具有蓝色系花色的菊花的制作方法
阅读：237发布：2020-05-19
专利汇可以提供具有蓝色系花色的菊花的制作方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 在于提供具有蓝色系花色的转化菊花 植物 或其自交或者异交后代或者它们的 营养繁殖 体、植物体的一部分、组织或细胞。使来自蝶豆的花色苷3′，5′-O- 葡萄糖 基转移酶基因(CtA3′5′GT)及来自 风 铃草的类黄 酮 3′，5′-羟化酶基因(CamF3′5′H)在菊花花瓣中共表达。，下面是具有蓝色系花色的菊花的制作方法专利的具体信息内容。
1.一种表达盒，其特征在于，包含第1多聚核苷酸及第2多聚核苷酸，第1多聚核苷酸选自以下的(1-a)～(1-e)：
(1-a)由序列号1的碱基序列构成的多聚核苷酸；
(1-b)与由与序列号1的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸在严谨条件下杂交的多聚核苷酸，且编码具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(1-c)编码由序列号2的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
(1-d)编码由在序列号2的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的多聚核苷酸；及
(1-e)编码相对于序列号2的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的多聚核苷酸；
第2多聚核苷酸选自以下的(2-a)～(2-e)：
(2-a)由序列号3的碱基序列构成的多聚核苷酸；
(2-b)与由与序列号3的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸在严谨条件下杂交的多聚核苷酸，且编码具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(2-c)编码由序列号4的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
(2-d)编码由在序列号4的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的多聚核苷酸；及(2-e)编码相对于序列号4的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的多聚核苷酸。
2.根据权利要求1所述的表达盒，其特征在于，进一步包含与所述第1多聚核苷酸运转有关的第1启动子及第1终止子以及与所述第2多聚核苷酸运转有关的第2启动子及第2终止子。
3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于，所述第1启动子为菊花F3H启动子，而且所述第1终止子为拟南芥HSP终止子或农杆菌nos终止子。
4.根据权利要求2或3所述的表达盒，其特征在于，所述第2启动子为菊花F3H启动子，而且所述第2终止子为拟南芥HSP终止子或农杆菌nos终止子。
5.一种载体，其特征在于，包含权利要求1～4中任一项所述的表达盒。
6.一种转化菊花植物或其自交或者异交后代或者它们的营养繁殖体、植物体的一部分、组织或细胞，其特征在于，包含权利要求1～4中任一项所述的表达盒。
7.根据权利要求6所述的转化菊花植物或其自交或者异交后代或者它们的营养繁殖体、植物体的一部分、组织或细胞，其特征在于，在花瓣中使来自蝶豆的花色苷3′，5′-O-葡萄糖基转移酶基因即CtA3′5′GT及来自风铃草的类黄酮3′，5′-羟化酶基因即CamF3′5′H共表达。
8.根据权利要求6或7所述的转化菊花植物或其自交或者异交后代或者它们的营养繁殖体、植物体的一部分、组织或细胞，其特征在于，含有花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′
5′-二葡萄糖苷及ternatin C5及/或花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷即preternatin C5。
9.一种切花或者由该切花制成的加工品，其特征在于，为权利要求6～8中任一项所述的转化菊花植物或其自交或者异交后代的切花或者由该切花制成的加工品。
10.一种方法，为用于制作具有蓝色系花色的转化菊花植物的方法，其特征在于，包含在宿主中导入第1多聚核苷酸及/或导入第2多聚核苷酸的工序，
第1多聚核苷酸选自以下的(1-a)～(1-e)：
(1-a)由序列号1的碱基序列构成的多聚核苷酸；
(1-b)与由与序列号1的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸在严谨条件下杂交的多聚核苷酸，且编码具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(1-c)编码由序列号2的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
(1-d)编码由在序列号2的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的多聚核苷酸；及
(1-e)编码相对于序列号2的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的多聚核苷酸；
第2多聚核苷酸选自以下的(2-a)～(2-e)：
(2-a)由序列号3的碱基序列构成的多聚核苷酸；
(2-b)与由与序列号3的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸在严谨条件下杂交的多聚核苷酸，且编码具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(2-c)编码由序列号4的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
(2-d)编码由在序列号4的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的多聚核苷酸；及(2-e)编码相对于序列号4的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的多聚核苷酸。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，通过在权利要求1～4中任一项所述的表达盒或权利要求5所述的载体中转化宿主来进行。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述蓝色系花色在RHS标准比色卡中为蓝色组或者紫罗兰色-蓝色组且/或在CIEL*a*b*表色系的色相角中显示230°～290°。
13.一种转化菊花植物或其自交或者异交后代或者它们的营养繁殖体、植物体的一部分、组织或细胞，其特征在于，通过权利要求10～12中任一项所述的方法制成。
14.一种切花或者由该切花制成的加工品，其特征在于，为权利要求13所述的转化菊花植物或其自交或者异交后代的切花或者由该切花制成的加工品。
具有蓝色系花色的菊花的制作方法
技术领域
[0001] 本发明涉及用于使来自蝶豆的花色苷3′，5′-O-葡萄糖基转移酶基因(CtA3′5′GT)及来自风铃草的类黄酮3′，5′-羟化酶基因(CamF3′5′H)在菊花花瓣中共表达的表达盒、包含该表达盒的载体及转化菊花植物或其自交或者异交后代或者它们的营养繁殖体、植物体的一部分(尤其是切花)或者其加工品(尤其是切花加工品)、组织或细胞以及用于制作具有蓝色系花色的转化菊花植物的方法。
背景技术
[0002] 菊花、玫瑰、康乃馨、百合等为世界性产业上重要的花卉。尤其是菊花在世界花卉产业中具有仅次于玫瑰的市场规模，为在日本国内占切花生产量的4成、生产额的3成的第1名花卉。然而，在上述主要花卉中，由于存在可杂交的近缘种中没有蓝色系花色的野生种等问题，从而在以往的杂交育种、突变育种中制作具有蓝色系花色的品种存在困难。对于全新的蓝色系花色的创造而言，伴随着花卉利用场所的扩大而唤起了新需要并与生产、消费的扩大有关。因此，通过基因工程的方法制作具有蓝色系花色的花卉，对于康乃馨与玫瑰而言均有市售。只是，以目前的蓝色系花色为目标的花色改变中，紫色(RHS标准比色卡色相组：紫色组)、蓝紫色(紫色-紫罗兰色组，紫罗兰色组)是极限，没有制作出具有紫蓝色(紫罗兰色-蓝色组)、蓝色(蓝色组)花色的蓝色花卉。因此，蓝色花卉现在也仅限于龙胆、飞燕草、蓝星等，依然希望开发出能够制造真正具有蓝色花色的花卉的蓝色表达控制技术。
