抗逆性相关蛋白质及其编码基因和应用
阅读：786发布：2020-05-15
专利汇可以提供抗逆性相关蛋白质及其编码基因和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 主要涉及 生物 技术领域，提供一种抗逆性相关 蛋白质 及其编码基因和应用。本发明的抗逆性相关蛋白质的编码基因及改良的抗逆性相关蛋白质编码基因在培育 植物 抗逆种中的应用。本发明对研究抗盐、抗旱相关调控基因提供方法，对培育和获得具有抗盐、抗旱的植物及其功能增强新品种具有参考及借鉴意义。本发明的方案平衡了以紫花苜蓿为代表的牧草自身的生长特性与种植地自然条件的矛盾，解决了我国现有的牧草需求和良田面积有限的难题，同时还为其它非粮食类经济作物(如 烟草 、药用植物等)提供了改良得到功能增强的新品种的方案，对我国 畜牧业 、农业、林业等带来了实质性的影响。，下面是抗逆性相关蛋白质及其编码基因和应用专利的具体信息内容。
1.一种编码抗逆性相关蛋白质的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列包括与如下b1)至b3)中的任意一种DNA序列具有至少90％的相似性的DNA序列：
b1)编码区包括SEQ ID NO.2所示的序列，且为非野生型的DNA序列；
b2)编码区包括重组DNA序列的编码抗逆性相关蛋白的DNA序列；所述重组DNA序列为SEQ ID NO.2所示的DNA序列经缺失、替换或添加中的至少一种编辑方式突变至少一个氨基酸残基的密码子得到的DNA序列；
b3)能与b1)或b2)的DNA序列杂交的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的编码抗逆性相关蛋白的DNA序列，其特征在于，所述编码抗逆性相关蛋白的DNA序列包括：编码区包含SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.22所表示的序列的DNA序列。
3.根据权利要求1或2所述的编码抗逆性相关蛋白质的DNA序列，其特征在于，所述抗逆性包括抗旱性和/或耐盐性；所述抗旱性指对抗失水逆境的能力；所述耐盐性指对盐胁迫的耐受能力。
4.根据权利要求3所述的编码抗逆性相关蛋白质的DNA序列，其特征在于，所述盐胁迫为与钠离子终浓度为150mM～200mM的逆境相同或等同的逆境。
5.根据权利要求3所述的编码抗逆性相关蛋白质的DNA序列，其特征在于，所述失水逆境为与Mannitol终浓度为300mM～500mM的逆境相同或等同的逆境。
6.一种扩增权利要求1所述的编码抗逆性相关蛋白质的DNA序列中任意片段的引物。
7.一种抗逆性相关的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质包括由权利要求1所述的DNA序列所编码，并通过生物表达和/或人工合成得到的蛋白质。
8.根据权利要求7所述的抗逆性相关的蛋白质，其特征在于，所述的抗逆性相关的蛋白质包括：包含SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的蛋白质。
9.一种权利要求1所述的DNA序列在生物工程领域的应用，其特征在于，包括制备含有所述DNA序列的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
10.一种编码抗逆性相关蛋白的DNA序列在获得抗逆性增强的转基因植物中的应用；所述编码抗逆性相关蛋白的DNA序列包括权利要求1所述的DNA序列、包含SEQ ID NO.2所示的序列的DNA序列或包含能与SEQ ID NO.2所示的序列杂交且编码抗逆性相关蛋白的DNA序列。
抗逆性相关蛋白质及其编码基因和应用
技术领域
背景技术
[0002] 紫花苜蓿是豆科苜蓿属多年生草本植物，是世界上畜牧业最依赖的饲草之一，栽培时间也最久。紫花苜蓿凭借产量高、根系发达、适应性强和再生能力强等特点，获得了“牧草之王”的美誉。我国种植苜蓿己有2000多年的历史，主要分布于西北、华北、东北地区。苜蓿生产早己植根于我国传统农业体系中。苜蓿的营养价值很高，粗蛋白质、维生素和矿物质含量很丰富，蛋白质的氨基酸种类比较齐全，动物必需的氨基酸含量高。苜蓿适口性好，各种家畜均喜欢采食。幼嫩的苜蓿可作为猪、禽良好的蛋白质、维生素补充饲料，青饲可以增加奶牛产奶量。苜蓿产业化带动整个草业的发展，也带动草业和农业的持续发展，使我国苜蓿进入了产业化。苜蓿产业化的发展带动了其它牧草得以快速发展，极大地带动了整个草业的产业化进程。苜蓿产业是解决饲料蛋白质短缺、增畜节粮、发展畜牧业的重要途径。苜蓿这一丰富的蛋白资源如果能得到科学利用，可提高20-30％的饲料利用率，节省粮食50-1200万吨，而且苜蓿经过腹还田，可为农业提供充足的有机粪肥。目前苜蓿草产品不仅在国内市场需求量很大，猪禽配合饲料中仅按5％的不理添加苜蓿草粉，总共就需要60万吨苜蓿草粉；在国际市场上也有很大的需求，日本每年需进口干草2600余万吨，韩国、新加坡及我国港、台地区也需求大量的苜蓿草产品。叶蛋白特别是苜蓿叶蛋白属于优质的植物性蛋白饲料，在配合饲料中应用叶蛋白，可以替代部分或全部其他蛋白原料。我国蛋白质资源缺乏，如果有充足的叶蛋白原料，将解决或缓解我国蛋白质资源缺乏这一现状。
[0003] 我国的地理状况是长江以北以及沿海许多地区，土壤中盐含量往往过高，对植物造成危害。这种由于土壤盐碱含量过高对植物造成的危害称为盐害，植物对盐害的适应能力叫抗盐性。土壤含盐量超过0.2％～0.25％时就会造成危害。钠盐是形成盐分过多的主要盐类，习惯上把盐分过多的土壤统称为碱土。世界上盐碱土面积很大，估计占灌溉农田的三分之一，约4×107ha，而且随着灌溉农业的发展，盐碱面积将继续扩大。我国盐碱土主要分布于西北、华北、东北和海滨地区，盐碱土总面积约2～7×107ha，而且这些地区都属平原，盐地土层深厚。
