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IiWRKY34在调控菘蓝木脂素生物合成和抗逆胁迫反应中的应用

阅读：820发布：2020-05-12

专利汇可以提供IiWRKY34在调控菘蓝木脂素生物合成和抗逆胁迫反应中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种IiWRKY34在调控菘蓝木脂素生物合成和抗逆胁迫反应中的应用，涉及生物技术领域。该IiWRKY34基因的开放阅读框具有如SEQ ID NO.1所示序列，所述IiWRKY34基因调控菘蓝的木脂素合成，当菘蓝的IiWRKY34基因抑制表达时，木脂素的合成量相比与野生型将下调至少50％；当菘蓝的IiWRKY34基因过表达时，木脂素的合成量是野生型的至少2倍，为从基因水平上研究和调控菘蓝中药物活性成分提供了一个可供选择的靶点。，下面是IiWRKY34在调控菘蓝木脂素生物合成和抗逆胁迫反应中的应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.IiWRKY34基因，所述IiWRKY34基因的开放阅读框具有如SEQ ID NO.1所示序列，所述IiWRKY34基因调控菘蓝的木脂素合成。
2.根据权利要求1所述的IiWRKY34基因，其特征在于，所述木脂素包括落叶松脂素。
3.根据权利要求1所述的IiWRKY34基因，其特征在于，所述IiWRKY34基因还调控菘蓝的生物量、木质化程度和抗胁迫能力中的至少一种；
优选地，所述抗胁迫包括抗干旱胁迫和抗高盐环境胁迫。
4.生物材料，其特征在于，选自如下(n1)～(n4)中的一种或多种：
(n1)含有权利要求1-3任一项所述IiWRKY34基因的表达盒；
(n2)含有权利要求1-3任一项所述IiWRKY34基因的载体，或含有(n1)所述表达盒的载体；
(n3)含有权利要求1-3任一项所述IiWRKY34基因的重组微生物，含有(n1)所述表达盒的重组微生物，或含有(n2)所述载体的重组微生物；
(n4)含有权利要求1-3任一项所述IiWRKY34基因的细胞系，含有(n1)所述表达盒的细胞系，或含有(n2)所述载体的细胞系。
5.菘蓝性状相关的标志物，所述标志物选自(a1)：权利要求1-3任一项所述的IiWRKY34基因；
(a2)含有所述IiWRKY34基因的融合基因；
(a3)：(a1)或(a2)转录的RNA；
(a4)：(a1)～(a3)中任一项表达的蛋白；
所述性状包括菘蓝的木脂素合成能力；
优选地，所述性状还包括木脂素的生物量、木质化程度和抗胁迫能力中的至少一种。
6.用于检测菘蓝性状的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测权利要求5所述的标志物；
优选地，所述试剂盒包含用于扩增菘蓝IiWRKY34基因的引物对，所述引物对具有如SEQ ID NO.6所示序列和具有如SEQ ID NO.7所示序列。
7.调控菘蓝性状的方法，所述方法包括过表达或抑制表达权利要求1-3任一项所述的IiWRKY34基因；
所述菘蓝性状包括(b1)～(b4)中的至少一种，(b1)木脂素的合成能力；(b2)生物量；
(b3)木质化程度；和，(b4)抗胁迫能力。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述过表达包括使用强启动子驱动IiWRKY34基因的表达；所述强启动子优选使用35S。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述抑制表达包括将IiWRKY34基因的反向重复序列表达载体转化至菘蓝中，以沉默IiWRKY34基因的表达。
10.权利要求1-3任一项所述的IiWRKY34基因，权利要求4所述的生物材料，权利要求5所述的标志物，权利要求6所述的试剂盒或权利要求7-9任一项所述的调控菘蓝性状的方法在制备药物中的应用。

说明书全文

IiWRKY34在调控菘蓝木脂素生物合成和抗逆胁迫反应中的

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种IiWRKY34在调控菘蓝木脂素生物合成和抗逆胁迫反应中的应用。

背景技术

[0002] 菘蓝(Isatis indigotica Fortune)又名大靛，为十字花科(Brassicaceae)菘蓝属二年生草本植物。菘蓝原产于中国北部，分布较广，是我国传统常用中药材。

[0003] 菘蓝干燥根为板蓝根，其别名有大青根、大蓝根、靛青根、蓝靛根、靛根等，其性寒，味苦，具有清热解毒，凉血利咽之功效，为常用中药之一，临床上广泛用于抗病毒、抗菌、抗肿瘤、增强机体免疫力等。菘蓝叶为大青叶，清热解毒，凉血消斑，能清解血分热毒实火，善于凉血消斑。适用于热入营血、气血两播、温毒发斑及咽肿口疮等症。