[0003] 在以花的蓝色化为目标的花色改变中，作为所导入的基因已知有F3′5′H(专利文献1)。通过单独导入F3′5′H或与抑制内源性F3′H、DFR表达的构建物一起导入，并将花瓣的花色苷转化为花翠素型，从而能够将花色改变为蓝色方向(图1)。在菊花中导入CamF3′5′H(非专利文献1、专利文献2)时，已知可改变为色相角315°左右的紫色(RHS标准比色卡紫罗兰色组83)或蓝紫色(紫罗兰色组88)(专利文献3、非专利文献2)。而且，已知通过三色堇-F3′5′H(专利文献1)的表达与内源性F3′H的抑制所得到的菊花成为紫色(紫色-紫罗兰色组N82)、蓝紫色(紫罗兰色组84)(专利文献4、非专利文献3)。进而，使A3′5′OMT(专利文献5)与CamF3′5′H共表达而合成·累积二甲花翠素型花色苷时，可得到显示更偏向蓝色侧的色相角305°～315°(蓝紫色)的菊花(非专利文献4)。报道了对于康乃馨(非专利文献5)、玫瑰(专利文献6、非专利文献6)、百合(专利文献7)、大丽花(非专利文献7)、蝴蝶兰(专利文献8、专利文献9)而言，也可同样制作具有紫色、蓝紫色花的转化体。
[0004] 对于使用F3′5′H、A3′5′OMT等以往的蓝色化技术而言，可制作紫色、蓝紫色的花色，但无法制作在紫罗兰色-蓝色组、蓝色组中显示色相角230°～290°的具有真正蓝色花色的转化体。而且，阐明了花的各种各样的蓝色表达机制(非专利文献8)，作为与其相关的基因还报道了负责引起分子内结合的芳香族有机酸引起的花色苷的聚酰化(图2)(专利文献10、专利文献11、专利文献12、专利文献13、专利文献14、非专利文献9)、引起分子间结合的花色苷与辅色素(辅色素)的合成(专利文献15，专利文献16，专利文献17)、液胞内pH的调整(专利文献18、专利文献19)、金属离子向液胞的运输(专利文献20、非专利文献10)、金属配合物构成黄酮的合成(专利文献21)等的基因，但并没有导入了上述基因的花卉的蓝色化的成功例子。而且，芳香族有机酸引起的聚酰化在花色苷的糖残基上发生，报道了负责该糖残基的赋予的来自蝶豆的花色苷3′，5′-O-葡萄糖基转移酶基因(CtA3′5′GT)(专利文献22)。
报道了将相关基因导入累积花翠素3-葡萄糖苷的浅紫色的山梗菜中，结果为花色变成蓝色，通过山梗菜内源性的3′-酰基转移酶(3′AT)及5′AT的作用，在花瓣中累积的花色苷约
70％的3′位、5′位的葡萄糖基被芳香族酰基修饰。由于该聚酰化花色苷的累积是山梗菜的花色向蓝色改变的要因，故而在导入CtA3′5′GT进行的蓝色花的制作中显示出使Ct3′AT等芳香族酰基转移酶基因共表达的必要性(非专利文献11)。事实上，判明即使在菊花中仅导入CtA3′5′GT也无法实现蓝色化(参考例1、2)。
为了再现蓝色表达机制而需要组合多个基因而使其全部基因发挥功能，由于并不一定在导入的宿主中发挥功能，从而仅有蓝色表达机制的阐述、负责该机制的基因的报道例，无法说能够真正地制作蓝色的花。
现有技术文献
专利文献
报道了将相关基因导入累积花翠素3-葡萄糖苷的浅紫色的山梗菜中，结果为花色变成蓝色，通过山梗菜内源性的3′-酰基转移酶(3′AT)及5′AT的作用，在花瓣中累积的花色苷约
70％的3′位、5′位的葡萄糖基被芳香族酰基修饰。由于该聚酰化花色苷的累积是山梗菜的花色向蓝色改变的要因，故而在导入CtA3′5′GT进行的蓝色花的制作中显示出使Ct3′AT等芳香族酰基转移酶基因共表达的必要性(非专利文献11)。事实上，判明即使在菊花中仅导入CtA3′5′GT也无法实现蓝色化(参考例1、2)。
为了再现蓝色表达机制而需要组合多个基因而使其全部基因发挥功能，由于并不一定在导入的宿主中发挥功能，从而仅有蓝色表达机制的阐述、负责该机制的基因的报道例，无法说能够真正地制作蓝色的花。
现有技术文献
专利文献
[0005] 专利文献1：国际公开第2004/020637号公报专利文献2：国际公开第2013/157502号公报
专利文献3：国际公开第2010/122849号公报
专利文献4：国际公开第2009/062253号公报
专利文献5：国际公开第2003/062428号公报
专利文献6：国际公开第2005/017147号公报
专利文献7：国际公开第2012/036290号公报
专利文献8：日本专利第5285304号公报
专利文献9：国际公开第2008/136434号公报
专利文献10：日本专利第4853853号公报
专利文献11：日本专利第4982782号公报
专利文献12：国际公开第1996/025500号公报
专利文献13：国际公开第2006/046780号公报
专利文献14：国际公开第2011/016260号公报
专利文献15：国际公开第2008/156211号公报
专利文献16：国际公开第2008/156214号公报
专利文献17：国际公开第2008/156206号公报
专利文献18：国际公开第2001/14560号公报
专利文献19：日本专利第507282号公报
专利文献20：日本专利第4958247号公报
专利文献21：国际公开第2012/096307号公报
专利文献22：日本专利第4418865号公报
非专利文献
专利文献3：国际公开第2010/122849号公报
专利文献4：国际公开第2009/062253号公报
专利文献5：国际公开第2003/062428号公报
专利文献6：国际公开第2005/017147号公报
专利文献7：国际公开第2012/036290号公报
专利文献8：日本专利第5285304号公报
专利文献9：国际公开第2008/136434号公报
专利文献10：日本专利第4853853号公报
专利文献11：日本专利第4982782号公报
专利文献12：国际公开第1996/025500号公报
专利文献13：国际公开第2006/046780号公报
专利文献14：国际公开第2011/016260号公报
专利文献15：国际公开第2008/156211号公报
专利文献16：国际公开第2008/156214号公报
专利文献17：国际公开第2008/156206号公报
专利文献18：国际公开第2001/14560号公报
专利文献19：日本专利第507282号公报
专利文献20：日本专利第4958247号公报
专利文献21：国际公开第2012/096307号公报
专利文献22：日本专利第4418865号公报
非专利文献
[0006] 非专利文献1：Biosci.Biotechnol.Biochem.(2003)67：161非专利文献2：Plant Cell Physiol(2013)54：1684
非专利文献3：Plant Cell Physiol(2013)54：1696
非专利文献4：ICP2014：251
非专利文献5：Phytochemistry(2003)63：15
非专利文献6：Plant Cell Physiol(2007)48：1589
非专利文献7：农耕与园艺(2012)10月号p.42，农业技术体系附录第15号330的1的192非专利文献8：Nat Prod Rep(2009)26：857
非专利文献9：Plant Cell Physiol(2015)56：28
非专利文献10：Plos one(2012)7：e43189
非专利文献11：日本植物细胞分子生物学会筑波大会·座谈会演讲摘要集(2006)p.40发明内容
非专利文献3：Plant Cell Physiol(2013)54：1696
非专利文献4：ICP2014：251
非专利文献5：Phytochemistry(2003)63：15
非专利文献6：Plant Cell Physiol(2007)48：1589
非专利文献7：农耕与园艺(2012)10月号p.42，农业技术体系附录第15号330的1的192非专利文献8：Nat Prod Rep(2009)26：857
非专利文献9：Plant Cell Physiol(2015)56：28
非专利文献10：Plos one(2012)7：e43189
非专利文献11：日本植物细胞分子生物学会筑波大会·座谈会演讲摘要集(2006)p.40发明内容
[0007] 本发明所要解决的课题在于提供具有蓝色系花色的转化菊花植物或其自交或者异交后代或者它们的营养繁殖体、植物体的一部分、组织或细胞。
[0008] 本申请发明者为了解决上述课题进行了深入研究并反复进行实验，结果发现通过使来自蝶豆的花色苷3′，5′-O-葡萄糖基转移酶基因(CtA3′5′GT)及来自风铃草的类黄酮3′，5′-羟化酶基因(CamF3′5′H)在菊花花瓣中共表达时，可得到以往无法得到的具有蓝色系花色(RHS标准比色卡第5版：紫罗兰色-蓝色组/蓝色组且/或色相角：230°～290°)的转化菊花植物，从而完成了本发明。