[0004] 由于在我国苜蓿不是主要的粮食作物，因此一般不会将苜蓿种植在水土条件良好的地区，同时又因为干旱和盐渍地区在我国占地面积较大，干旱和盐渍地区不宜种植粮食作物，故苜蓿等牧草常被种植于干旱和盐渍地区，而苜蓿即大多数牧草的抗寒、抗旱、抗盐碱性差，很难抵抗环境中的逆境胁迫。
[0005] 在非生物胁迫条件下，植物形态会受到影响，包括叶片颜色、叶片萎蔫程度、生长速度、茎直立程度、根系萎蔫程度及营养生长的时间长短等。植物的生理水平上也会产生变化，包括代谢紊乱、细胞结构和功能受损、蛋白表达水平受到抑制、光合作用受到抑制。植物为了保护自己，会产生一些响应，这个响应过程可以分为三步：(1)细胞感知和转导接收到的外界信号并产生胞间信使；(2)胞间信使在细胞和组织之间传递，最后传递到受体细胞；(3)受体细胞接收到信号后，对此信号产生响应，受体组织也在结构和功能上发生相应的变化，以此来提高自己的适应性或抗性。
[0006] 在失水逆境下，抗旱植物表现为：较厚叶片角质层、较厚栅栏组织、表面有茸毛，茎中维管束细胞排列紧密，主根长、根系较庞大等。在盐胁迫下，表现为主根长、根体积和表面积都有所增加等。在干旱和盐胁迫下植物体内会产生较多的活性氧，使植物的氧化能力受到威胁即氧化胁迫。另外，这两种胁迫可能还会产生渗透胁迫，影响渗透有关的物质，包括(1)小分子有机化合物，包括：脯氨酸、糖类、甜菜碱等；(2)蛋白质，包括：晚期胚胎丰富蛋白(LEAs)、水通道蛋白(AQPs)、热激蛋白(Hsps)等。这两种胁迫也会造成离子胁迫，使植物中Na+、K+、Ca+、Cl-无机离子含量的变化，从而影响植物的生理功能。
[0007] 土壤盐分过多对植物带来如下的危害：
[0008] 1.生理干旱：土壤中可溶性盐类过多，由于渗透势增高而使土壤水势降低，根据水从高水势向低水势流动的原理，根细胞的水势必须低于周围介质的水势才能吸水，所以土壤盐分愈多根吸水愈困难，甚至植株体内水分有外渗的危险。因而盐害的通常表现实际上是旱害，尤其在大气相对湿度低的情况下，随蒸腾作用加强，盐害更为严重，一般作物在湿季耐盐性增强。
[0009] 2.离子的毒害作用：在盐分过多的土壤中植物生长不良的原因，不完全是生理干旱或吸水困难，而是由于吸收某种盐类过多而排斥了对另一些营养元素的吸收，产生了类似单盐毒害的作用。
[0010] 3.破坏正常代谢：盐分过多对光合作用、呼吸作用和蛋白质代谢影响很大。盐分过多会抑制叶绿素生物合成和各种酶的产生，尤其是影响叶绿素-蛋白复合体的形成。盐分过多还会使PEP羧化酶与RuBP羧化酶活性降低，使光呼吸加强。生长在盐分过多的土壤中的作物(棉花、蚕豆、番茄等)，其净光合速率一般低于淡土的植物，不过盐分过多对光合作用的影响是初期明显降低，而后又逐渐恢复，这似乎是一种适应性变化。盐分过多对呼吸的影响，多数情况下表现为呼吸作用降低，也有些植物增加盐分具有提高呼吸的效应。盐分过多对植物的光合与呼吸的影响尽管不一致，但总的趋势是呼吸消耗增多，净光合速度降低，不利于生长。
[0011] 可见干旱、高盐的环境给苜蓿生长带来了不可忽视的损害，严重影响了我国苜蓿产业的发展。在我国的西北、华北、东北等主要种植地区，干旱和盐渍化地区占地面积较大，除了紫花苜蓿，还有许多生长在上述地区的其他饲草或者其他植物也同样面临着干旱和盐渍化的胁迫。而当今社会，畜牧业及其附属产品对人们的生活越来越重要，实际生产中紫花苜蓿或其他饲草的种植规模有限，所以结合实际生产中畜牧业的发展对紫花苜蓿或其他饲草的需求以及其种植现状，研究和改进紫花苜蓿或其他植物的自身对环境的适应能力变得十分重要，对于推动我国乃至世界畜牧业的发展具有重要意义。
发明内容
[0012] 本发明的目的在于提供一种抗逆性相关蛋白(MsDIUP)或改良的抗逆性相关蛋白及其编码基因。
[0013] 本发明还提供了上述抗逆性相关蛋白或改良的抗逆性相关蛋白MsDIUP及其编码基因在培育植物抗逆种中的应用。
[0014] 本发明技术方案平衡了以紫花苜蓿为代表的牧草自身的生长特性与种植地自然条件的矛盾，解决了我国现有的牧草需求和良田面积有限的难题，同时还为其它非粮食类经济作物(如烟草、药用植物等)提供了改良得到功能增强的新品种的方案，对我国畜牧业、农业、林业等带来了实质性的影响。
[0015] 本发明通过以下技术方案实现：
[0016] 一种编码抗逆性相关蛋白质的DNA序列，包括与如下b1)-b3)中的任一种DNA序列具有至少90％的相似性的DNA序列：
[0018] b2)编码区包括重组DNA序列的编码抗逆性相关蛋白的DNA序列；所述重组DNA序列为SEQ ID NO.2的所示的DNA序列经缺失、替换或添加中的至少一种编辑方式突变至少一个氨基酸残基的密码子得到的DNA序列；
[0019] b3)能与b1)或b2)所述的DNA序列杂交的DNA序列。
[0020] 进一步的，所述编码抗逆性相关蛋白的DNA序列包括但不限于编码区包含SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.22所表示的序列的DNA序列。
[0021] 进一步的，所述b3)中涉及的杂交操作需要在严格条件下进行；所述的严格条件为：6×SSC，0.5％SDS的溶液中，65℃下完成杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
[0022] 一种抗逆性相关的蛋白质，由上述DNA序列编码，并通过生物表达和/或人工合成得到。