[0004] 菘蓝中的木脂素类成分，例如落叶松脂素和落叶松脂素苷为菘蓝的主要药物活性成分，是极具有价值的药用资源。但是由于木脂素为菘蓝的次生代谢成分，通常情况下天然植株中的次生产物含量过低，如果通过化学合成法获得次生产物，一方面会提高药物成本，增加制药的工艺流程；另一方面在合成过程中又会形成同分异构体和造成环境污染等诸多问题。因此寻找菘蓝中活性成分的相关基因，以从基因水平上研究和调控菘蓝中药物活性成分，能够有效地提高菘蓝作为药用植物的质量，对保护菘蓝种质资源的同时，解决巨大的市场需求与有限资源之间的矛盾具有极其重要的意义。

[0005] 有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

[0006] 本发明第一的目的在于提供IiWRKY34基因，该基因能够调控菘蓝的木脂素合成。

[0007] 本发明第二的目的在于提供含有上述IiWRKY34基因的生物材料。

[0008] 本发明第三的目的在于提供菘蓝性状相关的标志物。

[0009] 本发明第四目的在于提供用于检测菘蓝性状的试剂盒。

[0010] 本发明第五目的在于提供调控菘蓝性状的方法。

[0011] 本发明第六目的在于提供上述IiWRKY34基因、含有上述IiWRKY34基因的生物材料、菘蓝性状相关的标志物、用于检测菘蓝性状的试剂盒或调控菘蓝性状的方法在制备药物中的应用。

[0012] 为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

[0013] 根据本发明的一个方面，本发明提供了一种IiWRKY34基因，所述IiWRKY34基因的开放阅读框具有如SEQ ID NO.1所示序列，所述IiWRKY34基因调控菘蓝的木脂素合成。

[0014] 优选地，所述木脂素包括落叶松脂素。

[0015] 优选地，所述IiWRKY34基因还调控菘蓝的生物量、木质化程度和抗胁迫能力中的至少一种；

[0016] 优选地，所述抗胁迫包括抗干旱胁迫和抗高盐环境胁迫。

[0017] 根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种生物材料，该生物材料选自如下(n1)～(n4)中的一种或多种：

[0018] (n1)含有所述IiWRKY34基因的表达盒；

[0019] (n2)含有所述IiWRKY34基因的载体，或含有(n1)所述表达盒的载体；

[0020] (n3)含有所述IiWRKY34基因的重组微生物，含有(n1)所述表达盒的重组微生物，或含有(n2)所述载体的重组微生物；

[0021] (n4)含有所述IiWRKY34基因的细胞系，含有(n1)所述表达盒的细胞系，或含有(n2)所述载体的细胞系。

[0022] 根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种菘蓝性状相关的标志物，所述标志物选自(a1)：所述的IiWRKY34基因；(a2)含有所述IiWRKY34基因的融合基因；(a3)：(a1)或(a2)转录的RNA；(a4)：(a1)～(a3)中任一项表达的蛋白；所述性状包括菘蓝的木脂素合成能力；

[0023] 优选地，所述性状还包括木脂素的生物量、木质化程度和抗胁迫能力中的至少一种。

[0024] 根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种用于检测菘蓝性状的试剂盒，所述试剂盒用于检测上述标志物；

[0025] 优选地，所述试剂盒包含用于扩增菘蓝IiWRKY34基因的引物对，所述引物对具有如SEQ ID NO.6所示序列和具有如SEQ ID NO.7所示序列。

[0026] 根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种调控菘蓝性状的方法，该方法包括过表达或抑制表达所述IiWRKY34基因；

[0027] 所述菘蓝性状包括(b1)～(b4)中的至少一种，(b1)木脂素的合成能力；(b2)生物量；(b3)木质化程度；和，(b4)抗胁迫能力。

[0028] 优选地，所述过表达包括使用强启动子驱动IiWRKY34基因的表达；所述强启动子优选使用35S。

[0029] 优选地，所述抑制表达包括将IiWRKY34基因的反向重复序列表达载体转化至菘蓝中，以沉默IiWRKY34基因的表达。

[0030] 根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述IiWRKY34基因，所述生物材料，所述标志物，所述试剂盒或所述调控菘蓝性状的方法在制备药物中的应用。

[0031] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0032] 本发明提供的IiWRKY34基因的开放阅读框具有如SEQ ID NO.1所示序列，所述IiWRKY34基因调控菘蓝的木脂素合成，当菘蓝的IiWRKY34基因抑制表达时，木脂素的合成量相比与野生型将下调至少50％；当菘蓝的IiWRKY34基因过表达时，木脂素的合成量是野生型的至少2倍。本发明还提供了含有上述IiWRKY34基因的生物材料，以用于调节IiWRKY34基因的表达以调控菘蓝中木脂素的含量。由于IiWRKY34基因调控菘蓝的木脂素合成，因此该基因还可以作为菘蓝木脂素合成能力的标志物，以用于评价菘蓝合成木脂素的能力，进一步的用于评价菘蓝品系的质量。

