技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物干细胞技术领域，具体是一种过表达TAT-KGF的干细胞上清液制备方法及其应用。
背景技术
[0002] 脱发是当今普遍存在的一种“现代病”，虽不属于严重的
疾病，但会对人的外观形象和心理造成负面影响，进而影响患者
生活质量；脱发的类型很多，包括雄
激素性脱发、斑秃、烧伤等创伤后的脱发。
[0003] 近年来，人们生活习惯的不规律和学习工作量超负荷导致脱发患者逐年增多且趋于年轻化，目前，常用非那雄胺和米诺地尔来
治疗脱发，虽然这两种药物有一定疗效，但停药后易复发，长期使用还会造成一定程度的
副作用，如皮
瘙痒、毛发干燥、头晕、冒冷汗、厌食、心肌梗塞等；而中医治疗的效果缓慢，长期服用还会引起患者对中药副作用的担心，如肝和肾毒性。因此，开发安全有效的治疗脱发的方法具有重要的实际意义及需求。
[0004] 针对上述问题，我们需要设计一种过表达TAT-KGF的干细胞上清液制备方法及其应用，能够有效对脱发进行治疗，这是我们亟待解决的问题之一。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种过表达TAT-KGF的干细胞上清液制备方法及其应用，以解决
现有技术中的问题。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0007] 一种过表达TAT-KGF的干细胞上清液制备方法，包括以下步骤：
[0008] 1)间充质干细胞的制备；
[0009] 2)将含有TAT-KGF的质粒
转染至步骤1)获得的间充质干细胞，得到过表达干细胞；
[0010] 3)利用有限稀释法进行亚克隆，构建稳定表达TAT-KGF的生产用干细胞；
[0011] 4)进行生产用干细胞的扩增传代，并收集培养上清液，无菌分装为1ml/支，保存，即得成品。
[0012] 干细胞是一种具有自我复制功能和多分化潜能的早期未分化细胞，医学界称之为“万用细胞”。干细胞具有各种各样的生物学特性，最主要的是具有自我更新和多向分化潜能及无限增殖能
力。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是一组源于基质的异质细胞群，可以从人体大多数组织获取。过去几年，间充质干细胞主要用于伤口组织的修复、促进新生血管的形成、刺激
角质形成细胞参与表皮的再生及促进糖尿病足溃疡的愈合等，如今也常用于脱发的治疗。间充质干细胞能分泌多种细胞因子，如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、角质细胞生长因子(KGF)、
成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板样衍生生长因子(PDGF)、纤维连接蛋白(FN)等。其中，成纤维细胞生长因子(FGF)是一类来源于中胚层和神经外胚层的细胞分泌的具有重要生物活性的细胞生长因子，也是一类重要的促有丝分裂因子和促细胞分化的诱导因子。
[0013] 有关研究表明，FGF能促进组织和神经修复、再生及
伤口愈合和新生血管生成等多种生理作用。FGF是现如今体内发现的最有效的血管生成因子之一，其在毛细管基底膜降解、内皮细胞迁移增生、胶原合成等新生血管生成过程中具有明显的促进作用。角质细胞生长因子(KGF)属于成纤维细胞生长因子(FGFs)家族的成员之一，又称FGF-7，主要由间质细胞产生，KGF与上皮细胞上的受体KGFR特异性结合来参与调控
信号传递级联反应，参与组织器官发育和细胞生长增殖等多种生物过程，改善
皮肤微循环及促进血管扩张，促进创伤愈合，并且在促进毛发再生也起到重要作用。
[0014] 但是，干细胞分泌的因子都属于大分子蛋白类，其被皮肤和毛囊前
体细胞吸收的比例率差低，因此，提高干细胞分泌因子的皮肤透过率具有重要的意义，有关研究表明，TAT能高效地介导大分子物质进入细胞甚至细胞核内，被广泛应用于携带药物、DNA等药物开发。
[0015] 本发明联用穿膜肽(TAT)来提高KGF的细胞透过率，利用分子克隆技术将TAT-KGF融合基因克隆至生产用干细胞中，经筛选亚克隆后，获得稳定表达TAT-KGF因子的干细胞株，加上该细胞株本身可自分泌FGF2，从而维持细胞的干细胞特性，避免其发生横向或纵向分化，使之成为具有长期传代和稳定表达细胞因子能力的工程细胞株，以保障生产用干细胞的
稳定性和
可持续性，从而达到产品质量的稳定。
[0016] 较优化地，包括以下步骤：
[0017] 1)间充质干细胞的制备：步骤1)中可先进行间充质干细胞的制备，实际操作时，可采用改良组织
块贴壁法制备人脐带间充质干细胞；
[0018] 2)将含有TAT-KGF的质粒转染至步骤1)获得的间充质干细胞，得到过表达干细胞；
[0019] A.构建TAT-pET28a-KGF真核表达质粒；
[0020] B.通过脂质体Lipofectamine2000分别包裹已构建好的TAT-pET28a-KGF真核表达质粒，转染至步骤1)获得的间充质干细胞中；