[0023] 进一步的，所述的抗逆性相关的蛋白质包括：包含SEQ ID NO.1(MsDIUP，DNA序列为SEQ ID NO.2)、SEQ ID NO.3(第70个氨基酸由E取代V，DNA序列为SEQ ID NO.18)、SEQ ID NO.4(第78个氨基酸由D取代E，DNA序列为SEQ ID NO.19)、SEQ ID NO.5(第118个氨基酸由S取代A，DNA序列为SEQ ID NO.20)、SEQ ID NO.6(第96个氨基酸后用17个(RKLIIEPNEDLFVFVHE)氨基酸序列替代原序列的6个(VHENHP)氨基酸序列，DNA序列为SEQ ID NO.21)、SEQ ID NO.7(第12～13两个氨基酸的序列(PQ)缺失，DNA序列为SEQ ID NO.22)所示的氨基酸序列的蛋白质。
[0024] 进一步的，所述抗逆性包括抗旱性和/或耐盐性；所述抗旱性指对抗失水逆境的能力；所述耐盐性指对盐胁迫的耐受能力。
[0025] 进一步的，所述盐胁迫表现为与钠离子终浓度为150mM～200mM的模拟逆境相同或等同的自然逆境。
[0026] 进一步的，所述失水逆境具体为与Mannitol终浓度为300mM～500mM的模拟逆境相同或等同的自然逆境。
[0027] 本发明还提供扩增上述DNA序列中任意片段的引物；所述引物包括如序列SEQ ID NO.8至SEQ ID NO.17中所示的至少一条引物序列。
[0028] 本发明还提供一种含有上述DNA分子的表达盒、重组菌、转基因细胞系或重组载体等。
[0029] 其中，上述的重组载体为将上述DNA序列插入植物表达载体，得到表达上述蛋白质的重组载体。所述植物表达载体类型既可以是传统酶切载体也可以是Gateway系统的重组载体，也可以是未来出现的适用于本发明DNA序列的表达载体。所述植物表达载体具体包括植物微弹轰击的载体和可用于双元农杆菌载体等。
[0030] 一种获得抗逆性增强的转基因植物新品种的方法，包括步骤：
[0032] 进一步的，上述任意所述的方法中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；优选为拟南芥。拟南芥是在植物科学，包括遗传学和植物发育研究中的模式生物之一。
[0033] 进一步的，所述转基因植物的制备方法中，所述的编码基因通过重组表达载体导入植物；所述重组表达载体是将所述编码基因插入Gateway系统载体pEarleyGate 100的重组位点得到的。
[0034] 一种获得抗逆性增强的转基因植物品种。
[0035] 上述植物抗逆性相关蛋白质及其编码基因在增强植物抗逆性中的应用。比如用于烟草、拟南芥等。
[0036] 本发明的有益效果：
[0037] 本发明从豆科植物紫花苜蓿中克隆得到的编码基因，在失水、盐和植物激素脱落酸的诱导下表达增加，编码的蛋白定位到细胞核、叶绿体和细胞膜上；并且本发明的编码基因及其改良的编码基因转入植物后可以提高目的植物抗失水能力和耐盐性，本发明对研究相关的抗盐、抗失水相关调控基因提供思路和方法，对培育和获得具有抗盐、抗失水性的豆科植物具有重要的参考及借鉴意义。
[0038] 本发明明确了蛋白质MsDIUP的功能，并将其应用于功能增强品种的培养。本发明的重组DNA序列及所编码的蛋白对原始蛋白及其编码基因的抗逆性(尤其是抗旱性和耐盐碱性能)增强，有利于培育抗逆性更强的植物品种或者改造其它植物的抗逆性。抗旱性和耐盐碱性能增强表现在转基因植物种子在失水和盐害环境下种子萌发更快、萌发率更高，植株根系发达、根长更长等。
[0039] 本发明提供了一种在功能不明确的MsDIUP蛋白，首先通过实验验证确定了MsDIUP蛋白的具体定位与生理功能，然后将其应用于植物遗传学研究，将MsDIUP蛋白的原始编码序列中与抗失水能力和抗盐害能力相关的序列进行突变，得到一系列序列和功能性高同源的功能增强的突变序列，并将编辑MsDIUP蛋白与抗失水能力和抗盐害能力相关的序列及其突变后的同源序列用于改造其他植物在抗失水和/或抗盐害能力上。平衡了以紫花苜蓿为代表的牧草自身的生长特性与种植地自然条件的矛盾，解决了我国现有的牧草需求和良田面积有限的难题，同时还为其它非粮食类经济作物(如烟草、药用植物等)提供了改良得到功能增强的新品种的方案，对我国畜牧业、农业、林业等带来了实质性的影响。附图说明
[0040] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，值得说明的是，以下附图仅示出了本发明的某些实施方式的相关附图，不能被看作是对本发明保护范围的限定。
[0041] 图1为MsDIUP与其他14个物种的氨基酸序列同源性比对。
[0042] 图2为MsDIUP基因受胁迫诱导时的Real-time PCR表达结果图。其中图表(A)为Mannitol终浓度为500mM条件下地上部分和地下部分MsDIU蛋白在各时间点的表达情况；图表(C)为NaCl终浓度为150mM条件下地上部分和地下部分MsDIU蛋白在各时间点的表达情况；图表(E)为植物激素脱落酸终浓度为80μM条件下地上部分和地下部分MsDIU蛋白在各时间点的表达情况。
[0043] 图3为MsDIUP在烟草叶片中的亚细胞定位。其中3-1为DIUP的GFP荧光图像；3-2为叶绿体marker的荧光图像；3-3为明场图像；3-4为3-1、3-2、3-3重合图像。
[0044] 图4为分子检测在转基因拟南芥中的目的基因；其中(A)为电泳图，M为DL500Marker,(-)为水对照，(+)为阳性对照，1-20为T3代20个纯合株系；(B)为相关蛋白表达情况柱状图，WT为野生型，OE1至OE20为T3代20个纯合株系。
[0045] 图5为转基因和野生型拟南芥抗旱性和耐盐性比较的对比结果图。其中5A为T3代株系OE11、OE13、OE19和野生型株系WT分别在MS培养基、含有300mM manntiol的MS培养基和含有150mM NaCl的MS培养基上生长的根系对比图；5B为T3代株系OE11、OE13、OE19和野生型株系WT分别在正常供水(Before drought treatment)、失水处理(After drought treatment for 20 days)和复水处理后(After re-watering for 4 days)的生长情况对比；5C为T3代株系OE11、OE13、OE19和野生型株系WT分别在盐处理前(Before salt treatment)、盐处理后12天(After salt treatment for 12 days)和盐处理后22天(After salt treatment for 122 days)的生长情况对比。