[0033] 本发明提供的IiWRKY34基因、含有上述IiWRKY34基因的生物材料、菘蓝性状相关的标志物、用于检测菘蓝性状的试剂盒或调控菘蓝性状的方法可以应用于制备药物。由于木脂素具有抗肿瘤、抗病毒、抗细菌、对心血管系统和中枢神经系统具有保护作用，通过调节菘蓝中IiWRKY34基因的表达，可以调控菘蓝中木脂素的表达，以制备出含量高的菘蓝以作为药物的原料，或作为木脂素的提取原料，以制备以木脂素作为活性成分的药物。附图说明

[0034] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0035] 图1为本发明实施例1提供的载体pHB-flag-WRKY34示意图；

[0036] 图2为本发明实施例2提供的载体pCAMBIA-1300-WRKY34示意图；

[0037] 图3和图4为本发明实施例3提供的各组菘蓝毛状根的鉴定结果；

[0038] 图5为本发明实施例中WT组、RNAi组和OVX组样品的IiWRKY34基因的表达量；

[0039] 图6为本发明实施例中WT组、RNAi组和OVX组样品的落叶松脂素的含量；

[0040] 图7为本发明各组菘蓝的毛状根在0～45天中的生物量；

[0041] 图8和图9为本发明各组菘蓝的毛状根；

[0042] 图10为本发明各组菘蓝的毛状根的番红固绿染色结果；

[0043] 图11为本发明各组菘蓝的毛状根的间苯三酚染色结果；

[0044] 图12为野生型开花期菘蓝植株不同器官组织IiWRKY34基因的表达情况；

[0045] 图13为野生型菘蓝无菌苗在干旱胁迫环境中的IiWRKY34基因表达量；

[0046] 图14为野生型菘蓝无菌苗在高盐环境胁迫中的IiWRKY34基因表达量；

[0047] 图15为野生型菘蓝无菌苗在水杨酸诱导下IiWRKY34基因表达量；

[0048] 图16为野生型菘蓝无菌苗在甲基茉莉酸诱导下IiWRKY34基因表达量；

[0049] 图17为WT组、OVX组和RNAi组的毛状根在无胁迫、干旱胁迫和高盐环境胁迫中的生长情况；

[0050] 图18为WT组、OVX组和RNAi组的毛状根在无胁迫、干旱胁迫和高盐环境胁迫下的ROS检测实验结果；

[0051] 图19为WT组、OVX组和RNAi组的毛状根在无胁迫、干旱胁迫和高盐环境胁迫下的总抗氧化能力；

[0052] 图20为WT组、OVX组和RNAi组的毛状根在无胁迫、干旱胁迫和高盐环境胁迫下的脯氨酸含量。

具体实施方式

[0053] 下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0054] 本发明提供了一种IiWRKY34基因，所述IiWRKY34基因的开放阅读框具有如SEQ ID NO.1所示序列，所述IiWRKY34基因调控菘蓝的木脂素合成。

[0055] 木脂素(lignan)，又称木脂体，是一类由被子植物和裸子植物中分离出的成分，多数以游离状态存在，也有些与糖结合成有存在于植物的木部和树脂中。木脂素的积累与物种的抗胁迫能力相关。木脂素还是植物的抗毒素和昆虫的拒食剂，具有植物毒性和细胞毒性，是植物防御病虫害的化学物质。此外，木脂素还参与植物的生长调控。

[0056] 组成木脂素的单体有桂皮酸、桂皮醛、桂皮醇、丙烯苯、烯丙苯等，不同种类的单体可脱氢，形成不同的游离基，各游离基相互缩合，形成各种不同类型的木脂素。所述木脂素包括但不限于为开环异落叶松脂酚、罗汉松脂酚、松脂酚、落叶松脂素、异落叶松脂酚、牛劳贰元、去甲二氢愈创木酸或萦丁香脂酚。

[0057] 本发明提供的IiWRKY34基因调控菘蓝的木脂素合成，是菘蓝中活性成分的相关基因，为从基因水平上研究和调控菘蓝中药物活性成分提供了一个可供选择的靶点。

[0058] 在一些优选的实施方式中，所述IiWRKY34基因调控菘蓝的落叶松脂素，当菘蓝的IiWRKY34基因抑制表达时，落叶松脂素的合成量相比与野生型将下调至少50％；当菘蓝的IiWRKY34基因过表达时，落叶松脂素的合成量是野生型的至少2倍。

[0059] 在一些优选的实施方式中，所述IiWRKY34基因还调控菘蓝的生物量、木质化程度。当菘蓝的IiWRKY34基因抑制表达时，菘蓝的生物量相比与野生型将下调至少50％，木质化程度也低于野生型；当菘蓝的IiWRKY34基因过表达时，菘蓝的生物量是野生型的至少2倍，木质化程度也高于野生型。

