一种新型生物絮团及应用和利用其标粗凡纳滨对虾的方法
阅读：31发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种新型生物絮团及应用和利用其标粗凡纳滨对虾的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种新型 生物 絮团，所述生物絮团包括微藻团聚体和共栖异养菌，所述共栖异养菌为假单胞菌属细菌(Pesudomonas sp.)和芽孢杆菌属细菌(Bacillus sp.)。本生物絮团显著改善了凡纳滨对虾标粗池塘的 水 质，提高了对虾的成活率、生长指标和免疫 力 ，同时减少了配合 饲料 和外加 碳 源的施用量，降低了曝气强度和换水量。，下面是一种新型生物絮团及应用和利用其标粗凡纳滨对虾的方法专利的具体信息内容。
1.一种新型生物絮团，其特征在于：所述生物絮团包括微藻团聚体和共栖异养菌，所述共栖异养菌为假单胞菌属细菌(Pesudomonas sp.)和芽孢杆菌属细菌(Bacillus sp.)。
2.根据权利要求1所述的新型生物絮团，其特征在于：所述共栖异养菌的制备步骤如下：
共栖异养菌的培养：严格按照无菌操作要求，用接种环从固体2216E培养基上刮取假单胞菌属细菌、芽孢杆菌属细菌的菌苔，分别接入液态2216E培养基中，30℃，160r/min的条件下培养36h制备种子液，分别得假单胞菌属细菌种子液、芽孢杆菌属细菌种子液。
3.根据权利要求2所述的新型生物絮团，其特征在于：当假单胞菌属细菌、芽孢杆菌属细菌与普通小球藻共培养时，当细菌密度≤5×106CFU/mL时，能够显著促进小球藻叶绿素a合成，并能减轻微藻细胞膜质过氧化损伤；当假单胞菌属细菌、芽孢杆菌属细菌与雨生红球藻共培养时，当细菌密度≤1×107CFU/mL时，微藻生长不会受到影响；当假单胞菌属细菌、
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芽孢杆菌属细菌与威氏海链藻共培养时，当细菌密度≤6×10CFU/mL时，微藻生长受到明显促进。
4.根据权利要求1所述的新型生物絮团，其特征在于：所述假单胞菌属细菌为W-TJ01，所述芽孢杆菌属细菌为Z-QS01，假单胞菌W-TJ01在生长过程中能够产生鼠李糖，促进微藻和细菌絮凝。
5.根据权利要求1至4任一项所述的新型生物絮团，其特征在于：所述微藻团聚体的制备步骤如下：
⑴絮团微藻的筛选
筛选出绿藻门的普通小球藻(Chlorella vulgaris)/亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)和硅藻门的威氏海链藻(Thalassiosira weissflogii)作为絮团微藻；
普通小球藻或亚心形扁藻的培养：采用f/2培养基，盐度25，培养温度23±1℃，光暗比
12hL：12hD，光照强度为60μmol/m2·s，培养期间每天摇晃培养瓶六次；
雨生红球藻的培养：采用BBM培养基，培养温度22±1℃，光暗比12hL：12hD，光照强度为
60μmol/m2·s，将雨生红球藻培养至对数生长期末得到种子液；用NaNO3浓度为0.03mol/L、NaCl浓度为0.3mol/L的低氮高盐BBM培养基将种子液稀释至5×105cells/mL，培养温度设定为22±1℃，光暗比为12hL：12hD，光照强度为200μmol/m2·s，当培养液在490nm波长下的吸光度OD490不发生显著改变时收集微藻细胞；
威氏海链藻的培养：采用f/2培养基，盐度30，培养温度22±1℃，光暗比12hL﹕12hD，光照强度60μmol/m2·s，培养期间每天摇晃培养瓶六次；
⑵微藻团聚体的制备与成型粒径的控制
①将步骤⑴的普通小球藻/亚心形扁藻、雨生红球藻和硅藻门的威氏海链藻混合后在
2000r/min条件下离心15min后，弃去上清，收集得到浓缩藻液，浓缩藻液与质量浓度2％的谷氨酰胺转氨酶液按1:3的体积比混合，并漩涡震荡1小时，得混合物，备好待用；
②用水配制质量浓度为0.1％-1％的褐藻胶，备用；
③用水配制质量浓度为5％的氯化钙溶液，备用；
④将步骤⑵①中混合物与步骤⑵②中褐藻胶按体积比1:1混合在一起，得混合物；
⑤将步骤⑵④中混合物用滴管向步骤⑵③中氯化钙溶液中逐滴滴加，即可得到微球状的微藻团聚体。
6.根据权利要求5所述的新型生物絮团，其特征在于：所述步骤⑵中微藻团聚体与质量浓度1％-9％的柠檬酸钠溶液混合，得到平均粒径0.30-0.94mm的微球，整个过程在室温下进行，制备出的微球内含有质量浓度63％-87％的活藻细胞。
7.根据权利要求5或6所述的新型生物絮团，其特征在于：所述微球的具体制备如下：
8.如权利要求1至7任一项所述的新型生物絮团在凡纳滨对虾标粗中的应用。
9.一种利用如权利要求1至7任一项所述的新型生物絮团标粗凡纳滨对虾的方法，其特征在于：步骤如下：
⑴苗种选择：选择经过检疫合格的凡纳滨对虾F1代虾苗，肉眼观测大小整齐，体长
0.8cm-1cm，虾苗活泼健壮，溯水能力强，体色透明不发红，肝心区呈黑褐色，肠道饱满；取虾苗试水1-2天，成活率≥95％进行正式标粗；
⑵池塘整备与絮团培养：放苗前清塘消毒，然后将池塘注入过滤海水并消毒，水深控制在0.5-0.7m，全池泼洒对虾配合饲料和碳源物质——糖蜜，调节水体C/N在12-15；每天向池塘接种微藻团聚体、假单胞菌属细菌和芽孢杆菌属细菌，其中微藻团聚体接种密度为20-30粒/mL，每粒微藻团聚体内含普通小球藻细胞/亚心形扁藻密度为5×104cells/mL-1×
