用于菠菜器官与非生物胁迫应答研究的内参基因及应用
阅读：878发布：2020-05-13
专利汇可以提供用于菠菜器官与非生物胁迫应答研究的内参基因及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 植物 分子 生物 学领域，尤其涉及一组用于菠菜器官与 非生物胁迫 应答研究的内参基因及应用。在不同器官中的所述内参基因为18s rRNA和ARF，在高温胁迫下的所述内参基因为Actin和ARF，在重金属镉胁迫下的所述内参基因为ARF和EF1α，在盐NaCl胁迫下的所述内参基因为COX和18s rRNA，在NaHCO3胁迫下的所述内参基因为RPL和Actin，以及在Na2CO3胁迫下的所述内参基因为ARF和CYP。本发明还提供了内参基因18s rRNA、Actin、ARF、COX、CYP、EF1α和RPL的特异性的正向引物和反向引物，并用bZIP9和HSFB2b基因在高温胁迫下的表达模式验证了本发明的可靠性。，下面是用于菠菜器官与非生物胁迫应答研究的内参基因及应用专利的具体信息内容。
1.一组内参基因在研究菠菜器官及非生物胁迫条件下目的基因表达模式中的应用，其特征在于，在不同器官中的所述内参基因为18s rRNA和ARF，在高温胁迫下的所述内参基因为Actin和ARF，在重金属镉胁迫下的所述内参基因为ARF和EF1α，在盐NaCl胁迫下的所述内参基因为COX和18s rRNA，在NaHCO3胁迫下的所述内参基因为RPL和Actin，以及在Na2CO3胁迫下的所述内参基因为ARF和CYP。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述内参基因18s rRNA、Actin、ARF、COX、CYP、EF1α和RPL的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.19所示。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述内参基因18s rRNA、Actin、ARF、COX、CYP、EF1α和RPL的特异性的正向引物和反向引物分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的应用，其特征在于，所述应用为RT-qPCR，反应条件为：反应体系为20μL，2×AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix10μL，5倍稀释的cDNA模板1μL，10mmol/L正反向引物各0.5μL，ddH2O8μL；反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性
15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，40个循环，65℃-95℃检测溶解曲线。
用于菠菜器官与非生物胁迫应答研究的内参基因及应用
技术领域
背景技术
[0002] 菠菜(Spinacia oleracea)又名赤根菜、波斯菜等，是石竹目苋科菠菜属一年 生草本植物。菠菜富含类葫萝卜素、维生素C、钙和铁等营养元素，是一种倍受人 们喜爱的绿色蔬菜。菠菜原产于亚洲中部和西南部，所以大多数菠菜品种都具有耐 寒性，但对高温敏感。我国南方夏季高温影响菠菜的生长发育，导致菠菜产量和品 质显著下降，其他一些非生物胁迫也同样影响着菠菜的生产。研究菠菜基因功能， 尤其是参与胁迫响应的基因功能已经成为了一个重要议题。而在研究基因功能时， 我们又需要检测目的基因在不同条件下的表达模式。
[0003] 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)出现于1992年，是一种准确、简便的基因表 达水平检-△△Ct测方法。在根据2 方法计算目的基因表达量时，选择合适的内参基因 是通过RT-qPCR检测基因表达水平的关键，使用不正确的内参基因将会导致检测 结果不可靠。RT-qPCR中常用的内参基因通常是看家基因，它们通常具有稳定的 mRNA水平。人们常以18S核糖体RNA(18S rRNA)、肌动蛋白(Actin)和甘油 醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)等作为内参基因，但它们不适用于所有条件。因此， 在RT-qPCR实验中，选择合适的内参基因是非常必要的。
发明内容
[0004] 针对上述技术问题，本发明提供了一组适用于菠菜器官及非生物胁迫应答研究 的内参基因、特异性引物及其在RT-qPCR中的应用，为研究不同条件下基因表 达量的变化提供依据。