具体实施方式
[0046] “由/通过……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的配方、步骤、方法、制品或装置不必仅限于这些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
[0047] 当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“3～8”时，所描述的范围应被解释为包括范围“3～7”、“3～6”、“3～5”、“3～4和4～5”、“5～6和7”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
[0048] 在这些实施例中，除非另有指明，所述的份和百分比均按质量计。
[0049] “和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生。
[0050] 本发明提供一种抗逆性相关蛋白质的DNA序列，包括与如下b1)-b3)中的任一种DNA序列具有至少90％相似性的DNA序列：
[0051] b1)编码区包括序列表SEQ ID NO.2所示的DNA序列；
[0052] b2)编码区包括重组DNA序列的编码抗逆性相关蛋白的DNA序列；所述重组DNA序列为SEQ ID NO.2所示的DNA序列经缺失、替换或添加中的至少一种编辑方式突变至少一个氨基酸残基的密码子得到的DNA序列；
[0053] b3)能与b1)或b2)的DNA序列杂交且编码抗逆性相关蛋白的DNA序列。
[0054] 在一些实施例中，所述编码抗逆性相关蛋白的DNA序列包括但不限于编码区包含SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.22所表示的序列的DNA序列。
[0055] 在一些实施例中，所述b3)中涉及的杂交操作需要在严格条件下进行；所述的严格条件为：6×SSC，0.5％SDS的溶液中，65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
[0056] 本发明还提供一种抗逆性相关的蛋白质，由上述DNA序列编码，通过生物表达和/或人工合成得到的蛋白质。
[0057] 在一些实施例中，所述的抗逆性相关的蛋白质包括：包含SEQ ID NO.1(MsDIUP)、SEQ ID NO.3(第70个氨基酸E取代V)、SEQ ID NO.4(第78个按氨基酸D取代E)、SEQ ID NO.5(第118个氨基酸S取代A)、SEQ ID NO.6(第96个氨基酸后用17个(RKLIIEPNEDLFVFVHE)氨基酸序列替代原序列的6个(VHENHP)氨基酸序列)、SEQ ID NO.7(第12～13两个氨基酸缺失，缺失序列为PQ)所示的氨基酸序列的蛋白质。
[0058] 上述例举的突变DNA序列的编码区均与SEQ ID NO.2中所示的DNA序列有至少90％的相似性，为SEQ ID NO.2的高度同源序列，他们所编码的蛋白质均与SEQ ID NO.2所编码的蛋白有高度相似的抗逆性。
[0059] 在一些实施例中，所述抗逆性具体为抗旱性和耐盐性；所述抗旱性指对抗失水逆境的能力；所述耐盐性指对盐胁迫的耐受能力。
[0060] 在一些实施例中，所述盐胁迫表现为于钠离子终浓度为150mM～200mM的模拟逆境相同或等同的逆境。
[0061] 在一些实施例中，所述失水逆境具体为与Mannitol终浓度为300mM～500mM的模拟逆境相同或等同的逆境。
[0062] 本发明还提供扩增上述DNA序列中任意片段的引物对所述引物。
[0063] 在一些实施例中，所述引物包括如序列SEQ ID NO.8至SEQ ID NO.17所示的引物序列中的至少一条引物序列。
[0064] 本发明还提供含有上述DNA序列的表达盒、重组菌、转基因细胞系或重组载体。
[0065] 其中，上述的重组载体为将上述DNA序列插入植物表达载体，得到表达上述蛋白质的重组载体。所述植物表达载体类型既可以是传统酶切载体也可以是Gateway系统的重组载体，也可以是未来出现的适用于本发明DNA序列的表达载体。所述植物表达载体具体包括植物微弹轰击的载体和可用于双元农杆菌载体等。
[0066] 本发明还提供一种获得抗逆性增强的转基因植物新品种的方法，包括步骤：
[0067] 将上述任意一种所述植物的编码基因或其CDS区域导入了目的植物基因组中，获得转基因植物种子；将转基因植物种子人工培育或自然生长成植株。与目的植物相比，转基因植物的抗逆性增强。
[0068] 在一些实施例中，所述转基因植物的制备方法中，所述的编码基因导入是通过重组表达载体导入实现的；所述重组表达载体是将所述编码基因插入Gateway系统载体pEarleyGate 100的重组位点得到的。
[0069] 在一些实施例中，上述的制备方法中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；优选为拟南芥。
[0070] 本发明还提供一种获得抗逆性增强的转基因植物新品种。
[0071] 本发明的方案还包括将上述植物抗逆性相关蛋白质及其编码基因在增强植物抗逆性中的应用。比如用于烟草、拟南芥、紫花苜蓿等。
