단백질간의 상호 결합을 조사할 수 있는 이중 라이브러리 단백질 결합 검색방법에 의한 검색 방법 및 이에 이용되는 재조합 효모 균주{Method for screening of protein-protein interaction by double library two-hybrid system and the recombinant yeast strains used for the system}

본 발명은 라이브러리 차원에서 단백질간의 상호 결합을 조사할 수 있는 이중 라이브러리 단백질 결합 검색 방법 (Double Library Two-Hybrid System) 및 이에 이용되는 재조합 효모 균주에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 효모를 이용한 기존의 투-하이브리드 (two-hybrid) 시스템을 발전시킨 것으로 이중 라이브러리 단백질 결합 검색 방법 (double library two-hybrid system: DLTS)에 의한 검색 방법 및 이에 이용되는 재조합 효모 균주들에 관한 것이다.

생체 내에서 일어나는 생명현상 탐구의 근간은 DNA, RNA, 단백질과 같은 거대분자 (macromolecule)들이 서로 어떠한 관계를 맺고 있는가에 있다고 볼 수 있으며, 이 중에서도 단백질간의 상호작용이 다양하고 광범위하게 관여한다. 그러므로, 한 개체 내에서 일어나는 생리현상을 총체적으로 이해하기 위해서는 모든 단백질들간의 상호 작용을 포괄적으로 알아야 한다. 게다가, 최근 게놈 사업으로 밝혀진 염기서열을 이용하여 단백질들간의 상호 관계를 체계적으로 규명하기 위해서는 단백질간의 상호 작용 여부를 검색할 수 있을 뿐만 아니라 특정 단백질과 작용하는, 알려져 있지 않은 단백질을 찾아낼 수 있어야 한다. 현재 MALDI/TOF을 이용한 프로티옴 법이나 효모의 유전 현상을 이용한 투-하이브리드 (two-hybrid) 시스템 등이 이러한 연구를 하는데 흔히 이용되고 있지만, 사람과 같이 많은 유전자를 가지고 있는 개체의 단백질들간의 상호작용을 총체적으로 이해하기 위해서는 보다 효율이 높고 포괄적인 방법이 필요한 현실이다.

투-하이브리드 (two-hybrid) 시스템은 알려진 단백질들간의 결합여부를 검색하거나 어떤 단백질과 결합하는 알려져 있지 않은 단백질을 찾는데 많은 사람들이 이용하고 있다 (Fields S, Song O. 1989. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature 340: 245-6). 이 시스템은 DNA에 붙어 전사를 활성하는 단백질인 Gal4p (Gal4 단백질)의 DNA결합 도메인에 연구대상이 되는 단백질(bait)을 붙여 하이브리드(hybrid) 단백질을 만들고, 그 단백질과 결합하는 단백질(prey)에 Gal4p의 전사활성 도메인을 붙인 하이브리드 단백질을 만들어 효모 내에서 동시에 발현시키면 이 두 하이브리드 단백질은 베이트(bait)와 프레이(prey) 사이에 결합하는 성질이 있으면 서로 결합하여 기능적인 Gal4 단백질, 즉 DNA에도 붙고 전사도 활성하는 단백질이 되어 Gal4p 결합 사이트(site) 뒤에 오는 유전자의 발현을 매개하는 전사활성 인자로 작용함을 이용한 것이다. 이와 같은 상태에서 효모 내에 Gal4p-결합 위치 뒤에 리포터(reporter) 유전자인 β-galactosidase ( lac Z )나 HIS3 을 붙여 놓아 이들의 발현 여부를 알 수 있게 된다.

세계적으로 많은 연구팀들이 여러 생물학적 과정들의 메커니즘을 알기 위한 기초연구와, 유용 유전자를 발견하거나 생리활성 물질들을 탐색하려는 목적으로 투-하이브리드 (two-hybrid) 시스템을 사용하고 있다. 효모 유전자 전체를 각각 베이트 (bait)와 프레이 (prey) 플라스미드에 넣고 단백질간의 작용을 조사한 것이 대표적인 예인데 (Uetz et al., 2000. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403: 623-7, McCraith et al., 2000. Genome-wide analysis of vaccinia virus protein-protein interactions. Proc Natl Acad Sci US A. 97: 4879-4884, Ito et al., 2000.Toward a protein-protein interaction map of the budding yeast: A comprehensive system to examine two-hybrid interactions in all possible combinations between the yeast proteins. Proc Natl Acad Sci US A. 97: 1143-1147, Ito et al., 2001. A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome. Proc Natl Acad Sci US A. 98: 4569-4574), 이런 연구 방법과 결과는 사람 유전자와 같이 게놈 크기가 훨씬 큰 경우에는 적용하기가 어렵다. 왜냐하면, 투-하이브리드 (two-hybrid)를 이용하여 단백질 결합 관계를 밝히는 과정에서는 여러 형태의 가짜 양성반응 (false-positive) 과 가짜 음성반응 (false-negative) 이 존재하기 때문에, 게놈 크기가 크고 복잡할 때에는 결과들에 대한 신뢰도가 낮고 해석이 매우 복잡하게 되는 한계점이 있기 때문이다.

이러한 시점에서 한 개체내의 모든 단백질들간의 상호작용을 규명하기 위해서는 기존의 투-하이브리드 (two-hybrid) 시스템의 한계점을 극복하고, 단일 단백질의 관점이 아닌 수많은 단백질의 검색 시스템을 구축하는 것이 필요하며, 이는 게놈 사업으로 알려진 염기 서열을 이용하여 생명현상을 총체적으로 이해하는 데에도 절실히 요구된다고 할 수 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래 기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 효모를 이용한 기존의 투-하이브리드 (two-hybrid) 시스템의 단점을 개선한 본 발명의 이중 라이브러리 단백질 결합 검색 방법 (double library two-hybrid system: DLTS)에 의한 검색 방법을 이용하는 경우, 단일 단백질이 아닌, 라이브러리 수준의 단백질들의 결합 쌍들을 동시에 효율적으로 검색하기 위한방법을 제공하는 할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 HF7c 효모의 URA3 유전자의 뉴클레오타이드의 일부가 제거된 재조합 효모 균주 및 476 효모의 URA3 의 코딩 부위와 그 상위 부위 사이에 GAL1 프로모터를 끼어 들어가도록 하여 URA3 의 발현이 Gal4p에 의존하도록 유전자를 재조합한 효모 균주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 효모 균주들을 이용한 이중 라이브러리 단백질 결합 검색 방법에 의한 검색 방법을 제공하는데 있다.

