一种调控水稻对干旱和盐碱耐性的基因及其应用
阅读：228发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种调控水稻对干旱和盐碱耐性的基因及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一个 水 稻ERF家族成员OsERF2调控水稻非 生物 胁迫耐性的应用。所述OsERF2表达或基因沉默影响水稻糖类物质积累及其对干旱和盐 碱 的耐性。通过转基因技术创建所述OsERF2基因沉默的转基因水稻，获得的转基因植株具有对干旱和盐碱的耐性，因此OsERF2基因在改良 植物 抗逆性和 农作物 品种方面具有很好的应用价值。，下面是一种调控水稻对干旱和盐碱耐性的基因及其应用专利的具体信息内容。
一种调控水稻对干旱和盐碱耐性的基因及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 水资源短缺和土壤盐渍化是全球农业生产面临的严峻事实。我国的可耕地中有近6亿亩的土地受到不同程度盐渍化的影响，土地盐渍化是造成我国西部和沿海滩涂等地区中、低产田和大面积土壤资源难以有效利用的直接原因。由于旱灾频繁，我国年平均受旱面积达3.27亿亩，随着全球气候变暖，旱灾将日趋严重，受旱灾威胁农田面积可能超过7亿亩。
因此水资源匮乏及盐碱胁迫已成为影响水稻高产、稳产的重要限制因子。
因此水资源匮乏及盐碱胁迫已成为影响水稻高产、稳产的重要限制因子。
[0003] 高盐和干旱等非生物胁迫下，植物通过胞间渗透物质积累和降低水分丧失，进而获得高渗透状态和维持细胞刚度。作物应对环境胁迫反应包括形态、生理、生物化学、细胞学以及分子生物学等水平的改变。植物遭遇到逆境时，许多胁迫应答基因被诱导表达特异蛋白，调节植物生理生化以及代谢的变化，从而适应外部逆境。植物受到干旱后，细胞迅速感知外界信号，通过一系列复杂的信号转导并激活特定转录调控因子，再通过特定的顺式作用元件，调控大量有关目标基因的转录表达，最终提高植物的耐旱性。作物对于低温、干旱、高盐和病害等非生物胁迫和生物胁迫的抗逆反应都是由多基因参与的协同防御反应，因此，在提高作物对环境胁迫的分子育种中，单一抗性功能基因的转基因策略对农作物抗性的改良存在一定局限，而增强一个关键的转录因子的调控可同时调控多个下游抗性功能基因的表达，提高作物抗逆性的更为有效方法。
[0004] 水稻中至少有186个转录因子基因受到干旱或高盐诱导。乙烯应答因子（ERF）含有一个保守的ERF 结构域，水稻中有170多个ERF基因，调控抗逆和生长发育等过程。水稻OsDREB1A超表达能提高转基因水稻对干旱、高盐和冻害的耐性；超表达OsDREB1G和OsDREB2B提高了转基因植株对干旱、盐和低温的耐性。水稻ERF因子Sub1A和Sub1C在淹水胁迫应答反应、生长发育与代谢调控等过程中发挥重要的作用。因此，通过生物技术利用转录因子培育耐逆水稻品种是充分利用我国盐碱地、缓解水资源短缺、保证水稻高产稳产的有效途径，对保障农业可持续发展具有重要的现实意义。
发明内容
[0005] 本发明人创建水稻OsERF2基因沉默的转基因水稻，抗逆性表型分析发现该基因沉默能增强水稻对干旱和高盐胁迫的耐性，表明OsERF2调控水稻对干旱和盐碱等逆境胁迫的应答反应。在正常生长状态下，OsERF2基因沉默的转基因水稻中葡萄糖活化供体UDPG（尿苷二磷酸葡萄糖）的含量高于非转基因水稻，表明OsERF2可能通过调节水稻体内UDPG的积累从而提高转基因水稻对干旱和盐碱的耐性。
[0006] 本发明提供的技术方案是：一种水稻ERF基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，称为OsERF2基因，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。该基因沉默提高水稻苗期对干旱和盐碱耐性。
[0007] 本发明还提供包含所述的基因的表达载体，优选为植物表达载体，更优选为pCAMBIA5300-AmiERF2表达载体。
[0008] 本发明还提供所述的基因在培育抗逆作物品种的应用，是将包括所述基因的表达载体导入植物中，筛选获得抗逆性提高的植株，优先为水稻。
