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利用BCS1L基因和向导RNA/CAS核酸内切酶系统改良 植物农艺性状的方法

阅读：751发布：2020-05-08

专利汇可以提供利用BCS1L基因和向导RNA/CAS核酸内切酶系统改良植物农艺性状的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了通过修饰植物或植物细胞基因组中的靶序列而改良农艺性状的方法及组合物。所述方法和组合物采用一个向导RNA/Cas核酸内切酶系统提供了一个有效的系统，用于修饰或改变植物或植物细胞的基因组区域内的靶位点而提供诸如耐旱性，产量和胁迫耐受性等期望农艺性状的改良。还提供了方法和组合物用于编辑细胞基因组内的核苷酸序列。，下面是利用BCS1L基因和向导RNA/CAS核酸内切酶系统改良植物农艺性状的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种植物，其中内源BCS1L多肽的表达或活性与对照植物的野生型BCS1L多肽的表达或活性相比是降低的，其中与所述对照植物相比，所述植物表现选自以下的至少一种表型：
增加的籽粒产量、增加的非生物胁迫耐受性和增加的生物量，其中内源BCS1L多肽的表达或活性是通过引入遗传修饰而降低的，所述BCS1L多肽具有与SEQ ID NO:8具有至少85％一致性的氨基酸序列。
2.权利要求1的植物，其中所引入的修饰包括在包含所述内源BCS1L基因和其启动子的基因组区域中(a)引入DNA片段或缺失DNA片段或替换DNA片段，或引入(b)一个或多个核苷酸改变，其中所述修饰降低所述内源BCS1L多肽的表达或活性。
3.权利要求2的植物，其中所引入的修饰包括在包含所述内源BCS1L基因的基因组区域中(a)缺失DNA片段或替换DNA片段或(b)插入一个核苷酸、缺失一或多个核苷酸、或替换一或多个核苷酸，其中所述修饰导致BCS1L基因的编码序列的提前终止，进而产生缩短的BCS1L多肽。
4.权利要求3的植物，其中所述植物为水稻，且所述BCS1L基因为OsBCS1L。
5.权利要求2的植物，其中所述植物包含突变的BCS1L基因，其中所述植物中BCS1L多肽的表达或活性与对照植物相比是降低的，且其中与所述对照植物相比，所述植物表现选自以下的至少一种表型：增加的籽粒产量、增加的非生物胁迫耐受性和增加的生物量。
6.权利要求2的植物，其中所述植物包含突变的BCS1L基因，其中所述植物中所述BCS1L多肽的活性与对照植物相比是降低的或者消除的，且其中与所述对照植物相比，所述植物表现选自以下的至少一种表型：增加的籽粒产量、增加的非生物胁迫耐受性和增加的生物量。
7.权利要求5或6的植物，所述突变的BCS1L基因包含与SEQ ID NO：6或7具有至少95％序列一致性的核苷酸序列。
8.权利要求2的植物，其中所述植物包含突变的BCS1L启动子，其中所述植物的所述BCS1L多肽的活性与对照植物相比是降低的或消除的，且其中与所述对照植物相比，所述植物表现选自以下的至少一种表型：增加的籽粒产量、增加的非生物胁迫耐受性和增加的生物量。
9.权利要求8的植物，其中所述突变的BCS1L启动子包含与SEQ ID NO：9具有至少90％序列一致性的核苷酸序列。
10.权利要求1至9任一项的植物，其中所述植物表现出非生物胁迫耐受性增加，并且所述非生物胁迫是干旱胁迫。
11.权利要求1至9任一项的植物，其中所述植物选自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
12.一种制备植物的方法，其中通过引入的遗传修饰，内源BCS1L多肽的表达或活性与对照植物的野生型BCS1L多肽的表达或活性相比是降低的，且其中与所述对照植物相比，所述植物表现选自以下的至少一种表型：增加的耐旱性、增加的籽粒产量、增加的非生物胁迫耐受性和增加的生物量，其中所述方法包括以下步骤：
在包含所述内源BCS1L基因和其启动子的基因组区域中(i)引入DNA片段、缺失DNA片段或替换DNA片段，或引入(ii)一个或多个核苷酸改变，其中所述修饰有效降低所述内源BCS1L多肽的表达或活性。
13.权利要求12的方法，其中所述修饰使用锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、CRISPR-Cas/Cpf1或大范围核酸酶引入。
14.权利要求13的方法，其中所述修饰使用CRISPR-Cas系统引入。
15.一种增加植物耐旱性的方法，包括：
(a)将构建体引入可再生的植物细胞以降低内源BCS1L多肽的表达或活性，其中所述BCS1L多肽具有与SEQ ID NO:8具有至少90％一致性的氨基酸序列；
(b)在步骤(a)后由所述可再生植物细胞再生经修饰的植物；和
(c)获得衍生自步骤(b)的经修饰的植物的子代植物，其中所述子代植物与对照植物相比显示增加的耐旱性。
16.权利要求15的方法，其中所述构建体包括：至少一个与gRNA可操作连接的异源调控序列，其中所述gRNA靶向BCS1L基因或其启动子，其中所述BCS1L基因具有与SEQ ID NO：6和
7具有至少85％一致性的核苷酸序列，且所述BCS1L启动子具有与SEQ ID NO：9具有至少
85％一致性的核苷酸序列。
17.权利要求16的方法，所述gRNA包含SEQ ID NO：13和14的核苷酸序列，所靶向的位点在水稻基因组Chr5：29332310-29332802之间，其中所述基因组编辑导致水稻基因组Chr5：
29332310-29332802附近的DNA片段插入、替换、缺失或核苷酸改变，且所述OsBCS1L表达提前终止。
18.一种使水稻植物籽粒产量与对照植物相比提高的方法，其中所述植物在胁迫条件下表现增加的籽粒产量，所述方法包括降低所述水稻植物的内源BCS1L基因或异源BCS1L基因的表达或活性的步骤。

说明书全文

利用BCS1L基因和向导RNA/CAS核酸内切酶系统改良 植物农艺

性状的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物分子生物学，特别是，涉及修饰或改变植物基因组的方法，提高诸如干旱胁迫等非生物胁迫的耐受性。

背景技术

[0002] 生物和非生物原因可以对植物产生胁迫。例如，造成生物胁迫的原因包括病原菌感染、昆虫取食、另一种植物的寄生例如槲寄生。非生物胁迫包括诸如有效水分的过量或者不足、极限温度和诸如除草剂的合成化学药品。

[0003] 非生物胁迫是造成世界范围内农作物减产的主要原因，造成主要农作物平均减产50％以上(Boyer,J.S.(1982)Science 218：443-448；Bray,E.A.等(2000)In Biochemistry and Molecular Biology of Plants,edited by Buchannan,B.B.等,Amer.Soc.Plant Biol.,pp.1158-1249)。

[0004] 重组DNA技术让外源DNA序列插入生物体基因组成为可能，它通过过量表达或抑制某些基因的表达，从而增加诸如耐旱性等非生物胁迫的耐受性，和改变生物体的表型。插入或修饰DNA序列的一种方法包括同源DNA重组，通过引入侧翼为与基因组靶同源的序列的转基因DNA序列进行。

[0005] 位点特异性重组广泛应用在生物技术相关领域。大范围核酸酶(Meganuclease)，锌指核酸酶(ZFN)，和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)包含一个DNA结合结构域和一个DNA切割结构域，能对基因组进行修饰。近来应用成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)的研究表明一种与类似系统(大范围核酸酶，ZFN和TALEN)相同有效的基因组修饰方法。

[0006] CRISPR系统由一个蛋白组分(Cas)和一个向导RNA(gRNA)组成，所述向导RNA将所述蛋白靶向用于内切核苷酸裂解的特异性位点。这一系统已被成功工程化以靶向特异性位点用于哺乳动物、斑马鱼、果蝇、线虫、细菌、酵母和植物基因组的内切核苷酸裂解。

[0007] 发明概述

[0008] 本发明包括以下具体实施方案：

[0009] 在一个实施方案中，本发明包括一个CRISPR-Cas构建体，所述构建体包括：至少一个可操作连接gRNA的异源调控序列，其中所述gRNA靶向含有内源BCS1L基因和其启动子的基因组区域。进一步的，所述BCS1L基因编码一种多肽，其包含与SEQ ID NO：8具有至少95％一致性的氨基酸序列。所述BCS1L基因包含一种具有SEQ ID NO：6或7的核苷酸序列的多核苷酸或其包含1至大约10个核苷酸改变的等位基因变体。所述BCS1L启动子包含具有SEQ ID NO：9的核苷酸序列的多核苷酸。

[0010] 在另一个实施方案中，本发明包括一种植物，其中内源BCS1L多肽的表达或活性与对照植物的野生型BCS1L多肽的表达或活性相比是降低的，其中，与所述对照植物相比，所述植物表现选自以下的至少一种表型：增加的籽粒产量、增加的非生物胁迫耐受性和增加的生物量，其中因引入的遗传修饰，内源BCS1L多肽的表达或者活性是降低的。其中所述引入的修饰包括在包含所述内源BCS1L基因和其启动子的基因组区域中(a)引入一个DNA片段或缺失一个DNA片段或替换一个DNA片段或引入(b)一个或多个核苷酸变化，其中所述修饰导致降低所述内源BCS1L多肽的表达或活性。

[0011] 进一步，本发明包括一种植物，所述植物含有一个突变的BCS1L基因，其中所述植物的所述BCS1L多肽的表达或活性与对照植物相比是下降的或消除的，且其中与所述对照植物相比，所述植物表现选自以下的至少一种表型：增加的籽粒产量、增加的非生物胁迫耐受性和增加的生物量。所述突变的BCS1L基因具有与SEQ ID NO：6或7为至少95％序列一致性的核苷酸序列。