도1은 효모의 투-하이브리드 (two-hybrid) 시스템을 이용한 라이브러리 스크리닝과 이중 라이브러리 단백질 결합 검색 방법 (DLTS)을 이용한 라이브러리 스크리닝의 원리를 개략적으로 나타내는 그림이다.

도2는 DLTS를 수행하는데 필수적인 효모 균주들을 제작하기 위해 고안된 DNA조각들과 상동 재조합이 일어나는 원리를 나타낸 그림이다.

도3은 유전자가 재조합 된 본 발명의 효모 균주들과 원 균주들에서의 URA3 의 발현 양상을 나타낸 그림이다.

도4는 제작된 효모 균주들을 이용하여, 임의로 만들어준 가짜 양성 반응들만을 선택적으로 제거할 수 있는 5-FOA의 적정농도의 결정을 나타낸 사진이다.

도5는 양 타입의 효모를 라이브러리로 형질 전환하고, 가짜 양성 반응들을 제거한 후, 단백질 결합 쌍들을 찾아내는 과정을 간단히 나타낸 도면이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 효모 균주 내의 URA3 을 파괴하여 a 타입 균주를 제조한 후, URA3 이 GAL1 프로모터에 의해 발현되는 플라스미드를 도입하는 단계; b) 유전자 재조합 방법을 이용하여 효모 균주 내의 URA3 이 GAL1 프로모터에 의해 발현되도록 직접 수정하여 α타입 균주를 제조하는 단계; c) 상기 제조된 a 타입 균주 및 α타입 균주에 베이트(bait) 라이브러리 및 프레이(prey) 라이브러리를 각각 형질 전환하는 단계 d) 상기 형질 전환된 a 타입 균주 및 α타입 균주를 각각 5-FOA(5- fluoroorotic acid)를 포함하는 배지에서 배양하면서 가짜 양성 반응을 선택적으로 제거하는 단계; e) 및, 상기 선택 과정에서 살아 남은 두 타입의 형질전환 효모를 메이팅(mating) 시켜 단백질-단백질 결합 쌍들을 검출하는 단계를 포함하는, 이중 라이브러리 단백질 결합 검색 방법을 제공한다. 상기 a) 및 b)와 같이 재조합 효모를 사용하는 이유는 URA3 이 Gal4p에 의존적으로 발현되게 하기 위함이다.

본 발명의 발명에서, 상기 d) 단계 이후에 살아 남은 효모들을 다시 회복시키는 단계를 더 포함하는 것이 바람직한데 이는 메이팅(mating)된 2배체들의 성장이나 단백질 결합쌍에 의해 나타나는 양성 반응 (real positive)이 5-FOA를 이용한 이전의 제거과정에 의해 영향을 받지 않도록, 메이팅(mating)에 앞서 살아남은 효모들은 5-FOA가 없는 배지에서 충분히 키워서 회복되도록 해야 하기 때문이다.

본 발명에 있어서, 상기 베이트 라이브러리는 GAL4p의 DNA 결합 도메인과 베이트 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하고 프레이 라이브러리는 Gal4p의 전사활성 도메인 및 프레이 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 5-FOA(5- fluoroorotic acid)의 농도는 PBN101인 경우에는 0.05 내지 0.07%이고 PBN201에서는 0.13 내지 0.15인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 PBN101의 경우엔 0.06%, PBN201의 경우엔 0.14%이다.

본 발명에 있어서, 상기 단백질-단백질 결합 쌍의 검출은 HIS3 또는 lac Z 리포터 유전자를 이용할 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 HF7c 효모 내의 URA3 이 상동 재조합에 의해서 파괴되어 있는 것이 특징인 효모 균주 PBN101(수탁번호: KCTC 10155BP) 및 476 효모의 URA3 의 코딩 부위와 그 상위 부위 사이에 GAL1 프로모터를 끼어 들어가도록 하여 URA3 의 발현이 Gal4p 의존적으로 되도록 조작된 것이 특징인 효모 균주 PBN201(수탁번호: KCTC 10156BP)을 제공한다. 이런 재조합 효모를 사용하는 이유는 URA3 가 Gal4p에 의존적으로 발현되게 하여, 5-FOA를 이용한 가짜 양성반응의 제거를 가능하도록 하기 위해서이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 효모의 투-하이브리드 (two-hybrid) 시스템의 약점을 없앤 방법을 개발한 것으로, 단백질-단백질 결합을 검색하는 기본적인 원리는 투-하이브리드 (two-hybrid) 시스템의 그것을 이용한다. 이 방법은 효모의 전사 활성인자 (transcriptional factor)인 Gal4p의 DNA 결합 기능과 전사 활성 기능이 분리 가능하고 각각의 기능이 독립적이라는 사실에 기초하여 만들어진 것이다(Fields and Song, 1989. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature 340: 245-6). 효모의 Gal4 단백질은 881개의 아미노산으로 이루어져 있는데, DNA-결합 도메인을 아미노산 말단 부위(1-147 아미노산)에 가지고 있고 2개의 전사 활성 도메인 [activation domain I(149-196), activation domain II(768-881)]을 단백질의 중간과 카복시 말단 부위에 가지고 있다. Gal4p DNA 결합 도메인은 Gal4p가 핵 내로 들어가서 Gal4p에 의하여 조절되는 유전자의 상위 (upstream) 부위에 가서 붙게 한다. 그리고 전사 활성 도메인은 전사를 시작하는데 필요한 전사 기구 (transcriptional machinery)의 인자들과 접촉하는 기능을 담당한다. 이러한 성질을 바탕으로 단백질-단백질 결합을 효모에서 조사할 수 있는 방법이 효모의 투-하이브리드 (two-hybrid) 시스템이다. 즉, 연구하고자 하는 단백질(bait)과 그 단백질에 결합하는 단백질(prey)을 각각 Gal4p의 DNA-결합 도메인과 전사 활성 도메인에 붙여 하이브리드 단백질들을 만들고, 이들을 효모 내에서 동시에 발현시키면 이 두 단백질은 서로 결합하여 정상적인 Gal4 단백질이 가진 기능을 재생하는컴플렉스(complex)를 형성함으로써 Gal4p-결합 위치 뒤에 오는 유전자의 발현을 매개하는 전사 활성인자로 작용한다 [도 1의 (A)]. 이와 같은 상태에서 효모 세포내의 Gal4p-결합 위치 아래쪽에 리포터 유전자인 β-galactosidase ( lac Z )를 도입시켜 놓으면 두개의 하이브리드 단백질에 의하여 재생된 Gal4p의 기능에 의해 β-galactosidase가 발현되어 배지에 있는 X-gal의 분해를 일으켜 콜로니의 색깔을 변화시켜 쉽게 판독할 수 있게 되며, 리포터로 HIS3 유전자를 붙여 놓으면 히스티딘(histidine)이 없는 배지에서 효모를 배양시킴으로써 HIS3 이 발현되는 효모만 살아남게 되어 리포터가 발현되는 효모만 선별할 수 있게 된다. 나아가, 투-하이브리드 (two-hybrid) 시스템을 이용하여 프레이 (prey)쪽에 cDNA 라이브러리를 붙여 놓음으로써 특정 단백질(bait)과 작용하는 단백질이 무엇이 있는지를 알아낼 수 있는 방법으로도 사용할 수 있다 (Fields and Sternglanz, 1994. The two-hybrid system: an assay for protein-protein interactions. Trends Genet. 10: 286-92). 그리고 이 투-하이브리드 (two-hybrid) 시스템을 변형 시켜서 RNA와 단백질과의 결합이나 DNA와 단백질과의 결합도 조사할 수 있는 방법으로 개발되어 있다 (SenGupta et al., 1996. A three-hybrid system to detect RNA-protein interactions in vivo. Proc Natl Acad Sci US A. 93: 8496-501).