[0005] 为此，本发明使用RT-qPCR技术分析了10个候选基因在不同器官(根、茎、 叶、雌花、雄花、苗)以及在5种逆境条件(高温：37℃，重金属胁迫：200μmol/L CdCl2，盐胁迫：200mmol/L NaCl，碱胁迫：200mmol/L NaHCO3和100mmol/L Na2CO3)下根部和叶片中的表达水平，并以NormFinder和BestKeeper软件分 析不同条件下10个候选基因表达量的稳定性。
[0006] 优选地，不同器官中最适的内参基因为18s rRNA和ARF，高温胁迫下最 适的内参基因为Actin和ARF，重金属(镉)胁迫下最适的内参基因为ARF和 EF1α，盐胁迫(NaCl)下最适的内参基因为COX和18s rRNA，NaHCO3胁迫 下最适的内参基因为RPL和Actin，Na2CO3胁迫下最适的内参基因为ARF和 CYP。利用表达量最稳定的Actin、ARF，以及表达量相对不稳定的TUBα对bZIP9 和HSFB2b这2个高温响应基因在37℃条件下的表达模式进行标准化，证明本 发明的可靠性和实用性。
[0007] 优选地，所述内参基因18s rRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述 内参基因Actin，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述内参基因ARF，其核苷 酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述内参基因COX，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10 所示；所述内参基因CYP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；所述内参基因 EF1α，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；所述内参基因RPL，其核苷酸序列如 SEQ ID NO.19所示。
[0008] 优选地，所述内参基因18s rRNA，其特异性引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；所述内参基因Actin，其特异性引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6 所示；所述内参基因ARF，其特异性引物序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所 示；所述内参基因COX，其特异性引物序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所 示；所述内参基因CYP，其特异性引物序列如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所 示；所述内参基因EF1α，其特异性引物序列如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所 示；所述内参基因RPL，其特异性引物序列如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所 示。
[0009] 优选地，所述应用为RT-qPCR，反应条件为：反应体系为20μL，2×SYBR qPCR Master Mix 10μL，5倍稀释的cDNA模板1μL，10mmol/L正反向引物各0.5μL， ddH2O 8μL；反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s，55℃退火15s，72℃ 延伸30s，40个循环，65℃-95℃检测溶解曲线。
[0010] 本发明使用RT-qPCR技术全面分析了不同器官和非生物胁迫下菠菜看家基因 的表达水平；确定了适用于不同器官中基因表达分析的内参基因为18s rRNA和 ARF，高温胁迫下基因表达分析的内参基因为Actin和ARF，重金属(镉)胁迫下 基因表达分析的内参基因为ARF和EF1α，盐胁迫(NaCl)下基因表达分析的内参 基因为COX和18s rRNA，NaHCO3胁迫下基因表达分析的内参基因为RPL和Actin， 及Na2CO3胁迫下基因表达分析的内参基因为ARF和CYP，并验证了高温条件下看 家基因Actin和ARF作为内参基因具有可靠性。