[0009] 即本发明如下所示。[1]一种表达盒，其特征在于，包含第1多聚核苷酸及第2多聚核苷酸，第1多聚核苷酸选自以下的(1-a)～(1-e)：
(1-a)由序列号1的碱基序列构成的多聚核苷酸；
(1-b)与由与序列号1的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸在严谨条件下杂交的多聚核苷酸，且编码具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(1-c)编码由序列号2的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
(1-d)编码由在序列号2的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的多聚核苷酸；及
(1-e)编码相对于序列号2的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的多聚核苷酸；
第2多聚核苷酸选自以下的(2-a)～(2-e)：
(2-a)由序列号3的碱基序列构成的多聚核苷酸；
(2-b)与由与序列号3的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸在严谨条件下杂交的多聚核苷酸，且编码具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(2-c)编码由序列号4的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
(2-d)编码由在序列号4的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的多聚核苷酸；及(2-e)编码相对于序列号4的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的多聚核苷酸。
[2]根据[1]所述的表达盒，其特征在于，进一步包含与所述第1多聚核苷酸运转有关的第1启动子及第1终止子以及与所述第2多聚核苷酸运转有关的第2启动子及第2终止子。
[3]根据[2]所述的表达盒，其特征在于，所述第1启动子为菊花F3H启动子，而且所述第
1终止子为拟南芥HSP终止子或农杆菌nos终止子。
[4]根据[2]或[3]所述的表达盒，其特征在于，所述第2启动子为菊花F3H启动子，而且所述第2终止子为拟南芥HSP终止子或农杆菌nos终止子。
[5]一种载体，其特征在于，包含[1]～[4]中任一项所述的表达盒。
[6]一种转化菊花植物或其自交或者异交后代或者它们的营养繁殖体、植物体的一部分、组织或细胞，其特征在于，包含[1]～[4]中任一项所述的表达盒。
[7]根据[6]所述的转化菊花植物或其自交或者异交后代或者它们的营养繁殖体、植物体的一部分、组织或细胞，其特征在于，在花瓣中使来自蝶豆的花色苷3′，5′-O-葡萄糖基转移酶基因即CtA3′5′GT及来自风铃草的类黄酮3′，5′-羟化酶基因即CamF3′5′H共表达。
[8]根据[6]或[7]所述的转化菊花植物或其自交或者异交后代或者它们的营养繁殖体、植物体的一部分、组织或细胞，其特征在于，含有花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′5′-二葡萄糖苷即ternatin C5及/或花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷即preternatin C5。
[9]一种切花或者由该切花制成的加工品，其特征在于，为[6]～[8]中任一项所述的转化菊花植物或其自交或者异交后代的切花或者由该切花制成的加工品。
[10]一种方法，为用于制作具有蓝色系花色的转化菊花植物的方法，其特征在于，包含在宿主中导入第1多聚核苷酸及/或导入第2多聚核苷酸的工序，
第1多聚核苷酸选自以下的(1-a)～(1-e)：
(1-a)由序列号1的碱基序列构成的多聚核苷酸；
(1-b)与由与序列号1的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸在严谨条件下杂交的多聚核苷酸，且编码具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(1-c)编码由序列号2的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
(1-d)编码由在序列号2的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的多聚核苷酸；及
(1-e)编码相对于序列号2的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的多聚核苷酸；
第2多聚核苷酸选自以下的(2-a)～(2-e)：
(2-a)由序列号3的碱基序列构成的多聚核苷酸；
(2-b)与由与序列号3的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸在严谨条件下杂交的多聚核苷酸，且编码具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(2-c)编码由序列号4的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
(2-d)编码由在序列号4的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的多聚核苷酸；及(2-e)编码相对于序列号4的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的多聚核苷酸。
[11]根据[10]所述的方法，其特征在于，通过在[1]～[4]中任一项所述的表达盒或[5]所述的载体中转化宿主来进行。
[12]根据[11]所述的方法，其特征在于，所述蓝色系花色在RHS标准比色卡中为蓝色组或者紫罗兰色-蓝色组且/或在CIEL*a*b*表色系的色相角中显示230°～290°。
[13]一种转化菊花植物或其自交或者异交后代或者它们的营养繁殖体、植物体的一部分、组织或细胞，其特征在于，通过[10]～[12]中任一项所述的方法制成。
[14]一种切花或者由该切花制成的加工品，其特征在于，为[13]所述的转化菊花植物或其自交或者异交后代的切花或者由该切花制成的加工品。
(1-a)由序列号1的碱基序列构成的多聚核苷酸；
(1-b)与由与序列号1的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸在严谨条件下杂交的多聚核苷酸，且编码具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(1-c)编码由序列号2的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
(1-d)编码由在序列号2的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的多聚核苷酸；及
(1-e)编码相对于序列号2的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的多聚核苷酸；
第2多聚核苷酸选自以下的(2-a)～(2-e)：
(2-a)由序列号3的碱基序列构成的多聚核苷酸；
(2-b)与由与序列号3的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸在严谨条件下杂交的多聚核苷酸，且编码具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(2-c)编码由序列号4的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
(2-d)编码由在序列号4的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的多聚核苷酸；及(2-e)编码相对于序列号4的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的多聚核苷酸。
[2]根据[1]所述的表达盒，其特征在于，进一步包含与所述第1多聚核苷酸运转有关的第1启动子及第1终止子以及与所述第2多聚核苷酸运转有关的第2启动子及第2终止子。