105cells/mL，雨生红球藻和威氏海链藻均为5×104cells/mL-2×105cells/mL，当每粒微藻团聚体内含普通小球藻细胞时，假单胞菌属细菌和芽孢杆菌属细菌的接种密度分别为1×
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10CFU/mL-3×10CFU/mL和2×10CFU/mL-5×10CFU/mL，当每粒微藻团聚体内含亚心形扁藻时，假单胞菌属细菌和芽孢杆菌属细菌的接种密度均在5×106CFU/mL以内；养殖环境中需要进行曝气，使水中逐渐形成生物絮团，此后减少配合饲料用量；每天测定水中生物絮团含量，根据实际情况去除过剩絮团，维持絮团浓度在9-16mL/L，并根据絮团存量决定糖蜜施用量和投饵量；
⑶标粗：放苗密度控制在200-400尾/m2，日投饲量为对虾体重的10％-15％，根据水色和虾苗密度日投饲4-8次；虾苗入池当天投喂粒径0.27±0.07mm的标粗专用料，5天后换粒径
0.37±0.07mm的标粗专用料，再过10天投喂粒径0.60±0.15mm的标粗专用料，3天后换粒径
0.85±0.10mm的标粗专用料，直至标粗结束，整个过程持续25天；然后进行曝气，并根据池塘水色、载虾量和天气情况确定曝气时长，日换水量控制在10％-33.33％；全程将水温控制在25-28℃，pH 7.8-8.5，DO≥5mg/L，氨氮和亚硝酸盐浓度≤1mg/L，水体总碱度维持在140-
160mg/L，透明度保持在0.3-0.4m，水中弧菌密度控制在5000CFU/L以内；每天监测水温、盐度、pH、OD、总碱度、氨氮浓度和亚硝酸盐浓度变化；另外，标粗阶段注意遮光；
在标粗养殖过程中，注意所投放的微藻团聚体粒径须与相应阶段标粗专用料粒径一致，精准适应对虾摄食需求。
10.根据权利要求5所述的利用新型生物絮团标粗凡纳滨对虾的方法，其特征在于：所述步骤⑵中使用英霍夫锥形管测定水中生物絮团含量，使用沉淀桶去除过剩絮团；或者，所述步骤⑵中养殖环境为养殖箱时，养殖箱内使用纳米管进行曝气，养殖环境为养殖池时，养殖池塘使用鼓风机+PVC管进行曝气。
一种新型生物絮团及应用和利用其标粗凡纳滨对虾的方法
技术领域
[0001] 本发明属于农业技术领域，尤其是一种新型生物絮团及应用和利用其标粗凡纳滨对虾的方法。
背景技术
[0002] 1999年，以色列科学家Avnimelech首次提出生物絮团技术(Biofloc Technology，BFT)在水产养殖领域的应用，经过近二十年的发展BFT已成为水产养殖过程(尤其是甲壳类养殖)中常用的环境调控技术。BFT的应用要点在于通过人工添加碳源以调节水体的C/N，从而促进水中的益生菌(如芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌、硝化细菌等)、微藻和原生动物等形成絮团，然后利用絮团生物去除水体中的氮磷营养盐和过量有机物，并转化为菌体/藻体蛋白，进而成为养殖动物的优质饵料，既改善了水质又促进了水中营养物质的循环利用，进而提高养殖产量和经济效益。
[0003] 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是我国最重要的经济虾类，2018年养殖总产量为111.75万吨，占全世界产量的31.71％，居全球首位。近年来随着养殖规模和集约化程度的提高，水体环境恶化、病害频发、种质资源退化等问题突出，严重制约了凡纳滨对虾养殖产业的可持续发展。目前虽然生物絮团技术在凡纳滨对虾养殖中得到了广泛应用，但是仍然存在一系列问题：1.传统生物絮团的核心组分是异养细菌，适合其生长繁殖的C/N在10以上，但是一般养殖池塘的C/N在4-5左右，远不能满足异养菌的生长需求，因此在实际应用中必须向池塘施加大量碳源物质促进异养菌生长繁殖，用量如果控制不当会造成水体富营养化和致病微生物孳生，使水质严重恶化，危及对虾正常生命活动；2.传统的生物絮团中微藻等光合放氧生物数量极少，异养细菌的大量繁殖会加重水体溶氧负荷导致水体溶氧亏缺，然后通过负反馈作用影响絮团生物的生命活动，大大削弱生物絮团的环境调控和饵料补充作用；3.养殖中后期含大量死亡菌体的生物絮团不断老化沉降，如果清理不及时会造成水体二次污染，而大量换水会造成对虾的胁迫应激，严重影响对虾生长甚至造成死亡，同时产生的养殖尾水又大大增加了环境负荷。
[0004] 微藻在生命活动过程中可以向周围环境分泌糖类、脂类、氨基酸、蛋白质/肽和有机酸等物质，能够为藻际共栖异养细菌所利用，而某些共栖细菌又通过自身生理代谢释放一些小分子物质，起到调节微藻生长的作用，由此微藻和异养细菌形成一种良性互动的共生关系。
[0006] 一种培养生物絮团的方法及在凡纳滨对虾养殖中的应用(CN 106754552 A)，公开了一种培养以异养细菌为主体的生物絮团的方法，并介绍了在凡纳滨对虾养殖中的应用实例。该技术中的生物絮团包括短小芽孢杆菌、嗜乳酸杆菌和季也蒙毕赤酵母；制备短小芽孢杆菌和嗜乳酸杆菌菌剂以及季也蒙毕赤酵母菌粉。通过每天在对虾养殖池塘泼洒短小芽孢杆菌和嗜乳酸杆菌菌剂以及季也蒙毕赤酵母菌粉的方式，并在池塘四周中下层设置纳米曝气管曝气，形成絮团，然后调节养殖水体C/N在12-14左右，在实施例中初始体长3cm的凡纳滨对虾经过30天的养殖平均存活率为93％，平均体长5.5cm，平均体重2.48g。