[0072] 干旱、高盐的环境给作物生长带来了不可忽视的损害，间接影响到了我国的农业、畜牧业和林业的发展。本发明提供的技术方案从遗传学上对植物品种进行了优化，在不改变植物基本的生理结构和营养价值的前提下，通过对抗逆性相关的MsDIUP基因的改造和利用，提升了植物对环境逆境胁迫的耐受能力，在无法改变土地质量的情况下，让植物能趋近于正常生长。
[0073] 本发明技术方案对于推动我国乃至世界畜牧业、农业、林业的发展具有重要意义。
[0074] 以下示出和描述的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
[0075] 实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0076] 本发明提供的抗逆性相关的蛋白质，源于紫花苜蓿(Medicago sativa L.)，是一种功能未知的LEA家族蛋白，命名为MsDIUP(Drought-Induced Unknown Protein)；所述抗逆性相关的蛋白质MsDIUP,由127个氨基酸残基组成。
[0077] 实施例1：克隆和测序MsDIUP编码基因，包括以下步骤：
[0078] 植物材料：紫花苜蓿中苜1号。
[0079] 在正常条件下将健康饱满的种子在铺好双层滤纸的培养皿中萌发5天，当幼苗子叶展开后，移至配好的PH5.8的1/2MS营养液。培养7天后，在1/2MS营养液中添加NaCl至终浓度为150mM，处理24小时，分别快速的取植物地上部分和地下部分，在液氮速冻，在-80℃保存备用。
[0080] 提取样品的RNA用Trizol提取法，然后用cDNA合成反转录试剂盒反转录成cDNA。PCR的检测体系的总体积为20μl，体系为引物(SEQ ID NO.8)MsDIUP-F(5′-3′)：
atgcttcacacaataaagactg 1μl，引物(SEQ ID NO.9)MsDIUP-R(5′-3′)：
ctaagcattggcgctgctct 1μl，2×EcoTaq PCR SuperMix 10μl，ddH2O 6μl和cDNA 2μL；反应程序为：第一轮：94℃预变性3min；第二轮：94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，第二轮循环38次；第三轮：72℃延伸7min；16℃终止，反应完成。
atgcttcacacaataaagactg 1μl，引物(SEQ ID NO.9)MsDIUP-R(5′-3′)：
ctaagcattggcgctgctct 1μl，2×EcoTaq PCR SuperMix 10μl，ddH2O 6μl和cDNA 2μL；反应程序为：第一轮：94℃预变性3min；第二轮：94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，第二轮循环38次；第三轮：72℃延伸7min；16℃终止，反应完成。
[0081] 用1％琼脂糖中电泳检测结果，目的基因的长度为381bp，回收该基因的DNA片段连接pMD19-T载体后，转入到大肠杆菌DH5α感受态细胞。在含Amp、IPTG和X-Gal的LB抗性平板涂上含pMD19-T-MsDIUP的大肠杆菌，在37℃培养箱中过夜培养，检测并挑选合适的阳性克隆菌斑，挑入含有Amp抗性的液体菌落中，在37℃摇床中200转过夜培养。菌液检测合适后送上海生工生物工程有限公司进行测序。测序结果表明菌落具有SEQ ID NO.2中的核苷酸序列，将其命名为MsDIUP基因，将该基因编码的蛋白命名为MsDIUP蛋白，蛋白序列如SEQ ID NO.1所示。
[0082] MsDIUP蛋白在GeneBank上与其他14个物种进行比对(结果如图1)，与蒺藜苜蓿的XP003611987.1同源性最高，该基因在这些物种中的同源基因功能未知。
[0083] 实施例2：实时荧光定量PCR分析MsDIUP编码基因的表达特性
[0084] 包括如下步骤：
[0085] 紫花苜蓿种子萌发和水培同实施例1。用12d的紫花苜蓿幼苗进行胁迫处理：
[0086] 干旱处理：在1/2MS水培营养液中添加Mannitol至终浓度为500mM，处理时间分别为0，1，3，6，12和24小时。分别快速的取植物地上部分和地下部分，样品在液氮速冻，在-80℃保存备用。
[0087] 盐处理：在1/2MS水培营养液中添加NaCl至终浓度为150mM，处理时间分别为0，1，3，6，12和24小时。分别快速的取植物地上部分和地下部分，样品在液氮速冻，在-80℃保存备用。
[0088] 植物激素脱落酸处理：在1/2MS水培营养液中添加植物激素脱落酸至终浓度为80μM，处理时间分别为0，1，3，6，12和24小时。分别快速的取植物地上部分和地下部分，每个样品设置3个技术重复，样品在液氮速冻，在-80℃保存备用。
[0089] 样品RNA提取和反转录cDNA方法同实施例1。将cDNA稀释成50ng/μL。用(SEQ ID NO.10)qRTMsDIUP-F(5′-3′)：ggtctgatgaagaaggatttggag1μl和(SEQ ID NO.11)qRTMsDIUP-R(5′-3′)：gtgtcttgtcataatctgggtgat对样品进行扩增检测目的基因，以MsACTIN-F(5′-3′)：actggaatggtgaaggctgg和MsACTIN-R(5′-3′)：tgacaataccgtgctcaatgg作为内参。qRT-PCR检测体系的总体积为20μl，体系为引物qRTMsDIUP-F 0.5μl，引物qRTMsDIUP-R 0.5μl，2xSG Fast qPCR Master Mix 10μl，DNF buffer 2μl，ddH2O 5μl和cDNA 2μl；反应程序为：第一轮：95℃预变性10min；第二轮：95℃变性15s，60℃退火1min，第二轮循环40次，反应完成。仪器为ABI7500实时荧光定量PCR。