[0012] 本发明还包括一种植物，所述植物含有一个导致编码序列提前终止的突变的BCS1L基因，其中与对照植物相比，所述植物表现出干旱耐受性。

[0013] 本发明还包括一种植物，所述植物含有一个突变的BCS1L启动子，其中所述植物的所述BCS1L多肽的表达或活性与对照植物相比是降低的，且其中与所述对照植物相比，所述植物表现选自以下的至少一种表型：增加的籽粒产量、增加的非生物胁迫耐受性和增加的生物量。所述突变的BCS1L启动子具有与SEQ ID NO：9为至少90％序列一致性的核苷酸序列。所述植物表现出非生物胁迫耐受性增加，且所述非生物胁迫是干旱胁迫。

[0014] 在另一个实施方案中，本发明包括任一公开的植物，其中所述植物选自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。

[0015] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种制备植物的方法，其中，通过引入的遗传修饰，内源BCS1L多肽的表达或活性与对照植物的野生型BCS1L多肽的表达和活性相比是降低的，且其中与所述对照植物相比，所述植物表现选自以下的至少一种表型：增加的耐旱性、增加的籽粒产量、增加的非生物胁迫耐受性和增加的生物量，其中所述方法包括如下步骤：在包含内源BCS1L基因和其启动子的基因组区域中(a)引入一个DNA片段、缺失一个DNA片段或替换一个DNA片段，或引入(b)一个或多个核苷酸变化，其中所述修饰有效降低所述内源BCS1L多肽的表达或活性。使用锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、CRISPR-Cas/Cpf1或大范围核酸酶引入所述修饰。进一步，所述修饰使用CRISPR-Cas系统引入。

[0016] 在另一个实施方案中，本发明提供了增加植物耐旱性的方法，所述方法包括：(a)将一个构建体引入一个可再生植物细胞以降低内源BCS1L多肽的表达或活性；(b)从步骤(a)的所述可再生植物细胞再生一个修饰的植物；和(c)获得衍生自步骤(b)的修饰的植物的子代植物，其中与对照植物相比，所述子代植物表现增加的耐旱性。

[0017] 所述构建体包括：至少一个与gRNA可操作连接的异源调控序列，其中所述gRNA靶向BCS1L基因或其启动子。

[0018] 所述gRNA靶向SEQ ID NO：6、7或9。所述gRNA包括SEQ ID NO：10-30所示的核苷酸序列。如果所述gRNA示出SEQ ID NO:13的核苷酸序列，则所述被靶向的位点在水稻基因组第五条染色体(Chr5)29332310-29332802之间，其中所述基因组编辑导致水稻基因组第五条染色体29332310-529332802附近的核苷酸插入、DNA片段替换或缺失，由此诱导所述OsBCS1L表达提前终止，或氨基酸替换或缺失。如果gRNA为SEQ ID NO:14的核苷酸序列，则所述被靶向的位点在水稻基因组第五条染色体29332065-29332085之间，其中所述基因组编辑导致水稻基因组第五条染色体29332065-29332085附近的核苷酸插入或替换、或DNA片段替换或缺失；由此诱导所述OsBCS1L表达提前终止，翻译移码或氨基酸替换或缺失。

[0019] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种与对照植物相比增加水稻植物的籽粒产量的方法，其中所述植物在胁迫条件下表现出增加的籽粒产量，所述方法包括降低水稻植物内源BCS1L基因或异源BCS1L基因的表达或活性的步骤。

[0020] 在另一个实施方案中，本发明涉及将gRNAs/Cas9酶复合体导入一个细胞、一个植物或一个种子。所述细胞可以是真核细胞如酵母、昆虫或植物细胞；或是原核细胞，如细菌细胞。

[0021] 附图简述和序列表

[0022] 根据以下发明详述和附图及序列表，可以更全面的理解本发明，以下发明详述和附图及序列表形成本发明的一部分。

[0023] 图1为sgRNA在水稻OsBCS1L基因的基因组中的分布图。

[0024] 图2为举例说明一个sgRNA在水稻OsBCS1L基因的基因组中的分布。

[0025] 图3为举例说明两个sgRNA在水稻OsBCS1L基因的基因组中的分布。

[0026] 图4为水稻植物中通过CRISPR-Cas构建体DP2317诱导的突变的比对。所述突变通过PCR和测序确定。参考序列为未修饰的位点，每个靶位点用下划线表示。PAM序列和预期的断裂位点也进行了标注。缺失、插入或替换分别用“-”，“斜体下划线核苷酸”或“粗体斜体核苷酸”表示。参考序列和靶位点突变1-14分别相应于SEQ ID NO：31-45。

[0027] 图5为CRISPR-Cas构建体DP2354诱导的突变的比对。所述突变通过PCR和测序确定。参考序列为未修饰的位点，每个靶位点用下划线表示。PAM序列和预期的断裂位点也进行了标注。缺失、插入或替换分别用“-”，“斜体下划线核苷酸”或“粗体斜体核苷酸”表示。参考序列和靶位点突变1-15分别相应于SEQ ID NO：46-61。

[0028] 图6为CRISPR-Cas构建体DP2420诱导的突变的比对。所述突变通过PCR和测序确定。参考序列为未修饰的位点，每个靶位点用下划线表示。PAM序列和预期的断裂位点也进行了标注。缺失、插入或替换分别用“-”，“斜体下划线核苷酸”或“粗体斜体核苷酸”表示。参考序列和靶位点突变1-7分别相应于SEQ ID NO：62-69。

[0029] 表1.序列表中核苷酸和氨基酸序列的SEQ ID NO

[0030]

[0031]

[0032] 序列表包含核苷酸序列的单字母码以及氨基酸序列的三字母码，如遵照IUPAC-IUBMB标准所定义，该标准在Nucleic Acids Res.13：3021-3030(1985)以及在Biochemical J.219(No.2)：345-373(1984)中描述，这两篇文献以引用的方式并入本发明。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循37C.F.R.§1.822中列出的规则。

[0033] 详细描述

[0034] 本发明中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文均以引用的方式并入本发明。

[0035] 如本发明所用的并在所附权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一个植物”的涵义包括多个该类植物。“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物等等。

[0036] 如本发明所述：

[0037] 术语“OsBCS1L(线粒体伴侣BCS1样蛋白)”是过表达时赋予植物干旱敏感表型且由水稻基因座LOC_Os05g51130.1编码的水稻多肽。“BCS1L多肽”在此处涉及OsBCS1L多肽和其源于其它生物体的同源物。

[0038] OsBCS1L多肽(SEQ ID NO：8)由水稻基因座LOC_Os05g51130.1的编码序列(CDS)(SEQ ID NO：7)或克隆的核苷酸序列(SEQ ID NO：6)编码。该多肽在TIGR中注释为“线粒体伴侣BCS1，推测，表达”。

[0039] OsBCS1L启动子如EQ ID NO:9所示。

[0040] 本发明中术语“单子叶植物(monocot)”和“单子叶的植物(monocotyledonous plant)”可以互换使用。本发明中单子叶植物包括禾本科(Gramineae)的植物。

[0041] 本发明中术语“双子叶植物(dicot)”和“双子叶的植物(dicotyledonous plant)”可以互换使用。本发明中双子叶植物包括如下科：十字花科(Brassicaceae)、豆科(Leguminosae)和茄科(Solanaceae)。

[0042] “植物”包括整个植物、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及该植物的子代。植物细胞包括但不限于来自下列的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。

[0043] “子代”包括植物的任何后续世代。

[0044] “性状”指植物或特定植物材料或细胞的生理的、形态的、生化的或物理的特征。在一些实例中，这种特征可以是肉眼可见的，比如种子或植物的大小；或可用生物化学技术测定的，如检测种子或叶片中蛋白、淀粉或油含量；或可观察的代谢或生理过程，如测定对水分胁迫或特定盐或糖或氮浓度的耐受性；或可检测的一或多个基因的表达水平；或可观察农艺性状如渗透胁迫耐受性或产量。

[0045] “农艺性状”是可测量的参数，包括但不限于：叶片绿色、籽粒产量、生长速率、总生物量或积累速率、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、植物总氮含量、果实氮含量、种子氮含量、植物营养组织氮含量、植物总游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、植物营养组织游离氨基酸含量、植物总蛋白含量、果实蛋白含量、种子蛋白含量、植物营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮的吸收、根的倒伏、收获指数、茎的倒伏、株高、穗高、穗长、耐盐性、分蘖数、圆锥花序的大小、早期苗的活力和低温胁迫下的出苗状况。

[0046] “基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质体)中的细胞器DNA。

[0047] “等位基因”是占据染色体上给定基因座的基因的两或更多种可选择形式之一。当二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。如果转基因存在于二倍体植物中一对同源染色体中的其中之一上，则该植物在该基因座处是半合子的。

[0048] “基因”是一段可表达功能分子的核酸片段，所述功能分子包括但不限于特定蛋白，所述基因包括位于编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的调控序列。“天然基因”是拥有自身调控序列的自然存在的基因。

[0049] “突变的基因”是通过人工干预改变的基因。由此产生的“突变的基因”的序列与相应非突变的基因的序列相比，差异至少一个核苷酸增加、缺失或替换。“突变的植物”是指含有突变的基因的植物。

[0050] 如本文所示及如本领域已知的，本发明中“定点突变”是指通过使用涉及能够诱导靶序列DNA双链断裂的双链断裂诱导剂的方法改变天然基因内靶序列产生的天然基因中的突变。

[0051] “多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是指单链或双链RNA或DNA聚合物，其任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)通过如下它们的单个字母名称来指代：“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸(分别对应RNA或DNA)，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。

[0052] “多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。

[0053] “调控序列”指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。术语“调控序列”和“调控元件”在本文可互换使用。

