【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、シロイヌナズナのＦＡＤ７のプロモーター領域に由来する傷害誘導応答性シスエレメントに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】例えば、植物の耐冷性と、生体膜を構成する脂肪酸の不飽和度との間には有意な相関があることが、これまでの研究で指摘されてきた。 本発明者は、形質転換タバコ植物体において、シロイヌナズナ由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子ＦＡＤ７を高発現させることにより、低温に対して一層耐性となることを、実験的に示した。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】一方、植物細胞で、ある蛋白質を生産しようとする際には、従来は構成的に発現し、かつプロモーター活性の強いものが使われてきた。 こうしたプロモーターは絶えず機能するため、植物にとっての経済学上は不利益なことも起こる。 例えば、
特に、昆虫による食害などの植物への物理的環境ストレスへの抵抗力を高めるために、種々の抵抗性遺伝子の利用が現在検討されている。 即ち、食害ないし傷害に対応してω−３脂肪酸不飽和化酵素を構成的プロモーターによって形質発現させることで、傷害に対する抵抗力を高めることが考えられる。

【０００４】しかし、こうした特定のタンパク質は、傷害のない通常の条件下では、植物にとって不要なものである。 ところが、従来の構成的プロモーターを用いて遺伝子発現システムでは、植物は、傷害のないときには不必要な特定のタンパク質、例えばω−３脂肪酸不飽和化酵素の発現を強いられる。

【０００５】このような背景から、傷害に応じて誘導される誘導的プロモーターの開発が求められている。 例えば、ω−３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子や、植物の食害に対する抵抗力を高めるようなその他のタンパク質遺伝子を、傷害誘導的に発現する育種中間母本を作出する必要がある。

【０００６】本発明の課題は、傷害に応じて誘導される誘導的プロモーターを開発するために、そのプロモーターに付加できる傷害誘導応答性エレメントを提供することである。 また、本発明の課題は、こうした傷害誘導応答性エレメントの付加されたプロモーターを使用することで、傷害に対する抵抗力の強い植物品種の中間母本を作出できるようにすることである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、以下の（ａ）
または（ｂ）に示す塩基配列からなることを特徴とする、傷害誘導応答性エレメントに係るものである。 （ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、塩基番号−４３０から−３６３までで表される塩基配列 （ｂ）（ａ）の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加された塩基配列

【０００８】また、本発明は、以下の（ｃ）または（ｄ）に示す塩基配列からなることを特徴とする、傷害誘導応答性エレメントに係るものである。 （ｃ）配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、塩基番号−２４２から−２２３までで表される塩基配列（ｄ）（ｃ）の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加された塩基配列

【０００９】また、本発明は、前記の傷害誘導応答性エレメントを含むことを特徴とする、傷害誘導性プロモーターに係るものであり、また、この傷害誘導性プロモーターを含む組み換えＤＮＡが導入されていることを特徴とする、形質転換植物に係るものである。

【００１０】ω−３脂肪酸不飽和化酵素は、植物脂質の主要構成成分であるトリエン脂肪酸生成の最終段階を触媒する酵素である。 シロイヌナズナのＦＡＤ７は、葉緑体に局在するω−３脂肪酸不飽和化酵素を暗号化する遺伝子である。 ＦＡＤ７は、葉緑組織において特異的に発現し、その発現は光誘導性であることが明らかにされている。 また、植物体に局所的な傷害を与えると、葉緑組織のみならず、茎や根のような非緑色組織においても極めて強い発現が誘導されることが明らかにされている。
本発明は、ＦＡＤ７遺伝子のプロモーター領域における器官特異的な傷害誘導に係わるシスエレメントを同定した点に、進歩性を有する。

【００１１】シロイヌナズナＦＡＤ７のプロモーター領域の塩基配列は、既に西内らによって発表されている（Nishiuchi et al. (1995) 、「Plant Mol. Biol.」2
9：599-609 頁) 。 このプロモーター領域の塩基配列を、後述の配列表１および図１として示す。