[0090] 计算相对表达量的方法为2-ΔΔCt方法。ΔΔCt＝(Ct.目的基因-Ct.内参基因)Time x-(Ct.目的基因-Ct.内参基因)Time 0；Time x表示逆境处理时间，即X代表1，3，6，12或24小时。Time 0表示没有经过逆境处理。作图软件为Origin 9。
[0091] 实验结果见图2(见图表(A)、图表(C)和图表(E))，MsDIUP基因在紫花苜蓿的地上部分中仅对Mannitol胁迫有显著影响，MsDIUP基因在紫花苜蓿的地下部分中对Mannitol、NaCl和植物激素脱落酸都有显著影响。表明MsDIUP在逆境条件下基因水平受到影响，但在地上和地下受到影响程度不同，MsDIUP在紫花苜蓿地下部分受到的影响更大。
[0092] 实施例3：MsDIUP亚细胞定位分析
[0093] 包括如下步骤：
[0094] 1.材料准备
[0095] 本实例中的植物材料为本氏烟草。在正常条件下将健康饱满的种子在离心管中用蒸馏水浸泡2小时，在每个小穴盘中分散点播2-3粒种子，6-7周后烟草可接受侵染。
[0096] 2.亚细胞载体的构建
[0097] 根据MsDIUP基因的序列设计引物MsDIUP-GFP-F和MsDIUP-GFP-R，引物5′端分别引入XhoI和SaI I酶切位点：
[0098] (SEQ ID NO.12)MsDIUP-GFP-F(5′-3′)：
[0099] cgctcgagatgcttcacacaataaagactg
[0100] (SEQ ID NO.13)MsDIUP-GFP-R(5′-3′)：gtgtcgacagcattggcgctgctct
[0101] 以实施例1中的紫花苜蓿的cDNA为模板，使用MsDIUP-GFP-F和MsDIUP-GFP-R进行PCR扩增。PCR扩增体系的总体积为50μl，其中包括5×Phusion HF Buffer 10μl，2.5mM dNTP 4μl引物MsDIUP-GFP-F 1μl；MsDIUP-GFP-R 1μl，ddH2O 32.5μl，Phusion DNA Polymerase 0.5μl和cDNA 1μl；扩增条件为，第一轮：98℃预变性30s；第二轮：98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸15s，第二轮循环32次；第三轮：72℃延伸5min；第四轮：16℃终止。用1％琼脂糖中电泳检测结果，目的基因的约为400bp。
[0102] 回收纯化PCR扩增产物：用限制性内切酶XhoI和SaI I酶切，回收酶切后的PCR产物，酶切产物的大小为391bp；同样，用限制性内切酶XhoI和SaI I对PBI121-GFP表达载体酶切，酶切产物的大小为1.4kb。
[0103] 将目的基因的酶切产物和PBI121-GFP表达载体的酶切产物用DNA连接酶(TaKaRa，货号：6022)连接。热击连接产物转入到大肠杆菌DH5α感受态细胞，在37℃培养箱中过夜培养，检测并挑选合适的阳性克隆菌斑送测序。选取MsDIUP测序序列与其CDS序列完全一致的阳性克隆菌落提质粒，并转入到农杆菌EHA105，得到重组农杆菌EHA105/pBI121-MsDIUP-GFP，将菌液与50％甘油按1:1的体积比例混合，液氮速冻，-80℃保存备用。
[0104] 从-80℃取重组农杆菌EHA105/pEarleyGate100-MsDIUP置于冰上，挑取部分冻住的菌块与3mL LB液体中，抗性为利福平和卡那霉素，在28℃和200rpm的摇床中摇24小时。
[0105] 取50μL小摇菌液加入到100ml LB液体中，抗性为利福平和卡那霉素，在28℃和200rpm的摇床中摇16～20小时，摇到OD600＝0.5～1。
[0106] 取部分大摇菌液离心，转速4500g，离心时间15min，倒掉LB液体，使用MS重悬液重悬和稀释至OD600＝0.4～0.6，在28℃和120rpm复苏2～3h，即可注射烟草叶片。
[0107] 3.注射法转化烟草叶片
[0108] 注射前一天给烟草浇充足的水，在光培养2～3h，使烟草处于健康饱满的状态。用1mL注射器将菌体从烟草叶背面无叶脉出注射进入叶片，叶片不要有太多注射孔。注射完后，黑暗处理24小时，再在光照下生长24～96小时即可切片观察。
[0109] 使用仪器为荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。
[0110] 观察方法：取注射孔附近健康的一小片叶片置于载玻片上，先在荧光显微镜下观察，若表达则用共聚焦显微镜拍照，以转叶绿体Maker(mCherry，RFP)的烟草作为maker。
[0111] 结果如图3所示(包括3-1、3-2、3-3和3-4)，MsDIUP基因定位于细胞核，叶绿体和细胞膜上。
[0112] 实施例4：MsDIUP在提高拟南芥抗逆性中的应用
[0113] 值得说明的是：拟南芥作为模式植物，本发明利用其对MsDIUP基因进行功能分析和验证，其结论可以认为等同于紫花苜蓿中MsDIUP调控植物响应干旱和盐的分子机理。
[0114] 本实施例实验操作包括如下步骤：
[0115] 一、转MsDIUP拟南芥的制备
[0116] 1.重组载体的构建
[0117] 1)MsDIUP基因的TOPO克隆
[0118] 试剂为pENTRTM Directional Cloning Kits试剂盒(Invitrogen公司，货号：K2400-20)和Phusion高保真酶(Thermo Fisher Scientific公司，货号：F530-S)。根据MsDIUP基因的序列设计引物对(MsDIUP-GT-F和MsDIUP-GT-R)，上游引物5′端引入“CACC”PENTR/D-TOPO入门载体的识别位点：
[0119] (SEQ ID NO.14)MsDIUP-GT-F：caccatgcttcacacaataaagactg；