[0007] 该公开文献中的生物絮团以异养细菌为主，系统运行过程需要大量施加碳源物质，用量把握不好极易造成水体富营养化，致使有害微生物大量孳生，同时加重水体溶氧负荷，而维持系统正常运行需要持续、高强度曝气，推高了养殖成本。凡纳滨对虾幼虾生长阶段偏好植物性饵料，该技术中以菌为主体的生物絮团起不到良好的饵料浓缩和食物补充作用，养殖过程中对虾配合饲料用量偏大。
[0008] 通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。
发明内容
[0009] 本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种新型生物絮团及应用和利用其标粗凡纳滨对虾的方法，该生物絮团显著改善了凡纳滨对虾标粗池塘的水质，提高了对虾的成活率、生长指标和免疫力，同时减少了配合饲料和外加碳源的施用量，降低了曝气强度和换水量。
[0010] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0011] 一种新型生物絮团，所述生物絮团包括微藻团聚体和共栖异养菌，所述共栖异养菌为假单胞菌属细菌(Pesudomonas sp.)和芽孢杆菌属细菌(Bacillus sp.)。
[0012] 而且，所述共栖异养菌的制备步骤如下：
[0013] 共栖异养菌的培养：严格按照无菌操作要求，用接种环从固体2216E培养基上刮取假单胞菌属细菌、芽孢杆菌属细菌的菌苔，分别接入液态2216E培养基中，30℃，160r/min的条件下培养36h制备种子液，分别得假单胞菌属细菌种子液、芽孢杆菌属细菌种子液。
[0014] 而且，当假单胞菌属细菌、芽孢杆菌属细菌与普通小球藻共培养时，当细菌密度≤5×106CFU/mL时，能够显著促进小球藻叶绿素a合成，并能减轻微藻细胞膜质过氧化损伤；
当假单胞菌属细菌、芽孢杆菌属细菌与雨生红球藻共培养时，当细菌密度≤1×107CFU/mL时，微藻生长不会受到影响；当假单胞菌属细菌、芽孢杆菌属细菌与威氏海链藻共培养时，当细菌密度≤6×106CFU/mL时，微藻生长受到明显促进。
当假单胞菌属细菌、芽孢杆菌属细菌与雨生红球藻共培养时，当细菌密度≤1×107CFU/mL时，微藻生长不会受到影响；当假单胞菌属细菌、芽孢杆菌属细菌与威氏海链藻共培养时，当细菌密度≤6×106CFU/mL时，微藻生长受到明显促进。
[0015] 而且，所述假单胞菌属细菌为W-TJ01，所述芽孢杆菌属细菌为Z-QS01，假单胞菌W-TJ01在生长过程中能够产生鼠李糖，促进微藻和细菌絮凝。
[0016] 而且，所述微藻团聚体的制备步骤如下：
[0017] ⑴絮团微藻的筛选
[0018] 筛选出绿藻门的普通小球藻(Chlorella vulgaris)/亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)和硅藻门的威氏海链藻(Thalassiosira weissflogii)作为絮团微藻；
[0020] 雨生红球藻的培养：采用BBM培养基，培养温度22±1℃，光暗比12hL：12hD，光照强度为60μmol/m2·s，将雨生红球藻培养至对数生长期末得到种子液；用NaNO3浓度为5
0.03mol/L、NaCl浓度为0.3mol/L的低氮高盐BBM培养基将种子液稀释至5×10cells/mL，培养温度设定为22±1℃，光暗比为12hL：12hD，光照强度为200μmol/m2·s，当培养液在
490nm波长下的吸光度OD490不发生显著改变时收集微藻细胞；
0.03mol/L、NaCl浓度为0.3mol/L的低氮高盐BBM培养基将种子液稀释至5×10cells/mL，培养温度设定为22±1℃，光暗比为12hL：12hD，光照强度为200μmol/m2·s，当培养液在
490nm波长下的吸光度OD490不发生显著改变时收集微藻细胞；
[0021] 威氏海链藻的培养：采用f/2培养基，盐度30，培养温度22±1℃，光暗比12hL﹕12hD，光照强度60μmol/m2·s，培养期间每天摇晃培养瓶六次；
[0022] ⑵微藻团聚体的制备与成型粒径的控制
[0023] ①将步骤⑴的普通小球藻/亚心形扁藻、雨生红球藻和硅藻门的威氏海链藻混合后在2000r/min条件下离心15min后，弃去上清，收集得到浓缩藻液，浓缩藻液与质量浓度2％的谷氨酰胺转氨酶液按1:3的体积比混合，并漩涡震荡1小时，得混合物，备好待用；
[0024] ②用水配制质量浓度为0.1％-1％的褐藻胶，备用；
[0025] ③用水配制质量浓度为5％的氯化钙溶液，备用；
[0026] ④将步骤⑵①中混合物与步骤⑵②中褐藻胶按体积比1:1混合在一起，得混合物；
[0027] ⑤将步骤⑵④中混合物用滴管向步骤⑵③中氯化钙溶液中逐滴滴加，即可得到微球状的微藻团聚体。
[0028] 而且，所述步骤⑵中微藻团聚体与质量浓度1％-9％的柠檬酸钠溶液混合，得到平均粒径0.30-0.94mm的微球，整个过程在室温下进行，制备出的微球内含有质量浓度63％-87％的活藻细胞。
[0029] 而且，所述微球的具体制备如下：