[3]根据[2]所述的表达盒，其特征在于，所述第1启动子为菊花F3H启动子，而且所述第
1终止子为拟南芥HSP终止子或农杆菌nos终止子。
[4]根据[2]或[3]所述的表达盒，其特征在于，所述第2启动子为菊花F3H启动子，而且所述第2终止子为拟南芥HSP终止子或农杆菌nos终止子。
[5]一种载体，其特征在于，包含[1]～[4]中任一项所述的表达盒。
[6]一种转化菊花植物或其自交或者异交后代或者它们的营养繁殖体、植物体的一部分、组织或细胞，其特征在于，包含[1]～[4]中任一项所述的表达盒。
[7]根据[6]所述的转化菊花植物或其自交或者异交后代或者它们的营养繁殖体、植物体的一部分、组织或细胞，其特征在于，在花瓣中使来自蝶豆的花色苷3′，5′-O-葡萄糖基转移酶基因即CtA3′5′GT及来自风铃草的类黄酮3′，5′-羟化酶基因即CamF3′5′H共表达。
[8]根据[6]或[7]所述的转化菊花植物或其自交或者异交后代或者它们的营养繁殖体、植物体的一部分、组织或细胞，其特征在于，含有花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′5′-二葡萄糖苷即ternatin C5及/或花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷即preternatin C5。
[9]一种切花或者由该切花制成的加工品，其特征在于，为[6]～[8]中任一项所述的转化菊花植物或其自交或者异交后代的切花或者由该切花制成的加工品。
[10]一种方法，为用于制作具有蓝色系花色的转化菊花植物的方法，其特征在于，包含在宿主中导入第1多聚核苷酸及/或导入第2多聚核苷酸的工序，
第1多聚核苷酸选自以下的(1-a)～(1-e)：
(1-a)由序列号1的碱基序列构成的多聚核苷酸；
(1-b)与由与序列号1的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸在严谨条件下杂交的多聚核苷酸，且编码具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(1-c)编码由序列号2的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
(1-d)编码由在序列号2的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的多聚核苷酸；及
(1-e)编码相对于序列号2的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的多聚核苷酸；
第2多聚核苷酸选自以下的(2-a)～(2-e)：
(2-a)由序列号3的碱基序列构成的多聚核苷酸；
(2-b)与由与序列号3的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸在严谨条件下杂交的多聚核苷酸，且编码具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(2-c)编码由序列号4的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
(2-d)编码由在序列号4的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的多聚核苷酸；及(2-e)编码相对于序列号4的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的多聚核苷酸。
[11]根据[10]所述的方法，其特征在于，通过在[1]～[4]中任一项所述的表达盒或[5]所述的载体中转化宿主来进行。
[12]根据[11]所述的方法，其特征在于，所述蓝色系花色在RHS标准比色卡中为蓝色组或者紫罗兰色-蓝色组且/或在CIEL*a*b*表色系的色相角中显示230°～290°。
[13]一种转化菊花植物或其自交或者异交后代或者它们的营养繁殖体、植物体的一部分、组织或细胞，其特征在于，通过[10]～[12]中任一项所述的方法制成。
[14]一种切花或者由该切花制成的加工品，其特征在于，为[13]所述的转化菊花植物或其自交或者异交后代的切花或者由该切花制成的加工品。
[0010] 对通过本发明所得到的具有蓝色花特征的菊花转化体的花瓣花色苷进行分析，结果发现新合成的主要花色苷为花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′5′-二葡萄糖苷(ternatinC5)，微量花色苷为花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatinC5)、花翠素3-(3″，6″-二丙二酰)葡萄糖苷-3′5′-二葡萄糖苷、花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷、矢车菊素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷，没有检测到通过分子内结合进行蓝色表达的被芳香族有机酸聚酰化的花色苷等。即根据本发明仅将花色苷3′位及5′位羟化及糖基化可赋予菊花蓝色的花色特征。本发明基于不需要对于蓝色表达所必须的芳香族酰基引起的聚酰化的与以往的理论、技术完全不同的蓝色表达控制技术。
附图说明
附图说明
[0011] 图1表示通过导入F3′5′H在菊花花瓣中合成的花翠素糖苷。图2表示引起分子内结合的芳香族有机酸进行的花色苷的聚酰化(蝶豆的ternatin生物合成的例子)。
图3表示蓝色菊花花瓣所包含的主要花色苷的HPLC-MS分析结果。
图4表示蓝色菊花花瓣所包含的主要花色苷的化学结构与LC-MS/MS分析结果。
图5为导入CamF3′5′H及CtA3′5′GT的菊花花色的蓝色化的照片及蓝色菊花花瓣所包含的主要花色苷的HPLC分析结果。
图6为导入CtA3′5′GT的菊花花色的照片。
图3表示蓝色菊花花瓣所包含的主要花色苷的HPLC-MS分析结果。
图4表示蓝色菊花花瓣所包含的主要花色苷的化学结构与LC-MS/MS分析结果。
图5为导入CamF3′5′H及CtA3′5′GT的菊花花色的蓝色化的照片及蓝色菊花花瓣所包含的主要花色苷的HPLC分析结果。
图6为导入CtA3′5′GT的菊花花色的照片。
[0012] 本发明涉及一种表达盒，其特征在于，包含第1多聚核苷酸及第2多聚核苷酸，第1多聚核苷酸选自以下的(1-a)～(1-e)：(1-a)由序列号1的碱基序列构成的多聚核苷酸；
(1-b)与由与序列号1的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸在严谨条件下杂交的多聚核苷酸，且编码具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(1-c)编码由序列号2的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
(1-d)编码由在序列号2的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的多聚核苷酸；及
(1-e)编码相对于序列号2的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的多聚核苷酸；
第2多聚核苷酸选自以下的(2-a)～(2-e)：
(2-a)由序列号3的碱基序列构成的多聚核苷酸；
(2-b)与由与序列号3的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸在严谨条件下杂交的多聚核苷酸，且编码具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(2-c)编码由序列号4的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
(2-d)编码由在序列号4的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的多聚核苷酸；及(2-e)编码相对于序列号4的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的多聚核苷酸。
(1-b)与由与序列号1的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸在严谨条件下杂交的多聚核苷酸，且编码具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(1-c)编码由序列号2的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