[0060] 在一些优选的实施方式中，所述IiWRKY34基因还和菘蓝的抗胁迫能力相关，所述抗胁迫包括抗干旱胁迫和抗高盐环境胁迫。一方面，野生型菘蓝在干旱胁迫和高盐环境胁迫的生长条件下，IiWRKY34基因均出现上调表达；并且当向野生型菘蓝施与能够提高植物胁迫能力的外源水杨酸(salicylic acid，SA)或茉莉酸甲酯(Methyl jasmonic acid，MeJA)时，野生型菘蓝的IiWRKY34基因也会出现上调表达。另一方面，当IiWRKY34基因抑制表达时，菘蓝的抗胁迫能力均呈现下降的状态。

[0061] 本发明还提供了一种生物材料，所述生物材料含有上述菘蓝的IiWRKY34基因，所述生物材料包括但不限于表达盒、载体、重组微生物和细胞系。所述“表达盒”指的是含有目标基因和用于调控目标基因的元件的核酸构建体。所述“载体”指的是能够实现目标基因复制和/或表达，以及将目标基因导入原核或者真核细胞的物质，所述载体包括但不限于为质粒、噬菌体、病毒基因组或者病毒等。所述“重组微生物”指的是经过操作后，与所述微生物的野生型呈现出的基因型或者表型不相同的微生物。

[0062] 具体的，所述生物材料选自如下：(n1)含有所述IiWRKY34基因的表达盒；(n2)含有所述IiWRKY34基因的载体，或含有(n1)所述表达盒的载体；(n3)含有所述IiWRKY34基因的重组微生物，含有(n1)所述表达盒的重组微生物，或含有(n2)所述载体的重组微生物；(n4)含有所述IiWRKY34基因的细胞系，含有(n1)所述表达盒的细胞系，或含有(n2)所述载体的细胞系。

[0063] 本发明还提供了菘蓝性状相关的标志物，所述标志物选自(a1)：所述IiWRKY34基因；(a2)含有所述IiWRKY34基因的融合基因；(a3)：(a1)或(a2)转录的RNA；(a4)：(a1)～(a3)中任一项表达的蛋白；所述性状包括菘蓝的木脂素合成能力。

[0064] 由上述可知，所述IiWRKY34基因和菘蓝的木脂素合成能力相关，因此可以以菘蓝的IiWRKY34基因作为标志物表征菘蓝的木脂素合成能力。所述“含有所述IiWRKY34基因的融合基因”指的是除去所述IiWRKY34基因，融合基因中还可以含有其他功能单元，包括但不限于作为标记的基因部分，例如荧光蛋白基因或者筛选标记基因；或者编码其他性状标志物的基因部分；也可以是调控基因表达量的元件，比如启动子或者增强子。相应的，所述IiWRKY34基因以及含有其的融合基因转录得到的RNA或者蛋白分子也可以作为菘蓝的木脂素合成能力的标志物。

[0065] 进一步的，由于菘蓝的IiWRKY34基因和菘蓝的生物量、木质化程度和抗胁迫能力，尤其是抗干旱胁迫和抗高盐环境胁迫能力，具有一定程度的相关性，因此在一些可选的实施方式中，上述标志物也可以作为菘蓝生物量、木质化程度和抗胁迫能力中的至少一种的标志物。

[0066] 基于上述发明构思本发明还提供了用于检测菘蓝性状的试剂盒，该试剂盒通过检测上述标志物来检测菘蓝的性状，所述性状包括但不限于为菘蓝的木脂素合成能力、生物量、木质化程度和抗胁迫能力中的至少一种。

[0067] 在一些具体的实施例中，所述试剂盒中包含用于扩增菘蓝IiWRKY34基因的引物对，优选地，所述引物对具有如SEQ ID NO.6所示序列和具有如SEQ ID NO.7所示序列。所述试剂盒还包含用于进行PCR或者荧光定量PCR反应的试剂，包括但不限于为酶、dNTP、缓冲2+
液、Mg 以及荧光染料。在一些具体的实施例中，所述试剂盒中包含用于提取样品中mRNA的成套试剂。在一些具体的实施例中，所述试剂盒中包含用于检测所述IiWRKY34基因，或含有所述IiWRKY34基因的融合基因表达的蛋白的抗体，以及用于ELISA实验的试剂和耗材。

[0068] 本发明还提供了调控菘蓝的木脂素的合成能力、生物量、木质化程度和抗胁迫能力中的至少一种的方法，所述方法包括过表达或抑制表达菘蓝的IiWRKY34基因。