[0030]
[0031] 如上所述的新型生物絮团在凡纳滨对虾标粗中的应用。
[0032] 一种利用如上所述的新型生物絮团标粗凡纳滨对虾的方法，步骤如下：
[0033] ⑴苗种选择：选择经过检疫合格的凡纳滨对虾F1代虾苗，肉眼观测大小整齐，体长0.8cm-1cm，虾苗活泼健壮，溯水能力强，体色透明不发红，肝心区呈黑褐色，肠道饱满；取虾苗试水1-2天，成活率≥95％进行正式标粗；
[0034] ⑵池塘整备与絮团培养：放苗前清塘消毒，然后将池塘注入过滤海水并消毒，水深控制在0.5-0.7m，全池泼洒对虾配合饲料和碳源物质——糖蜜，调节水体C/N在12-15；每天向池塘接种微藻团聚体、假单胞菌属细菌和芽孢杆菌属细菌，其中微藻团聚体接种密度为4
20-30粒/mL，每粒微藻团聚体内含普通小球藻细胞/亚心形扁藻密度为5×10 cells/mL-1×105cells/mL，雨生红球藻和威氏海链藻均为5×104cells/mL-2×105cells/mL，当每粒微藻团聚体内含普通小球藻细胞时，假单胞菌属细菌和芽孢杆菌属细菌的接种密度分别为1×104CFU/mL-3×104CFU/mL和2×104CFU/mL-5×104CFU/mL，当每粒微藻团聚体内含亚心形
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扁藻时，假单胞菌属细菌和芽孢杆菌属细菌的接种密度均在5×10 CFU/mL以内；养殖环境中需要进行曝气，使水中逐渐形成生物絮团，此后减少配合饲料用量；每天测定水中生物絮团含量，根据实际情况去除过剩絮团，维持絮团浓度在9-16mL/L，并根据絮团存量决定糖蜜施用量和投饵量；
20-30粒/mL，每粒微藻团聚体内含普通小球藻细胞/亚心形扁藻密度为5×10 cells/mL-1×105cells/mL，雨生红球藻和威氏海链藻均为5×104cells/mL-2×105cells/mL，当每粒微藻团聚体内含普通小球藻细胞时，假单胞菌属细菌和芽孢杆菌属细菌的接种密度分别为1×104CFU/mL-3×104CFU/mL和2×104CFU/mL-5×104CFU/mL，当每粒微藻团聚体内含亚心形
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扁藻时，假单胞菌属细菌和芽孢杆菌属细菌的接种密度均在5×10 CFU/mL以内；养殖环境中需要进行曝气，使水中逐渐形成生物絮团，此后减少配合饲料用量；每天测定水中生物絮团含量，根据实际情况去除过剩絮团，维持絮团浓度在9-16mL/L，并根据絮团存量决定糖蜜施用量和投饵量；
[0035] ⑶标粗：放苗密度控制在200-400尾/m2，日投饲量为对虾体重的10％-15％，根据水色和虾苗密度日投饲4-8次；虾苗入池当天投喂粒径0.27±0.07mm的标粗专用料，5天后换粒径0.37±0.07mm的标粗专用料，再过10天投喂粒径0.60±0.15mm的标粗专用料，3天后换粒径0.85±0.10mm的标粗专用料，直至标粗结束，整个过程持续25天；然后进行曝气，并根据池塘水色、载虾量和天气情况确定曝气时长，日换水量控制在10％-33.33％；全程将水温控制在25-28℃，pH 7.8-8.5，DO≥5mg/L，氨氮和亚硝酸盐浓度≤1mg/L，水体总碱度维持在140-160mg/L，透明度保持在0.3-0.4m，水中弧菌密度控制在5000CFU/L以内；每天监测水温、盐度、pH、OD、总碱度、氨氮浓度和亚硝酸盐浓度变化；另外，标粗阶段注意遮光；
[0036] 在标粗养殖过程中，注意所投放的微藻团聚体粒径须与相应阶段标粗专用料粒径一致，精准适应对虾摄食需求。
[0037] 而且，所述步骤⑵中使用英霍夫锥形管测定水中生物絮团含量，使用沉淀桶去除过剩絮团；或者，所述步骤⑵中养殖环境为养殖箱时，养殖箱内使用纳米管进行曝气，养殖环境为养殖池时，养殖池塘使用鼓风机+PVC管进行曝气。本发明取得的优点和积极效果为：
[0038] 1、本发明生物絮团显著改善了凡纳滨对虾标粗池塘的水质，提高了对虾的成活率、生长指标和免疫力，同时减少了配合饲料和外加碳源的施用量，降低了曝气强度和换水量。
[0039] 2、本发明通过构建以自养微藻-异养细菌为核心的新型生物絮团，改善了凡纳滨对虾标粗池塘的环境，降低了曝气强度。通过粒径控制技术调节微藻团聚体尺寸，精准适应对虾摄食需求，取得了相比传统BFT更好的饵料补充和水质净化效果，而絮团中富含虾青素的雨生红球藻具有明显的免疫增强功能，显著提高了对虾的免疫力和抗病力。新型絮团的使用减少了人工配合饲料和外加碳源的投放，降低了水体富营养化和致病微生物孳生的风险。凡纳滨对虾苗经过25天的标粗，平均成活率达94.1％-97.2％，平均体长达5.66cm-5.82cm，平均体重达5.91-6.20g，显著高于对比例.。
[0040] 3、团聚体中的海洋微藻可以进行正常的生命活动，它们通过光合作用释放氧气，有助于改善养殖环境，降低曝气强度。微藻在生命活动过程中可以向周围环境分泌糖类、脂类、氨基酸、蛋白质/肽和有机酸等物质，能够为藻际共栖异养细菌所利用，而某些共栖细菌又通过自身生理代谢释放一些小分子物质，起到调节微藻生长的作用，由此微藻和异养细菌形成一种良性互动的共生关系。絮团内的微藻与细菌通过互利共生关系形成稳定的聚集体，降低了系统维持的物质、能量消耗，同时提升了饵料浓缩效果，而且团聚体的存在利于抱食性的凡纳滨对虾摄食，起到了良好的营养补充作用，显著提高了对虾的养殖成活率和生长指标，减少了配合饲料的使用，团聚体中的雨生红球藻富含虾青素，能够明显提升对虾的免疫力和抗病力。另外微藻也能吸收水中的营养盐以净化水质，减少了絮团中具有相似作用的异养细菌的接种量，进而降低了外加碳源的使用和发生水体富营养化的风险。