(1-d)编码由在序列号2的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的多聚核苷酸；及
(1-e)编码相对于序列号2的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的多聚核苷酸；
第2多聚核苷酸选自以下的(2-a)～(2-e)：
(2-a)由序列号3的碱基序列构成的多聚核苷酸；
(2-b)与由与序列号3的碱基序列互补的碱基序列构成的多聚核苷酸在严谨条件下杂交的多聚核苷酸，且编码具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的多聚核苷酸；
(2-c)编码由序列号4的氨基酸序列构成的蛋白质的多聚核苷酸；
(2-d)编码由在序列号4的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成且具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的多聚核苷酸；及(2-e)编码相对于序列号4的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列且具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的多聚核苷酸。
[0013] 在本说明书中，用语“多聚核苷酸”意味着DNA或RNA，在本发明的表达盒中第1多聚核苷酸编码来自蝶豆的花色苷3′，5′-O-葡萄糖基转移酵或其类似物，而且第2多聚核苷酸编码来自风铃草的类黄酮3′，5′-羟化酶或其类似物。在此“编码”意味着使目标蛋白质在具备其活性的状态下表达。而且，“编码”包括将目标蛋白质作为连续的结构序列(外显子)进行编码或介由间隔序列(内含子)进行编码的两种意思。
[0014] 花色苷3′，5′-O-葡萄糖基转移酶为催化将糖依次转移到花色苷的3′位及5′位羟基的反应的酶，从蝶豆的蓝色花瓣中被发现。认为由于花色苷的羟基中3′位及5′位均被糖基化，进而累积了经芳香族酰基进行修饰的聚酰化花翠素，从而蝶豆的花瓣发色成蓝色。而且，类黄酮3′，5′-羟化酶为将类黄酮的3′位及5′位羟化的酶，从风铃草的蓝色花瓣等中被发现。认为在F3′5′H表达的花瓣中花翠素型花色苷大量累积，据此可发色成浅紫色、紫色、蓝紫色或蓝色。然而，菊花植物既没有编码花色苷3′，5′-O-葡萄糖基转移酶的基因也没有编码类黄酮3′，5′-羟化酶的基因。而且，由于菊花具有六倍体这样的高倍体性且基因组大小也较大，故而除转化效率较低以外还会引起导入基因的沉默(非活性)，导入这些基因而得到稳定表达的基因重组菊花并不容易。进而，即使导入CtA3′5′GT或CamF3′5′H中的任一个，花瓣也不会发生蓝色化，目前并不知道具有蓝色系花色的转化菊花植物。
[0015] 在本说明书中，用语“严谨条件”是指多聚核苷酸或寡聚核苷酸与基因组DNA能够选择性且可检测的特异性结合的条件。严谨条件可通过盐浓度、有机溶剂(例如甲酰胺)、温度及其他公知的条件的适当组合来定义。即通过减少盐浓度或增加有机溶剂浓度或提高杂交温度可增加严谨性(stringency)。进而，杂交后的清洗条件也会对严谨性产生影响。而且，该清洗条件还可由盐浓度与温度定义，通过减少盐浓度与提高温度可增加清洗的严谨性。因此，用语“严谨条件”是指各碱基序列间“同一性”的程度，例如意味着仅在以全体的平均计具有约80％以上、优选约90％以上、更优选约95％以上、进一步优选97％以上、最优选98％以上这样高同一性的碱基序列间进行特异性杂交的条件。作为“严谨条件”，例如可列举在温度60℃～68℃下钠浓度为150～900mM、优选600～900mM、pH6～8这样的条件，作为具体例，可列举在5×SSC(750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠)、1％SDS、5×Denhardt溶液50％甲醛及42℃的条件下进行杂交，在0.1×SSC(15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠)、0.1％SDS及55℃的条件下进行清洗。
[0016] 杂交例如可按照最新分子生物学实验方法汇编(Current protocols in molecular biology(edited by Frederick M.Ausubel et al.，1987))记载的方法等本领域公知的方法或者以其为参考的方法进行。而且，使用市售的文库时可按照所附的使用说明书记载的方法进行。作为通过这样的杂交所选择的基因，可为来自天然的基因例如来自植物基因、来自除植物以外的物质的基因。而且，通过杂交所选择的基因可为cDNA，也可为基因组DNA，还可为化学合成的DNA。
[0017] 上述“1或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列”是指例如1～20个、优选1～5个、更优选1～3个的任意数量的氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列。由于作为基因工程的方法之一的部位特异性诱变法为可在特定位置导入特定突变的方法，故而有用，可按照Molecular C loning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989等记载的方法进行。
通过使用适当的表达体系使该突变DNA表达，可得到由1或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成的蛋白质。
而且，多聚核苷酸可通过本领域技术人员公知的方法得到，例如通过磷酰胺法等进行化学合成的方法、以植物的核酸试剂作为模板并使用基于目标基因的核苷酸序列设计的引物的核酸增幅法等。
通过使用适当的表达体系使该突变DNA表达，可得到由1或多个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成的蛋白质。
而且，多聚核苷酸可通过本领域技术人员公知的方法得到，例如通过磷酰胺法等进行化学合成的方法、以植物的核酸试剂作为模板并使用基于目标基因的核苷酸序列设计的引物的核酸增幅法等。
[0018] 本说明书中，用语“同一性”是指在多肽序列(或氨基酸序列)或者多聚核苷酸序列(或碱基序列)的2条链之间构成该链的各氨基酸残基彼此或各碱基彼此的相互配合关系中可确定为相同的量(个数)，意味两个多肽序列或两个多聚核苷酸序列之间的序列相关性的程度，“同一性”可容易地算出。已知有很多测定两个多聚核苷酸序列或多肽序列间的同一性的方法，用语“同一性”为本领域技术人员所周知(例如参考Lesk，A.M.(Ed.)，Computational Molec ular Biology，Oxford University Press，New York，(1988)；Smith，D.W.(Ed.)，Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Academic Press，New York，(1993)；Grifin，A.M.&Grifin，H.G.(Ed.)，Computer Analysis of Sequence Data：Part I，Human Press，New Jersey，(1994)；von Heinje，G.，Sequence Analysis in Molecular Biology，Academic Press，New York，(1987)；Gribsko v，M.&Devereux，J.(Ed.)，Sequence Analysis Primer，M-Stockton Press，New York，(1991)等)。
[0019] 而且，本说明书中记载的“同一性”的数值除特别明示的情况外，还可为本领域技术人员使用公知的同一性检索程序算出的数值，优选使用MacVector应用程序(Version 9.5 Oxford Molecular Ltd.，Oxford，England)的ClustalW程序算出的数值。在本发明中，各氨基酸序列间的“同一性”的程度例如约80％以上、优选约90％以上、更优选约95％以上、进一步优选约97％以上、最优选约98％以上。