앞서 언급한 투-하이브리드 (two-hybrid) 시스템에서의 가짜 양성 반응이라 함은 베이트 (bait)와 프레이 (prey)의 결합 때문이 아니라, 다른 이유 (결합 도메인에 결합된 베이트 (bait)가 전사조절인자의 성질을 가진다든지, 효모내의 다른 단백질과 결합하는 경우 등) 때문에 마치 베이트 (bait)와 프레이 (prey) 단백질결합에 의해 일어나는 것처럼 결과가 나타나는 것이다. 반대로, 가짜 음성 반응은 다른 개체로부터 온 단백질이 효모 시스템 속에서 올바른 기능과 성질을 가지지 못하여 단백질 결합이 없는 것으로 나타나는 현상이다. 예를 들어, 투-하이브리드 (two-hybrid) 시스템이 작동하기 위해서는 하이브리드 단백질들이 핵 속으로 이동하여야만 하는데 전체 길이(full-length)의 단백질을 사용하였을 경우에는 그 단백질 자체에 포함되어 있는 세포 내 이동 신호(localization signal)에 의하여 핵으로 이동하는 것이 저해될 수 있기 때문이다. 또한, 온전한 단백질들의 경우 조절 도메인(regulatory domain)에 의하여 결합 도메인이 가려져 있다가 특정한 경우에만 노출되어 단백질 결합에 관여하는 경우도 있다. 실제로 투-하이브리드 (two-hybrid) 시스템을 이용하여 단백질-단백질 결합을 조사하는 경우, 유전자의 일부만 사용하였을 때에는 결합을 보이지만 전체 유전자를 사용하였을 때에는 가짜 음성반응으로 관찰되는 경우는 흔하다.

이를 보완하기 위해 만들어진 이중 라이브러리 단백질 결합 검색 방법 (double library two-hybrid system: DLTS)은 기존의 투-하이브리드 (two-hybrid) 시스템에 다음과 같이 다른 점들이 추가되어 있다 [도 1의 (B)]. 가장 큰 특징은 베이트 (bait)로 특정 유전자뿐만 아니라 라이브러리 DNA를 사용할 수 있도록 개선한 것이다. 이런 탐색은 기존의 투-하이브리드 (two-hybrid) 시스템의 경우, 베이트 (bait) 플라스미드 내에 라이브러리 DNA를 넣으면 가짜 양성 반응이 너무 많이 나와서 프레이 (prey) 라이브러리 탐색을 하기가 불가능하다. DLTS에서는 가짜 양성 반응들을 제거할 수 있도록 효모 균주와 리포터를 개선하였다.

효모의 생장에 필요한 유라실(uracil)의 생합성 과정에 관여하는 URA3 유전자의 산물은 5-FOA(5-fluoroorotic acid)라는 기질 유사체(analog)와 반응할 때 독성을 내는 5-fluorouracil을 생성하고 이것이 효모를 죽이게 된다. 이 성질을 이용하기 위하여 URA3 을 리포터로 이용하였다. 만약, URA3 이 가짜 양성반응이 일어날 때에만 발현되도록 만들어 준다면, 5-FOA를 넣어줌으로써 가짜 양성반응이 일어나는 효모들만 선택적으로 죽일 수 있기 때문이다. 투-하이브리드 (two-hybrid) 시스템에서 일반적으로 사용되는 효모 균주들은 URA3 을 근본적으로 계속 발현하고 있으므로 이를 가능하게 하기 위해서는 이것을 Gal4p에 의해 조절되도록 해야 한다. 즉, URA3 을 파괴한 후, GAL1 프로모터(promoter)에 의해 조절되는 URA3 리포터 플라스미드로 형질 전환하거나, 균주 유전자의 URA3 을 Gal4p에 의해 조절될 수 있는 프로모터 아래에 놓이도록 만들어야 한다. 효모 내에서는 유전자의 상동 재조합(homologous recombination)이 높은 효율로 잘 일어나고 균주마다 그 유전자형이 잘 알려져 있으므로, 이러한 변화를 유도할 수 있는 DNA 조각들을 디자인하여 효모 내로 넣어줌으로써 원하는 새로운 균주를 얻을 수 있다.

본 발명에서는 기존의 시스템에서 이용되던 효모 균주들에 유전적 조작을 가하여 DLTS을 수행할 수 있는 균주들을 생산하였다. 투-하이브리드 (two-hybrid) 시스템에서 이용되었던 HF7c(MATa: a 타입) 내의 URA3 유전자를 파괴함으로써 이 균주가 5-FOA 존재 하에서도 항상 살 수 있도록 만들었다. 이 효모 균주에 GAL1 프로모터의 조절하의 URA3 유전자를 가지고 있는 플라스미드(pGUA)를 만들어 Gal4p DNA 결합 도메인과 일종의 전사 활성인자가 결합된 유전자를 가지고 있는 플라스미드를동시에 형질 전환시킨 경우에는 5-FOA 존재 하에서 살지 못한다. 상기의 HF7c는 "Clontech MATCHMAKER Two-hybrid system"이라는 제품의 구성요소로 제공되는 스트레인(strain)이다.