【００１２】このプロモーター領域を、５'上流から段階的に欠失させた各配列を、Ｔｉ−プラスミドバイナリーベクターｐＢＩ１０１．１（Ｃｌｏｔｅｃｈ社）のＧ
ＵＳ遺伝子に結合させた。 各コンストラクトを、アグロバクテリウム（ＬＢＡ４４０４）を介したリーフディスク法（Horsch et al. (1985)「 Science」227 ：1229−
1231頁) によって、タバコＳＲ１株に導入した。 導入したタバコのＲ１世代のリポーター（ＧＵＳ）活性を測定した。

【００１３】ここで、図２の実験結果を参照すると、Ａ
は、葉における実験であり、Ｂは、茎における実験であり、Ｃは根における実験である。 各タバコは土に植え、
３カ月、連続光の下に２６℃で育成した。 横軸の大きい数字は、その数字よりも上流を欠失したコンストラクトを導入した形質転換タバコを示している。 横軸の小さい数字は、用いたＲ１世代の系統番号である。 縦軸の値は、傷害を受けていないものに対する、傷害を受けた場合のＧＵＳ活性の比率を示す。 それぞれの系統について、５つの植物体の平均をデータとして示した。

【００１４】この結果、葉および茎（Ａ、Ｂ）では、−
２５９から−１９７の領域が、根（Ｃ）では−５２０から−３６３の領域が、ＦＡＤ７遺伝子の発現の傷害誘導に関与することが判明した。

【００１５】そこで、これらの領域に結合する転写因子の存在について調べるために、ゲルシフト法（Green et
al. (1989) 、「Plant Mol. Biol. Manual 」Ｂ11、1
−22頁) による解析を行った。 葉、茎および根において、健全な組織と、傷害を与えた組織とから抽出した核タンパク質と、上述のそれぞれの領域における様々な塩基配列に対応する各ＤＮＡプローブを用いて、ゲルシフトを行った。 その結果、葉および茎においては、−２４
２／−２２３の塩基配列（ＴＡＡＣＡＡＴＣＴＴＡＴＡ
ＴＡＧＴＣＡＣ）をプローブに用いた場合に、傷害で移動度がシフトするバンドを電気泳動法によって検出した。 この配列を欠失したＦＡＤ７プロモーターをＧＵＳ
遺伝子に結合させ、タバコに導入すると、葉および茎の組織特異性傷害誘導性が消失した。

【００１６】根においては、−４３０／−３６３の塩基配列をプローブに用いた場合に、傷害で移動度がシフトするバンドを電気泳動法によって検出した。 この配列を欠失したＦＡＤ７プロモーターをＧＵＳ遺伝子に結合させ、タバコに導入すると、根の組織特異性傷害誘導性が消失した。

【００１７】従って、これらの各配列は、シスエレメントとして機能していることが判明した。 更に、−４３０
／−３６３のエレメントは、ジャスモン酸応答性を示し、オクタデカノイド細胞内信号伝達経路の末端にあることがわかった。 −２４２／−２２３エレメントは、ジャスモン酸応答性を示さず、異なる信号伝達経路の末端に位置することがわかった。

【００１８】本発明において、組み換えＤＮＡを作製する際のベクターとしては、例えばプラスミドを使用できる。 また、組み換えＤＮＡを導入するための植物としては、トウモロコシ、イネ、小麦、大麦、オート麦、粟、
ひえ、タバコ等の単子葉有用栽培植物が好ましい。 また、各傷害誘導応答性エレメントにおいては、一個または数個の塩基について、欠失、置換、付加が行われても、本発明のプロモーター機能を損なうものでない限り、本発明の範囲内である。 また、本発明の傷害誘導応答性エレメントによって、生産が誘導され得るタンパク質としては、ω−３脂肪酸不飽和化酵素、プロテアーゼインヒビターＩＩ等がある。

