶的方法，其特征在于：步骤S4中，所述离心分离的时间为10 20min，转速为3000 5000 ~ ~
r/min。
一种利用蛋白酶缺失微生物生产壳聚糖酶的方法
技术领域
背景技术
发明内容
将所述枯草芽孢杆菌WB800接种于活化培养基平板，置于培养箱内倒置培养以活化菌株；
S2：种子培养
挑取步骤S1活化后的单菌落接种于种子培养基，置于摇床震荡培养至种子液的OD600 达到0.6 1.0；
~
S3：发酵产酶
将步骤S2中的种子液接入发酵培养基中，置于摇床震荡培养；
S4：离心分离
将步骤S3发酵后的产物进行离心，收集上清液，获得壳聚糖酶的粗酶液。
~ ~ ~
~ ~
7.6。
~
所述培养时间为13h，14h，15h，16h，17h，18h，19h，20h，21h，22h，23h。
所述培养时间为13h，14h，15h；
所述培养转速为185 r/min，190 r/min，195 r/min，200 r/min，205 r/min，210r/min，
215 r/min。
所述发酵时间为26 h，27 h，28 h，29 h；
所述发酵转速为185 r/min，190 r/min，195 r/min，200 r/min，205 r/min，210r/min，
215 r/min。
19min；
所述离心分离的转速为3500 r/min，4000 r/min，4500 r/min。
具体实施方式
S1：菌种活化
将所述枯草芽孢杆菌WB800接种于活化培养基平板，控制温度为37℃，置于培养箱内倒置培养20h以活化菌株；
所述活化培养基的配方为：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉
20 g/L，用氢氧化钠调节所述活化培养基的pH为7.4；
S2：种子培养
挑取步骤S1活化后的单菌落接种于种子培养基，控制温度为37℃，转速为200 r/min于摇床震荡培养15 h至种子液的OD600 达到0.8；
所述种子培养基的配方为：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10g/L，用氢氧化钠调节所述种子培养基的pH，使其达到7.4；
S3：发酵产酶
将步骤S2中的种子液按体积百分比2% 的接种量接入发酵培养基中，控制温度为37℃，转速为200 r/min于摇床震荡培养28 h；
所述发酵培养基的配方为：壳寡糖25 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠
10 g/L，用氢氧化钠调节所述发酵培养基的pH，使其达到7.4；
S4：离心分离
将步骤S3发酵后的产物进行离心，控制转速为3500 r/min，离心15min，收集上清液，获得壳聚糖酶的粗酶液。
S1：菌种活化
将所述枯草芽孢杆菌WB800接种于活化培养基平板，控制温度为37℃，置于培养箱内倒置培养15h以活化菌株；
所述活化培养基的配方为：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉
20 g/L，用氢氧化钠调节所述活化培养基的pH为7.4；
S2：种子培养
挑取步骤S1活化后的单菌落接种于种子培养基，控制温度为38℃，转速为220 r/min于摇床震荡培养14 h至种子液的OD600 达到0.7；
所述种子培养基的配方为：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10g/L，用氢氧化钠调节所述种子培养基的pH，使其达到7.4；
S3：发酵产酶
将步骤S2中的种子液按体积百分比2.5% 的接种量接入发酵培养基中，控制温度为36℃，转速为220 r/min于摇床震荡培养25 h；
所述发酵培养基的配方为：壳寡糖25 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠
10 g/L，用氢氧化钠调节所述发酵培养基的pH，使其达到7.4；
S4：离心分离
将步骤S3发酵后的产物进行离心，控制转速为4000 r/min，离心10min，收集上清液，获得壳聚糖酶的粗酶液。
S1：菌种活化
将所述枯草芽孢杆菌WB800接种于活化培养基平板，控制温度为39℃，置于培养箱内倒置培养13h以活化菌株；
所述活化培养基的配方为：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉
20 g/L，用氢氧化钠调节所述活化培养基的pH为7.4；
S2：种子培养
挑取步骤S1活化后的单菌落接种于种子培养基，控制温度为38℃，转速为180 r/min于摇床震荡培养12 h至种子液的OD600 达到0.9；