[0120] (SEQ ID NO.15)MsDIUP-GT-R：ctaagcattggcgctgctct。
[0121] PCR检测体系的总体积为50μl，体系为MsDIUP-GT-F 1μl；MsDIUP-GT-R1μl，5×Phusion HF Buffer 10μl，2.5mM dNTP 4μl，ddH2O 32.5μl，Phusion DNA Polymerase 0.5μl和cDNA 1μl；反应程序为：第一轮：98℃预变性30s；第二轮：98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸10s，第二轮循环32次；第三轮：72℃延伸5min；16℃终止，反应完成。得到大小为
381bp的PCR产物。
381bp的PCR产物。
[0122] 2)TOPO连接
[0123] 纯化PCR产物并连接PENTR/D-TOPO入门载体。热击连接产物转化大肠杆菌DH5α，37℃过夜培养，检测并挑选合适的阳性克隆菌斑送测序。
[0124] 3)LR连接
[0125] 选取MsDIUP测序序列与其CDS序列完全一致的阳性克隆菌落提质粒，使用LRII Plus Enzyme Mix(Invitrogen公司，货号：11791-020)将入门载体质粒与
pEarleyGate 100表达载体进行LR连接反应。热击连接产物转化大肠杆菌DH5α，37℃过夜培养，PCR检测阳性克隆并提质粒。
pEarleyGate 100表达载体进行LR连接反应。热击连接产物转化大肠杆菌DH5α，37℃过夜培养，PCR检测阳性克隆并提质粒。
[0126] 4)重组农杆菌获得
[0127] 用重组的pEarleyGate100-MsDIUP载体转入到农杆菌EHA105，得到重组农杆菌EHA105/pEarleyGate100-MsDIUP，将菌液与50％甘油按1:1的体积比混合，液氮速冻，-80℃保存备用。
[0128] 2.转MsDIUP拟南芥获得
[0129] 从-80℃取出重组农杆菌EHA105/pEarleyGate100-MsDIUP置于冰上，挑取部分冻住的菌块与3mL LB液体中，抗性为利福平和卡那霉素，在28℃和200rpm的摇床中摇24小时。
[0130] 取2ml小摇菌液加入到200ml LB液体中，抗性为利福平和卡那霉素，在28℃和200rpm的摇床中摇20-24小时，摇到OD600＝1.2-2.0。
[0131] 取部分大摇菌液离心，转速4500g，离心时间15min，倒掉LB液体，使用5％蔗糖重悬和稀释至OD600＝0.8的花浸泡缓冲液。
[0132] 将拟南芥(哥伦比亚生态型Col-0)花序(前两天可以剪掉果荚，提高转染效率)浸泡入侵染液中，侵染3-5秒；
[0133] 浸泡完毕后，取出花盆，黑暗处理24小时，于温室中继续培养。1周后侵染第2次。
[0134] 收获T1代种子，筛选阳性植株用草铵膦(PPT，10mg/mL)筛选，传代，直至T3代获得纯合株系。
[0135] T2代表示T1代自交产生的种子及种子生长所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及种子生长所长成的植株。
[0136] 以T3代再生植株的整个植株的DNA作为模板，用目的基因引物对(SEQ ID NO.16)[35sF(5′-3′)：gcacaatcccactatccttc和(SEQ ID NO.17)MsDIUP-R(5′-3′)：ctaagcattggcgctgctct]，以及Bar引物对Bar-F(5′-3′)：tgcaccatcgtcaaccacta和Bar-R(5′-3′)：acagcgaccacgctgttgaa]进行PCR扩增。目的基因和Bar基因的PCR检测体系和扩增条件一致。PCR检测体系为：PCR的总体积为20μl，其中包括2×EcoTaq PCR SuperMix 10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，ddH2O 6μl和DNA模板(50ng/μl)，2μl；扩增条件为：(1)94℃预变性4min；(2)94℃变性30s；(3)56℃退火30s；(4)72℃延伸30s；(5)2-4步骤循环35次；(6)
72℃延伸7min。结果如图4中(A)所示，T3代20个纯合株系在381bp扩增出单一条带。
72℃延伸7min。结果如图4中(A)所示，T3代20个纯合株系在381bp扩增出单一条带。
[0137] 提取T3代再生植株的整个植株的RNA，并反转录成cDNA作为模板，用目的基因部分片段引物对qRTMsDIUP-F和qRTMsDIUP-R，以及内参基因对AtACTIN-F(5′-3′)tgtgccaatctacgagggttt和AtACTIN-R(5′-3′)tttcccgctctgctgttgt进行qRT-PCR扩增。
qRT-PCR体系包括2xSG Fast qPCR Master Mix 10μl，引物qRTMsDIUP-F 0.5μl，引物qRTMsDIUP-R 0.5μl，DNF buffer 2μl，ddH2O 5μl和cDNA 2μl，总体积为20μl。qRT-PCR扩增条件为：(1)95℃预变性10min；(2)95℃变性15s；(3)60℃退火1min；(4)步骤(2)至(3)循环
40次。结果如图4中(B)所示，MsDIUP在野生型株系(WT)中不表达，而在纯合株系中有不同程度的表达。从纯合株系中挑选3个高表达株系进行后续的生理分析。
qRT-PCR体系包括2xSG Fast qPCR Master Mix 10μl，引物qRTMsDIUP-F 0.5μl，引物qRTMsDIUP-R 0.5μl，DNF buffer 2μl，ddH2O 5μl和cDNA 2μl，总体积为20μl。qRT-PCR扩增条件为：(1)95℃预变性10min；(2)95℃变性15s；(3)60℃退火1min；(4)步骤(2)至(3)循环