[0020] 具有天然的碱基序列的基因例如可通过DNA测序仪进行解析来得到。而且，编码具有经修饰的氨基酸序列的酶的多聚核苷酸能够以具有天然的碱基序列的多聚核苷酸为基础使用常用的定点诱变法、PCR法来合成。例如可通过将欲修饰的多聚核苷酸片段用天然cDNA或基因组DNA的限制酶处理来得到，将其作为模板使用导入了期望突变的引物实施定点诱变法、PCR法，从而得到期望修饰的多聚核苷酸片段。其后，只要将导入了该突变的多聚核苷酸片段与编码成为目标的酶的其他部分的DNA片段连接即可。或者为了得到编码由被缩短的氨基酸序列构成的酶的多聚核苷酸，例如将比目标氨基酸序列长的氨基酸序列例如编码全长氨基酸序列的多聚核苷酸由所期望的限制酶切断，其结果所得到的多聚核苷酸片段不编码目标氨基酸序列的全体时，只要合成由不足部分的序列构成的DNA片段并连接即可。
[0021] 而且，通过用大肠杆菌及酵母的基因表达系统使所得到的多聚核苷酸表达并测定酶活性，可确认所得到的多聚核苷酸编码具有所期望活性的蛋白质。进而，通过使该多聚核苷酸表达，可得到作为多聚核苷酸产物的具有所期望活性的蛋白质。或者即使使用相对于由序列号2记载的氨基酸序列构成的多肽的抗体，也可取得具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质，还可使用相关抗体将来自其他生物的编码具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的多聚核苷酸克隆化。同样地，即使使用相对于由序列号4记载的氨基酸序列构成的多肽的抗体，也可取得具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质，可使用相关抗体将来自其他生物的编码具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的多聚核苷酸克隆化。
[0022] 本说明书中，“表达盒”是指在多聚核苷酸上启动子与终止子任意连接的多聚核苷酸片段。本发明的表达盒还可进一步包含分别与编码来自蝶豆的花色苷3′，5′-O-葡萄糖基转移酵或其类似物的第1多聚核苷酸及编码来自风铃草的类黄酮3′，5′-羟化酶或其类似物的第2多聚核苷酸运转有关的第1启动子及/或第1终止子以及与所述第2多聚核苷酸运转有关的第2启动子及/或第2终止子。
[0023] 本发明的表达盒中所使用的启动子及终止子只要能够使来自蝶豆的花色苷3′，5′-O-葡萄糖基转移酶基因(CtA3′5′GT)及来自风铃草的类黄酮3′，5′-羟化酶基因(CamF3′
5′H)在菊花花瓣中共表达，则没有特别限制，所述第1启动子优选菊花F3H启动子特别是菊花F3H1k及菊花F3H500，所述第1终止子优选拟南芥HSP终止子或农杆菌nos终止子，所述第2启动子优选菊花F3H启动子，而且所述第2终止子优选拟南芥HSP终止子或农杆菌nos终止子。
5′H)在菊花花瓣中共表达，则没有特别限制，所述第1启动子优选菊花F3H启动子特别是菊花F3H1k及菊花F3H500，所述第1终止子优选拟南芥HSP终止子或农杆菌nos终止子，所述第2启动子优选菊花F3H启动子，而且所述第2终止子优选拟南芥HSP终止子或农杆菌nos终止子。
[0024] 本发明还涉及包含所述表达盒的(重组)载体尤其是表达载体、进一步由该载体转化的菊花植物。
[0025] 进而，本发明涉及通过将编码具有将糖转移到花色苷的3′位及5′位羟基的活性的蛋白质的所述第1多聚核苷酸及/或编码具有将类黄酮的3′位及5′位羟化的活性的蛋白质的所述第2多聚核苷酸作为外源性多聚核苷酸导入宿主所得到的转化菊花植物或其自交或者异交后代或者它们的营养繁殖体、植物体的一部分、组织或细胞。多聚核苷酸的导入可通过将宿主用本发明的表达盒或载体转化来实现。或者在宿主中使来自蝶豆的花色苷3′，5′-O-葡萄糖基转移酶基因(CtA3′5′GT)或来自风铃草的类黄酮3′，5′-羟化酶基因(CamF3′5′H)表达时，仅将所述第1多聚核苷酸或第2多聚核苷酸中的一个导入宿主即可。
[0026] 在目前的技术水平下，为了将多聚核苷酸导入植物并使该多聚核苷酸构成性或组织特异性表达，可通过本领域技术人员公知的方法例如农杆菌法、双元载体法、电穿孔法、PEG法、粒子枪法等来进行。
[0027] 在本说明书中，用语“菊花植物(也仅称为“菊花”)”是指菊花科(Asteraceae)菊花属(Chrysanthemum)的植物。在菊花属(Chrysanthemum)中有通常被称为野菊的野路菊(C.japonense)、C.zawadskii var.latilobum、C.indicum var.procumbens、紫花野菊(C.zawadskii)、矶菊(C.pacificum)等。而且存在通常也被称作家养菊花、栽培菊花的通过野生种间的杂交等进行多种品种改良的多头菊(Spray chrysanthemum)、大菊、小菊等菊花(Chrysanthemummorifolium；原物种名：Dendranthema grandiflora、Chrysanthemum grandiflorum))。在本发明中，关于宿主中所使用的菊花植物的种类没有特别限制，可使用多头菊、独轮菊、盆菊等根据制造用途的不同而挑选·育种的各种各样的菊花的品种·系统，银莲花(anemone)花型、马先蒿(decora)花型、绒球状花型、雏菊花型(单层花型)等具有不同花形的多种菊花的品种·系统。在以下的实施例中，作为宿主在SEI SHAWL(S39)、大平，T27、SEI ARABELLA(T34)、T37、CANDELA TIERRA、T10、T24、T44、T57等多种品种·系统(色相角的平均值：55°左右～0°(360°)～337°左右；RHS标准比色卡：49C-D的红色组～红色-紫色组～75B-C的紫色组)中，也证实显示RHS标准比色卡第5版(英国皇家园艺协会)中的蓝色组或者紫罗兰色-蓝色组或用色彩色差计或色彩分光计等测定所得到的CIEL*a*b*表色系的色相角为230°～290°的蓝色系花色。
[0028] 宿主中使用的显示红色组、红色-紫色组及紫色组花色的菊花植物的主要花色苷为矢车菊素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷及矢车菊素3-(3″，6″-二丙二酰)葡萄糖苷。通过导入风铃草等的F3′5′H基因并使其发挥功能所得到的转化菊花的主要花色苷为花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷，还包含微量的花翠素3-(3″，6″-二丙二酰)葡萄糖苷。矢车菊素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷及矢车菊素3-(3″，6″-二丙二酰)葡萄糖苷的可见最大吸收波长为518nm，相对于此，花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷为527nm。由于该向长波长侧的位移，主要包含花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷的转化菊花显示紫色、蓝紫色。另一方面，判明了通过使风铃草F3′5′H基因与蝶豆A3′5′GT基因同时在菊花花瓣中表达所制作的蓝色菊花作为主要色素包含花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′，5′-二葡萄糖苷(ternatin C5)，作为微量色素包含作为ternatin C5的脱丙二酰体的花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatin C5)、花翠素3-(3″，6″-二丙二酰)葡萄糖苷-3′5′-二葡萄糖苷、花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷以及矢车菊素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷。作为蓝色菊花的主要花色苷的花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′，5′-二葡萄糖苷(ternatin C5)的可见最大吸收波长为512nm，比作为原本的红色、粉色的主要花色苷的矢车菊素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷进一步向短波长侧移动。这意味着尽管花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′，5′-二葡萄糖苷(ternatin C5)比原本的色素红，但可使菊花的花瓣成为蓝色。因此，认为通过使花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′，5′-二葡萄糖苷(ternatin C5)与菊花的内源性辅色素物质等相互作用等，可使花瓣进行蓝色表达，但目前并没有报道使花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-