[0054] “启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。

[0055] “植物中有功能启动子”是能够控制植物细胞中基因转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。

[0056] “组织特异性启动子”和“组织优选启动子”指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而且也可在一种特定细胞或细胞型中表达的启动子。

[0057] “发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。

[0058] “可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段是可操作地连接的。

[0059] “表达”指功能产物的产生。例如，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如转录生成mRNA或功能RNA)和/或mRNA翻译成前体或成熟蛋白质。

[0060] “表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。

[0061] 插入核酸片段(如CRISPR-Cas构建体)的上下文中的“引入”是指“转染”或“转化”或“转导”，包括将核酸片段掺入真核细胞或原核细胞，所述核酸片段可以整合到细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，从而变为一个自主复制子，或暂时性表达(例如转染mRNA)。

[0062] “转化细胞”是将核酸片段(如CRISPR-Cas DNA构建体)导入其中的任何细胞。

[0063] 本发明所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。

[0064] “核定位信号”是将蛋白靶向核的信号多肽(Raikhel，(1992)Plant Phys.100：1627-1632)。

[0065] “CRISPR-相关基因”是指编码成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)-相关系统(Cas)的多肽组分的核酸序列，所述基因通常与CRISPR位点侧翼偶联、关联或接近，或在CRISPR位点侧翼附近。术语“Cas基因”和“CRISPR-相关基因”在本发明中可互换使用。例如包括但不限于Cas3和Cas9，它们分别编码CRISPR类型I和CRISPR类型II系统中的核酸内切酶。

[0066] “Cas核酸内切酶”是指一个由Cas基因编码的Cas蛋白，其中所述Cas蛋白能在DNA靶序列中引入双链断裂。所述向导多核苷酸引导Cas核酸内切酶识别并任选在细胞基因组特定靶位点引入双链断裂。

[0067] “向导RNA(gRNA)”是指一个crRNA(CRISPR RNA)：tracrRNA融合杂合RNA分子，由可定制的DNA元件编码，通常gRNA包括一个拷贝的与基因组靶位点的前间区序列互补的间隔序列，和一个用于CRISPR复合体的相关Cas核酸内切酶的结合结构域。

[0068] “向导多核苷酸”是指一个可与Cas核酸内切酶形成复合体且让Cas核酸内切酶识别和任选切割DNA靶位点的多核苷酸序列。所述向导多核苷酸可以包含单个分子或双分子。

[0069] 术语“向导多核苷酸/Cas核酸内切酶系统”是指一个Cas核酸内切酶和一个向导多核苷酸的复合体，其可在DNA靶序列中引入双链断裂。在向导RNA识别靶序列时，但是只在正确的前间区序列邻近基序(PAM)大致定位于靶序列的3'末端，Cas核酸内切酶才能解开基因组靶位点附近的DNA双链序列并切割两条DNA链。

[0070] “基因组靶位点”是指位于宿主基因组的选择用于靶向突变和/或双链断裂的一个前间区和一个前间区序列邻近基序(PAM)。

[0071] “前间区”是指一段被靶向用于由CRISPR系统核酸内切酶由与crRNA或sgRNA的间隔序列互补碱基配对导向的酶促断裂介导的突变和/或双链断裂的短DNA序列(12-40bp)。

[0072] “前间区序列邻近基序(PAM)”包括一段3-8bp序列，紧邻基因组靶位点前间区序列。

[0073] CRISPR位点(成簇规律间隔短回文重复，也称为SPIDRs-间隔散布定向重复)包括最近描述的DNA位点家族。CRISPR位点由一段部分回文的短而高度保守的DNA重复(一般24-40bp，重复1-140次，也称为CRISPR-重复)组成。所述重复序列(一般存在物种特异性)被不同数量的固定长度(一般20-58bp，依赖于CRISPR位点)的序列间隔(WO2007/025097，公开于
2017年3月1日)。

[0074] 核酸内切酶是可裂解多核苷酸链内磷酸二酯键的酶类，包括在特定位点不破环碱基的前提下切断DNA的限制性核酸内切酶。限制性核酸内切酶包括类型I、类型II、类型III和类型IV核酸内切酶，其进一步包括类型。在类型I和类型III系统中，单复合体具有甲基化酶和限制活性。核酸内切酶也包括大范围核酸酶，也称为归巢核酸内切酶(HEases)，它类似于限制性核酸内切酶，结合和切割特定识别位点，然而所述大范围核酸酶的识别位点通常更长，约18bp或更长(专利申请WO-PCT PCT/US12/30061，提交日期2012年3月22日)。根据保守序列基序，大范围核酸酶分为四个家族，分别为LAGLIDADG、GIY-YIG、H-N-H和His-Cys盒家族。这些基序参与金属离子配位和磷酸二酯键的水解。HEases的主要优势在于其长识别位点和容忍其DNA底物中的一些序列多态性。

[0075] TAL效应物核酸酶是一种新的序列特异性核酸酶，能用于导致植物或其他生物基因组中特定靶序列的双链断裂。TAL效应物核酸酶通过将一个天然或工程化的转录激活因子样(TAL)效应物或其功能部分融合到核酸内切酶如Foki的催化结构域而产生。所述独特的、模块化的TAL效应物DNA结合结构域允许设计具有潜在地任何给定DNA识别特异性的蛋白质(Miller et al.(2011)Nature Biotechnology 29：143-148)。锌指核酸酶(ZFN)是一种工程化的双链断裂诱导剂结构域，含有一个锌指DNA结合结构域和一个双链断裂诱导剂结构域。锌指结构域赋予识别位点特异性，其一般包括2、3或4个锌指结构，例如具有一个C2H2结构，然而其他锌指结构也是已知并已被工程化的。锌指结构域可用于设计多肽，其能特异结合选定的多核苷酸识别序列。ZFN由一个与非特异性核酸内切酶结构域连接的工程化DNA结合锌指结构域组成，例如来自于一个诸如FokI的IIS型核酸内切酶的核酸酶结构域。其它功能性可与锌指结合结构域包括转录激活物结构域、转录阻遏物结构域和甲基化酶融合。在一些例子中，裂解活性需要核酸酶结构域的二聚化。每一个锌指可识别靶DNA的3个连续碱基对。例如，一个3指结构域能识别9个连续核苷酸的序列，核酸酶二聚化要求两组锌指三联体用于结合一个18核苷酸识别序列。

[0076] 术语“靶位点”、“靶序列”、“靶DNA”、“靶基因座”、“基因组靶位点”、“基因组靶序列”和“基因组靶基因座”在本发明中可互换使用，指植物细胞基因组中的一段多核苷酸序列(包括叶绿体DNA和线粒体DNA)，在此处通过Cas核酸内切酶在植物细胞基因组中诱导双链断裂。靶位点可以是植物基因组中的内源位点，或者靶位点也可以对植物而言是异源的，从而不会自然发生在基因组中；或者，与自然发生相比，靶位点可以在异源基因组位置处发现。本发明中所用术语“内源靶序列”和“天然靶序列”可以互换使用，指对植物基因组是内源或天然的靶序列，并且是在植物基因组中靶序列的内源或天然位置。

[0077] “改变的靶位点”、“改变的靶序列”、“修饰的靶位点”、“修饰的靶序列”在本发明中可互换使用，指与未改变的靶序列相比，包含至少一种改变的本文公开的靶序列。这种“改变”包括例如：(i)至少一个核苷酸的替换，(ii)至少一个核苷酸的缺失，(iii)至少一个核苷酸的插入，或(iv)上述(i)-(iii)的任意组合。

[0078] “干旱”指植物可用水分的减少，特别是持续时间较长的缺水或者在重要的生长阶段发生的缺水，会造成植物损伤，或阻止其成功生长(例如限制植物生长或种子产量)。

[0079] “耐旱性”指干旱情况下能够存活并且没有显示实质性的生理或物理恶化的植物能力，和/或一段时间干旱后复水能够恢复的能力。

[0080] 植物“增加的耐旱性”是与参照或对照植物相比测定的，反映了植物在干旱条件下存活的能力，并且与在相似干旱条件下生长的参照或对照植物相比，具有较少的生理或物理恶化，或者干旱后复水时，所述植物比对照植物更实质性和/或更快速恢复的能力。

[0081] “环境条件”指植物生长的条件，诸如可用水分、可用营养物质或存在昆虫或疾病。

[0082] “百草枯”(1,1-二甲基-4,4-联吡啶二氯化物)是一类叶片喷施的非选择性的联吡啶除草剂，能够引起光氧化胁迫，并进一步造成植物的损害或者阻止植物的成功生长。

[0083] “百草枯耐性”是植物的一种性状，反映了百草枯溶液处理后，与参照或对照植物相比，存活或生长良好的能力。

[0084] 植物“增加的百草枯耐受性”是相对于参照或对照植物测定的，反映了植物在百草枯溶液处理后，与参照或对照植物相比，能够存活并具有较小的生理或物理恶化的能力。通常，对相对低水平百草枯的耐受性可以用作非生物胁迫耐受性如干旱耐受性的标志。

[0085] “氧化胁迫”反映了活性氧分子的系统生成和生物系统快捷清除活性中间体或修复损伤的能力之间的不平衡。扰乱细胞正常的氧化还原状态会导致产生过氧化氢和自由基的毒性效应，过氧化氢和自由基能够损害包括蛋白、脂质和DNA在内的细胞组分。

[0086] 相对于参考序列(subject)的“百分比(％)序列一致性”是经过序列比对和如果需要的话引入缺口以达到最大比例的序列一致性后，待测序列(query)中与参考序列中相应氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比，且不考虑任何氨基酸保守替换属于序列一致性的部分。确定百分比序列一致性的比对可以以本领域技术人员熟知的各种方法实现，例如利用如BLAST、BLAST-2等的公开电脑软件。本领域技术人员可以决定序列比对的合适参数，包括需要与在待比较序列全长达到最大化比对的任何算法。所述两个序列之间的“百分比一致性”是所述序列具有的相同位置数的函数(例如，待测序列的百分比一致性＝待测序列和参考序列间相同位置数/待测序列的位置总数×100)。