[0011] 与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：
[0012] (1)本发明首次对菠菜中的10个看家基因在不同器官和非生物胁迫下表达量 的稳定性进行分析，筛选出适用于不同器官中和胁迫条件下的内参基因。
[0013] (2)本发明利用NormFinder和BestKeeper软件，分析10个菠菜看家基因在 不同器官中和胁迫条件下的Ct值，解析这些看家基因的稳定性，表明不同器官中 最适的内参基因为18s rRNA和ARF，高温胁迫下最适的内参基因为Actin和ARF， 重金属(镉)胁迫下最适的内参基因为ARF和EF1α，盐胁迫(NaCl)下最适的内 参基因为COX和18s rRNA，NaHCO3胁迫下最适的内参基因为RPL和Actin，以 及Na2CO3胁迫下最适的内参基因为ARF和CYP。
[0014] (3)本发明考虑到了一般研究中常涉及到的不同器官(根、茎、叶、雄花、 雌花和幼苗)和不同胁迫条件(高温、重金属及盐碱胁迫)，筛选出了上述条件下 最适的内参基因，适用于器官表达特异性和逆境条件下目的基因表达模式的研究， 具有广泛的适用性。附图说明
[0015] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或 现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图 仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动 性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0016] 图1是10个候选内参基因引物PCR产物的电泳结果，单一的产物条带表明了 引物的特异性；
[0017] 图2是10个候选内参基因引物的溶解曲线，溶解曲线单一的峰进一步证明了 引物的特异性；
[0018] 图3是10个候选内参基因的在不同器官中和不同胁迫条件下Ct值的箱线图， 图中箱子的上边界、箱子中的直线和箱子的下边界分别表示上四分位数、中位数和 下四分位数，两端的端线代表最大值和最小值，空心圆圈代表异常值；
[0019] 图4是以Actin、ARF和TUBα作为内参基因分别标准化bZIP9表达量在热胁 迫条件下变化趋势的结果；
[0020] 图5是以Actin、ARF和TUBα作为内参基因分别标准化HFSB2b表达量在热 胁迫条件下变化趋势的结果。
具体实施方式
[0021] 以下将结合附图对本发明的构思、具体结果及产生的技术效果作进一步说明， 以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
[0022] 实施例1
[0023] 菠菜不同器官是根、茎、叶、雄花、雌花和幼苗，不同胁迫条件是高温：37℃、 重金属胁迫：200μmol/L CdCl2，盐胁迫：200mmol/L NaCl，碱胁迫：200mmol/L NaHCO3和100mmol/L Na2CO3。
[0024] 1、菠菜的种植、处理及取样：以菠菜耐高温种质Sp75为试验材料。培养温 度和光周期为22/18℃、10/14h昼夜循环，相对湿度为60％。在种植后10天收取 幼苗样品；播种后50天，收取根、茎、叶(倒三叶和倒四叶)、雄花和雌花。播种 后50天的菠菜用于胁迫处理。使用37℃进行高温胁迫，于取样前0、1、2、4、6、 8、12、24和48小时，将菠菜放置于培养箱中；而重金属、盐和碱胁迫则分别用200 μmol/L CdCl2、200mmol/L NaCl、200mmol/L NaHCO3和
100mmol/L Na2CO3模拟， 于取样前0、1、3、6、12、24和48小时用上述溶液分别浇灌菠菜。收取经过胁迫 处理的菠菜的叶片(倒三叶和倒四叶)及根系。所有样品在收取后立即用液氮冷冻， 并在-80℃下保存。
100mmol/L Na2CO3模拟， 于取样前0、1、3、6、12、24和48小时用上述溶液分别浇灌菠菜。收取经过胁迫 处理的菠菜的叶片(倒三叶和倒四叶)及根系。所有样品在收取后立即用液氮冷冻， 并在-80℃下保存。
[0025] 2、样品总RNA提取及完整性检测：将收取的样品在液氮中研磨成粉末，取 约100mg粉末放入1.5mL RNase free的离心管中，加入1mL TrizolTM LS Regent (Invitrogen)，参照说明书提取样品总RNA。用1％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA， 以确保RNA的完整性；利用Nano pro微型分光光度计检测RNA的质量和浓度， 是否适用于后续实验。