[0069] 在一些可选的实施方式中，过表达菘蓝中的IiWRKY34基因能够提高菘蓝的木脂素合成能力，可以提高菘蓝的生物量、木质化程度和抗胁迫能力中的至少一种。

[0070] 在一些可选的实施方式中，所述过表达IiWRKY34基因包括使用强启动子驱动IiWRKY34基因的表达，在一些优选的实施方式中，以含有35S启动子的pHB载体作为载体将IiWRKY34基因转化至菘蓝中，可使菘蓝相较于野生型菘蓝的落叶松脂素合成量上调表达5.6倍，生物量提高3.7倍和木质化程度显著提高。

[0071] 在一些可选的实施方式中，抑制表达菘蓝中的IiWRKY34基因能够降低菘蓝的木脂素合成能力，减少菘蓝的生物量和木质化程度，以及降低菘蓝的抗胁迫能力。

[0072] 在一些可选的实施方式中，抑制表达菘蓝中的IiWRKY34基因包括构建IiWRKY34基因的反向重复序列表达载体，然后将反向重复序列表达载体转化至菘蓝中以沉默IiWRKY34基因的转录和表达。其原理如下：与RNAi有关的dsRNA(double-stranded RNA)及蛋白质可参与染色质的修饰作用，使其中的组蛋白和DNA发生甲基化作用，相应基因不能被转录，从而导致受阻基因不能被表达。构建靶基因的反向重复序列表达载体，转入机体后，反向重复序列的转录本发生分子内杂交而形成dsRNA，从而介导靶基因的沉默。

[0073] 在一些优选的实施方式中，以pCAMBIA-1300为基源载体构建含有反向重复的IiWRKY34基因的质粒，然后将该质粒转入菘蓝中，可使菘蓝中落叶松脂素的合成量下降80％，生物量减少70％，木质化程度降低，并且菘蓝的抗胁迫能力也显著降低。

[0074] 本发明还提供了上述IiWRKY34基因、上述生物材料、上述标志物、上述试剂盒或上述调控菘蓝性状的方法在制备药物中的应用。

[0075] 木脂素具有抗肿瘤活性，能抑制细胞增殖，诱导分化；诱导细胞凋亡；抗血管生成；逆转肿瘤细胞多药耐药，对激素依赖型肿瘤，例如乳腺癌、良性前列腺增生及前列腺癌具有预防作用；木脂素还具有抗病毒活性和抑菌作用，对心血管系统和中枢神经系统具有保护作用。因此可以将本发明提供的IiWRKY34基因、生物材料、标志物、试剂盒或调控菘蓝性状的方法应用于制备药物中。

[0076] 在一些具体的实施例中，可以采用上述调控菘蓝性状的方法，上调IiWRKY34基因的表达，使菘蓝高表达木脂素，尤其是落叶松脂素，以获得木脂素合成量高并且抗胁迫能力好的菘蓝，可以将该菘蓝用于制备板蓝根药物，或者以板蓝根作为药物活性成分之一的药物，也可以以该菘蓝为原料提取木脂素，用于制备以木脂素作为活性成分的药物。在另一些具体的实施方式中，也可以将上述试剂盒用于鉴定作为药物原料的菘蓝，以把控药物原料的质量。

[0077] 下面结合优选实施例进一步说明本发明的有益效果。

[0078] 实验材料：40天左右的菘蓝无菌苗，发根农杆菌C58C1株系，质粒载体pCAMBIA-1300、pHB-flag。落叶松脂素标准品(上海源叶)。

[0079] ROS荧光探针-DHE(威格拉斯生物技术(北京)有限公司)，荧光显微镜(奥林巴斯，日本)，脯氨酸(Pro)含量测定试剂盒(索莱宝，北京)，其他仪器及试剂同前文，其他常规试剂(国药)。

[0080] 实施例1

[0081] 构建IiWRKY34基因过量表达载体pHB-flag-WRKY34，包括如下步骤：

[0082] 根据载体构建方法设计目标片段扩增引物，如表1所示，以菘蓝cDNA为模板扩增目标片段，使用0.8％琼脂糖凝胶电泳及DNA胶回收试剂盒回收扩增产物。

[0083] 使用BamH I和Spe I对pHB-flag载体质粒进行双酶切，使用Bcl I和Spe I对扩增回收产物进行双酶切，使用0.8％琼脂糖凝胶电泳及DNA胶回收试剂盒回收酶切产物，使用T4连接酶进行连接。连接产物转化大肠杆菌感受态，涂布平板，恒温培养。

[0084] 挑取单菌落，使用pHB-flag-WRKY34-F/R作为引物进行PCR鉴定，使用10μL扩增体系，扩增条件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，68℃1min20s，30个循环；68℃7min；4℃恒温，目标片段长度约为900bp。将鉴定阳性的单菌落菌株送测序，将测序正确的菌株于-80℃保存备用。载体pHB-flag-WRKY34示意图如图1所示。

[0085] 表1构建载体pHB-flag-WRKY34引物

[0086]引物名称序列编号
pHB-flag-WRKY34-F aatgatcaatggaccagtactcatcgtctt SEQ ID NO.2
pHB-flag-WRKY34-R aaactagttttctcggtttgattctgttga SEQ ID NO.3