[0087] CRISPR-Cas构建体：

[0088] 一个CRISPR-Cas构建体，包括：一个编码CRISPR酶的多核苷酸，一个编码核定位信号的多核苷酸和至少一个与gRNA可操作连接的异源调控序列，其中所述gRNA靶向包含BCS1L基因和其启动子的基因组区域。

[0089] 进一步地，所述gRNA靶向包含具有SEQ ID NO：6、7或9所示的核苷酸序列的多核苷酸的基因组区域。

[0090] 调控序列：

[0091] 调控序列可能是启动子、增强子、5’UTR或3’UTR。

[0092] 多种启动子可用于本发明的重组DNA构建体。启动子根据期望的结果选择，可包括用于在宿主生物体中表达的组成型、组织特异型、诱导型或其它启动子。

[0093] 一般将引起基因在多数细胞类型中在多数情况下表达的启动子称为“组成型启动子”。

[0094] 尽管当由组成型启动子驱动时可估计候选基因效力，但是候选基因在35S或UBI启动子控制下的高水平组成型表达可具有多重效应。使用组织特异和/或胁迫诱导的启动子可消除不需要的效应但保留提高耐旱性的能力。在拟南芥属中已经观察到了该效应(Kasuga等人(1999)Nature Biotechnol.17：287-91)。

[0095] 适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子和在WO 99/43838和美国专利号6,072,050中公开的其它组成型启动子；CaMV 35S核心启动子(Odell等人，(1985)Nature 313：810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等人，(1990)Plant Cell
2：163-171)；泛素(Christensen等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等人，(1991)
Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等人，(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其它组成型启动子包括例如在美国专利号5,608,149、5,
608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,
611中公开的那些启动子。

[0096] 在选择启动子用于本发明方法时，期望使用组织特异性启动子或发育调节启动子。

[0097] 组织特异性启动子或发育调节启动子是这样的DNA序列，其调节DNA序列选择性地植物细胞/组织如在对雄穗发育、结籽或两者重要的植物细胞/组织中的表达，并通常限制这种DNA序列在植物的感兴趣发育期间(例如雄穗发育或种子成熟)表达。任何引起所需时空表达的可鉴定启动子均可用于本发明的方法中。

[0098] 对于在种子组织发育过程中表达多核苷酸，特定感兴趣的启动子包括种子优选启动子，尤其是早期籽粒/胚启动子和晚期籽粒/胚启动子。授粉后籽粒发育大致可以分为三个基本阶段。籽粒生长的停滞期起始于0到10-12DAP。在此期间，籽粒整体不再明显生长，但是决定籽粒活力的重要事件将在此期间发生(如细胞建成数目)。线性籽粒灌浆期起始于约10-12DAP并延续到约40DAP。在此籽粒发育阶段，籽粒几乎达到其最终质量，并产生多种储藏产物(即淀粉、蛋白质、油)。最终，成熟期起始于大约40DAP到收获。在这一籽粒发育阶段，籽粒开始休眠，变干并为萌芽前的种子休眠期做准备。本发明中的“早期籽粒/胚启动子”指主要在发育中的种子的发育停滞期(也就是约0到约12DAP)驱动表达的启动子。本文定义的“晚期籽粒/胚启动子”主要在发育中的种子的约12DAP到成熟过程中驱动表达。表达窗口可能会有一些重叠。将根据使用的ABA相关序列和期望的表型选择启动子。

[0099] 早期籽粒/胚启动子包括例如Cim1，其在5DAP在特定组织中有活性(WO00/11177)，其并入本文参考。其它早期籽粒/胚启动子包括种子优选启动子end1，其在7-10DAP有活性，和end2，其在9-14DAP在整个籽粒中有活性并且在10DAP在胚乳和果皮中有活性(WO00/12733)，并入本文参考。本发明的某些方法使用的其它早期籽粒/胚启动子包括种子优选启动子ltp2(美国专利号5,525,716)；玉米Zm40启动子(美国专利号6,403,862)；玉米nuc1c(美国专利号6,407,315)；玉米ckx1-2启动子(美国专利号6,921,815和美国专利申请公开号2006/0037103)；玉米lec1启动子(美国专利号7,122,658)；玉米ESR启动子(美国专利号
7,276,596)；玉米ZAP启动子(美国专利申请公开号20040025206和20070136891)；玉米启动子eep1(美国专利申请公开号20070169226)；和玉米启动子ADF4(美国专利申请号60/963,
878，2007年8月7日申请)。

[0100] 用于本发明某些实施方案的启动子可以包括：RIP2、mLIP15、ZmCOR1、Rab17、CaMV 35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM合成酶、泛素、CaMV 19S、nos、Adh、蔗糖合成酶、R-等位基因、维管组织优选启动子S2A(Genbank登录号EF030816)和S2B(Genbank登录号EF030817)及来自玉米的组成型启动子GOS2；根优选启动子，例如玉米NAS2启动子、玉米Cyclo启动子(US
2006/0156439，公开于2006年7月13日)、玉米ROOTMET2启动子(WO05063998，公开于2005年7月14日)、CRlBIO启动子(WO06055487，公开于2006年5月26日)、CRWAQ81(WO05035770，公开于2005年4月21日)和玉米ZRP2.47启动子(NCBI登录号：U38790；GI No.1063664)。

[0101] 内含子序列可加至5’非翻译区、蛋白编码区或3’非翻译区以增加积聚在胞浆中的成熟信使RNA的量。已经显示，在植物和动物表达构建体二者的转录单位中包含可剪接内含子可使基因表达在mRNA和蛋白质水平上均增强高达1000倍(Buchman and Berg，(1988)Mol.Cell Biol.8：4395-4405；Callis等，(1987)Genes Dev.1：1183-1200)。

[0102] 增强子或增强子元件是指顺式作用转录调控元件，或者说顺式元件，其是总体表达模式的一个方面，但是通常不足以独自驱动可操作连接的多核苷酸序列的转录。一个分离的增强子元件能够融合到一个启动子以产生嵌合启动子顺式元件，其作为整个基因表达调节的一个方面。增强子是本领域技术人员所熟知的，包括SV40增强子区域、CaMV 35S增强子元件等等。也已知一些增强子改变正常调控元件表达模式，例如当不含该增强子时可导致调控元件组成型表达，这个相同的调控元件仅在一个特定组织或一些特定组织中表达。已示出CaMV35S启动子上游区域的重复导致表达增加近10倍(Kay,R.et al.,(1987)Science 236：1299-1302)。

[0103] 组合物：

[0104] 本发明的一个组合物为一种植物，其中内源BCS1L多肽的表达或活性与对照植物的野生型BCS1L多肽的表达或活性相比是降低的，其中与所述对照植物相比，所述植物表现选自以下的至少一种表型：增加的耐旱性、增加的籽粒产量、增加的非生物胁迫耐受性和增加的生物量，其中内源BCS1L多肽的表达和活性通过引入的遗传修饰而降低。其中所述修饰包括：在包含内源BCS1L基因和其启动子的基因组区域中(a)引入一个DNA片段或缺失一个DNA片段或替换一个DNA片段或引入(b)一个或多个核苷酸变化，其中所述变化有效降低所述内源BCS1L多肽的表达或活性。

[0105] 本发明的一个组合物为一种包含修饰的BCS1L基因的植物，或其中BCS1L基因启动子被修饰的植物。组合物还包括所述植物的任何子代，以及获自所述植物或其子代的任何种子，其中所述子代或种子在其基因组中包含所述修饰的BCS1L基因或启动子。子代包括植物通过自花授粉或异系杂交而获得的后续世代。子代也包括杂交种和自交系。

[0106] 在杂交种子繁殖的农作物中，成熟的修饰植物可自花授粉而产生纯合的自交系植物。该自交系植物产生的种子含有所述修饰的BCS1L基因或启动子。这些种子可生长成植物，所述植物表现出改变的农学特性(如任选在水分限制条件下的增加的农艺特性)，或者用于育种程序以产生杂交种子，这些杂交种子可生长成植物，所述植物将会表现出如改变的农学特性。所述种子可为玉米种子或水稻种子。

[0107] 植物可为单子叶植物或双子叶植物例如水稻、玉米或大豆植物，如玉米杂种植物或玉米自交系植物。植物还可为向日葵、高梁、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗或柳枝稷。

[0108] CRISPR-Cas构建体能稳定整合到植物基因组中。所述基因或启动子的修饰能稳定地在植物中遗传。

[0109] 特定的实施方案包括但不限于以下：

[0110] 1.一种修饰的植物(例如水稻或玉米或大豆植物)，包含(a)一个修饰的多核苷酸，具有与SEQ ID NO：6具有至少85％序列一致性的核苷酸序列；(b)一个修饰的多核苷酸，具有与SEQ ID NO：7具有至少85％序列一致性的核苷酸序列；或(c)核苷酸序列(a)或(b)的全互补序列，其中所述植物表现出增强的耐旱性。

[0111] 2.一种修饰的植物(例如水稻或玉米或大豆植物)，包含(a)一个修饰的多核苷酸，具有与SEQ ID NO：6具有至少95％序列一致性的核苷酸序列；(b)一个修饰的多核苷酸，具有与SEQ ID NO：7具有至少95％序列一致性的核苷酸序列；或(c)核苷酸序列(a)或(b)的全互补序列，其中所述植物表现出增强的耐旱性。