具体实施方式
[0041] 下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0042] 本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
[0043] 一种新型生物絮团，所述生物絮团包括微藻团聚体和共栖异养菌，所述共栖异养菌为假单胞菌属细菌(Pesudomonas sp.)和芽孢杆菌属细菌(Bacillus sp.)。
[0044] 较优地，所述共栖异养菌的制备步骤如下：
[0045] 共栖异养菌的培养：严格按照无菌操作要求，用接种环从固体2216E培养基上刮取假单胞菌属细菌、芽孢杆菌属细菌的菌苔，分别接入液态2216E培养基中，30℃，160r/min的条件下培养36h制备种子液，分别得假单胞菌属细菌种子液、芽孢杆菌属细菌种子液。
[0046] 较优地，当假单胞菌属细菌、芽孢杆菌属细菌与普通小球藻共培养时，当细菌密度≤5×106CFU/mL时，能够显著促进小球藻叶绿素a合成，并能减轻微藻细胞膜质过氧化损7
伤；当假单胞菌属细菌、芽孢杆菌属细菌与雨生红球藻共培养时，当细菌密度≤1×10CFU/mL时，微藻生长不会受到影响；当假单胞菌属细菌、芽孢杆菌属细菌与威氏海链藻共培养时，当细菌密度≤6×106CFU/mL时，微藻生长受到明显促进。
伤；当假单胞菌属细菌、芽孢杆菌属细菌与雨生红球藻共培养时，当细菌密度≤1×10CFU/mL时，微藻生长不会受到影响；当假单胞菌属细菌、芽孢杆菌属细菌与威氏海链藻共培养时，当细菌密度≤6×106CFU/mL时，微藻生长受到明显促进。
[0047] 较优地，所述假单胞菌属细菌为W-TJ01，所述芽孢杆菌属细菌为Z-QS01，假单胞菌W-TJ01在生长过程中能够产生鼠李糖，促进微藻和细菌絮凝。
[0048] 较优地，所述微藻团聚体的制备步骤如下：
[0049] ⑴絮团微藻的筛选
[0050] 筛选出绿藻门的普通小球藻(Chlorella vulgaris)/亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)和硅藻门的威氏海链藻(Thalassiosira weissflogii)作为絮团微藻；
[0051] 普通小球藻或亚心形扁藻的培养：采用f/2培养基，盐度25，培养温度23±1℃，光暗比12hL：12hD，光照强度为60μmol/m2·s，培养期间每天摇晃培养瓶六次；
[0052] 雨生红球藻的培养：采用BBM培养基，培养温度22±1℃，光暗比12hL：12hD，光照强度为60μmol/m2·s，将雨生红球藻培养至对数生长期末得到种子液；用NaNO3浓度为0.03mol/L、NaCl浓度为0.3mol/L的低氮高盐BBM培养基将种子液稀释至5×105cells/mL，培养温度设定为22±1℃，光暗比为12hL：12hD，光照强度为200μmol/m2·s，当培养液在
490nm波长下的吸光度OD490不发生显著改变时收集微藻细胞；
490nm波长下的吸光度OD490不发生显著改变时收集微藻细胞；
[0053] 威氏海链藻的培养：采用f/2培养基，盐度30，培养温度22±1℃，光暗比12hL﹕12hD，光照强度60μmol/m2·s，培养期间每天摇晃培养瓶六次；
[0054] ⑵微藻团聚体的制备与成型粒径的控制
[0055] ①将步骤⑴的普通小球藻/亚心形扁藻、雨生红球藻和硅藻门的威氏海链藻混合后在2000r/min条件下离心15min后，弃去上清，收集得到浓缩藻液，浓缩藻液与质量浓度2％的谷氨酰胺转氨酶液按1:3的体积比混合，并漩涡震荡1小时，得混合物，备好待用；
[0056] ②用水配制质量浓度为0.1％-1％的褐藻胶，备用；
[0057] ③用水配制质量浓度为5％的氯化钙溶液，备用；
[0058] ④将步骤⑵①中混合物与步骤⑵②中褐藻胶按体积比1:1混合在一起，得混合物；
[0059] ⑤将步骤⑵④中混合物用滴管向步骤⑵③中氯化钙溶液中逐滴滴加，即可得到微球状的微藻团聚体。
[0060] 较优地，所述步骤⑵中微藻团聚体与质量浓度1％-9％的柠檬酸钠溶液混合，得到平均粒径0.30-0.94mm的微球，整个过程在室温下进行，制备出的微球内含有质量浓度63％-87％的活藻细胞。
[0061] 较优地，所述微球的具体制备如下：
[0062]
[0063] 如上所述的新型生物絮团在凡纳滨对虾标粗中的应用。
[0064] 一种利用如上所述的新型生物絮团标粗凡纳滨对虾的方法，步骤如下：
[0065] ⑴苗种选择：选择经过检疫合格的凡纳滨对虾F1代虾苗，肉眼观测大小整齐，体长0.8cm-1cm，虾苗活泼健壮，溯水能力强，体色透明不发红，肝心区呈黑褐色，肠道饱满；取虾苗试水1-2天，成活率≥95％进行正式标粗；