所述种子培养基的配方为：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10g/L，用氢氧化钠调节所述种子培养基的pH，使其达到7.4；
S3：发酵产酶
将步骤S2中的种子液按体积百分比3% 的接种量接入发酵培养基中，控制温度为37℃，转速为210 r/min于摇床震荡培养28 h；
所述发酵培养基的配方为：壳寡糖25 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠
10 g/L，用氢氧化钠调节所述发酵培养基的pH，使其达到7.4；
S4：离心分离
将步骤S3发酵后的产物进行离心，控制转速为5000 r/min，离心12min，收集上清液，获得壳聚糖酶的粗酶液。
S1：菌种活化
将所述枯草芽孢杆菌WB800接种于活化培养基平板，控制温度为37℃，置于培养箱内倒置培养20h以活化菌株；
所述活化培养基的配方为：胰蛋白胨9 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠9g/L，琼脂粉18 g/L，用氢氧化钠调节所述活化培养基的pH为7.3；
S2：种子培养
挑取步骤S1活化后的单菌落接种于种子培养基，控制温度为37℃，转速为200 r/min于摇床震荡培养15 h至种子液的OD600 达到0.8；
所述种子培养基的配方为：胰蛋白胨12 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10g/L，用氢氧化钠调节所述种子培养基的pH，使其达到7.5；
S3：发酵产酶
将步骤S2中的种子液按体积百分比2% 的接种量接入发酵培养基中，控制温度为37℃，转速为200 r/min于摇床震荡培养28 h；
所述发酵培养基的配方为：壳寡糖30 g/L，胰蛋白胨9 g/L，酵母提取物6 g/L，氯化钠
10 g/L，用氢氧化钠调节所述发酵培养基的pH，使其达到7.4；
S4：离心分离
将步骤S3发酵后的产物进行离心，控制转速为3500 r/min，离心15min，收集上清液，获得壳聚糖酶的粗酶液。
S1：菌种活化
将所述枯草芽孢杆菌WB800接种于活化培养基平板，控制温度为37℃，置于培养箱内倒置培养20h以活化菌株；
所述活化培养基的配方为：胰蛋白胨9 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠8g/L，琼脂粉17 g/L，用氢氧化钠调节所述活化培养基的pH为7.5；
S2：种子培养
挑取步骤S1活化后的单菌落接种于种子培养基，控制温度为37℃，转速为200 r/min于摇床震荡培养15 h至种子液的OD600 达到0.8；
所述种子培养基的配方为：胰蛋白胨8 g/L，酵母提取物6 g/L，氯化钠11g/L，用氢氧化钠调节所述种子培养基的pH，使其达到7.5；
S3：发酵产酶
将步骤S2中的种子液按体积百分比2% 的接种量接入发酵培养基中，控制温度为37℃，转速为200 r/min于摇床震荡培养28 h；
所述发酵培养基的配方为：壳寡糖23 g/L，胰蛋白胨11 g/L，酵母提取物4 g/L，氯化钠
9 g/L，用氢氧化钠调节所述发酵培养基的pH，使其达到7.5；
S4：离心分离
将步骤S3发酵后的产物进行离心，控制转速为3500 r/min，离心15min，收集上清液，获得壳聚糖酶的粗酶液。
S1：菌种活化
将所述枯草芽孢杆菌WB800接种于活化培养基平板，控制温度为37℃，置于培养箱内倒置培养20h以活化菌株；
所述活化培养基的配方为：胰蛋白胨12 g/L，酵母提取物6g/L，氯化钠8g/L，琼脂粉17 g/L，用氢氧化钠调节所述活化培养基的pH为7.3；
S2：种子培养
挑取步骤S1活化后的单菌落接种于种子培养基，控制温度为37℃，转速为200 r/min于摇床震荡培养15 h至种子液的OD600 达到0.8；
所述种子培养基的配方为：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物4 g/L，氯化钠10g/L，用氢氧化钠调节所述种子培养基的pH，使其达到7.5；
S3：发酵产酶
将步骤S2中的种子液按体积百分比2% 的接种量接入发酵培养基中，控制温度为37℃，转速为200 r/min于摇床震荡培养28 h；
所述发酵培养基的配方为：壳寡糖24 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物4 g/L，氯化钠
11 g/L，用氢氧化钠调节所述发酵培养基的pH，使其达到7.6；
S4：离心分离
将步骤S3发酵后的产物进行离心，控制转速为3500 r/min，离心15min，收集上清液，获得壳聚糖酶的粗酶液。
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