【００１９】

【配列表】 出願人氏名：九州大学長 発明の名称：傷害誘導応答性エレメント、傷害誘導性プロモーターおよび形質 転換植物 配列の数：１ 配列番号：１ 配列の長さ：１０４４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 起源：シロイヌナズナ ＦＡＤ７遺伝子のプロモーター領域 配列：別紙 -853 AAATTCATGC GGAATCAGAG AACGTTACCA TGGTGGGATG AAGATGAATT GCGGCCCTGT -793 AAAGTTTTAG TCTTGTTCAA TAGATTGCAC AAAGAAAGTA AACAAACAAC AACAAAAAAA -733 AAGACTGTAG AAAAGAAAAA AAAAAAGGAT AATCATAACG GAATCTTTAA TTTACCAGCG -673 CGATTAAGGA CCTCAGATTG TTGTTCGGTG CCATGATCGG ATATTAGGGT TCGTTCGCTC -613 TTCTTCTTCT TTGTCTATAC GCGATTTGTG AGAATAAAAA AGGTCGGATC TTTTGAGAGT -553 TCTGTAGTTT AATGGGCTTA TACTATTGGG CCCTAGCCCA AATGAGCGAC ACTATTGTTC -493 ATTTTGTACA AATCTCTTGG GCTAATTTAT TTCAGGCTGA CCAACTAATT TGGTCAACTA -433 GTT GGGTTTG GCATGTTTAA TTTCAATTTC CACTTGGTTC AATTTTTATG TTCACCGTCC -373 ATGTAACTTG AC TAGTAGCA TGAGATTTGG TTTGTCCCTA TTGAAACAAT AGGTATAGGG -313 TGTGAAACAT TGAAACGTAA TTGACTCAAA TTCTCAAATA GGTTTCTTCA CCAAACTCCT -253 CTTGTTTTGT CTAACAATCT TATATAGTCA CT AAAATAAT GTGTATAAAT TTTGCTACCG -193 TCATTTAAAA GTTAGTGTCA TGAAACATAT GCCTCATTAT ATTTTATTAT TTTCGTTCAC -133 TTTATTTCAA AGGCTTTAAA CTATATGACA TCATAACCAA AACAAGAATT AAAACGAGAT - 73 CAATCAAACC CGTGTTGAAA CCTCAACTTG TGTCTAAATT GACCGTCACA AAAAAAAATC - 13 TCACATCACA CCATCACTAA TAAATTTCCT TCTCCTTTCA AGTTGTAGCT AACTTATATA + 48 AGACATAAGC GTGCGAACCA GAGACAGAGA TAGAAATTGA GAGACGATAA GCAAAGTAGA +108 AAACACAAGT TTCTCTCACA CACATTATCT CTTTCTCTAT TACCACCACT CATTCATAAC +168 AGAAACCCAC CAAAAAATAA AAAGAGAGAC TTTTCACTCT GGGGAGAGAG CTCAAGTTCT +228 AATG Initiation codon

【図面の簡単な説明】

【図１】シロイヌナズナのＦＡＤ７遺伝子のプロモーター領域のゲノム配列を示す。

【図２】ＦＡＤ７遺伝子のプロモーター領域の各部分を欠失させた各エレメントについて、傷害誘導性を実験した結果を示し、Ａは葉、Ｂは茎、Ｃは根に関する実験結果である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１１年９月３日（１９９９．９．３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】発明の名称

【補正方法】変更

【補正内容】

【発明の名称】 傷害誘導応答性エレメントおよび形質転換植物

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００７

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、塩基番号−４３０から−
３６３までで表される塩基配列からなることを特徴とする、傷害誘導応答性エレメントに係るものである。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００８

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００８】また、本発明は、配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、塩基番号−２４２から−２２３までで表される塩基配列からなることを特徴とする、傷害誘導応答性エレメントに係るものである。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００９

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００９】また、本発明は、前記の傷害誘導応答性エレメントを含む組み換えＤＮＡが導入されていることを特徴とする、形質転換植物に係るものである。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１８】本発明において、組み換えＤＮＡを作製する際のベクターとしては、例えばプラスミドを使用できる。 また、組み換えＤＮＡを導入するための植物としては、トウモロコシ、イネ、小麦、大麦、オート麦、粟、
ひえ、タバコ等の単子葉有用栽培植物が好ましい。 また、本発明の傷害誘導応答性エレメントによって、生産が誘導され得るタンパク質としては、ω−３脂肪酸不飽和化酵素、プロテアーゼインヒビターＩＩ等がある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 草野 友延 奈良県生駒市高山町8916−５ 奈良先端科 学技術大学院大学遺伝子教育研究センター 内 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD04 CA16 CA19 CB03 4B024 AA08 BA80 CA01 DA01 EA04 GA11 4B065 AA88Y AA89X AB01 BA02 CA23 CA53