[0027] 4、看家基因选择、引物设计及特异性检测：选取已报道的10个在其他植物中 常用作内参基因的看家基因，在菠菜数据库中通过BLAST检索其同源基因。使用 Primer3plus(http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)软件设计候选 基因的RT-qPCR引物，引物的特性如表1所示。
[0028] 使用PCR初步验证引物的特异性。反应体系为20μL，其中2×PCR Master Mix (CWBIO)10μL，5倍稀释的cDNA模板1μL，10mmol/L正反向引物各0.5μL， ddH2O 8μL。RT-qPCR所采用的程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，55℃ 退火15s，72℃延伸30s，30个循环；72℃充分延伸5min，4℃保温。反应结束 后使用1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，所有产物均为单一条带(图1)，说明 了这些引物的特异性。
[0029] 使用RT-qPCR近一步检测引物的特异性。反应体系为20μL，其中2×AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)10μL，5倍稀释的cDNA模板1μL，10mmol/L正反向引物各0.5μL，ddH2O 8μL。RT-qPCR所采用的程序为：第一阶 段：95℃预变性3min；第二阶段：95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s， 40个循环；第三阶段：65℃-95℃检测溶解曲线。这些引物的溶解曲线均为单峰(图 2)，进一步说明了这些引物的特异性。
[0030] 表1候选基因及引物信息
[0031]
[0032] 5、数据采集及处理：以上述RT-qPCR体系和程序，检测每个看家基因在不同 样品中的Ct值(每个反应管内的荧光信号达到设定的阂值时所经历的循环数)，这 些Ct值如图3所示。每个基因Ct值的平均数在13.14(18s rRNA)到27.86(TUBα) 之间，每个基因Ct值的变化范围在3.22(Actin)到11.43(COX)之间。
[0033] 6、利用NormFinder和BestKeeper软件分析看家基因表达的稳定性：在不同 器官中和胁迫下，各个看家基因的Ct值按照这2个软件的要求输入Excel表格， 分别使用这2个Excel宏进行分析，结果如表2所示。NormFinder所得结果中，M 值越低的基因表达量越稳定；BestKeeper分析结果中标准差(SD)越小的基因表 达量越稳定。
[0034] NormFinder和Bestkeeper给出的这10个看家基因的稳定性分析结果如下：
[0035] (1)不同器官(根、茎、叶、雄花、雌花、苗)中看家基因稳定性由强到弱 的排序为：
[0036] NormFinder：ARF>EF1α>COX>GAPDH>RPL>Actin>H3>18s rRNA>TUBα>CYP；
[0037] BestKeeper：18s rRNA>CYP>COX>ARF>RPL>Actin>EF1α>H3>GAPDH>TUBα。
[0038] (2)高温胁迫(37℃)下看家基因稳定性由强到弱的排序为：
[0039] NormFinder：ARF>RPL>COX>EF1α>H3>GAPDH>CYP>18s rRNA>Actin>TUBα；
[0040] BestKeeper：Actin>18s rRNA>GAPDH>RPL>ARF>H3>EF1α>CYP>COX>TUBα。
[0041] (3)重金属胁迫(200μmol/L CdCl2)下看家基因稳定性由强到弱的排序为：
[0042] NormFinder：EF1α>RPL>ARF>COX>H3>GAPDH>CYP>Actin>18s rRNA>TUBα；
[0043] BestKeeper：ARF>EF1α>CYP>Actin>18s rRNA>RPL>H3>GAPDH>COX>TUBα。
[0044] (4)盐胁迫(200mmol/L NaCl)下看家基因稳定性由强到弱的排序为：
[0045] NormFinder：COX>ARF>EF1α>GAPDH>H3>CYP>Actin>18s rRNA>RPL>TUBα；
[0046] BestKeeper：18s rRNA>ARF>COX>EF1α>Actin>GAPDH>CYP>H3>RPL>TUBα。