[0021] C.更换含800μg/mlG418的opti-MEM换液，继续培养；
[0022] D.培养72h，采用RT-PCR法检测间充质干
细胞转染情况，并得到转染后的过表达干细胞；步骤2)中先构建TAT-pET28a-KGF真核表达质粒，再将该基因转染至间充质干细胞中，使得TAT-KGF基因在间充质干细胞中过表达；同时采用RT-PCR法检测，用于确定间充质干细胞的转染情况，检测转染步骤是否成功，同时可以将转染后的过表达干细胞的TAT-KGF表达情况与常规干细胞进行比较；
[0023] 3)利用有限稀释法进行亚克隆，构建稳定表达TAT-KGF的生产用干细胞；步骤3)中利用有限稀释法进行亚克隆，将步骤2)获得的过表达干细胞进行扩增传代，得到稳定表达TAT-KGF的生产用干细胞，用于批量生产；
[0024] a)取步骤2)获得的过表达干细胞，0.25％胰蛋白酶进行常规消化，收集细胞悬液；
[0025] b)用血球计数板进行计数，并采用有限稀释法将细胞稀释为105个/ml，每孔接种100μl于96孔细胞培养板中，用含1600μg/mlG418选择培养基100μl/孔，进行选择培养；
[0026] c)培养7天，再用0.25％胰蛋白酶进行消化，并扩增至24孔板；
[0027] d)进行扩增传代，并逐步减少G418用量至10μg/ml，继续培养，直至扩增量达到所需数量，得到生产用干细胞；
[0028] e)常规收集，洗涤，加入干细胞冻存液，分装并作好标记，并采用程序降温法冻存生产用干细胞于-196℃液氮中；
[0029] 4)进行生产用干细胞的扩增传代，并收集培养上清液，无菌分装为1ml/支，保存，即得成品。
[0030] 较优化地，步骤B操作时，将间充质干细胞按每孔5×104个细胞接种于24孔板中，培养24h，去上清，再换成无血清培养基培养4h，再加入含有已包裹TAT-pET28a-KGF真核表达质粒的脂质体Lipofectamine2000的opti-MEM培养基，进行转染。
[0031] 较优化地，所述步骤4)中，具体操作步骤为：
[0032] a)将步骤3)获得的生产用干细胞扩增传代二十代，直至细胞数量≥1010；
[0033] b)换成新鲜的无血清干细胞培养基，继续培养生产用干细胞3天；
[0034] c)收集生产用干细胞培养上清液，混匀；
[0035] d)将收集到的上清液进行
透析浓缩至蛋白总浓度为20μg/ml，无菌分装为1ml/支，于-20℃保存，即得成品。
[0036] 较优化地，所述上清液中含过表达的TAT-KGF，且上清液中还含有人表皮细胞生长因子、人角质细胞生长因子、人血小板样衍生生长因子、纤维连接蛋白和免疫因子。
[0037] 较优化地，所述间充质干细胞的制备步骤如下：
[0038] a)无菌条件下取近
胎儿端脐带20cm，两端各剪去2cm，先用含200U青
链霉素的生理盐
水漂洗脐带4-5次，至无血迹，再用无双抗的生理盐水漂洗，放含少许DMEM/F12培养基的培养皿中，剪成2-3cm的小段，将小段纵向剪开，剔除脐带内动、静脉血管，用组织镊将组织块撕成细条状，放入含少量DMEM/F12培养基的培养皿中，用眼科剪剪成1-2mm3的碎块，整个过程在
冰浴中进行；
[0039] b)将剪碎的组织块蘸上少许血清，移入透气T25培养瓶中，每瓶20个，加入1.5ml含20％胎
牛血清的DMEM/F12培养基，培养48h后换液，待有细胞贴壁后更换培养基，培养约8-
12天，去除组织块；培养约20天，细胞长至80％融合，经胰酶消化收集细胞，得到间充质干细胞。
[0040] 较优化地，所述上清液的细胞浓度≥1×107个/ml。
[0041] 按上述任意一项所述的干细胞上清液在治疗脱发的药物中的用途。
[0042] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0043] 本发明提供一种用于治疗脱发患者的快速毛发再生的干细胞制备方法，该干细胞能够改善皮肤微循环，促进新毛囊再生。使用常规分离获得的干细胞，经分子克隆技术“过表达”TAT-KGF融合蛋白，该干细胞上清液富含TAT-KGF融合蛋白及干细胞自身自分泌的细胞因子，包括人表皮细胞生长因子、人血管内皮细胞生长因子和人成纤维细胞生长因子、人成纤维细胞生长因子、人血小板样衍生生长因子和纤维连接蛋白等，可应用于促进脱发患者的毛发再生。
[0044] 本发明涉及一种过表达TAT-KGF融合蛋白的干细胞上清液的制备，以及其应用于促进毛发的再生，该干细胞是经分子克隆技术将穿膜肽(TAT)和角质细胞生长因子(KGF)融合基因引入至干细胞，过表达TAT-KGF融合蛋白的干细胞应用于毛发的再生；该发明方法简便易行，适用于不同来源的干细胞培养的大规模生产，该类干细胞可应用于促进不同起因的脱发再生，同时也为干细胞应用于医学转化事业提供一条新的路径。
[0045] 本发明公开了一种过表达TAT-KGF的干细胞上清液制备方法及其应用，工艺设计合理，可行性高，且可产业化和衍生化，适用于制备不同来源的间充质干细胞，能够对不同起因的脱发进行治疗，脱发再生效果优异，实用性较高。
附图说明