[0112] 3.一种修饰的植物，其中所述植物的BCS1L基因的表达与对照植物相比是降低的，并且其中与所述对照植物相比，所述植物表现选自以下的至少一种表型：增加的籽粒产量、增加的非生物胁迫耐受性和增加的生物量，所述植物表现出非生物胁迫耐受性增加，并且所述非生物胁迫是干旱胁迫。

[0113] 4.上述实施方案1-3所述植物的任何子代，上述实施方案1-3所述植物的任何种子，上述实施方案1-3所述植物的任何子代的种子，和来自上述实施方案1-3所述植物和其子代任意的细胞。

[0114] 在任何前述实施方案1-4或其它实施方案中，所述至少一种农艺性状的改变是增加。

[0115] 在任何前述实施方案1-4或其它实施方案中，在水分限制条件下，所述植物与对照植物相比可以表现至少一种农艺性状的改变。

[0116] 以下实施例阐述一些模拟干旱条件和/或评估耐旱性及模拟氧化条件的代表性方案或技术。

[0117] 本领域技术人员也可以在模拟或者自然发生的干旱条件下田间测试植物保持足够产量(至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％产量)的能力来评估耐旱性(例如通过测量在干旱条件下相比非干旱条件下的实质相当的产量；或测量在干旱条件下与对照或参照植物显示的产量减少相比的较少的产量减少)。

[0118] 参数如恢复度、存活率、百草枯耐性率、基因表达水平、水分利用效率、编码蛋白的水平或活性和其它参数典型参考对照细胞或对照植物显示。

[0119] “对照”、“对照植物”或“对照植物细胞”为测定其中对感兴趣基因已进行了遗传改变如转化的受测试植物或植物细胞的表型变化提供参考点。测试植物或植物细胞可以是如此改变的植物或细胞的子代及将包含所述改变。本领域技术人员容易找到适当的对照或参照植物，用于采用本发明描述的组合物或方法评估或测定转基因植物一个农艺性状或表型。例如，但不限于下述举例：

[0120] 1.修饰植物的子代，所述修饰植物相对于修饰的多核苷酸是半合子的，由此所述子代分离成包含或不包含该修饰的多核苷酸的植物：所述包含该修饰的多核苷酸的子代将通常相对于不包含该修饰的多核苷酸的子代来测量。不包含该修饰的多核苷酸的子代是对照或参照植物。

[0121] 2.修饰的多核苷酸渗入至近交系中，例如在水稻和玉米中，或渗入变种中，如在大豆中：渗入品系将通常相对于亲本近交系或变种品系进行测量(即亲本近交系或变种品系是对照或参照植物)

[0122] 3.双杂交系，其中第一杂交系由两个亲本近交系产生，而第二杂交系由相同的两个亲本近交系产生，不同的是其中一个亲本近交系含有修饰的多核苷酸：第二杂交系通常相对于第一杂交系进行测量(即第一杂交系为对照或参照植物)。

[0123] 4.包含修饰的多核苷酸的植物：该植物可以相对于不包含所述修饰的多核苷酸的对照植物进行评价或测量，但对照植物具有与该植物相当的遗传背景(例如，与包含所述修饰的多核苷酸的植物相比较，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、
73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的核遗传物质)。

[0124] 对照植物或植物细胞包括例如：(a)相同基因型的野生型(WT)植物或细胞，即用作起始材料用于基因改变产生受测植物或细胞；(b)相同基因型的植物或细胞，作为起始材料但是已用空构建体(即对感兴趣性状没有已知影响的构建体，如包含标记基因的构建体)转化；(c)在测试植物或植物细胞子代中，是非转化分离体的植物或植物细胞；(d)与测试植物或植物细胞遗传上相同的但是没有暴露于可诱导感兴趣基因表达的条件或刺激的植物或植物细胞；或(e)在感兴趣基因不表达情况下的测试植物或者植物细胞本身。对照可以包括多种代表上述一种或多种类别的个体，例如，类别“c”的非转化分离体的集合通常称为是bulk null。

[0125] 本发明中，ZH11-TC、DP0158和基因组编辑阴性指对照植物，ZH11-TC表示通过组织培养的中花(Zhonghua)11产生的水稻植物，DP0158表示用空载体DP0158转化的水稻植物，基因组编辑阴性代表用CRISPR-Cas构建体转化的但在靶位点未产生修饰的水稻植物。

[0126] 方法：

[0127] 方法包括但不限于：修饰或改变宿主内源基因组基因的方法，改变内源多肽表达和/或活性的方法，提高植物耐旱性的方法，评估植物耐旱性的方法，提高植物百草枯耐受性的方法，改变植物农艺性状的方法，确定植物农艺性状变化的方法，和生产种子的方法。

[0128] 方法包括但不限于如下：

[0129] 对植物或植物细胞基因组靶序列进行基因组修饰的方法，选择植物的方法，基因编辑的方法，和将感兴趣的多核苷酸插入到植物基因组的方法。这些方法使用一个向导RNA/Cas核酸内切酶系统，其中向导RNA引导Cas核酸内切酶识别和任选在特定靶位点向细胞基因组引入双链断裂。向导RNA/Cas核酸内切酶系统通过了修饰植物、植物细胞或种子基因组内靶位点的有效系统。本发明还提供了一个利用向导多核苷酸/Cas核酸内切酶系统的方法和组合物以提供修饰细胞基因组内靶位点或编辑细胞基因组中核苷酸序列的有效系统。一旦确定基因组靶位点，可以采用多种方法进一步修饰靶位点，以便其含有多个感兴趣的多核苷酸。

[0130] 在一个实施方案中，提供了一种修饰植物细胞基因组靶位点的方法，所述方法包括引入一个向导RNA和一个Cas核酸内切酶至所述植物，其中所述向导RNA和Cas核酸内切酶能形成一个复合体，其能使Cas核酸内切酶在所述靶位点引入双链断裂。

[0131] 另外提供了一种修饰植物细胞基因组靶位点的方法，所述方法包括：a)将一个向导RNA和一个Cas核酸内切酶引入到一个植物细胞，其中所述向导RNA和Cas核酸内切酶能形成一个复合体，其能使Cas核酸内切酶在所述靶位点引入双链断裂；和b)确定至少一个在所述靶位点具有一个修饰的植物细胞，其中所述修饰在所述靶位点包括一或多个核苷酸的至少一个缺失、插入或替换。

[0132] 蛋白质可以多种方式改变，包括氨基酸替换、缺失、截短和插入。这些操作方法通常是已知的。例如，通过DNA突变制备蛋白的氨基酸序列变体。例如，诱变和核苷酸序列变化的方法包括Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-92；Kunkel等(1987)和其中引用的参考文献。关于不会影响蛋白生物学活性的氨基酸替换的指导例如见于Dayhoff等(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl Biomed Res Found，Washington，D.C.)的模型。保守替换，例如将一个氨基酸与另一个拥有相似特性的氨基酸的交换可能是优选的。保守缺失、插入和氨基酸替换并不期望能对蛋白的特性产生根本改变；任何替换、缺失、插入或其组合的效应都能通过常规筛选实验评估。双链断裂诱导活性的测定是已知的，一般测量物质对包含靶位点的DNA底物的总体活性和特异性。

[0133] 一种编辑细胞基因组中核苷酸序列的方法，所述方法包括将一个向导多核苷酸、一个Cas核酸内切酶和任选一个多核苷酸修饰模板引入一个细胞中，其中所述向导RNA和Cas核酸内切酶能形成一个复合体，其能使Cas核酸内切酶在所述细胞基因组靶位点引入双链断裂；其中所述多核苷酸修饰模板包括所述核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰。细胞基因组的核苷酸序列选自：启动子序列，终止子序列，调控元件序列，剪接位点，编码序列，多聚泛素化位点，内含子位点和内含子增强基序。

[0134] 一种编辑细胞基因组中启动子序列的方法，所述方法包括将一个向导多核苷酸、一个多核苷酸修饰模板和至少一个Cas核酸内切酶引入一个细胞中，其中所述向导RNA和Cas核酸内切酶能形成一个复合体，其能使Cas核酸内切酶在所述细胞基因组靶位点引入双链断裂；其中所述多核苷酸修饰模板包括所述核苷酸序列的至少一个核苷酸修饰。

[0135] 一种转化细胞的方法，包括用本公开的任意一个或多个CRISPR-Cas载体转化细胞，其中，在特定的实施方案中，所述细胞是真核细胞如酵母、昆虫或植物细胞或是原核细胞如细菌细胞。

[0136] 一种产生修饰的植物的方法，包括用本公开的任意CRISPR-Cas构建体转化植物细胞和由转化的植物细胞再生修饰的植物，其中通过本方法获得的修饰的植物和修饰的种子可用于本公开的其它方法。

[0137] 一种改变本发明多肽在植物中表达水平的方法，包括：(a)用本公开的CRISPR-Cas构建体转化可再生植物细胞；和(b)自步骤(a)的可再生植物细胞再生修饰的植物，其中所述植物基因是被编辑的；和(c)使转化的植物生长，其中CRISPR-Cas构建体的表达导致本公开的多肽在转化的植物中的产生水平改变。

[0138] 一种制备植物的方法，其中通过引入的遗传修饰，内源BCS1L多肽的表达或活性与对照植物的野生型BCS1L多肽的表达和活性相比是降低的，并且其中与所述对照植物相比，所述植物表现选自以下的至少一种表型：增加的耐旱性，增加的籽粒产量，增加的非生物胁迫耐受性和增加的生物量，其中所述方法包括如下步骤：在包含内源BCS1L基因和其启动子的基因组区域中(i)引入一个DNA片段、缺失一个DNA片段或替换一个DNA片段，或引入(ii)一个或多个核苷酸变化，其中所述变化能有效降低所述内源BCS1L多肽的表达或活性。