한편, 또 다른 균주인 476(MATα: α타입) 역시 효모 내의 야생형 URA3 이 자체의 전사 조절 기작에 의해 발현되지 않고 다른 리포터 유전자들( HIS3, lac Z )과 동일하게 Gal4p에 의하여 조절될 수 있도록, GAL1 프로모터를 URA3 의 상동 부분에 삽입시켜 URA3 역시 HIS3 나 lac Z 와 같이 Gal4p에 의해 조절되는 리포터로 만들었다. 이렇게 만들어진 균주들을 이용하여 베이트 (bait) 라이브러리나 프레이 (prey) 라이브러리들을 각각 효모에 형질 전환한 후, 적절한 농도의 5-FOA가 함유된 상태에서 키워 가짜 양성 반응을 나타내는 것들만을 미리 제거할 수 있다. 상기의 균주 476은 미국 시애틀의 워싱턴 주립대 S. Fields 연구실(Dept. of Genetics and Medicine and Howard Hughes Medical Institute, University of Washington, Box 357360, Seattle, Washington 98195-7360, USA)에서 용이하게 입수할 수 있다.

가짜 양성반응을 나타내는 효모들이 제거되고 남은 a 타입과 α타입의 효모들을 서로 섞어서 메이팅(mating)을 시킨 후, 히스티딘(histidine)이 결핍된 배지에서 키우면, 2배체(diploid)이면서 서로 상호 작용하는 단백질 쌍을 가진 효모들을 골라낼 수 있다. 이렇게 선별된 효모들 내에서 다른 리포터인 lac Z 의 발현을 조사하고, 이렇게 얻어진 효모들로부터 베이트 (bait)와 프레이 (prey) 플라스미드를 분리하여 염기서열을 조사함으로써 단백질-단백질 결합에 참여하는 결합 쌍을 규명한다.

이와 같이, DLTS는 기존의 투-하이브리드 (two-hybrid) 시스템에서 라이브러리 수준의 베이트 (bait)를 이용하여 검색할 때의 약점들을 해결하였다. 그러므로, 세포내의 여러 단백질들간의 상호 작용을 포괄적으로 동시에 조사하는 데에 특히 유용하게 이용될 수 있을 것이다. 게놈 사업으로 이미 사람의 염기서열이 모두 밝혀졌으므로 DLTS로부터 얻어지는 유전자의 부분적인 염기서열 만으로도 유전자 전체의 정보를 알 수 있기 때문이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

<1> 플라스미드의 제조

DNA 조작은 표준적인 방법에 의하여 실시하였다 (Sambrook et al., 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). HF7c 내의 URA3 을 파괴하는데 이용될 DNA 조각을 만들기 위하여 pYES2 (Invitrogen)를 제한효소 Nde I 과 Apa I (Roche)으로 처리하여 URA3 유전자의 중간 459 개의 뉴클레오타이드를 제거하고 다시 접합(ligation) 하였다. 이 플라스미드를 대장균에서 증폭한 다음, Nhe I 과 Nsi I (Roche)으로 처리해 ura3 부분만 분리하여 효모의 형질 전환에 이용하였다(도2의 (A)).

한편, 476 효모 내에서 근본적으로 발현되고 있는 URA3 을 Gal4p 의존적으로 발현되도록 조작하는데 이용될 DNA 조각을 만들기 위하여 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction: PCR)을 다음의 2개의 올리고-뉴클레오타이드 (oligonucleotide)를 사용하여 수행하였다(도2의 (B)).

프라이머 1:

5-GGTATATATACGCATATGTGGTGTTGAAGAAACATG

AAATTGCCCAGTATGAATTCGAGCTCGTTTAAAC-3

프라이머 2:

5-ACAGGACTAGGATGAGTAGCAGCACGTTCCTTATAT

GTAGCTTTCGACATCATTTTGAGATCCGGGTTTT-3

이 프라이머들은 pFA6a-kanMX6-PGAL1 (Longtine et al., 1998. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 14: 953-961)을 템플레이트(template)로 하여 선택적 마커인 kan ^R 과 GAL1 프로모터를 증폭시키기 위하여 사용되었다. Gal4p 의존적으로 URA3 이 발현될 수 있도록 하는 플라스미드 pGUA의 제작을 위해 pYES2를 제한효소 Hind III (Roche)로 처리하여 벡터로 사용하고, URA3 유전자의 분리를 위해 pYES2를 Nde I과 Nsi I으로 잘라 나온 908bp 조각을 클레나우(Klenow) 효소로 처리하여 위 벡터에 라이게이션하여 pGU를 만들었다. 이 플라스미드의 효모 내에서의 선택적 마커로 ADE2 를 이용하기 위해 pASZ11 (Stotz et al., 1990. The ADE2 gene from Saccharomyces cerevisiae : sequence and new vectors. Gene95: 91-98)을 Bgl II와 클레나우로 처리하여 얻은 조각을 pGU의 Nhe I 과 Bst1107 I 로 처리하고 난 위치로 라이게이션하였다. 또한 Gal4p DNA 결합 도메인을 가지고 있는pGBT9(Clontech)의 선택적 마커를 TRP에서 ADE로 바꾸기 위해서 위에서 준비한 ADE2 조각을 pGBT9의 Pvu II와 Ban II 로 처리하고 난 위치로 라이게이션하였다.