[0066] ⑵池塘整备与絮团培养：放苗前清塘消毒，然后将池塘注入过滤海水并消毒，水深控制在0.5-0.7m，全池泼洒对虾配合饲料和碳源物质——糖蜜，调节水体C/N在12-15；每天向池塘接种微藻团聚体、假单胞菌属细菌和芽孢杆菌属细菌，其中微藻团聚体接种密度为20-30粒/mL，每粒微藻团聚体内含普通小球藻细胞/亚心形扁藻密度为5×104cells/mL-1×105cells/mL，雨生红球藻和威氏海链藻均为5×104cells/mL-2×105cells/mL，当每粒微藻团聚体内含普通小球藻细胞时，假单胞菌属细菌和芽孢杆菌属细菌的接种密度分别为1×104CFU/mL-3×104CFU/mL和2×104CFU/mL-5×104CFU/mL，当每粒微藻团聚体内含亚心形扁藻时，假单胞菌属细菌和芽孢杆菌属细菌的接种密度均在5×106CFU/mL以内；养殖环境中需要进行曝气，使水中逐渐形成生物絮团，此后减少配合饲料用量；每天测定水中生物絮团含量，根据实际情况去除过剩絮团，维持絮团浓度在9-16mL/L，并根据絮团存量决定糖蜜施用量和投饵量；
[0067] ⑶标粗：放苗密度控制在200-400尾/m2，日投饲量为对虾体重的10％-15％，根据水色和虾苗密度日投饲4-8次；虾苗入池当天投喂粒径0.27±0.07mm的标粗专用料，5天后换粒径0.37±0.07mm的标粗专用料，再过10天投喂粒径0.60±0.15mm的标粗专用料，3天后换粒径0.85±0.10mm的标粗专用料，直至标粗结束，整个过程持续25天；然后进行曝气，并根据池塘水色、载虾量和天气情况确定曝气时长，日换水量控制在10％-33.33％；全程将水温控制在25-28℃，pH 7.8-8.5，DO≥5mg/L，氨氮和亚硝酸盐浓度≤1mg/L，水体总碱度维持在140-160mg/L，透明度保持在0.3-0.4m，水中弧菌密度控制在5000CFU/L以内；每天监测水温、盐度、pH、OD、总碱度、氨氮浓度和亚硝酸盐浓度变化；另外，标粗阶段注意遮光；
[0068] 在标粗养殖过程中，注意所投放的微藻团聚体粒径须与相应阶段标粗专用料粒径一致，精准适应对虾摄食需求。
[0069] 较优地，所述步骤⑵中使用英霍夫锥形管测定水中生物絮团含量，使用沉淀桶去除过剩絮团；或者，所述步骤⑵中养殖环境为养殖箱时，养殖箱内使用纳米管进行曝气，养殖环境为养殖池时，养殖池塘使用鼓风机+PVC管进行曝气。
[0070] 具体地，相关步骤如下：
[0071] 一、絮团微藻和共栖细菌的筛选
[0072] 凡纳滨对虾养殖的最佳水色是由绿藻和硅藻形成的黄绿色和黄褐色。在实验室内通过对虾摄食的适口性实验筛选出绿藻门的普通小球藻(Chlorella vulgaris)、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)和硅藻门的威氏海链藻(Thalassiosira weissflogii)作为絮团微藻。
[0073] 普通小球藻培养方法：采用f/2培养基，盐度25‰，培养温度23±1℃，光暗比12hL：12hD，光照强度为60μmol/m2·s。培养期间定时摇晃培养瓶，以防微藻细胞附壁、下沉。
[0074] 雨生红球藻培养方法：采用BBM培养基，培养温度22±1℃，光暗比12hL：12hD，光照强度为60μmol/m2·s，将雨生红球藻培养至对数生长期末得到种子液。用NaNO3浓度为5
0.03mol/L、NaCl浓度为0.3mol/L的低氮高盐BBM培养基将种子液稀释至5×10cells/mL，培养温度设定为22±1℃，光暗比为12hL：12hD，光照强度为200μmol/m2·s，当培养液在
490nm波长下的吸光度OD490不发生显著改变时收集微藻细胞。
0.03mol/L、NaCl浓度为0.3mol/L的低氮高盐BBM培养基将种子液稀释至5×10cells/mL，培养温度设定为22±1℃，光暗比为12hL：12hD，光照强度为200μmol/m2·s，当培养液在
490nm波长下的吸光度OD490不发生显著改变时收集微藻细胞。
[0075] 威氏海链藻培养方法：采用f/2培养基，盐度30‰，培养温度22±1℃，光暗比12hL﹕2
12hD，光照强度60μmol/m·s。培养期间定时摇晃培养瓶，以防微藻细胞附壁、下沉。
12hD，光照强度60μmol/m·s。培养期间定时摇晃培养瓶，以防微藻细胞附壁、下沉。
[0076] 从实验室培养的普通小球藻藻际环境中分离出两株共生异养细菌，经鉴定分别为假单胞菌属细菌(W-TJ01)和芽孢杆菌属细菌(Z-QS01)。两株细菌与普通小球藻的共培养试验表明，当细菌密度≤5×106CFU/mL时，可以显著促进小球藻叶绿素a合成，并能较好地减轻微藻细胞膜质过氧化损伤。两株细菌与雨生红球藻的共培养试验表明，当细菌密度≤1×107CFU/mL时，微藻生长不会受到明显影响。两株细菌与威氏海链藻的共培养试验表明，当细菌密度≤6×106CFU/mL时，微藻生长受到明显促进。另外假单胞菌W-TJ01在生长过程中可以产生鼠李糖，能够促进微藻和细菌絮凝。
[0077] 共栖异养菌培养方法：严格按照无菌操作要求，用接种环从固体2216E培养基上刮取适量菌苔，接入已经装有液态2216E培养基的三角瓶中，在摇床(30℃，160r/min)上培养制备种子液，然后不断进行继代培养扩大细菌生物量。
[0078] 二、微藻团聚体制备与成型粒径控制方法