[0139] 一种制备植物的方法，其中内源OsBCS1L多肽的表达或活性与对照植物的野生型OsBCS1L多肽的活性相比是降低的，并且其中所述植物与所述对照植物相比，表现选自以下的至少一种表型：增加的耐旱性，增加的籽粒产量，增加的非生物胁迫耐受性和增加的生物量，其中所述方法包括如下步骤：在Chr5：29332310-29332330、Chr5：29332065-29332085或Chr5：29332310-29332802附近的基因组区域中(i)引入一个DNA片段、缺失一个DNA片段或替换一个DNA片段，或引入(ii)一个或多个核苷酸变化，其中所述变化有效降低所述内源OsBCS1L多肽的表达或活性。

[0140] 一种提高植物耐旱性和/或百草枯耐受性的方法，包括(a)将CRISPR-Cas构建体导入到可再生植物细胞中，所述CRISPR-Cas构建体包含一个编码CRISPR酶的多核苷酸、一个编码核定位信号的多核苷酸和至少一个可操作连接gRNA的异源调控序列，其中所述gRNA靶向包含BCS1L基因和其启动子的基因组区域；(b)获得衍生自所述修饰的植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述修饰的BCS1L基因或其启动子并且与对照植物相比表现出提高的耐旱性。

[0141] 一种提高植物耐旱性和/或百草枯耐受性的方法，包括(a)将CRISPR-Cas构建体导入到可再生植物细胞中，所述CRISPR-Cas构建体包含一个编码CRISPR酶的多核苷酸、一个编码核定位信号的多核苷酸和至少一个可操作连接gRNA的异源调控序列，其中所述gRNA靶向SEQ ID NO：6、7或9；(b)获得衍生自所述修饰的植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述修饰的OsBCS1L基因，并且与对照植物相比表现出提高的耐旱性。

[0142] 一种生产种子的方法，包括前述的任一方法，进一步还包括从所述子代植物获得种子，其中所述种子在其基因组中包含所述修饰的BCS1L基因或其启动子。

[0143] 在前述任一的方法或任一本文方法的其它实施方案中，在所述引入步骤中，所述可再生植物细胞可包括愈伤细胞、胚胎愈伤细胞、配子细胞、分生细胞、或不成熟胚胎的细胞。所述可再生植物细胞可源于自交玉米植物或水稻。

[0144] 在前述任一方法或本文方法的任一其它实施方案中，所述再生步骤可包括如下：(i)在含有胚促激素培养基中培养所述转化的植物细胞直至观察到愈伤组织结构；(ii)将步骤(i)所述的转化的植物细胞转移至包括促组织结构激素的第一培养基中；和(iii)将步骤(ii)所述转化的植物细胞传代培养到第二培养基，使茎伸长、根发育或两者。

[0145] 在前述任一方法或本发明方法的任一其它实施方案中，确定修饰的植物中农艺性状的变化的步骤，如果可行，可包括在可变的环境条件下，确定所述修饰的植物与对照植物或野生型植物相比是否表现出至少一个农艺性状的改变。

[0146] 在前述任一方法或本发明方法的任一其它实施方案中，确定子代植物农艺性状的改变的步骤，如果可行，可包括在可变的环境条件下，确定所述子代植物与对照植物或野生型植物相比是否表现出至少一个农艺性状的改变。

[0147] 在前述任一方法或者本发明方法的任一其它实施方案中，与对照植物相比，所述植物在水分限制条件下可表现出至少一个农艺性状的改变。

[0148] 可以通过任何适当的技术将本发明的CRISPR-Cas构建体导入植物中，所述技术包括但不限于载体介导的DNA转移、基因枪轰击或农杆菌介导的转化、生物溶解颗粒导弹方法(biolistic particle bombardment)。植物转化和再生的技术在国际专利公开WO 2009/006276中描述，其内容并入本文作为参考。

[0149] 本领域技术人员熟悉修饰的植物的发育和再生。再生的植物可以自花授粉产生纯合子修饰植物。或者，将得自所述再生植物的花粉与种子长出的农艺重要品系的植物杂交。或者，来自这些重要品系的植物的花粉用于对再生的植物授粉。
实施例

[0150] 本发明进一步在下列实施例中阐明，在这些实施例中，除非特别说明，份数和百分比是重量并且度数是摄氏度。应理解这些实施例，尽管表明本发明的实施方案，仅用于说明目的。通过上述讨论和这些实施例，本领域技术人员可以明确本发明的必要特征，在不偏离本发明精神和范围下，可以对本发明进行各种改变和修改以适用于各种用途和条件。而且，除了本文示出和描述的那些，根据前述描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员是明显的。这种修改也将落入所附权利要求书的范围内。

[0151] 实施例1

[0152] sgRNA序列的设计

[0153] 采用可用的工具分析靶基因组序列产生候选的sgRNA序列。sgRNA序列也可以通过其他的网络工具产生，所述网络工具包括但不限于网站http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/和在线的CRISPR-PLANT。

[0154] 本专利申请中，分析OsBCS1L启动子和基因序列(SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10)产生多个sgRNA序列。OsBCS1L启动子和基因序列包括启动子、外显子、内含子、5’-UTR和3’-UTR，并产生许多sgRNA序列。选择21个sgRNA序列，分布如图1所示。sgRNA序列如序列SEQ ID NO:10-30所示。

[0155] 实施例2

[0156] OsBCS1L基因的CRIPSR-Cas构建体的构建

[0157] 在CRIPSR-Cas9系统中，玉米Ubi启动子(SEQ ID NO：1)驱动优化后的Cas9蛋白编码序列(SEQ ID NO：2)，CaMV35S 3’-UTR(SEQ ID NO：3)增加Cas9蛋白的表达水平，水稻U6启动子(SEQ ID NO：4)驱动gRNA的表达(gRNA骨架，SEQ ID NO：5)。

[0158] 一个sgRNA可用于构建基因组编辑构建体(图2)，sgRNA可选自片段如启动子、外显子、内含子和UTR的任何区域。单个sgRNA可以引导Cas9酶定位于靶区域，在靶DNA序列上产生双链断裂，启动非同源末端连接(NHEJ)修复机制和同源介导修复(HDR)，通常会在靶位点诱导随机插入、缺失和替换。例如，所述编辑可以移除OsBCS1L基因启动子区域的表达元件，从而降低mRNA水平或导致OsBCS1L多肽结构变化而降低OsBCS1L蛋白活性。

[0159] 两个sgRNA也可以用于构建基因组编辑构建体(图3)，两个或更多个sgRNA可选自片段如启动子、外显子、内含子和UTR的任何区域。这个构建体可以导致片段缺失、点突变(少量碱基的插入、缺失和替换)。

[0160] 表2为引物序列，靶位置和特定链。对于DP2317和DP2354构建体，使用一个sgRNA。靶引物首先退火形成短双链片段，然后将片段插入到pHSG396GW-URS-UC-mpCas9&U6-DsRed中(基于VK005-01的改良载体，购自北京唯尚立德生物技术公司)。pHSG396GW-URS-UC-mpCas9&U6-DsRed克隆载体的元件示于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5。确定gRNA片段的核苷酸序列后，将所述gRNA片段连入表达载体PCAMBIA1300DsRed-GW-Adv.ccdB中。针对含有两个sgRNA的构建体，不同的引物首先退火形成双链片段，然后这两个gRNA片段融合并插入到克隆载体中，接着插入到表达载体中形成DP2420、DP3090和DP3091。预计的断裂位点示于图1。

[0161] DP2317、DP2354和DP2420构建体中的sgRNA靶向含有OsBCS1L基因的基因组区域；DP3090和DP3091构建体中sgRNA靶向含有OsBCS1L基因启动子的基因组区域。

[0162] 表2.构建用于OsBCS1L基因和启动子编辑的CRISPR/Cas9构建体的引物

[0163]

[0164] 实施例3

[0165] 转化获得基因组编辑的水稻

[0166] 用于OsBCS1L基因的CRIPSR-Cas9构建体采用Lin and Zhang((2005)Plant Cell Rep.23：540-547)描述的农杆菌介导的方法转化入中花11号水稻。通过PCR和测序验证转化实验室获得的转化幼苗(T0)，然后移栽至田间获得T1种子。T1和T2代种子储藏在冷库中(4℃)。

[0167] 实施例4

[0168] 确定水稻植物中OsBCS1L基因的修饰和剪切位点

[0169] 以转化幼苗的基因组DNA为模板，设计引物扩增基因组编辑靶位点附近的靶序列。扩增的靶序列通过测序确定编辑结果，示于图4、图5和图6。产生修饰如至少一个核苷酸的插入、缺失或替换，导致编码序列的提前终止、翻译移码和/或至少一个氨基酸残基的缺失。

[0170] 如图4所示，在DP2317水稻植物预期位点产生了约14个修饰。7个突变导致翻译移码，且在最初的终止密码位点并未停止翻译；5个突变导致ORF提前终止和进一步导致443-454个氨基酸残基的长度；1个突变导致9个核苷酸的缺失和3个氨基酸残基的缺失；和1个突变导致3个氨基酸残基的替换。

[0171] 如图5所示，在DP2354水稻植物预期位点产生了约12个修饰。所有12个突变体均导致翻译提前终止。翻译出的多肽具有244-284个氨基酸残基长度。

[0172] 如图6所示，在DP2420水稻植物预期位点产生了7个修饰。DP2420H.01A水稻植物具有突变体1序列，其示于SEQ ID NO：45；DP2420H.05A水稻植物具有突变体2序列，示于SEQ ID NO：44；以及DP2420.06A水稻植物具有突变体3序列，示于SEQ ID NO：46。突变体1、2和3导致在ATPase AAA-类型结构域OsBCS1L编码序列的翻译的提前终止，其进一步影响了翻译的多肽的长度和活性。