[0087] 实施例2

[0088] 构建IiWRKY34基因抑制表达载体pCAMBIA-1300-WRKY34，包括如下步骤：

[0089] 根据载体构建方法设计目标片段扩增引物，如表2所示，以菘蓝cDNA为模板扩增目标片段，使用0.8％琼脂糖凝胶电泳及DNA胶回收试剂盒回收扩增产物。

[0090] 使用相应的限制性内切酶及其缓冲液对扩增回收片段及p1300载体进行双酶切、回收及连接。Nco I和Kpn I为第一组，Xba I和Sal I为第二组。首先使用第一组限制性内切酶对扩增回收片段及p1300载体进行酶切，使用0.8％琼脂糖凝胶电泳及DNA胶回收试剂盒回收酶切产物，使用T4连接酶进行连接。将连接产物转化入Trans-T1(大肠杆菌DH5α)感受态中，涂布LB-Kan固体培养基，37℃培养12～16h后挑取单菌落，使用质粒小量抽提试剂盒提取质粒，作为载体p1300a；将扩增回收片段与载体p1300a进行第二组双酶切，并使用T4连接酶进行连接。连接产物转化大肠杆菌感受态，涂布平板，恒温培养。

[0091] 挑取单菌落，使用通用引物(JDPDK-1F/JDPDK-R)进行PCR鉴定，使用10μL扩增体系，扩增条件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，68℃30s，30个循环；68℃7min；4℃恒温，目标片段长度约为527bp。将鉴定阳性的单菌落菌株送测序，将测序连接正确的菌株-80℃保存备用，载体pCAMBIA-1300-WRKY34示意图如图2所示。

[0092] 表2构建载体pCAMBIA-1300-WRKY34引物

[0093]引物名称序列编号
pCAMBIA-1300-WRKY34-F ccatgggtcgacttgtgctccaagctgt SEQ ID NO.4
pCAMBIA-1300-WRKY34-R ggtacctctagaacagctgctgctaatg SEQ ID NO.5

[0094] 实施例3

[0095] 构建重组菘蓝毛状根材料，按照如下分组：

[0096] 带有载体pHB-flag-WRKY34的农杆菌诱导的毛状根为基因过量表达组，命名为OVX组；仅带有载体pHB-flag的农杆菌诱导的毛状根为基因过量表达对照组，命名为PHB组；带有载体pCAMBIA-1300-WRKY34的农杆菌C58C1诱导的毛状根为基因抑制组，命名为RNAi组；仅带有载体p1300的农杆菌诱导的毛状根为基因抑制对照组，命名为p1300组；使用不含任何载体的农杆菌C58C1诱导的毛状根为野生型，命名为WT组，该组不使用Hyg进行筛选。

[0097] 按照如下方法构建重组菘蓝毛状根材料：

[0098] OVX组和RNAi组将鉴定为阳性的质粒载体转入农杆菌C58C1株系中，PHB组和p1300组转入空载体，WT组不转入载体，取带有质粒载体的C58C1菌株活化，使用20mL～40mL YEB-Kan-Rif液体培养基扩大培养至OD600≈0.6；4℃5000rpm离心15min，弃上清，使用等体积1/2MS液体培养基重悬菌体，28℃恒温摇床80rpm培养30min。

[0099] 以40d～60d左右的菘蓝无菌苗为材料剪1cm2左右大小叶盘，置于1/2MS固体培养基上，25℃恒温培养箱放置过夜；将叶盘浸入已活化的农杆菌培养液中，28℃恒温摇床90rpm浸染10min；用镊子夹出叶盘，吸除叶盘上多余的菌液，叶盘正面朝上置于1/2MS固体培养基上，25℃恒温培养箱中暗培养2天；将叶盘转移到1/2MS-Cef(250mg/L，500μL/200mL)固体培养基上继续暗培养，2周左右叶盘伤口边缘能够长出毛状根。待毛状根长至约3～5cm时剪下，将其接种到新的1/2MS-Cef-Hyg固体筛选培养基上培养。在毛状根生长的过程中，对使用的培养基进行梯度降抗处理，约每2周更换一次培养基，Cef的用量从500μL/200mL减至0，根据实际情况自行调节抗生素浓度；与此同时，在培养基中梯度增加Hyg的浓度，Hyg(10mg/L)的用量从0增至40μL/200mL。将抗生素调节完成的毛状根样品，转移到1/2MS-Hyg液体培养基中扩大培养，每2～4周更换新鲜培养基，培养周期为45天左右。