[0009] 本发明具有以下有益效果：本发明研究表明OsERF2在水稻应答干旱、盐碱等逆境胁迫反应中发挥重要的作用。通过转基因技术创建OsERF2基因沉默的转基因水稻，转基因植株对相关胁迫具有耐性，进而培育抗逆性增强的转基因植物品种。实验表明，通过人工小RNA方法(artificial microRNA)将本发明所述的编码调控植物盐胁迫诱导基因OsERF2的DNA序列片段导入水稻中使OsERF2基因的沉默过表达部分抑制（通过RNAi方法抑制水稻OsERF2的表达），能够提高转基因水稻耐盐性和耐旱性。附图说明
[0010] 图1基因沉默转基因水稻中OsERF2基因表达水平降低，从左至右依次为WT，Ami-957，Ami-958，Ami-991。
[0011] 图2生长2周的转基因水稻与野生型水稻之间没有明显差异。
[0012] 图3 OsERF2基因沉默的转基因水稻的耐盐性增强。
[0013] 图4 OsERF2基因沉默的转基因水稻的耐旱性增强。
[0014] 图5 OsERF2调节水稻UDPG的积累。
[0015] 图6 pCAMBIA5300-AmiERF2表达载体。
具体实施方式
[0016] 下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
[0017] 实施例一转基因水稻材料的创建
[0018] 本发明人通过农杆菌侵染法创建OsERF2基因沉默的转基因水稻。
[0019] 基因沉默方法如下：
[0020] 利用其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示基因（OsERF2基因）3’端非编码区序列AGCATCATTTAGAGCATAA作为目的序列，通过生物信息学分析设计约21碱基amiRNA；以内源miRNA前体（pre-miRNA）骨架为模板，采用重叠PCR构建amiRNA基因； 将amiRNA基因克隆到相应的植物转化载体上；通过转基因技术将amiRNA导入植物体中，利用植物的miRNA 加工作用体系表达amiRNA并沉默靶基因。构建过程如下：首先针对ERF2基因利用WMD3软件Designer模块(http://wmd3.weigelworld.org)设计amiRNA序列，以Oligo模块以pNW55为载体设计4条amiRNA重叠PCR引物，即PI miR-s1th agTTTATGCTCTAAATGATGCTGcaggagattc agtttga，PII miR-a1th tgCAGCATCATTTAGAGCATAAActgctgctgctacagcc，PIII miR*s1th ctCAGCAACATATAGAGCATAAAttcctgctgctaggctg和PIV miR*a1th aaTTTATGCTCTATAT GTTGCTGagagaggcaaaagtgaa。结合通用引物G-4368(5’-CTGCAAGGCGATTAAGTT GGGTAAC-3’)和G-4369 (5’-GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG-3’)以质粒pNW55(克隆有水稻内源miRNA基因osa-MIR528的254bp的前体miRNA序列)为模板，运用3对引物G-4368+PII，P I+P IV，P III+G-4369进行PCR扩增。分别将PCR产物回收后混合作为模板，运用引物对(G-4368+G-4369)进行融合PCR获得554b的产物，运用BamHI/KpnI双酶切后转入植物转化载体pCAMBIA5300，得到表达载体（pCAMBIA5300-AmiERF2）（请参见图6），导入根癌农杆菌AGL0中。
[0021] 通过农杆菌侵染法创建OsERF2基因沉默的转基因水稻的方法如下：
[0022] 1）水稻胚愈伤的诱导与继代：将水稻种子（越光）脱壳，用75%乙醇浸泡1min，用次氯酸钠溶液浸泡30min，无菌水冲洗，用次氯酸钠重复浸泡15min，用无菌水冲洗。将灭菌后的水稻种子于灭菌滤纸上晾干，种于诱导培养基中。28℃暗培养2周。分离愈伤组织转移至诱导培养基28℃继代3次。挑取颜色淡黄且质地松散愈伤颗粒28℃暗培养3天。
[0023] 2）菌种活化及扩繁：在28℃条件下，将含有目的基因表达载体（pCAMBIA5300-AmiERF2）的农杆菌分别于YEB固体培养基上划线培养2天。