<2> 새로운 효모 균주들의 생산

투-하이브리드 (two-hybrid) 시스템에서 일반적으로 사용하는 HF7c[ MATa, ura3-52, his3-200, lys2-801, ade2-101, trp1-901, leu2-3,112, gal4-542, gal80-538, cyhr2, LYS2::GAL1 _UAS -GAL1 _TATA -HIS3, URA3::GAL4 _17mer(×3) -CyC1 _TATA -lac Z ]와 476[ MATα, ura3-52, his3-200, lys2-801, ade1, ade2, trp1-901, leu2-3,112, gal4, gal80, URA3::GAL1-lac Z, lys2::GAL1-HIS3 ](genotype은 모두 이탤릭체로)균주의 URA3 유전자가 Gal4p에 의해 조절될 수 있도록 조작한다. 효모의 배양이나 형질 전환 방법은 기존의 보고에 의하여 실시하였다 (Cho et al., 1999. Analysis of the C-terminal region of Arabidopsis thaliana APETALA1 as a transcription activation domain. Plant Mol. Biol. 40: 419-429). HF7c의 경우, URA3 가운데 부분의 459 뉴클레오타이드가 절단된 돌연변이체 Δ ura3 를 HF7c 내로 도입시킨 후 0.1% 5-FOA (Diagnostic Chemical Limited)가 들어있는 최소 배지에서 3-4일 키워, 효모 내에서 상동 재조합(homologous recombination)에 의해 정상적인 URA3 이 파괴된 효모들만 자랄 수 있도록 한다. 얻어진 효모들을 다시 유라실(uracil)이 결핍된 SD 배지 (SD-Ura)에 점균 (streaking)하고 성장을 관찰하여 URA3 이 파괴되었음을 확인하였다. 이 균주들 내로 GAL1 프로모터의 조절을 받는 URA3 의 발현 플라스미드 (pGUA) 와 함께 pGBT9과 pY-AD (Cho et al., 1999. Analysis of the C-terminal region of Arabidopsis thaliana APETALA1 as a transcription activation domain.Plant Mol. Biol. 40: 419-429; Gal4p의 DNA 결합 부분과 전사활성부분이 결합되어 있는 플라스미드)을 각각 형질 전환한 후 Gal4p에 의존적으로 Ura3p가 발현 되는지도 확인하였다. 이 새로운 효모 균주를 PBN101(수탁번호:KCTC 10155BP; 수탁일:2002년 1월 5일; 수탁기관:유전자은행(KCTC))이라 하겠다.

한편, 476의 경우는 좀더 부위-지향적인 재조합 방법을 이용하였다. 효모 내의 URA3 코딩 부분 앞쪽에 GAL1 프로모터를 넣기 위해 효모내의 프로모터 (promoter) 끝부분과 URA3 coding 부분을 양끝으로 하고 geneticin (G418) 저항성 유전자(kan ^R )와 GAL1 프로모터가 사이에 들어있는 DNA 조각을 형질 전환하였다. 먼저 YEPD 배지에서 2일 동안 키운 후, 선택적 마커인 200㎍/ml의 G418(Calbiochem)과 0.08%의 5-FOA가 함유된 YEPD (YEPD+G418+FOA)로 리플리카를 만들어 옮기고 (replica-plating) 다시 2일 후 새로운 동일 배지로 한번 더 옮겨 주어 안정적으로 재조합이 일어난 효모만을 얻는다. 앞에서와 마찬가지로 SD-Ura에서 URA3 의 발현이 중단되었음을 확인하였고, pGBT9과 pY-AD를 이용하여 Gal4p 의존적인 URA3 의 발현도 확인하였다. 이 새로운 효모 균주를 PBN201(수탁번호:KCTC 10156; 수탁일:2002년 1월 5일; 수탁기관: 유전자은행(KCTC))이라 하겠다.

<3> 가짜 양성 반응을 제거하기 위한 5-FOA 농도의 결정

라이브러리를 DLTS에 적용하였을 때에 쉽게 일어날 수 있는 가짜 양성 반응을 나타내는 효모 콜로니들을 단백질 결합 검색 전에 미리 제거할 수 있는 적절한 5-FOA의 농도 조건을 확립한다. DNA-결합 도메인이 결합된 라이브러리가 효모 내에서 일으키는 가짜 양성 반응을 제거하기 위해서, 베이트 (bait) 벡터인 pGBT9에 클로닝 된, 이미 알려진 여러 전사활성 인자들을 PBN101(위에서와 같이 조작된 HF7c) 균주에 형질 전환 한 후, 특정 농도의 5-FOA를 처리하였을 때, 베이트 (bait) 벡터로 형질 전환된 효모는 잘 자라게 하고 전사활성 인자를 가진 경우에는 죽일 수 있는 조건을 찾아낸다. 이미 알려진 전사활성 인자로는 Gal4p의 전사 활성 도메인을 코딩하는 pY-AD, OsMADS1의 CI과 CII 도메인을 코딩하는 pGBT9-OsMADS1 CI과 pGBT9-OsMADS1 CII (Lim et al., 2000. Two rice MADS domain proteins interact with OsMADS1. Plant Mol Biol. 44:513-27)을 이용하였고, pGBT9 자체도 형질 전환하였다. 모든 경우에 있어서, pGUA를 함께 형질 전환(co-transformation) 하였다. 이들을 0~0.1% 범위 내 여러 농도의 5-FOA가 함유된 SD -Ade, -Trp 배지에서 3-5일 정도 키우면서 성장정도를 관찰하였다. 5-FOA의 여러 농도 중에서 pGBT9이 형질 전환된 효모만 살 수 있게 하고, 나머지 전사조절 인자들이 형질 전환된 것들은 모두 죽이는 5-FOA의 농도를 찾아낸다.

한편, 전사 활성 도메인이 결합된 라이브러리가 단독으로 형질 전환된 경우에 나타나는 가짜 양성반응을 제거하기 위해서는, 이미 보고된 바 있는 단백질 결합 쌍들을 이용하였다 (Kim et al., 2000. Protein-Protein Interaction among hnRNPs Shuttling between Nucleus and Cytoplasm. J. Mol. Biol. 298: 395-405). 강한 결합을 나타내는 단백질 쌍인 BD-hnRNP C1과 AD-hnRNP C1을 코딩하는 pGBT9-hnRNP C1과 pGAD424-hnRNP C1, 약한 결합을 나타내는 단백질 쌍인 BD-hnRNP A1과 AD-hnRNP A1을 코딩하는 pGBT9-hnRNP A1과 pGAD424-hnRNP A1, 그리고 결합을 나타내지 않는 pGBT9과 pGAD424를 각각 쌍으로 PBN201 (조작된 476) 균주 내로 형질 전환 (co-transformation)한 다음, 0~0.2% 범위 내 여러 농도의 5-FOA가 함유된 SD -Ade, -Leu 배지에서 3-5일간 키운다. PBN101의 경우와 마찬가지로 pGBT9과 pGAD424 (Clontech)가 함께 형질 전환된 경우만 살고, 나머지 강하거나 약한 결합이 존재하는 경우에는 죽는 5-FOA의 농도를 찾아낸다.