[0100] 取适量新鲜毛状根材料使用植物DNA提取试剂盒提取基因组DNA，提取方法参考说明书，提取后的DNA样品于-20℃保存。使用鉴定引物对DNA样品进行鉴定。另外，因为所有的毛状根材料中都带有rolB或rolC基因，并且使用的载体中都带有潮霉素抗性基因hpt，因此同时进行鉴定两种基因。鉴定阳性的材料一部分以100mg/份用液氮速冻，-80℃保存备用；另一部分40℃烘干至重量不再发生变化，使用球磨机将材料磨碎，阴凉干燥处储存。

[0101] 取新鲜毛状根材料提取总RNA，使用nanodrop检测RNA含量，并定量反转录成cDNA，以此cDNA为模板进行实时定量PCR，以检测IiWRKY34基因的表达情况，所用引物见表3，菘蓝毛状根鉴定结果见如图3和图4所示，其中图3和图4的泳道1为marker，泳道2为阳性对照，泳道3为空白对照；图3泳道4为空载体PHB，泳道5～11为IiWRKY34基因过量表达的毛状根材料，依次为OVX-1、OVX-2、OVX-3、OVX-4、OVX-5、OVX-6、OVX-7、OVX-8和OVX-9；图4泳道4为空载体p1300，泳道5～11为IiWRKY34基因抑制表达的毛状根材料，依次为RNAi-3、RNAi-4、RNAi-5、RNAi-6、RNAi-7、RNAi-8和RNAi-2。

[0102] 表3 PCR鉴定引物

[0103]引物名称序列编号
qPCR-WRKY34-F gttaacaagagcaatatggccg SEQ ID NO.6
qPCR-WRKY34-R cccttgagactttctccttcacaa SEQ ID NO.7
Actin-F atcctccgtcttgaccttgat SEQ ID NO.8
Actin-R tttcccgttctgctgttgtg SEQ ID NO.9

[0104] 各毛状根株系中IiWRKY34基因的表达情况如图5所示，由图5可以看出，在使用RNA干扰技术诱导得到的IiWRKY34基因抑制表达材料中，IiWRKY34基因的表达量明显降低；相反，所得诱导过量表达IiWRKY34基因的材料中该基因的表达量明显升高。

[0105] 实施例4

[0106] IiWRKY34基因对落叶松脂素的调控作用：

[0107] 提取毛状根中的落叶松脂素：精密称取各组毛状根的粉末，按照比例(100mg/10mL甲醇)加入溶液；超声30min或15min 2次；取1mL萃取液于离心管中，最大转速离心10min；取700μL上清于新离心管中，使用低温浓缩仪挥发溶液；加入等体积甲醇震荡复溶；最大转速离心10 min；取上清液200μL转移到进样小瓶中。

[0108] 结果如图6所示，在各组毛状根材料中检测落叶松脂素的含量时发现，OVX组中落叶松脂素含量显著上升，其落叶松脂素的含量为野生型的5.6倍；RNAi组中落叶松脂素含量明显下降，下降约80％。

[0109] 实施例5

[0110] IiWRKY34基因对落叶毛状根的生物量的调控作用：

[0111] 结合图7中结果，随着在培养时间的延长，各组毛状根材料都在稳定的生长，但明显地发现IiWRKY34基因抑制表达组(RNAi)材料明显低于野生型空白对照组(WT)及空载体对照组(p1300)，约减少70％；而IiWRKY34基因过量表达组(OVX)的材料生物量则明显高于WT(约为3.7倍)及空载体对照组(pHB)；同时图8和图9所示锥形瓶中展示的毛状根材料生物量情况，与该结果相吻合。

[0112] 实施例6

[0113] IiWRKY34基因对落叶毛状根材料木质化的调控作用：

[0114] 取新鲜的毛状根样品进行番红固绿染色，并制作石蜡切片，观察其横截面的组织形态；另去新鲜的毛状根样品进行间苯三酚染色，观察染色情况。结果如图10和图11所示：对照番红固绿染色和间苯三酚-浓盐酸染色的结果，发现IiWRKY34基因抑制表达组(RNAi组)的毛状根材料木质化程度低于对照组(横截面示意图中被染红的细胞壁较少，间苯三酚-浓盐酸染色后材料颜色相对较浅)；而IiWRKY34基因过量表达组(OVX组)的毛状根材料木质化程度则远远高于对照组(横截面示意图中被染红的细胞壁较多，间苯三酚-浓盐酸染色后材料颜色相对较深)。

[0115] 从实施例4～实施例6可以看出，相比WT组而言，IiWRKY34基因抑制表达的材料其生物量明显降低，木质化程度降低，所含落叶松脂素的含量也明显降低；而与之相反IiWRKY34基因过量表达的材料中，生物量、木质化程度，包括落叶松脂素的含量都明显升高。这说明菘蓝中IiWRKY34基因的功能与菘蓝根的生长发育密切相关，其表达水平能够明显影响根的生物量，并且影响根中组织细胞的木质化程度，表明其可能参与到根中木脂素的形成过程中。