[0046] 为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体
实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
[0047] 图1为本发明一种过表达TAT-KGF的干细胞上清液制备方法的实验1中①、②组RT-PCR法检测结果示意图。
具体实施方式
[0048] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0049] 实施例1：
[0050] S1：间充质干细胞的制备：
[0051] 无菌条件下取近胎儿端脐带20cm，两端各剪去2cm，先用含200U青链霉素的生理盐水漂洗脐带4次，至无血迹，再用无双抗的生理盐水漂洗，放含少许DMEM/F12培养基的培养皿中，剪成2cm的小段，将小段纵向剪开，剔除脐带内动、静脉血管，用组织镊将组织块撕成细条状，放入含少量DMEM/F12培养基的培养皿中，用眼科剪剪成1-2mm3的碎块，整个过程在冰浴中进行；
[0052] 将剪碎的组织块蘸上少许血清，移入透气T25培养瓶中，每瓶20个，加入1.5ml含20％胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养48h后换液，待有细胞贴壁后更换培养基，培养约8天，去除组织块；培养约20天，细胞长至80％融合，经胰酶消化收集细胞，得到间充质干细胞。
[0053] S2：将含有TAT-KGF的质粒转染至获得的间充质干细胞，得到过表达干细胞；
[0054] 构建TAT-pET28a-KGF真核表达质粒；再通过脂质体Lipofectamine2000分别包裹已构建好的TAT-pET28a-KGF真核表达质粒，转染至获得的间充质干细胞中；
[0055] 将间充质干细胞按每孔5×104个细胞接种于24孔板中，培养24h，去上清，再换成无血清培养基培养4h，再加入含有已包裹TAT-pET28a-KGF真核表达质粒的脂质体Lipofectamine2000的opti-MEM培养基，进行转染；培养72h，采用RT-PCR法检测间充质干细胞转染情况，并得到转染后的过表达干细胞；
[0056] S3：利用有限稀释法进行亚克隆，构建稳定表达TAT-KGF的生产用干细胞；
[0057] 取S2获得的过表达干细胞，0.25％胰蛋白酶进行常规消化，收集细胞悬液；用血球计数板进行计数，并采用有限稀释法将细胞稀释为105个/ml，每孔接种100μl于96孔细胞培养板中，用含1600μg/mlG418选择培养基100μl/孔，进行选择培养；培养7天，再用0.25％胰蛋白酶进行消化，并扩增至24孔板；
[0058] 再进行扩增传代，并逐步减少G418用量至10μg/ml，继续培养，直至扩增量达到所需数量，得到生产用干细胞；常规收集，洗涤，加入干细胞冻存液，分装并作好标记，并采用程序降温法冻存生产用干细胞于-196℃液氮中；
[0059] S4：将生产用干细胞扩增传代二十代，直至细胞数量≥1010；再换成新鲜的无血清干细胞培养基，继续培养生产用干细胞3天；收集生产用干细胞培养上清液，混匀；将收集到的上清液进行透析浓缩至蛋白总浓度为20μg/ml，无菌分装为1ml/支，于-20℃保存，即得成品。
[0060] 实验1：RT-PCR法检测TAT-KGF的表达水平
[0061] ①组：实施例1中S2步骤，转染结束后培养72h，再用TRIzon总RNA提取
试剂提取总RNA，再将总RNA使用PrimeScriptTMmRNA qPCR starter kit进行反转录(37℃，2h)，反转录完成后，将cDNA稀释10倍，然后用SybrGreenⅡ2×PCR Mix(Perfect Real-time)检测RNA的表达。
[0062] ②组以常规间充质干细胞进行检测，①、②组形成对照，检测结果如
说明书附图1所示(①组为最右数据，②组为最左数据)
[0063] 结论：由于TAT-KGF中含有KGF的RNA序列，以KGF的表达量与对照组相比能间接反应TAT-KGF的表达量；检测结果显示，经载TAT-pET28a-KGF的脂质体2000转染后MSC的KGF表达显著增多，以此反映MSC过表达了TAT-KGF。
[0064] 实验2：对脱发患者的治疗效果评价
[0065] 某先生，男，45岁。严重脱发，头顶大面积脱光，雄性激素分泌过多脱发，常用治疗效果不佳，后作为自愿者使用了本发明的干细胞上清液。
[0066] 使用时，在脱发处边缘采用水光仪注射，注射剂量5mL，浓度为1×107个/mL，一个月注射一次，三个月后发脱发处长出新的小绒毛。
[0067] 结论：本发明公开了一种过表达TAT-KGF的干细胞上清液制备方法及其应用，工艺设计合理，可行性高，且可产业化和衍生化，能够对不同起因的脱发进行治疗，脱发再生效果优异，实用性较高。
[0068] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附
权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