[0173] 基因组编辑的纯合水稻植物用于后续功能测定。

[0174] 实施例5

[0175] 修饰OsBCS1L基因以增加水稻植物的籽粒产量

[0176] 将OsBCS1L基因过表达水稻植物(DP196)，OsBCS1L基因抑制水稻植物(DP1200)(在WO2016/000644中描述)和OsBCS1L基因编辑水稻植物(DP2317、DP2354和DP2420)种植在水分充足条件下以测试籽粒产量。

[0177] 方法：

[0178] 每个基因构建体测试大约5株修饰的水稻株系。T2代种子首先采用800ppm的多菌灵在32℃消毒8h，然后使用蒸馏水冲洗3～5次，然后32℃浸种16h，在35-37℃培养箱中萌发18h。萌发的种子种植在田间苗床上。三叶期时，将水稻幼苗移栽到田间试验地，设置四个重复，每个重复每个转基因株系10株苗，并将四个重复种植在同一地块。同一地块中，ZH11-TC、DP0158或基因组编辑阴性水稻植物邻近修饰的株系种植，并用作统计分析中的对照。

[0179] 水稻植物正常管理，并使用相应的杀虫剂和化肥。在整个生长期正常灌水。

[0180] 试验过程中，观察并记录植物表型。表型包括抽穗期、卷叶程度、敏旱性和耐旱性。尤其关注中午时植物的卷叶程度。生长季最后，每个转基因株系在每行中间挑选约6株具有代表性的植物，并称量每株植物的籽粒重量。

[0181] 结果：

[0182] 1)第一次实验中OsBCS1L基因编辑水稻植物的籽粒产量

[0183] 水稻植物被种植在水田中，以基因组编辑阴性水稻植物(有野生型OsBCS1L基因和不包含Cas9的非转基因)为对照。植物充分浇水，对照和突变植物在整个生长期未发现表型有明显差异。表3示出每株植物的籽粒产量，OsBCS1L过表达水稻植物(DP0196)的每株籽粒产量显著少于对照，OsBCS1L基因抑制水稻植物的每株籽粒产量与对照相当，基因编辑水稻植物比对照显示更加增加的每株籽粒产量。

[0184] 表3.水田条件下构建体水平的籽粒产量分析(第一次实验)

[0185]

[0186] 2)第二次实验中OsBCS1L基因组编辑水稻植物的籽粒产量

[0187] OsBCS1L基因组编辑水稻植物DP2317、DP2354和DP2420种植在水田中，对每株籽粒产量进行了再次测定。在这个实验中，每个株系种植了200株植物，设置4个重复。DP0158和基因组编辑阴性水稻植物(带有野生型OsBCS1L基因，不含包括Cas9的转基因)作为对照。在表4、表5和表6中，基因组编辑阴性水稻植物被指定为阴性。在对照组和突变植物的完全生长周期未观察到表型的显著差异。

[0188] 如实施例4所述，OsBCS1L基因编辑在DP2317水稻植物预期位点产生了14个修饰，进一步导致了翻译移码或提前终止。

[0189] 水稻植物DP2317P.01B.01、DP2317P.02B.05、DP2317P.03B.01、DP2317P.04B.03和DP2317P.10B.19的OsBCS1L基因的修饰产生翻译移码，但是翻译并未在最初终止密码子位点终止。翻译的多肽在N端比OsBCS1L具有更多的氨基酸残基。这些修饰的株系的详细籽粒产量结果示于表4。翻译移码株系的每株籽粒产量与DP0158和构建体水平的阴性水稻植物相同。仅1个株系在株系水平示出显著更低的每株籽粒产量。

[0190] 水稻植物DP2317P.05B.24、DP2317P.11B.28和DP2317P.11B.05的OsBCS1L基因的修饰导致编码序列的提前终止，进一步导致443到454个氨基酸残基长度。如表4所述，这3个株系比DP0158显示更高的每株籽粒产量以及比构建体水平的所述阴性植物显示显著更高的每株籽粒产量，且两个植物在株系水平显示更高的每株籽粒产量。表4.水田条件下株系水平OsBCS1L基因编辑(DP2317)水稻植物的籽粒产量分析(第二次实验)

[0191]

[0192]

[0193] 如实施例4所述，在DP2354水稻植物中OsBCS1L基因在预期位点的修饰产生了12个变体。所有这些12个突变体均导致翻译提前终止。翻译出的多肽具有244-284个氨基酸残基长度。OsBCS1L编码序列在ATPase AAA-类型结构域的翻译提前终止，进一步影响了翻译的多肽的长度和活性。

[0194] 如表5所述，DP2354水稻每株籽粒产量在构建体和株系水平上与DP0158和阴性水稻植物相当。DP2354水稻与DP0158和阴性的每株籽粒产量的差异未达到显著水平。表5.水田条件下株系水平OsBCS1L基因编辑(DP2354)水稻植物的籽粒产量分析(第二次实验)[0195]

[0196] 如表6所述，DP2420水稻每株籽粒产量在构建体水平与DP0158和阴性水稻相当。6个株系在株系水平上示出比两个对照更高的每株籽粒产量。

[0197] 表6.水田条件下株系水平OsBCS1L基因编辑(DP2420)水稻植物的籽粒产量分析(第二次实验)

[0198]

[0199] 实施例6

[0200] 修饰OsBCS1L基因增加水稻植物的耐旱性

[0201] 开花期干旱胁迫是农业生产中的严重问题。修饰的水稻植物进一步在田间干旱条件下进行验证。

[0202] 方法：

[0203] 每个基因构建体测试9～12株修饰的株系。如实施例5所述萌发T1和T2种子，移植至测试田，设置四个重复，每株系每个重复10或者50个植物，并将四个重复种植在同一地块。OsBCS1L基因组编辑水稻植物(具有野生型OsBCS1L基因和不包含包括Cas9的转基因)和DP0158水稻在同一地块并作为用于统计分析的对照。

[0204] 水稻植物正常管理，使用杀虫剂和化肥。在穗分化期停止浇水，因此开花期时产生干旱胁迫，这取决于天气条件(温度和湿度)。使用TDR30(Spectrum Technologies，Inc.)在每块地的大约10个位点每四天测定土壤含水量。

[0205] 生长季结束时，每个转基因株系的代表性植物自每行中间收获，并称量每株籽粒重量。籽粒重量数据采用混合线性模型进行统计分析。基于所述分析选择阳性转基因株系(P＜0.1)。

[0206] 结果：

[0207] 1)第一次实验

[0208] OsBCS1L基因编辑水稻植物(DP2420)、OsBCS1L基因过表达水稻植物(DP0196)和OsBCS1L抑制水稻植物(DP1200)的T1代种子种植在同一地块，经过转化过程并具有野生型(不突变)OsBCS1L基因的基因组编辑阴性水稻植物用作对照。当主茎穗在穗分化III期时断水。土壤含水量从16％缓慢降到6％。22天后，水稻植物开始抽穗。基因组编辑水稻植物在蜡熟期没有表现出干旱胁迫表型，在成熟期表现较好的灌浆率。如表7所示，OsBCS1L过表达水稻植物显示比对照低的每株籽粒产量，OsBCS1L抑制水稻植物和基因编辑水稻植物显示比对照更多的每株籽粒产量。这些结果显示，降低OsBCS1L基因的表达或降低OsBCS1L活性增加干旱胁迫后的每株籽粒产量。进一步的分析如表8所示，DP2420植物在株系水平比基因组编辑阴性水稻获得更高的每株籽粒产量。

[0209] 表7.干旱胁迫后构建体水平的籽粒产量分析(第一次试验)

[0210]

[0211] 表8.田间干旱胁迫后株系水平OsBCS1L基因编辑(DP2420)水稻植物的籽粒产量分析(第一次试验)

[0212]

[0213] 2)第二次试验

[0214] OsBCS1L基因编辑水稻植物((DP2317，DP2354和DP2420)、OsBCS1L过表达水稻植物(DP0196)和OsBCS1L抑制水稻植物(DP1200)的T2代种子种植在海南的同一地块，经过转化过程并具有野生型(未突变)OsBCS1L基因的基因组编辑阴性水稻植物用作对照。当主茎穗在穗分化III期时断水。土壤含水量从35％缓慢降到5％。21天后，水稻植物开始抽穗，部分水稻植物表现卷叶表型。如表9所示，OsBCS1L过表达水稻植物比对照显示显著更低的每株籽粒产量，OsBCS1L抑制水稻植物比对照显示更高的每株籽粒产量，且所有基因编辑水稻植物在构建体水平比对照显示更高的每株籽粒产量。这些结果进一步证明，降低OsBCS1L基因的表达增加每株籽粒产量，降低OsBCS1L活性也增加干旱胁迫后的每株籽粒产量。

[0215] 表9.干旱胁迫后在构建体水平的籽粒产量分析(第二次实验)

[0216]

[0217]

[0218] 水稻植物DP2317P.01B.01、DP2317P.02B.05、DP2317P.03B.01、DP2317P.04B.03和DP2317P.10B.19的OsBCS1L基因的修饰产生翻译移码，但是并未在原始终止密码子位点终止翻译。翻译的多肽在N端可具有比OsBCS1L更多的氨基酸残基。这些修饰的株系的详细籽粒产量结果示于表10。在株系水平，4个株系显示比对照更高的每株籽粒产量，1个株系比对照显示稍低的每株籽粒产量。

[0219] 水稻植物DP2317P.05B.24、DP2317P.11B.28和DP2317P.11B.05的OsBCS1L基因的修饰导致编码序列提前终止，进一步导致443-454个氨基酸残基长度。如表10所示，所有这3个株系在株系水平比对照显示显著更高的每株籽粒产量。

[0220] 表10.田间干旱胁迫后在株系水平OsBCS1L基因编辑(DP2317)水稻植物的籽粒产量分析

[0221]