<4> 가짜 양성 반응의 제거

라이브러리 대 라이브러리 수준의 본격적인 단백질 결합의 스크리닝에 앞서, 기존에 규명된 여러 가지 단백질 쌍들을 이용하여 DLTS를 수행해 보았다. PBN101 균주에 pGUA 플라스미드 50㎍과 함께 8.3㎍씩의 pGBT9-hnRNP A1, pGBT9-hnRNP E2, pGBT9-hnRNP C1, 그리고, 가짜 양성 반응을 일으킬 수 있는 전사 활성인자 [Arabidopsis thaliana 의 전사활성 단백질 APETALA1의 C 말단 부위(193-256아미노산), Cho et al., 1999. Analysis of the C-terminal region of Arabidopsis thaliana APETALA1 as a transcription activation domain. Plant Mol. Biol. 40: 419-429]와 Gal4p의 DNA 결합 부위가 결합된 하이브리드 단백질을 만드는 pY-AP1(193-256) 25㎍을 혼합하여 형질 전환하였다. PBN201 균주에는 8.3㎍ 씩의 pGAD424-hnRNP A1, pGAD424-hnRNP E2, pGAD424-hnRNP C1, 그리고 이전의 투-하이브리드 (two-hybrid) 스크리닝에서 가짜 양성반응을 나타내었던 플라스미드(data not shown) 25㎍를 혼합하여 형질 전환하였는데, 선택적 마커가 ADE2 로 치환된 pGBT9 50㎍도 함께 형질 전환하였다. 형질 전환된 PBN101은 14장의 SD -Ade, -Trp에, 그리고 형질 전환된 PBN201은 14장의 SD -Ade, -Leu 배지에 60시간 정도 키운 후, 두 부분으로 나누어 한 부분은 5-FOA로 가짜 양성 반응을 제거해 주고, 나머지 한 부분은 12시간 정도 더 키운 후 가짜 양성 반응의 제거 없이 바로 메이팅(mating)한다. PBN101 형질 전환체의 경우, 0.06%의 5-FOA가 함유된 동일 배지로 옮겼고, PBN201 형질 전환체의 경우에는 0.14%의 5-FOA가 함유된 동일 배지로 옮긴 후 2일간 배양하였다. 이 과정에서 살아남은 콜로니들을 다시 5-FOA 가 결핍된 동일 배지로 옮기어 3일 동안 회복(recovery)되도록 하였다.

<5> 메이팅(mating)을 이용한 단백질 결합쌍의 검색

상기와 같이 실시한, 가짜 양성반응의 제거 후의 두 형질 전환 균주들을 각각 적당량의 액체 YEPD에서 4-5시간동안 30℃에서 배양한다. 두 배양액을 서로 섞어준 다음, Millipore HA filter (Millipore)로 아스퍼레이션(aspiration)하고, 효모가 묻어 있는 filter를 YEPD 배지 위에서 30℃로 배양해 메이팅(mating)이 일어나게 한다. 6시간 후, 물로 filter를 씻어내어 효모가 다 떨어지게 한 다음, 이들을 SD -Leu, -Trp, -His 배지에서 키워 단백질 결합이 있는 경우에만 자라 나오는 콜로니들을 얻고, 이 콜로니들을 이용하여 β-galactosidase assay로 lac Z 의 발현도 확인한다(Lim et al., 2000. Two rice MADS domain proteins interact with OsMADS1. Plant Mol Biol. 44:513-27). 단백질 결합을 나타내는 콜로니로부터 DNA 결합 도메인 쪽과 전사 활성 도메인쪽 플라스미드들을 각각 분리하고, 이들을 따로따로 혹은 함께 HF7c내에 형질 전환한 후 얻은 콜로니들로 β-galactosidase filter assay를 수행하여 위에서 얻은 단백질 결합쌍이 의미 있는 것임을 확인한다. 한편, 5-FOA에 의한 가짜 양성반응의 제거 과정이 생략된 부분도 같은 방법으로 진행하여 그 결과를 비교해 본다.

<6> 제한 효소 처리를 통한 결합 유전자 확인

최종적으로 단백질 결합쌍임이 밝혀진 플라스미드들을 제한 효소인 Pvu II와 Stu I으로 처리한다. 효소 처리후의 잘려진 패턴으로부터 플라스미드가 코딩하는 유전자의 정체를 알아내기 위해 pGBT9-hnRNP A1, -hnRNP E2, -hnRNP C1, pGAD424-hnRNP A1, -hnRNP E2, -hnRNP C1도 같은 방법으로 Pvu II와 Stu I을 처리하였다. 처리한 DNA를 0.8% agarose 젤을 이용하여 전기 영동한 후 그 패턴을 비교하였다.

상기한 재료 및 방법에 따라 실험하여 하기의 결론을 도출하게 되었고 이에 따른 확인 실험도 수행했다.