40次。结果如图4中(B)所示，MsDIUP在野生型株系(WT)中不表达，而在纯合株系中有不同程度的表达。从纯合株系中挑选3个高表达株系进行后续的生理分析。
[0138] 二、转基因植物的抗逆性评价
[0139] 1.转基因植物的抗失水能力性评价
[0140] 1)失水逆境对根长的影响
[0141] 植物材料为T3代转MsDIUP拟南芥的3个代表性株系OE11、OE13、OE19和野生型WT。将每个株系的种子消毒处理后，选健康饱满的种子，用10μL枪头均匀点在培养基上，培养基分为：MS培养基、含有300mM manntiol的MS培养基和含有150mM NaCl的MS培养基上，用封口膜密封，春化3天后，移入温度22℃、光照时间为16h、相对湿度60％的培养箱中培养7天，挑选根系长度一致的3个转基因株系和野生型WT幼苗分别移至MS培养基、含有300mM
manntiol的MS培养基和含有150mM NaCl的MS培养基上，培养12天后统计各株系根长，每个处理设置三个生物学重复，结果取平均值，并计算标准差。
manntiol的MS培养基和含有150mM NaCl的MS培养基上，培养12天后统计各株系根长，每个处理设置三个生物学重复，结果取平均值，并计算标准差。
[0142] 结果如图5中的A所示，在MS平板上，无论是野生型和MsDIUP转拟南芥株系根长基本一致；而在含有300mM manntiol和含有150mM NaCl的平板上，野生型比MsDIUP转拟南芥株系的根长较小。
[0143] 2)土壤失水对转基因植株抗性的影响
[0144] 植物材料为T3代转MsDIUP拟南芥的3个代表性株系OE11、OE13、OE19和野生型WT。将每个株系的种子消毒处理后，选健康饱满的种子，用1mL枪头均匀点在培养基上，封口膜密封，春化3天后，移入温度为22℃，光照时间为16h，相对湿度60％的培养箱中培养14天，将幼苗移小方盆中，每盆土壤重量一致，每盆9株苗，正常条件培养14天后，使每盆土壤吸水至饱和，然后断水，进行失水处理20天，直至野生型植株萎蔫，然后开始复水，正常条件4天，观察植物表型并拍照(图5中的B)。
[0145] 结果如图5B所示，失水前，无论是MsDIUP转拟南芥株系和野生型生长状况基本一致；失水后，野生型明显比转基因株系生长情况要弱；复水后，野生型的存活率比转基因株系要低。
[0146] 2.转基因植物的耐盐性评价
[0147] 1)盐胁迫对根长的影响
[0148] 植物材料为T3代转MsDIUP拟南芥的3个代表性株系OE11、OE13、OE19和野生型WT。将每个株系的种子消毒处理后，选健康饱满的种子，用10μL枪头均匀点在培养基上，培养基分为：MS培养基和含有150mM NaCl或200mM NaCl的MS培养基上，用封口膜密封，春化3天后，移入温度为22℃，光照时间为16h，相对湿度60％的培养箱中培养7天，挑选根系长度一致的
3个转基因株系和野生型WT幼苗移至MS培养基和含有150mM NaCl或200mM NaCl的MS培养基上，培养12天后统计各株系根长，每个处理设置三个生物学重复，结果取平均值，并计算标准差。
3个转基因株系和野生型WT幼苗移至MS培养基和含有150mM NaCl或200mM NaCl的MS培养基上，培养12天后统计各株系根长，每个处理设置三个生物学重复，结果取平均值，并计算标准差。
[0149] 结果如图5A所示，在MS平板上，无论是野生型和MsDIUP转拟南芥株系根长基本一致；而在150mM NaCl或200mM NaCl平板上，野生型比MsDIUP转拟南芥株系的根长较小。
[0150] 2)土壤盐胁迫对转基因植株抗性的影响
[0151] 植物材料为T3代转MsDIUP拟南芥的3个代表性株系OE11、OE13、OE19和野生型WT。将每个株系的种子消毒处理后，选健康饱满的种子，用1mL枪头均匀点在培养基上，封口膜密封，春化3天后，移入温度为22℃，光照时间为16h，相对湿度60％的培养箱中培养14天，将幼苗移小方盆中，每盆土壤重量一致，每盆9株苗，正常条件培养14天后，每个方盆浇100mL的50mM NaCl水溶液，NaCl浓度每天增加50mM，直至终浓度为200mM，以此浓度处理20天，每三天浇一次。观察植物表型、统计存活率并拍照(图5中的C)。
[0152] 结果如图5C所示，盐处理前，无论是MsDIUP转拟南芥株系和野生型生长状况基本一致；干旱后，野生型明显比转基因株系生长情况要弱。
[0153] 本发明实施例仅以MsDIUP为例进行相关实验设计和结果分析，而对于其他突变DNA序列(如SEQ ID NO.18至SEQ ID NO.22)，因为本发明所选的突变序列为核心编码区均与SEQ ID NO.2所示的DNA序列有不少于90％的同源性，且控制相同性状的与MsDIUP高度同源的序列，他们所编码的蛋白质均与MsDIUP蛋白有高度相似的抗逆性，按照上述实施例的实验设计，可以得出相似的实验结果和相同的实验结论。
[0154] 本发明提供了一种在功能不明确的MsDIUP蛋白，首先通过实验验证确定了MsDIUP蛋白的具体定位与生理功能，然后将其应用于植物遗传学研究，将MsDIUP蛋白的原始编码序列中与抗失水能力和抗盐害能力相关的序列进行突变，得到一系列序列和功能性高同源的功能增强的突变序列，并将编辑MsDIUP蛋白与抗失水能力和抗盐害能力相关的序列及其突变后的同源序列用于改造其他植物在抗失水和/或抗盐害能力上。平衡了以紫花苜蓿为代表的牧草自身的生长特性与种植地自然条件的矛盾，解决了我国现有的牧草需求和良田面积有限的难题，同时还为其它非粮食类经济作物(如烟草、药用植物等)提供了改良得到功能增强的新品种的方案，对我国畜牧业、农业、林业等带来了实质性的影响。
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