3′，5′-二葡萄糖苷(ternatin C5)这样的花色苷B环的3′位及5′位羟基均被糖基化的红色花色苷进行蓝色表达的例子，本发明基于不需要对于蓝色表达所必须的芳香族酰基进行的聚酰化的与以往的理论、技术完全不同的蓝色表达控制技术。
3′，5′-二葡萄糖苷(ternatin C5)这样的花色苷B环的3′位及5′位羟基均被糖基化的红色花色苷进行蓝色表达的例子，本发明基于不需要对于蓝色表达所必须的芳香族酰基进行的聚酰化的与以往的理论、技术完全不同的蓝色表达控制技术。
[0029] 进而，本发明还涉及上述所得到的转化菊花植物或其自交或者异交后代的切花或者由该切花制成的加工品(尤其是切花加工品)。在此作为切花加工品，包括使用该切花的压花、保鲜花、干花、树脂密封品等，但并不限定于此。
[0030] 以下，通过实施例具体地说明本发明。只要没有特别声明，分子生物学的方法按照Molecular Cloning(Sambrook and Russell，2001)进行。增幅的PCR产物、通过克隆所得到的质粒可通过确认碱基序列来确定DNA序列没有错误。
实施例
实施例
[0031] [实施例1：pB423向菊花品种“大平”的导入(使在菊花F3H启动子1k与农杆菌nos终止子控制下的蝶豆A3′5′GT基因及在菊花F3H启动子1k及在拟南芥HSP终止子控制下的风铃草F3′5′H基因共表达)][1]载体的构建
通过模板使用pBluescript SK-gF3H9(菅野等(2001)园学杂70(别2)193)，将HANS-F3Hpro1k-Fd(5′-CCAAGCTTGGCGCGCCGCGGCCGCATTTAAATTTACAAAACCATGTGCAAGAATG-3′；下划线部分为包含F3H启动子区域的退火成DNA的序列；序列号5)与SNM-F3Hpro-Rv(5′-ACTAGTGCTAGCACGCGTTTTTTATTTTTTCTTCACACACTTG-3′；下划线部分为包含F3H启动子区域的退火成DNA的序列；序列号6)作为引物使用的PCR，在5′侧增幅包含附加了HindIII、AscI、NotI、SwaI限制酶位点的CmF3H启动子1k的DNA片段，在3′侧增幅包含附加了SpeI、NheI限制酶位点的CmF3H启动子1k的DNA片段，TA克隆为pGEM-T easy(Progemga)后用HindIII与SpeI消化从而得到DNA片段。
通 过 以 p B I 2 2 1 为 模 板 将 S S S - N O S t e r - F d ( 5 ′-
GAGCTCACTAGTGTCGACGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAG-3′；下划线部分为包含NOS终止子区域的 退 火 成 D N A 的 序 列 ；序 列 号 7 ) 与 E S P - N O S t e r - R v ( 5 ′-CGAATTCAGGCCTGTTTAAACGATCTAGTAACATAGATGACAC-3′；下划线部分为包含NOS终止子区域的退火成DNA的序列；序列号8)作为引物使用的PCR，在5′侧增幅包含附加了SacI、EcoICRI(Ecl136II)、SpeI、SalI限制酶位点的农杆菌nos终止子的DNA片段，在3′侧增幅包含附加了PmeI、SrfI、EcoRI限制酶位点的农杆菌nos终止子的DNA片段，TA克隆成pCR2.1(Invitrogen)后用SacI与EcoRI进行消化，从而得到包含农杆菌nos终止子的DNA片段。
分别将附加了限制酶位点的CmF3H启动子1k的DNA片段及NOS终止子的DNA片段替换到pBI221的包含CaMV 35S启动子的HindIII-XbaI区域、包含NOS终止子的SacI-EcoRI区域后，连接用HindIII与EcoRI消化所得到的HANS-CmF3Hp1k：GUS：NOSt-PSE盒与将pSPORT2(Invitrogen)用HindIII与EcoRI消化所得到的质粒片段，可得到用于使基因表达盒持续结合于双元载体的作为入门-载体的pMCE5。
通过模板使用pBluescript SK-gF3H9(菅野等(2001)园学杂70(别2)193)，将HANS-F3Hpro1k-Fd(5′-CCAAGCTTGGCGCGCCGCGGCCGCATTTAAATTTACAAAACCATGTGCAAGAATG-3′；下划线部分为包含F3H启动子区域的退火成DNA的序列；序列号5)与SNM-F3Hpro-Rv(5′-ACTAGTGCTAGCACGCGTTTTTTATTTTTTCTTCACACACTTG-3′；下划线部分为包含F3H启动子区域的退火成DNA的序列；序列号6)作为引物使用的PCR，在5′侧增幅包含附加了HindIII、AscI、NotI、SwaI限制酶位点的CmF3H启动子1k的DNA片段，在3′侧增幅包含附加了SpeI、NheI限制酶位点的CmF3H启动子1k的DNA片段，TA克隆为pGEM-T easy(Progemga)后用HindIII与SpeI消化从而得到DNA片段。
通 过 以 p B I 2 2 1 为 模 板 将 S S S - N O S t e r - F d ( 5 ′-
GAGCTCACTAGTGTCGACGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAG-3′；下划线部分为包含NOS终止子区域的 退 火 成 D N A 的 序 列 ；序 列 号 7 ) 与 E S P - N O S t e r - R v ( 5 ′-CGAATTCAGGCCTGTTTAAACGATCTAGTAACATAGATGACAC-3′；下划线部分为包含NOS终止子区域的退火成DNA的序列；序列号8)作为引物使用的PCR，在5′侧增幅包含附加了SacI、EcoICRI(Ecl136II)、SpeI、SalI限制酶位点的农杆菌nos终止子的DNA片段，在3′侧增幅包含附加了PmeI、SrfI、EcoRI限制酶位点的农杆菌nos终止子的DNA片段，TA克隆成pCR2.1(Invitrogen)后用SacI与EcoRI进行消化，从而得到包含农杆菌nos终止子的DNA片段。
分别将附加了限制酶位点的CmF3H启动子1k的DNA片段及NOS终止子的DNA片段替换到pBI221的包含CaMV 35S启动子的HindIII-XbaI区域、包含NOS终止子的SacI-EcoRI区域后，连接用HindIII与EcoRI消化所得到的HANS-CmF3Hp1k：GUS：NOSt-PSE盒与将pSPORT2(Invitrogen)用HindIII与EcoRI消化所得到的质粒片段，可得到用于使基因表达盒持续结合于双元载体的作为入门-载体的pMCE5。
[0032] 将用于使基因表达盒持续结合于双元载体的入门-载体pMCE5启动子5′侧的限制酶位点改变成HindIII、FseI、AscI、StuI、SwaI，同时制作将终止子从农杆菌nos终止子替换成拟南芥heat shock proteins(HSP)18.2终止子(AtHSPter，Plant Cell Physiol.51(2)：328-332(2010)；序列号37)的pMCE5-2。在AtHSPter的5′侧赋予EcoICRI、SacI、SpeI、SalI限制酶位点，在3′侧赋予SrfI、SmaI、PmeI、EcoRI、KpnI限制酶位点。
将通过以pBluescript SK-gF3H9为模板将hFAStSw-proCmF3H-Fd(5′-
AAGCTTGGCCGGCCTAGGCGCGCCAGGCCTATTTAAATTTACAAAACCATGTGCAAGAATG-3′；下划线部分为F3H启动子区域的退火成DNA的序列；序列号9)与SNM-F3Hpro-Rv(5′-
ACTAGTGCTAGCACGCGTTTTTTATTTTTTCTTCACACACTTG-3′；下划线部分为F3H启动子区域的退火成DNA的序列；序列号6)作为引物使用的PCR进行增幅的DNA片段克隆成pCR-BluntII-TOPO(Life Technologies)，从而得到pCR-FASS-CmF3Hpro1k。连接将该质粒用HindIII与NheI消化所得到的FASS-CmF3Hpro1k的DNA片段与将pMCE5用HindIII与SpeI消化所得到的质粒的DNA片段，从而得到pMCE5-FASS。