<7> DLTS에 필요한 효모 균주들의 제작과 시스템의 최적화

기존의 투-하이브리드 (two-hybrid) 시스템에서 이용되던 HF7c와 476은 Gal4p에 의존적으로 발현되는 HIS3 와 lac Z 리포터 유전자를 가지고 있지만, 가짜 양성반응 제거에 필수적인 URA3 유전자는 자체의 조절 기작에 의해 발현되고 있다. 라이브러리를 이용하여 DLTS를 수행할 때 나타날 수 있는 많은 가짜 양성 반응들을 URA3 의 발현을 이용하여 제거하기 위해서는, 이 유전자의 발현이 보통의 경우에는 중단되어 있고 Gal4p에만 의존적으로 일어나도록 조작할 필요가 있다. 이를 위해서, HF7c의 경우에는 절단된 ura3 (Δ ura3 ) 도막으로 효모를 형질 전환한 후, 5-FOA가 함유된 배지에서 키워 Δ ura3 로 치환된 효모들만 살아날 수 있도록 하였고[도 2의(A)], 476의 경우에는 부위-지향적 재조합을 유도하여 기존의 URA3 이 Gal4p에 의해 그 발현이 조절되도록 성공적으로 조작하였다[도2의 (B)]. HF7c 내로 Δ ura3 를 형질 전환한 후, 0.1% 5-FOA가 함유된 SC 배지에서 자라는 4개의 후보 콜로니들을 얻었고 이들 모두 SD-Ura에서는 자라지 못함이 확인되었으며, 이들 중 가장 성장정도가 좋은 후보를 선택하였다. 이 균주 내에 pGUA와 함께 pGBT9과 pY-AD를 형질 전환하였을 때, pGBT9 형질 전환 효모에서는 pGUA에 있는 URA3 의 발현이 일어나지 않으나, pY-AD로 형질 전환된 효모에서는 Gal4p DNA 결합 도메인과 전사활성 도메인에 의존적으로 URA3 이 발현됨을 알 수 있었다. 476 효모의 경우에는 효모 내의 URA3 유전자의 코딩 시작 부위와 그 상위 (upstream) 부분의 50개의 뉴클레오타이드를 양끝으로 하면서 선택적 마커인 kan ^R 와 GAL1 프로모터를 가지는 DNA 조각을 중합효소 연쇄반응 (PCR)에 의해 합성하였다. 따라서, 이 경우에는 근본적으로 발현되고 있는 URA3 의 코딩 시작 부위와 그 상위 부분 사이에 GAL1 프로모터가 정확히 끼어 들어가도록 함으로써 Ura3p의 발현을 Gal4p 의존적으로 변화시킬 수 있고, HF7c의 경우와는 달리 Ura3p의 유도를 위해 pGUA를 함께 형질 전환하지 않아도 된다는 장점이 있다. 476 효모에 이 DNA 조각을 형질 전환한 후 YEPD에서 2일 동안 배양하여 수많은 콜로니들을 얻었고, DNA 조각이 정확한 위치에 끼어 들어간 효모를 골라내기 위해서 G418과 5-FOA가 모두 함유된 YEPD로 옮겨서 50개 정도의 콜로니들을 얻었다. 이 중 일부를 새로운 동일 배지에 다시 옮겨서 안정적인 14개의 후보 콜로니들을 얻었으나, HF7c의 경우와 같이 SD-Ura에서 배양하였을 때에는 3개의 콜로니만 자라지 못함이 확인되었다. 또한, pGBT9와 pY-AD를 이 균주들에 형질 전환하여 Gal4p 의존적인 Ura3p 발현유도를 알아보았을 때에는 2개의 콜로니만이 적합하였고, 이 중 좀더 Ura3p 유도 정도가 강한 균주를 선택하였다. 이렇게 해서 얻어진 새 균주들을 각각 PBN101, PBN201으로 명명하였고, 위에서 확인한 이균주들의 특성을 도3에 나타내었다. 즉, PBN101과 PBN201에서는 ura3 의 발현이 일어나지 않아 5-FOA가 함유된 배지에서는 잘 자라지만 [도 3의 (A)], SD-Ura에서는 자라지 못하고 있음을 나타내고 있으며[도 3의 (B)], PBN101과 PBN201이 Gal4p 활성이 있을 경우에만 URA3 를 발현하는 Gal4p 의존적인 양상을 유라실이 없는 배지 [도 3의 (C)]와 5-FOA가 포함된 배지 [도 3의 (D)]에서의 증식 결과로 보여줌을 알 수 있다.

이 균주들을 각각 베이트 (bait)와 프레이 (prey) 라이브러리들만으로 형질 전환하고 5-FOA를 더해주면, 가짜 양성 반응에 의해서 Ura3p가 발현되는 효모는 자라지 못하므로 효과적으로 가짜 양성반응을 일으키는 라이브러리들이 제거될 수 있다. 그러나, 너무 높은 농도의 5-FOA가 더해지면 효모 균주 자체도 잘 자라지 못하게 되므로, 가짜 양성반응이 일어나는 효모와 그렇지 않은 효모를 잘 구분하여 제거할 수 있는 적절한 농도의 5-FOA를 처리하는 것이 필수적이다. 즉, 효율적으로 가짜 양성반응을 제거하면서도 형질 전환된 라이브러리들의 다양성의 감소는 최소화하는 5-FOA의 농도가 결정되고, 그 세부과정이 최적화 되어야 한다. 이를 위해서 두 균주들을 임의로 양성반응을 일으킬 수 있는 플라스미드들로 형질 전환한 후, 이러한 효모들은 죽이면서 양성반응을 일으키지 않는 효모들은 자라게 하는 5-FOA의 농도를 찾아야 한다. DNA 결합 도메인이 결합된 베이트 (bait) 라이브러리가 효모 내에서 가짜 양성 반응을 일으킬 수 있는 경우는 DNA 결합 도메인 뒤에 어떤 전사 활성인자를 가진 조각이 결합되었을 경우이므로, PBN101에는 DNA 결합 도메인과 결합된 여러 전사 활성인자의 DNA가 pGUA와 함께 형질 전환되었다. 강한 전사 활성인자인 Gal4p의 전사 활성 도메인과 이전에 보고된 바 있는 OsMADS1의 CI과 다소 약한 CII 도메인 , 그리고 DNA 결합 도메인만 존재하는 경우가 테스트되었다. PBN101 균주 자체도 0.1%보다 높은 5-FOA농도에서는 잘 자라지 못하므로, 위의 형질 전환 효모들을 0.02%, 0.04%, 0,06%, 0.08%, 0.1% 농도의 5-FOA가 함유된 배지에서 키워 그 자라는 정도를 관찰하였다. 이 중 0.06%의 FOA에서 DNA 결합 도메인만이 형질 전환된 경우 (도 4의 (A) 중의 BD) 엔 잘 자라지만 나머지 강하거나 약한 전사 활성인자들이 형질 전환된 경우 (도 4의 (A) 중의 BD-AD, BD-CI, 그리고 BD-CII) 에는 모두 자라지 못했으므로 적당한 5-FOA의 농도는 0.06%임이 결정되었다 [도4의 (A)].