[0079] TGase是一种硫醇酶，能够促进蛋白质分子内(间)和蛋白质与氨基酸的交联，目前在食品加工领域得到广泛应用。本发明正是利用TGase催化交联法将微藻悬液制备成团聚体。由于TGase催化“谷氨酰胺残基的γ-酰胺基+赖氨酸的ε-氨基→ε-(γ-谷酰胺)-赖氨酸的异型肽键”的反应在微藻种内和种间均可发生，因此该方法可作为一种通用的微藻团聚体制备方法。
[0080] 微藻团聚体制备与成型粒径控制：
[0081] (1)备好三个干净烧杯并标号1、2、3；(2)将前述的微藻培养在2000r/min条件下离心15min后，弃去上清，收集得到浓缩藻液，藻液与质量浓度2％的谷氨酰胺转氨酶液按1:3的体积比快速加入1号烧杯，并漩涡震荡1小时，备好待用；(3)2号烧杯配制质量浓度为0.1％-1％的褐藻胶备用；(4)3号烧杯配制质量浓度为5％的氯化钙溶液备用；(5)将AB胶(玻璃胶)管两个空腔分别标注甲和乙(体积比1:1)，然后向甲中注入备好的1号烧杯混合物，向乙中注入2号烧杯配制的褐藻胶；(6)将AB胶管甲、乙空腔的内容物混合，然后用滴管向3号烧杯逐滴滴加，即可得到微球状的微藻团聚体。
[0082] 将得到的微藻团聚体溶液与质量浓度1％-9％的柠檬酸钠溶液按一定体积比(v:v)混合，可以得到平均粒径0.31-0.87mm的微球(表1)。A、B、C和D的平均粒径分别对应对虾
0﹟标粗专用料(粒径0.27±0.07mm)、1﹟标粗专用料(粒径0.37±0.07mm)，2﹟标粗专用料(粒径0.60±0.15mm)和3﹟标粗专用料(粒径0.85±0.10mm)。
0﹟标粗专用料(粒径0.27±0.07mm)、1﹟标粗专用料(粒径0.37±0.07mm)，2﹟标粗专用料(粒径0.60±0.15mm)和3﹟标粗专用料(粒径0.85±0.10mm)。
[0083] 表1不同粒径微藻团聚体制备条件
[0084]
[0085]
[0086] 整个过程在室温下进行，制备出的微藻团聚体内大约含有63％-87％的活藻细胞。
[0087] 三、新型生物絮团的培养及在凡纳滨对虾标粗中的应用
[0088] 苗种选择：选择经过检疫合格的凡纳滨对虾F1代虾苗，肉眼观测大小整齐，体长0.8cm-1cm，虾苗活泼健壮，溯水能力强，体色透明不发红，肝心区呈黑褐色，肠道饱满。取虾苗试水1-2天，成活率≥95％才可进行正式标粗。
[0089] 池塘整备与絮团培养：放苗前清塘消毒，然后将池塘注入过滤海水并消毒，水深控制在0.5-0.7m，全池泼洒对虾配合饲料和碳源物质——糖蜜，调节水体C/N在12-15左右。每天向池塘接种混合微藻团聚体颗粒、W-TJ01和Z-QS01菌液，其中混合微藻团聚体接种密度为20-30粒/mL(内含普通小球藻细胞密度为5×104cells/mL-1×105cells/mL，雨生红球藻和威氏海链藻均为5×104cells/mL-2×105cells/mL)，W-TJ01和Z-QS01接种密度分别为1×104CFU/mL-3×104CFU/mL和2×104CFU/mL-5×104CFU/mL。养殖箱内使用纳米管曝气，养殖池塘使用鼓风机+PVC管曝气，水中逐渐形成生物絮团，此后便可以减少配合饲料用量。每天使用英霍夫锥形管(Imhoffcone)测定水中生物絮团含量，根据实际情况用沉淀桶去除过剩絮团，维持絮团浓度在9-16mL/L，并根据絮团存量决定糖蜜施用量和投饵量。
[0090] 标粗试验：放苗密度控制在200-400尾/m2，日投饲量为对虾体重的10％-15％，根据水色和虾苗密度日投饲4-8次。虾苗入池当天投喂0﹟标粗专用料(粒径0.27±0.07mm)，5天后换1﹟标粗专用料(粒径0.37±0.07mm)，再过10天投喂2﹟标粗专用料(粒径0.60±0.15mm)，3天后换3﹟标粗专用料(粒径0.85±0.10mm)直至标粗结束，整个过程持续25天。使用鼓风机+PVC管方式进行曝气，并根据池塘水色、载虾量和天气情况确定曝气时长，日换水量控制在10％-20％。试验全程将水温控制在25-28℃，pH7.8-8.5，DO≥5mg/L，氨氮和亚硝酸盐浓度≤1mg/L，水体总碱度维持在140-160mg/L，透明度保持在0.3-0.4m，水中弧菌密度控制在5000CFU/L以内。每天监测水温、盐度、pH、OD、总碱度、氨氮浓度和亚硝酸盐浓度变化。另外标粗阶段注意遮光，避免高光刺激抑制对虾生长以及水生生物旺发降低水体透明度。
[0091] 在标粗养殖过程中，注意所投放的微藻团聚体粒径须与相应阶段标粗专用料粒径一致，精准适应对虾摄食需求。
[0092] 本发明利用新型生物絮团标粗凡纳滨对虾的相关实施例及对比例如下：
[0093] 实施例1
[0094] 标粗试验在2m×1.5m×1.2m(长×宽×高)的蓝色塑料养殖箱中进行。放苗前使用高锰酸钾对养殖箱进行彻底消毒，然后注入经砂滤且消毒的海水，保持水深0.7m。箱内四周按同一方向布置纳米曝气管，分别距箱底0.1m和0.4m。
[0095] 放苗前在箱内添加45g糖蜜调节水体C/N在12-14左右，同时接种混合微藻团聚体、W-TJ01和Z-QS01菌液，其中混合微藻团聚体接种密度为25粒/mL(内含普通小球藻细胞密度为5×104cells/mL，雨生红球藻和威氏海链藻均为1×105cells/mL)，W-TJ01和Z-QS01接种密度分别为1×104CFU/mL和3×104CFU/mL。充分曝气至水中形成悬浮生物絮团颗粒，此后便可逐渐减少饲料用量。逐日测定水中生物絮团含量，根据实际情况用沉淀桶去除过剩絮团，维持絮团浓度在9-14mL/L，并根据絮团存量决定糖蜜施用量和投饵量。