[0116] 实施例7

[0117] 取野生菘蓝植株开花期不同器官组织的材料，液氮速冻，-80℃保存备用。取冷冻材料，提取总RNA并检测RNA浓度，反转录成cDNA。以此cDNA样品为模板进行IiWRKY34基因表达情况的检测。

[0118] 使用实时定量PCR的方法，针对野生开花期菘蓝植株不同器官组织IiWRKY34基因的表达情况检测，见图12所示。IiWRKY34基因在花中的表达量比较低，而在根、茎、叶中的表达量则相对较高，三者中在叶中的表达量相对较低，但差距不大，使用单因素方差分析将各组数据与根中数据相比较无显著性差异。

[0119] 实施例8

[0120] 使用40天左右的野生型菘蓝无菌苗作为抗胁迫能力实验材料。

[0121] 人为制造逆境：模拟干旱条件(PEG2.5％)，高盐环境(NaCl 200mM)，其他诱导因素(ASA，100μM；MeJA，100μM)，喷洒到叶片上，对照组喷洒等量水。

[0122] 分别在喷洒后1h、3h、6h、12h采收叶片，液氮速冻，-80℃保存备用。取冷冻材料，提取总RNA并检测RNA浓度，反转录成cDNA。以此cDNA样品为模板进行IiWRKY34基因表达情况的检测。

[0123] 使用菘蓝无菌苗作为研究材料进行逆境模拟实验，结果如图13～图16所示：虽然IiWRKY34基因在不同模拟逆境条件下、不同处理时间点的表达情况有所不同，但在所有处理条件下IiWRKY34基因的表达量都有所升高。在模拟干旱条件下，在6小时左右明显升高(0小时组的7.67倍)，在12小时时下降；在高浓度盐环境中，同样在6小时表达量升高(0小时组的24倍)；而受水杨酸(SA)和甲基茉莉酸(MeJA)诱导组，在1小时时IiWRKY34基因的表达量会升高(分别为0小时组的16.65倍和27.7倍)，在3小时时降低(与1小时组相比分别下降61.18％和81.62％)，在6小时时又升高(分别为3小时组的3.12倍与5.68倍)。

[0124] 实施例9

[0125] 使用诱导的IiWRKY34基因抑制表达及过量表达毛状根材料。

[0126] 人为制造逆境：模拟干旱条件(PEG2.5％)，高盐环境(NaCl 75mM)，加入到培养基中，对照组加入等量水，暗培养3天收集毛状根材料进行检测。

[0127] 取收获期新鲜的毛状根材料，按照说明书所示比例使用1/2MS液体培养基对ROS荧光探针进行稀释，并对毛状根材料进行孵育处理，1.5h-2h在荧光显微镜下进行观察，绿光激发，呈现红色。

[0128] 精密称取毛状根样品粉末，按照说明书所示方法进行处理，使用酶标仪检测材料的吸光度，并进行计算材料中脯氨酸(PRO)的含量。

[0129] 精密称取毛状根样品粉末，按照说明书所示方法进行处理，使用酶标仪检测材料的吸光度，并进行计算材料的总抗氧化能力。

[0130] 使用毛状根材料进行逆境模拟实验，结果如图17～图20所示。虽然过表达IiWRKY34毛状根的生长状态在盐和干旱处理下与未处理组相比无明显差异，但是抑制表达IiWRKY34时，在盐和干旱处理下毛状根显示出明显的早衰现象，表明IiWRKY34表达与抗盐和抗干旱胁迫密切关联(如图17所示)。

[0131] 在ROS检测实验中(图18)，荧光强度越弱，表明材料的抗胁迫能力越强。在未处理对照组以及干旱处理组、盐处理组中过量表达IiWRKY34基因的材料荧光强度比对照组弱，而基因表达抑制组的荧光强度则在干旱处理及盐处理组中有明显的增强。

[0132] 在毛状根材料总抗氧化能力的检测实验中(图19)，使用TEAC作为材料抗氧化能力的参照，数值越高抗氧化能力越强。由图可知在未处理对照组以及干旱处理组、盐处理组中，IiWRKY34基因过量表达材料的总抗氧化能力均大于野生型对照组(分别为1.48倍，2.48倍和3.56倍)，且具有显著性差异；而抑制表达IiWRKY34基因材料的总抗氧化能力相对野生型对照组除则没有显著变化甚至有所降低。

[0133] 在脯氨酸含量检测实验中(图20)脯氨酸的含量越高，总抗氧化能力越高，则表明抗胁迫能力越强。干旱处理组及盐处理组中，IiWRKY34基因过量表达材料的脯氨酸含量大于野生型对照组WT(分别为1.05倍及1.25倍)而IiWRKY34基因抑制表达材料中脯氨酸含量则小于野生型对照组WT(分别下降19.8％及12.63％)。综上所述，IiWRKY34基因在菘蓝植物中参与植物的抗胁迫作用。

[0134] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

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