技术领域
[0001] 本
发明属于
植物繁殖技术领域，具体涉及一种快速获得椴树属植物初代无菌材料的方法。
背景技术
[0002] 椴树属(Tilia L.)属椴树科落叶乔木，树形美观，多数种
姿态雄伟，叶大荫浓，病虫害少，对
烟尘及有害气体抗性强，是优良的园林绿化树种，被誉为世界四大阔叶行道树之一，许多种还是重要的用材树种，其木材色白轻软，富弹性，不翘不裂，可供多种用材，其花芳香馥郁，是主要的蜜源植物，此外，椴树花、叶中含有黄
酮类、香豆素类、内脂类等多种次
生物质，具有较高的药用价值。然而，由于其具有较大的药用价值和观赏价值等，所以遭受破坏的程度较严重，加之
幼苗更新能
力极低，也加快了物种数量的降低速度，因此有必要对其扩繁方法进行研究。
[0003] 目前，椴树属植物的主要繁殖方法仍为
种子繁殖，但椴树属植物种子都具有深休眠特性，且种子饱满度低，自然条件下种子发芽周期较长且出苗不整齐；在
无性繁殖方面，嫁接和扦插是椴树传统无性繁殖的主要方式，但椴树又属于难生根树种，扦插繁殖还未能实现规模化生产；在椴树的组织培养方面人们也展开了一定的研究，涉及外植体选择、培养基、
激素种类等，但在组织培养工作中，污染问题一直是难以控制和克服的，这给椴树属植物的组织培养工作带来了很大的困难。
发明内容
[0004] 针对上述
现有技术的不足，本发明提供一种快速获得椴树属植物初代无菌材料的方法，本发明以
河沙为初代无菌苗培养基质，既有利于快速解除椴树种子的休眠，又能大大节约生产成本，同时有效避免组织培养中的污染问题，得苗率极高，具有良好的实际应用前景。
[0005] 本发明的目的之一在于提供一种快速获得椴树属植物初代无菌材料的方法。
[0006] 本发明的目的之二在于提供上述方法在快速扩繁椴树属植物中的应用。
[0007] 为实现上述目的，本发明涉及以下技术方案：
[0008] 本发明的第一个方面，提供一种快速获得椴树属植物初代无菌材料的方法，所述方法包括：
[0009] S1.培养基质处理：将湿沙进行灭菌处理后作为椴树种子培养基质；
[0010] S2.椴树种子处理：依次使用浓
硫酸、升汞和赤霉素处理椴树种子；
[0011] S3.无菌材料的获得：将步骤S2中处理后的椴树种子置于S1的培养基质中进行培养。
[0012] 进一步的，所述步骤S1中，控制湿沙
含水量为60～70％(优选为65％)；所述灭菌处2
理方式为高温高压灭菌，具体条件为：121℃，0.12Mpa/cm下灭菌20min；
[0013] 进一步的，所述步骤S2中，椴树种子处理方法具体为：在无菌条件下，使用浓硫酸浸泡处理椴树种子10～20min，从而增加种皮通透性；然后使用升汞溶液浸泡处理椴树种子4～5min，从而对椴树种子进行灭菌处理；最后使用200-1000mg/L GA3溶液浸泡椴树种子6-
12h，解除休眠促进椴树种子发芽；
[0014] 进一步的，所述步骤S3具体方法为：
[0015] 将处理后的椴树种子置于步骤S1的湿沙中，在0-4℃环境条件下进行培养，待种子裂口后将椴树种子转移到组培室内，3-5d种子即可萌发。
[0016] 其中，组培室环境
温度控制为白天温度25±2℃，夜间温度18±2℃；
[0017] 进一步的，所述快速获得椴树初代无菌材料的方法还包括步骤S4.无菌种的转接，具体方法为：将已萌发的幼苗转移到含有
植物生长调节剂的MS培养基上进行培养，即可在短期内获得大量组培苗。
[0018]
发明人经过前期研究发现，紫椴、糠椴(辽椴)等椴树属植物采用本发明所述方法，均可获得极好的出苗率，同时未见产生污染，需要说明的是，采用紫椴等椴树属植物的其他组织器官如芽尖使用本发明方法不仅无法出苗，且污染严重。