[0096] 选取健壮凡纳滨对虾F1代虾苗试水后放养，放苗密度200尾/m2，日投饲量为对虾体重的10％-15％，日投饲4次。放苗当天投喂0﹟标粗专用料，5天后换1﹟标粗专用料，再过10天投喂2﹟标粗专用料，3天后换3﹟标粗专用料直至标粗结束，整个过程持续25天。放苗前20天每天曝气6小时，放苗20天至标粗结束每日曝气8小时，日换水量控制在三分之一以内。试验全程将水温控制在25-28℃，pH7.9-8.5，DO≥5mg/L，氨氮和亚硝酸盐浓度≤1mg/L，总碱度维持在140mg/L以上，透明度保持在0.3-0.4m，水中弧菌密度控制在5000CFU/L以内。每天监测水温、盐度、pH、OD、总碱度、氨氮浓度和亚硝酸盐浓度变化。
[0097] 注意所投放的微藻团聚体粒径须与相应阶段标粗专用料一致，精准适应对虾摄食需求。经过25天标粗，对虾平均成活率达97.2％，平均体长达5.82cm，平均体重达6.20g。
[0098] 实施例2
[0099] 标粗试验在钢架温棚中进行，棚内池塘面积1.5亩，配置底充式增氧设备，用鼓风机充气，PVC管为充气管(管直径15mm)，管间距4m，另外PVC管间隔0.6m打孔，孔径0.6mm，充氧装置配置功率为0.2kW/亩。放苗前全池清洗并消毒，然后注入经过24小时自然沉淀且通过80目筛绢过滤的海水，控制水深0.6-0.7m，使用漂白粉(有效氯浓度5-10mg/L)进行水体消毒，然后充分曝气去除余氯。放苗前全池泼洒0﹟标粗专用料(9kg/亩)和糖蜜(5kg/亩)，调整水体C/N在13-15左右，同时每天接种混合微藻团聚体、W-TJ01和Z-QS01菌液，其中混合微藻团聚体接种密度为30粒/mL(内含普通小球藻细胞密度为1×105cells/mL，雨生红球藻和威氏海链藻均为2×105cells/mL)，W-TJ01和Z-QS01接种密度分别为2×104CFU/mL和4×104CFU/mL。充分曝气至水中形成悬浮生物絮团颗粒，此后便可逐渐减少饲料用量。逐日测定水中生物絮团含量，根据实际情况用沉淀桶去除过剩絮团，维持絮团浓度在10-15mL/L，并根据絮团存量决定糖蜜施用量和投饵量。
[0100] 选取健壮凡纳滨对虾F1代虾苗试水后放养，放苗密度300尾/m2，日投饲量为对虾体重的10％-15％，日投饲6次。虾苗入池当天投喂0﹟标粗专用料，5天后换1﹟标粗专用料，再过10天投喂2﹟标粗专用料，3天后换3﹟标粗专用料直至标粗结束，整个过程持续25天。放苗前
20天每天黎明前和中午各曝气2小时，放苗20天至标粗结束每日增加曝气2小时，日换水量控制在10％-20％。试验全程将水温控制在25-28℃，pH7.9-8.5，DO≥5mg/L，氨氮和亚硝酸盐浓度≤1mg/L，使用生石灰将水体总碱度维持在150mg/L以上，透明度保持在0.3-0.4m，水中弧菌密度控制在5000CFU/L以内。每天监测水温、盐度、pH、OD、总碱度、氨氮浓度和亚硝酸盐浓度变化。
20天每天黎明前和中午各曝气2小时，放苗20天至标粗结束每日增加曝气2小时，日换水量控制在10％-20％。试验全程将水温控制在25-28℃，pH7.9-8.5，DO≥5mg/L，氨氮和亚硝酸盐浓度≤1mg/L，使用生石灰将水体总碱度维持在150mg/L以上，透明度保持在0.3-0.4m，水中弧菌密度控制在5000CFU/L以内。每天监测水温、盐度、pH、OD、总碱度、氨氮浓度和亚硝酸盐浓度变化。
[0101] 注意所投放的微藻团聚体粒径须与相应阶段标粗专用料一致，精准适应对虾摄食需求。经过25天标粗，对虾平均成活率达94.1％，平均体长达5.66cm，平均体重达5.91g。
[0102] 对比例1
[0103] 在名为“一种培养生物絮团的方法及在凡纳滨对虾养殖中的应用”的发明专利(CN106754552A)应用实例中，通过每天在对虾养殖池塘泼洒短小芽孢杆菌和嗜乳酸杆菌菌剂以及季也蒙毕赤酵母菌粉的方式，并在池塘四周中下层设置纳米曝气管曝气，形成絮团，然后调节养殖水体C/N在12-14左右，在实施例中初始体长3cm的凡纳滨对虾经过30天的养殖平均存活率为93％，平均体长5.5cm，平均体重2.48g。
[0104] 由此可以看出，本发明方法得到的凡纳滨对虾存活率、生长指标均优于现有技术。
[0105] 针对目前BFT应用过程中生物絮团以异养菌为主而微藻极少的现状，本发明从菌-藻共生理论出发，根据对虾幼期阶段偏好植物性饵料的实际情况，首先筛选适于凡纳滨对虾摄食的饵料微藻和藻际共栖异养细菌，然后通过可用作食品添加剂的谷氨酰胺转氨酶(Glutamine transaminase，TGase)对微藻进行催化交联，催化交联法制备可作为生物絮团骨架的微藻团聚体，并根据对虾标粗阶段的生长情况调控团聚体成型粒径，再通过适量添加低成本碳源物质促进调水细菌生长繁殖，构建以微藻团聚体为骨架、藻际共栖异养菌伴生的新型生物絮团，并对养殖过程中絮团存量进行密切监测和调节。本发明生物絮团显著改善了凡纳滨对虾标粗池塘的水质，提高了对虾的成活率、生长指标和免疫力，同时减少了配合饲料和外加碳源的施用量，降低了曝气强度和换水量。
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