[0222] 如表11所示，6个DP2354修饰株系的比对照显示更高的每株籽粒产量，其中在成熟期显示良好结籽表型株系的3个株系显示显著更高的每株籽粒产量。

[0223] 表11.田间干旱胁迫后在株系水平OsBCS1L基因编辑(DP2354)水稻植物的籽粒产量分析

[0224]

[0225]

[0226] 在第二次实验中，2个修饰株系DP2420H.01B.02和DP2420P.08B.01在成熟期表现出较好的结籽表型。如表12所示，测试的7个株系的5个比对照显示显著更高的每株籽粒产量。

[0227] 表12.田间干旱胁迫后在株系水平OsBCS1L基因编辑(DP2420)水稻植物的籽粒产量分析(第二次实验)

[0228]

[0229] 3)第三次实验

[0230] OsBCS1L基因编辑水稻植物((DP2317，DP2354和DP2420)种植在海南的同一地块并在干旱条件下检测。DP0158水稻植物和基因组编辑阴性水稻植物作为对照。当主茎穗在穗分化II期时断水。土壤含水量从35％缓慢降到15％。32天后，水稻植物开始抽穗，部分水稻植物表现卷叶表型。

[0231] 如表13所示，突变导致翻译移码的OsBCS1L基因编辑水稻植物(DP2317)在构建体水平上与对照显示相似的每株籽粒产量。只有一个株系DP2317P.01B.01在株系水平上显示显著更高的每株籽粒产量。具有编码序列提前终止的OsBCS1L基因编辑水稻植物(DP2317)在构建体水平上显示比对照显著更高的每株籽粒产量，其中在成熟期表现良好结籽表型的2个株系显示显著更高的每株籽粒产量。

[0232] 表13.田间干旱胁迫后在株系水平OsBCS1L基因编辑(DP2317)水稻植物的籽粒产量分析(第三次实验)

[0233]

[0234]

[0235] 如表14所示，OsBCS1L基因编辑水稻植物(DP2354)在构建体水平上比对照显示显著更高的每株籽粒产量，5个株系在株系水平上显示显著更高的每株籽粒产量。

[0236] 表14.田间干旱胁迫后在株系水平OsBCS1L基因编辑(DP2354)水稻植物的籽粒产量分析(第三次实验)

[0237]

[0238] 如表15所示，OsBCS1L基因编辑水稻植物(DP2420)在构建体水平上比对照显示显著更高的每株籽粒产量，3个株系在株系水平上显示显著更高的每株籽粒产量。

[0239] 表15.田间干旱胁迫后在株系水平OsBCS1L基因编辑(DP2420)水稻植物的籽粒产量分析(第三次实验)

[0240]

[0241]

[0242] 上述三次实验结果证明减少OsBCS1L基因的表达增加每株籽粒产量，降低OsBCS1L的活性亦可在干旱胁迫后增加每株籽粒产量。

[0243] 实施例7

[0244] 修饰水稻植物的实验室百草枯测定

[0245] 百草枯(1,1-二甲基-4,4-联吡啶二氯化物)是一类叶面喷施的非选择性的联吡啶除草剂，是一种世界范围内最广泛使用的除草剂，其能够控制大量作物如玉米、水稻、大豆等中的杂草。在植物细胞中，百草枯主要靶向叶绿体，百草枯通过接受光系统I的电子，然后与氧气反应生成过氧化物和过氧化氢，导致光氧化胁迫。干旱胁迫和冷冻胁迫通常导致植物中活性氧(ROS)增加，有时，植物的耐旱性和/或抗冻性与增强的抗活性氧能力相关。百草枯是强有力的氧化胁迫诱导剂，能够大大增加ROS产生并抑制抗氧化系统活性所需的还原物和化合物的再生。非生物胁迫条件下增加ROS产生，而植物响应的范围是耐受到死亡，取决于胁迫强度和其相关ROS水平。相对低水平的百草枯能够模拟胁迫相关ROS产生并用作植物胁迫生物学中的胁迫耐受性标记(Hasaneen M.N.A.(2012)Herbicide-Properties,Synthesis and Control of Weeds book)。因此，测试基因组编辑水稻植物的百草枯耐受性。

[0246] 百草枯测定方法：

[0247] 通过百草枯测定测试8个修饰株系的OsBCS1L修饰水稻植物。组培中花11(ZH11-TC)植物和空载体转基因植物DP0158用作对照。T3代种子如实施例4所述消毒和萌发，本测定在温度28-30℃和湿度30％的生长室中进行。萌发的种子放置在底部有孔的离心管中，水培，30℃培养5天，至一叶一顶芽期。选择高度大约3.5-4cm的一致幼苗用于百草枯试验。本实验采用随机区组设计。设置5个区组；每个区组基因16*12孔。每个修饰株系种植在一行(12株/行)，ZH11-TC和DP0158幼苗随机置于一个区组内的3行(3x 12株)。然后幼苗用0.8μM百草枯溶液以10h白天/14h黑夜处理7天，处理的幼苗首先面对黑暗，然后用百草枯溶液处理，每两天更换一次。处理7天后，计算绿色幼苗。保持绿色而没有损伤的那些幼苗被认为是百草枯耐性幼苗；具有叶片或茎部变白褪色的那些幼苗不认为是百草枯耐性幼苗。

[0248] 耐受率作为本试验筛选的一个参数，指保持绿色并显示耐受表型的植物相对于总植物数的百分数。

[0249] 数据在构建体水平(所有修饰的植物与对照相比)和株系水平(不同的修饰株系与对照相比)进行分析，采用统计模型为“Y～seg+line(seg)+rep+error”，随机效应为“rep”，统计方法是“ PROC GLIMMIX”。

[0250] 百草枯试验结果：

[0251] 1)OsBCS1L基因编辑水稻植物(DP2317)百草枯验证结果

[0252] 在第一次实验里，百草枯溶液处理7天后，480个DP2317幼苗中有330株(69％)保持绿色，表现出耐受表型，而120个ZH11-TC幼苗中有92株(77％)表现出耐受表型，120个DP0158幼苗中有84株(70％)表现出耐受表型。所有筛选的DP231幼苗的耐受率在构建体水平上比ZH11-TC和DP0158对照低。

[0253] 进一步在株系水平的分析表明，基因组编辑株系和对照的耐性率差异小，未达到显著水平(表16)。

[0254] 表16.实验室条件下OsBCS1L基因编辑(DP2317)水稻植物的百草枯耐受性测定(第一次实验)

[0255]

[0256] 第二次实验结果显示相似趋势。所有筛选的DP2317幼苗的耐受率在构建体水平上与ZH11-TC和DP0158对照相似。只有一个株系在株系水平比ZH11-TC对照表现出显著更高的百草枯耐受率(表17)。这些结果表明DP2317水稻植物与ZH11-TC和DP0158水稻植物对照相比，在幼苗期在构建体和转基因株系水平上没有增加百草枯耐受性。

[0257] 表17.实验室条件下OsBCS1L基因编辑(DP2317)水稻植物的百草枯耐受性测定(第二次实验)

[0258]

[0259]

[0260] 2)OsBCS1L基因编辑水稻植物(DP2354)的百草枯验证结果

[0261] 在第一次实验里，百草枯溶液处理7天后，480个DP2354幼苗中有335株(70％)保持绿色，表现出耐受表型，而120个ZH11-TC幼苗中有94株(78％)表现出耐受表型，120个对照DP0158幼苗中有85株(71％)表现出耐受表型。所有筛选的DP2354幼苗的耐受率在构建体水平上与ZH11-TC和DP0158对照低。

[0262] 进一步在株系水平的分析表明，DP2354水稻植物的耐受率低于ZH11-TC对照，而3个株系比DP0158对照表现出稍高的耐受率(表18)。

[0263] 表18.实验室条件下OsBCS1L基因编辑(DP2354)水稻植物的百草枯耐受性测定(第一次实验)

[0264]

[0265] 第二次实验结果表现出相似趋势。所有筛选的DP2354幼苗的耐受率在构建体和株系水平上与ZH11-TC和DP0158对照相似(表19)。这些结果表明DP2354水稻植物在构建体和转基因株系水平上与ZH11-TC和DP0158水稻植物二者相比，在幼苗期未能增加百草枯耐受性。

[0266] 表19.实验室条件下OsBCS1L基因编辑(DP2354)水稻植物的百草枯耐受性测定(第二次实验)

[0267]

[0268]

[0269] 3)OsBCS1L基因编辑水稻植物(DP2420)的百草枯验证结果

[0270] 在第一次实验里，百草枯溶液处理7天后，480个DP2420幼苗中有329株(69％)保持绿色，表现出耐受表型，而120个ZH11-TC幼苗中有81株(68％)表现出耐受表型，120个DP0158幼苗中有86株(72％)表现出耐受表型。所有筛选的DP2420幼苗的耐受率在构建体水平上与ZH11-TC和DP0158对照相似。

[0271] 进一步在株系水平的分析表明，基因组编辑株系(DP2420)和对照的耐受率差异小，未达到显著水平(表20)。

[0272] 表20.实验室条件下OsBCS1L基因编辑(DP2420)水稻植物的百草枯耐受性测定(第二次实验)

[0273]

[0274] 第二次实验结果表现出相似趋势。所有筛选的DP2420幼苗的耐受率在构建体和株系水平上低于ZH11-TC和DP0158对照(表21)。这些结果表明DP2420水稻植物在构建体和转基因株系水平上与ZH11-TC和DP0158水稻植物二者对照相比，在幼苗期未能增加百草枯耐受性。

[0275] 表21.实验室条件下OsBCS1L基因编辑(DP2420)水稻植物的百草枯耐受性测定(第二次实验)

[0276]

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