[0047] (5)200mmol/L NaHCO3处理下看家基因稳定性由强到弱的排序为：
[0048] NormFinder：RPL>Actin>EF1α>GAPDH>H3>CYP>ARF>COX>TUBα>18s rRNA；
[0049] BestKeeper：18s rRNA>Actin>RPL>H3>GAPDH>COX>CYP>ARF>EF1α>TUBα。
[0050] (6)100mmol/L Na2CO3处理下看家基因稳定性由强到弱的排序为：
[0051] NormFinder：ARF>H3>RPL>EF1α>COX>Actin>TUBα>18s rRNA>CYP>GAPDH；
[0052] BestKeeper：CYP>Actin>ARF>GAPDH>H3>TUBα>EF1α>RPL>COX>18s rRNA。
[0053] 表2不同条件下内参基因稳定性的评价(最稳定的以加粗和下划线表示)
[0054]
[0055] 其中内参基因18s rRNA的正向特异性引物为： 5’-GATTCCGACGAACAACTGCG-3’(如SEQ ID NO.2所示)，反向特异性引物为： 5’-AAGTAACATCCGCCGATCCC-3’(如SEQ ID NO.3所示)；内参基因Actin的正 向特异性引物为：5’-TGTTCACGACATCAGCCGAA-3’(如SEQ ID NO.5所示)， 反向特异性引物为：5’-CGTCGGGTAGCTCGTAGTTC-3’(如SEQ ID NO.6所示)； 内参基因ARF的正向特异性引物为：5’-CCGATAAGCTTGGCCTCCAT-3’(如SEQ ID NO.88所示)，反向特异性引物为：5’-AGCCTTGCTAGCGATGTTGT-3’(如SEQ ID NO.9所示)；内参基因COX的正向特异性引物为： 5’-AGGTTGCTCATGCTGTCTTGA-3’(如SEQ ID NO.11所示)，反向特异性引物 为：5’-CAACGACACTGATCTGGCCT-3’(如SEQ ID NO.12所示)；内参基因CYP 的正向特异性引物为：5’-TCCTTTCCATGGCCAATGCT-3’(如SEQ ID NO.14所 示)，反向特异性引物为：5’-CCCTAACAACGTCCATGCCT-3’(如SEQ ID NO.15 所示)；内参基因EF1α的正向特异性引物为：5’-ACCTCTCAGGCTGATTGTGC-3’ (如SEQ ID NO.17所示)，反向特异性引物为： 5’-GAGTACTTGGGAGTGGTGGC-3’(如SEQ ID NO.18所示)；内参基因RPL的 正向特异性引物为：
5’-TTCTCGTCCGTCTCCCTTCT-3’(如SEQ ID NO.20所示)， 反向特异性引物为：5’-TACCCTCACCACCACCATGA-3’(如SEQ ID NO.21所示)。
5’-TTCTCGTCCGTCTCCCTTCT-3’(如SEQ ID NO.20所示)， 反向特异性引物为：5’-TACCCTCACCACCACCATGA-3’(如SEQ ID NO.21所示)。
[0056] 实施例2
[0057] 使用高温条件最适内参基因Actin、ARF和相对不稳定的TUBα分别对热胁迫 响应基因bZIP9和HSFB2b在37℃处理后表达量变化趋势进行标准化。
[0058] 采用由NormFinder和BestKeeper筛选出适用于高温胁迫的内参基因Actin和 ARF，以及NormFinder和BestKeeper同时认定的热胁迫下相对最不稳定的看家基 因TUBα分别作为标准化因子，分析2个已有文献报道的热胁迫响应基因bZIP9和 HSFB2b在热胁迫下的表达模式。
[0059] 结果表明(图4)，选用Actin和ARF作为内参基因时，bZIP9在短时间的热处 理后下调；选用TUBα作为内参基因时，热处理后bZIP9的表达量上调。而转录组 学分析表明，在短时间(1小时内)的高温处理后，bZIP9下调表达。
[0060] 结果表明(图5)，选用Actin和ARF作为内参基因时，HSFB2b在热处理后1 小时上调了约10倍；选用TUBα作为内参基因时，热处理后1小时HSFB2b的表 达量上调了24倍。而文献报道中，在高温处理后1小时，HSFB2b表达量上调都 未超过10倍。
[0061] 在高温胁迫下，选取ARF或Actin作为内参基因时，能获得目的基因较为准确 的表达模式。而TUBα作为内参基因时，则会得到错误或夸大的目的基因的表达模 式。
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