[0024] 3）农杆菌与愈伤组织的共培养：取适量菌体悬浮于100μM AS+AA液体培养基中，菌液OD值达0.3时，使愈伤组织浸入菌液中，轻摇20分钟。弃菌液，取出愈伤，滤干多余菌液，转移到NB固体培养基上22℃暗培养3天。
[0025] 4）筛选抗性愈伤：挑选共培养的愈伤组织，无菌水漂洗，滤干后铺于筛选培养基上，28℃暗培养2周后继代一次。
[0026] 5）预分化与分化：选生长旺盛呈乳白色的愈伤组织转至预分化培养基上，28℃暗培养1周，28℃光照培养2周，见到绿点时继代一次，4周后分化成苗。
[0027] 6）生根与壮苗：将长势较好的幼苗移至生根培养基上，培养2周后移栽。
[0029] 8）得到的转基因阳性植株的幼苗，经加代获得T1和高世代的种子。
[0030] 实施例二 不同转基因材料中OsERF2的表达水平鉴定
[0031] TRIzol方法提取2周龄野生型和OsERF2转基因植株叶片总RNA，取2 μg总RNA，以2μRNase-free DNase (Promega) 37℃ 处理30 min，以polyA为引物，利用M-MLV反转录酶42 ℃合成cDNA第一链，然后以cDNA为模板，以Ubiquitin (引物5-CCATCCTCAAGCTGCTTACC-3和5-GACTGGCAAGACC ATTACCC-3)为内参，PCR方法检测OsERF2基因(引物5-AGATCTCCTGCTGA TGTGCC 3和5- CACAAGCTGCTCCAGAACTC-3)表达，结果如图1所示。相对于野生型对照植株，OsERF2的表达在转基因植株(Ri-1, Ri-2)中减少为野生型的30%-50%。这表明在转基因植株中OsERF2的表达被部分沉默。
[0032] 实施例三 OsERF2基因沉默能提高水稻对干旱和盐碱的耐性
[0033] 野生型和OsERF2转基因水稻种子42℃处理3天后，于水中浸种24小时，37℃催芽，选取萌芽一致的种子种于装有营养土的小盆中，覆盖一层保鲜膜保湿，待幼苗出土后，去除保鲜膜，2周后，将种植水稻苗的小盆放入含100 mM NaCl的水中浸泡1周，然后将盐水倒出，每天换一次水，正常3周后的生理表型如图2所示，转基因水稻和野生型水稻之间没有明显的表型差异，表明该隐的沉默不影响水稻的正常生长。但2周幼苗早用盐水处理1周后复水5天后，野生型对照植株的几乎全部死亡，而OsERF2基因沉默的转基因水稻株系Ami957、Ami958和Ami991的植株大部分还存活正常，显著高于野生型对照（参见图3）。对于干旱处理，将2周的水稻苗小盆进行自然的干旱吐水处理，6天后野生型开始轻度的叶片卷曲，而基因沉默的转基因水稻叶片还正常舒展，8天后大部分野生型植株的叶片极度卷曲或枯黄，而转基因水稻叶片还大都舒展，结果表明与非转基因野生型对照相比，OsERF2基因沉默的转基因水稻株系的耐旱性显著提高（参见图4）。
[0034] 实施例四 转基因水稻中UDPG含量的改变
[0035] UDPG 是一种活化的葡萄糖糖基供体，在植物的碳水化合物代谢、纤维素合成、营养生长与生殖生长转换和胁迫应答反应等生理过程中发挥重要的调控作用。本发明人通过液相色谱的方法比较了野生型水稻和基因沉默的转基因水稻之间UDPG的积累，结果如图5所示，基因沉默的转基因水稻中UDPG积累高于野生型水稻，UDPG 的积累可能在转基因水稻耐逆性提高方面具有重要的调控作用。
[0036] 实施例五 转基因水稻中OsERF2的表达水平分析
[0037] 基因表达分析方法：取2周转基因水稻和野生型水稻的叶片，用RNA提取试剂盒(MagMAX™ Total RNA Isolation Kit)提取RNA。采用M-MLV试剂盒(Promega) 合成cDNA。用SYBR Premix Ex TaqTM (TaKaRa)在ABI PRISM7000上分析候选基因的表达。PCR条件为
95℃ 4 min、95℃ 15 s、59℃ 30s、72℃ 30s，共40个循环，以ubiquitin作为内参，用2-∆∆CT法分析基因表达水平。相对于野生型水稻，OsERF2的表达水平在转基因水稻中降低。
95℃ 4 min、95℃ 15 s、59℃ 30s、72℃ 30s，共40个循环，以ubiquitin作为内参，用2-∆∆CT法分析基因表达水平。相对于野生型水稻，OsERF2的表达水平在转基因水稻中降低。
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