[0019] 本发明的第二个方面，提供上述方法在快速扩繁椴树属植物中的应用。
[0020] 所述椴树属植物包括但不限于紫椴、糠椴。
[0021] 本发明有益效果：
[0022] (1)本发明以河沙作为初代无菌苗培养基质，既有利于快速解除椴树种子的休眠，又能大大节约生产成本，同时经试验验证可有效避免组织培养中的污染问题，因此具有广阔的市场前景；
[0023] (2)本发明所述方法各步骤之间相互配合，不仅有效解决了组织培养中的污染问题，同时还能显著提高椴树属植物种子的发芽率，培育周期短，发芽率高达90％以上，可实现大规模育苗生产，有效解决了椴树属植物种子组织培养的技术难题。
附图说明
[0024] 图1为
实施例1初代无菌苗生长情况图。
具体实施方式
[0025] 应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本
申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0026] 需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本
说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0027] 如前所述，在椴树属植物的组织培养方面虽然也开展了一定的研究，但污染问题一直是难以控制和克服的，这给椴树属植物的组织培养工作带来了很大的困难。
[0028] 有鉴于此，本发明的一个典型实施方式中，提供一种快速获得椴树属植物初代无菌材料的方法，具体步骤包括：
[0029] (1)培养基质处理：以普通河沙代替MS培养基，将河沙加水拌湿，湿度保持在65％左右；将湿沙分装在培养瓶中进行高压灭菌，灭菌方法为：121℃，0.12Mpa/cm2下灭菌20min；
[0030] (2)椴树种子处理：
[0031] a.将种子放入无菌瓶中，倒入浓硫酸(浓硫酸的用量以没过种子为宜)处理10-20min，期间不断用玻璃棒进行搅拌；
[0032] b.倒掉浓硫酸，用无菌水冲洗种子数次，直至将浓硫酸残留冲洗干净；
[0033] c.将种子用0.1％的升汞溶液浸泡5min，无菌水冲洗5次；
[0034] d.用无菌的GA3(200-1000mg/L)溶液浸泡种子6-12h(种子处理过程均在无菌操作台上进行)；
[0035] (3)无菌材料的获得：在无菌操作台上，将处理后的种子放入步骤(1)所述湿沙中，每瓶放入20粒左右，之后将培养瓶置于0-4℃环境条件下进行培养(有无光照条件均可)，20d左右即有90％以上的种子裂口(部分种子已萌发出胚根)，此时将培养瓶转移到组培室内(白天温度25±2℃，夜间温度18±2℃)，3-5d种子即可萌发。
[0036] (4)无菌苗转接：待种子萌发后，在无菌操作台上，将幼苗转移到含有植物生长调节剂的MS培养基上进行培养，可在短期内获得大量组培苗。
[0037] 本发明的又一具体实施方式中，所述椴树属植物为紫椴或糠椴。
[0038] 以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
[0039] 实施例1
[0040] 一种快速获得紫椴初代无菌材料的方法，具体步骤包括：
[0041] (1)培养基质处理：将河沙加水拌湿，湿度保持为65％；将湿沙分装在培养瓶中进行高压灭菌，灭菌方法为：121℃，0.12Mpa/cm2下灭菌20min；
[0042] (2)椴树种子处理：a.将种子放入无菌瓶中，倒入浓硫酸(浓硫酸的用量以没过种子为宜)处理15min，期间不断用玻璃棒进行搅拌；b.倒掉浓硫酸，用无菌水冲洗种子数次，直至将浓硫酸残留冲洗干净；c.将种子用0.1％的升汞溶液浸泡5min，无菌水冲洗5次；d.用无菌的500mg/L GA3溶液浸泡种子8h(种子处理过程均在无菌操作台上进行)；