한편, PBN201에는 라이브러리가 전사 활성 도메인과 결합되어 있으므로 베이트 (bait) 라이브러리에서와 다른 기작으로 가짜 양성 반응이 일어날 가능성이 높다. 따라서, 기존의 보고된 단백질 결합쌍들을 형질 전환하여 양성 반응이 일어나도록 한 다음에 이 효모들만 선택적으로 제거할 수 있는 5-FOA의 농도를 찾아내려고 하였다. 양성 반응이 일어나지 않는 pGBT9과 pGAD424, 다소 약한 결합을 나타내는 pGBT9-hnRNP A1과 pGAD424-hnRNP A1, 중간 정도의 결합을 나타내는 pGBT9-hnRNP E2과 pGAD424-hnRNP E2, 그리고 강한 결합을 나타내는 pGBT9-hnRNP C1과 pGAD424-hnRNP C1의 DNA들로 각각 형질 전환하였다. PBN201 균주 자체는 PBN101의 경우보다 더 높은 농도의 5-FOA에서도 잘 자람이 확인되었으므로 0.1%~0.2%의 농도의 범위에서 0.02% 차이를 두어 만들어진 배지에서 형질 전환 효모를 키워 자라는 정도를 관찰하였다. 이 중 0.14% 5-FOA가 함유된 배지에서 벡터들로 형질 전환된 효모들 (도4의 (B) 중의 BD+AD)만 자랄 수 있고, pGBT9-hnRNP A1와 pGAD424-hnRNP A1이 함께 형질 전환된 효모들 (도 4의 (B) 중의 A1+A1)은 자라지 못했으므로 5-FOA의 적정농도는 0.14%로 결정되었다 [도4의 (B)].

DLTS를 수행함에 있어, 베이트 (bait)와 프레이 (prey) 라이브러리로 각각의 균주를 형질 전환하고 위와 같이 결정된 5-FOA농도에서 가짜 양성반응을 제거하고 난 후에 살아남은 효모들을 서로 메이팅(mating) 시키게 되면 비로소 베이트 (bait)와 프레이 (prey) 라이브러리가 한 효모 내에 있게 되고 이들간의 단백질 결합쌍들이 리포터의 발현을 일으켜 새로이 양성 반응을 나타내게 된다. 이 때, 메이팅(mating)된 2배체들의 성장이나 단백질 결합쌍에 의해 나타나는 양성 반응 (real positive)이 5-FOA를 이용한 이전의 제거과정에 의해 영향을 받지 않도록, 메이팅(mating) 이전에 살아남은 효모들은 5-FOA가 없는 배지에서 충분히 키워서 회복되도록 해야 한다.

<8> 여러 단백질 결합쌍들을 이용한 DLTS 수행

본격적으로 라이브러리 수준에서 단백질들간의 결합쌍을 규명하기 전에, 이미 알려진 단백질 결합쌍들로 DLTS를 수행하였다 (도5). 이 때, 가짜 양성 반응을 보이는 단백질의 존재 하에 가운데에서 단백질 결합쌍에 의한 양성 반응만을 효과적으로 검색할 수 있는가를 확인하기 위해서 이미 가짜 양성반응을 나타냄이 확인된 DNA를 다량 섞어준 상태에서 DLTS를 수행하였고, 가짜 양성반응 제거과정을 생략한 동일한 실험군의 경우와 최종 결과를 비교하였다. 즉, PBN101에는 DNA 결합 도메인과 결합된 hnRNP A1, hnRNP E2, hnRNP C1을 형질 전환할 DNA의 50%으로 하고, 이미 보고된 전사 활성 도메인인 pY-AP1(193-256)의 DNA를 나머지 50%로 섞어서 같이 형질 전환하였다. PBN201에는 전사 활성 도메인과 결합된 hnRNP A1, hnRNP E2, hnRNP C1을 50%로 하고, 기존의 투-하이브리드 (two-hybrid) 스크리닝에서 프레이 (prey) 쪽의 가짜 양성 반응으로 밝혀진 DNA를 나머지로 섞어서 형질 전환하였다. 이 효모들을 0.06%와 0.14%의 5-FOA가 함유된 배지로 옮겨 가짜 양성 반응이 제거되도록 하였고, 일부 실험 군은 이 과정을 생략하였다. 가짜 양성 반응의 제거 후 충분한 회복 과정을 거친 효모들을 서로 메이팅(mating)하고 SD -Leu, -Trp, -His에서 키운 결과, HIS3 를 발현하는 148개의 효모 콜로니들을 얻었으며, 그 중 102개의 콜로니들이 또 다른 리포터인 β-galactosidase를 발현하는 것으로 나타났다. 이들 중 임의로 20개의 콜로니들을 선택하고 플라스미드를 꺼내어 그 양성 반응이 가짜인지 혹은 단백질 결합쌍에 의해 나타난 것인지를 확인한 결과, 9개의 후보 콜로니만이 단백질 결합쌍에 의한 것이었다 (표 1).

상기 9개의 콜로니로부터 단백질 결합쌍의 정체를 규명하기 위해서 제한 효소에 의한 절단 패턴을 이용하였다. 단백질 결합쌍들은 hnRNP A1-hnRNP A1, hnRNP E2-hnRNP E2, 혹은 hnRNP C1-hnRNP C1 일 것으로 예상하므로, 단백질 결합쌍을 가지고 있는 콜로니들로부터 베이트 (bait)와 프레이 (prey) 쪽의 플라스미드를 각각 분리한 후 이들을 서로 구별할 수 있는 제한 효소인 Pvu II와 Stu I로 처리하여 그 패턴을 비교함으로써 단백질 결합쌍들의 정체를 규명하였다. 그 결과 대부분이 가장 강한 결합을 나타내는 hnRNP C1-hnRNP C1사이의 결합으로 밝혀졌다. 한편, 가짜 양성 반응 제거과정을 생략한 실험 군으로부터는 약 900개의 HIS3 발현 콜로니들을 얻었고, 이들 중 대부분이 β-galactosidase를 발현하는 것으로 나타났다. 그러나, 임의로 20개의 콜로니들을 선택하여 가짜 양성반응의 여부를 조사한 결과 19개가 가짜 양성 반응인 것으로 나타나, DLTS에서의 가짜 양성반응을 제거하는 과정은 라이브러리 대 라이브러리의 결합검색을 더욱 효율적으로 수행할 수 있도록 해 주는 필수적인 과정으로 보여졌다 (표 1). 비록, 5-FOA를 이용하여 가짜 양성반응을 제거한 실험 군에서도 55%의 가짜 양성반응이 나타났지만, 형질 전환시 인위적으로 상당히 많은 양 (전체 DNA의 50%)의 가짜 양성반응 DNA를 넣어주었음을 감안하면 효과적인 제거라고 할 수 있고, 필요에 따라서는 제거과정을 반복적으로 수행하여 결과를 개선할 수도 있을 것이다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 단일 단백질이 아닌, 라이브러리 수준의 단백질들의 결합 쌍들을 동시에 효율적으로 검색하기 위한 시스템을 제공할 수 있다.