[0043] (3)无菌材料的获得：在无菌操作台上，将处理后的种子放入步骤(1)所述湿沙中，每瓶放入20粒左右，之后将培养瓶置于0-4℃环境条件下进行培养(有无光照条件均可)，20d即有93％的种子裂口(部分种子已萌发出胚根)，且未出现种子污染现象，此时将培养瓶转移到组培室内(白天温度25±2℃，夜间温度18±2℃)，3-5d种子即可萌发，种子发芽率达
91％。
[0044] (4)无菌苗转接：待种子萌发后，在无菌操作台上，将幼苗转移到含有植物生长调节剂的MS培养基上进行培养。
[0045] 实施例2
[0046] 一种快速获得紫椴初代无菌材料的方法，具体步骤包括：
[0047] (1)培养基质处理：将河沙加水拌湿，湿度保持为60％；将湿沙分装在培养瓶中进行高压灭菌，灭菌方法为：121℃，0.12Mpa/cm2下灭菌20min；
[0048] (2)椴树种子处理：a.将种子放入无菌瓶中，倒入浓硫酸(浓硫酸的用量以没过种子为宜)处理15min，期间不断用玻璃棒进行搅拌；b.倒掉浓硫酸，用无菌水冲洗种子数次，直至将浓硫酸残留冲洗干净；c.将种子用0.1％的升汞溶液浸泡5min，无菌水冲洗5次；d.用无菌的200mg/L GA3溶液浸泡种子10h(种子处理过程均在无菌操作台上进行)；
[0049] (3)无菌材料的获得：在无菌操作台上，将处理后的种子放入步骤(1)所述湿沙中，每瓶放入20粒左右，之后将培养瓶置于0-4℃环境条件下进行培养(有无光照条件均可)，20d即有90％的种子裂口(部分种子已萌发出胚根)，且未出现种子污染现象，此时将培养瓶转移到组培室内(白天温度25±2℃，夜间温度18±2℃)，3-5d种子即可萌发，种子发芽率达
91％。
[0050] (4)无菌苗转接：待种子萌发后，在无菌操作台上，将幼苗转移到含有植物生长调节剂的MS培养基上进行培养。
[0051] 实施例3
[0052] 一种快速获得糠椴初代无菌材料的方法，具体步骤包括：
[0053] (1)培养基质处理：将河沙加水拌湿，湿度保持为60％；将湿沙分装在培养瓶中进行高压灭菌，灭菌方法为：121℃，0.12Mpa/cm2下灭菌20min；
[0054] (2)椴树种子处理：a.将种子放入无菌瓶中，倒入浓硫酸(浓硫酸的用量以没过种子为宜)处理15min，期间不断用玻璃棒进行搅拌；b.倒掉浓硫酸，用无菌水冲洗种子数次，直至将浓硫酸残留冲洗干净；c.将种子用0.1％的升汞溶液浸泡5min，无菌水冲洗5次；d.用无菌的800mg/L GA3溶液浸泡种子7h(种子处理过程均在无菌操作台上进行)；
[0055] (3)无菌材料的获得：在无菌操作台上，将处理后的种子放入步骤(1)所述湿沙中，每瓶放入20粒左右，之后将培养瓶置于0-4℃环境条件下进行培养(有无光照条件均可)，20d即有92％的种子裂口(部分种子已萌发出胚根)，且未出现种子污染现象，此时将培养瓶转移到组培室内(白天温度25±2℃，夜间温度18±2℃)，3-5d种子即可萌发，种子发芽率达
90％。
[0056] (4)无菌苗转接：待种子萌发后，在无菌操作台上，将幼苗转移到含有植物生长调节剂的MS培养基上进行培养。
[0057] 实验例1
[0058] 除步骤(1)中的培养基采用常规MS培养基外，其余步骤与实施例1相同，20d后种子萌发率为0。
[0059] 应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行
修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