将 通 过 以 p C R - H S P 为 模 板 将 S S S - t e r H S P - F d ( 5 ′-GAGCTCACTAGTGTCGACATATGAAGATGAAGATGAAAT-3′；下划线部分为退火成AtHSPter的DNA序列 ；序 列 号 1 0 ) 与 K E S P - t e r H S P - R v ( 5 ′-
GGTACCGGTCCGGAATTCGTTTAAACGCCCGGGCCTTATCTTTAATCATATTCCATAGTCC-3′；下划线部分为退火成AtHSPter的DNA序列；序列号11)作为引物使用的PCR进行增幅的DNA片段克隆成pCR-BluntII-TOPO(Life Technologies)，从而得到pCR-SSS-AtHSPter-PSEK。连接将该质粒用KpnI与SacI消化所得到的AtHSPter的DNA片段与将pMCE5-FASS用SacI与KpnI消化的载体DNA片段，从而得到pMCE5-2。
将通过以pBluescript SK-gF3H9为模板将hFAStSw-proCmF3H-Fd(5′-
AAGCTTGGCCGGCCTAGGCGCGCCAGGCCTATTTAAATTTACAAAACCATGTGCAAGAATG-3′；下划线部分为F3H启动子区域的退火成DNA的序列；序列号9)与SNM-F3Hpro-Rv(5′-
ACTAGTGCTAGCACGCGTTTTTTATTTTTTCTTCACACACTTG-3′；下划线部分为F3H启动子区域的退火成DNA的序列；序列号6)作为引物使用的PCR进行增幅的DNA片段克隆成pCR-BluntII-TOPO(Life Technologies)，从而得到pCR-FASS-CmF3Hpro1k。连接将该质粒用HindIII与NheI消化所得到的FASS-CmF3Hpro1k的DNA片段与将pMCE5用HindIII与SpeI消化所得到的质粒的DNA片段，从而得到pMCE5-FASS。
将 通 过 以 p C R - H S P 为 模 板 将 S S S - t e r H S P - F d ( 5 ′-GAGCTCACTAGTGTCGACATATGAAGATGAAGATGAAAT-3′；下划线部分为退火成AtHSPter的DNA序列 ；序 列 号 1 0 ) 与 K E S P - t e r H S P - R v ( 5 ′-
GGTACCGGTCCGGAATTCGTTTAAACGCCCGGGCCTTATCTTTAATCATATTCCATAGTCC-3′；下划线部分为退火成AtHSPter的DNA序列；序列号11)作为引物使用的PCR进行增幅的DNA片段克隆成pCR-BluntII-TOPO(Life Technologies)，从而得到pCR-SSS-AtHSPter-PSEK。连接将该质粒用KpnI与SacI消化所得到的AtHSPter的DNA片段与将pMCE5-FASS用SacI与KpnI消化的载体DNA片段，从而得到pMCE5-2。
[0033] 连接将pMCE5-2用NheI与EcoICRI消化所得到的质粒的DNA片段与将pCR ADHNF-Campanula F3′5′H(日本专利5697040号公报)的KpnI消化产物进行平滑末端化后用XbaI消化所得到的约1.7kb的DNA片段，从而得到pMCE5-2 ADHNF-CamF3′5′H。连接将该质粒用AscI与PmeI消化所得到的表达盒的DNA片段与将在参考例2中得到的pB249用AscI与SwaI消化所得到的双元载体的DNA片段，从而得到pB423(pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H)。
[0034] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB423的农杆菌EHA105(Hood，E.E.et al.(1993)New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants.Transgenic Res.2，208-218，由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将粉色系中的中轮菊的菊花品种“大平”(在花卉研究所中通过无菌培养测试维持的遗传资源)转化，从而得到46个系统的转化体。用色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果发现26个系统(57％)的花色向蓝色方向变化。通过色彩分光计的测定为最低测定3个花瓣并算出其平均值。色相角(Hue°)用arctan(b*/a*)算出，彩度(C*值)用(a2+b2)1/2算出。其中的22个系统(全体的48％)显示色相角290°以下的蓝色，而且22个系统(全体的48％)显示RHS标准比色卡的紫罗兰色-蓝色组的花色。在使该CamF3′5′H用菊花F3H启动子与拟南芥HSP终止子表达的同时使蝶豆A3′5′GT用菊花F3H启动子表达的pB423为最单纯的基因导入构建物，能够以48％这样的高比例得到蓝色菊花。而且，通过使来自风铃草F3′5′H基因的终止子成为拟南芥HSP，与使用农杆菌nos终止子的情况(实施例4、12-18)相比，能够以高比例来制作蓝色菊花。
[0035] 将赋予了蓝色特征的菊花品种“大平”中所包含的花色苷通过液质联用仪(ACQUITY UPLC·串联四极杆MS ACQUITY TQD，日本Waters)分析。溶剂A使用含有1％甲酸的蒸馏水，溶剂B使用含有1％甲酸的乙腈。溶剂的流速为0.1ml/分钟并进行如下梯度洗脱：在0-5分钟使溶剂B从0成为5％，在5-20分钟从5％成为35％，其后维持20-25分钟的35％。色谱柱使用连接了Guard色谱柱VanGuard(日本Waters)的ACQUITY UPLC BEH C18 1.7μm(2.1i.d.×100mm；日本Waters)，以柱温35℃进行分析。将通过光电二极管阵列分析所得到的光谱数据在530nm下进行解析，结果在保留时间约9分钟(峰1)、10.5分钟(峰2)、12.7分钟(峰3)发现花色苷的峰(图3)。各个质量([M+H]+)的最主要的峰2为m/z 875、峰1为m/z 789、峰3为m/z 697。而且，由各峰的吸收光谱的测定、与由蝶豆调整的标准品的对比、LC-MS/MS分析(图4)等结果可知，峰1为花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatin C5)，峰2为花翠素
3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′，5′-二葡萄糖苷(ternatin C5)，峰3为矢车菊素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷，通过导入的风铃草F3′5′H与蝶豆A3′5′GT的表达从而成为改变成作为目标的花色苷的结构。而且，通过作为主要色素的花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-
3′，5′-二葡萄糖苷(ternatin C5)与花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatin C5)的累积，菊花可表达蓝色。
花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′，5′-二葡萄糖苷(ternatinC5)、花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatinC5)、矢车菊素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷等新合成的花色苷的累积还可通过薄层色谱(TLC)检测。在距离TLC Cellulose Glass Plate(10×20cm，Millipore)的下侧1.5cm的位置滴加10％乙酸花瓣提取液并风干后，在加入了展开剂BAW(丁醇：乙酸：水＝4：1：2(v/v/v))的展开槽中从原点展开至7cm的位置。展开后使板干燥并在荧光灯下及UV光(CSN-15AC，Cosmo Bio，254/360nm)下检测。各花色苷的Rf值如下所示。
花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′，5′-二葡萄糖苷(ternatin C5)：0.15，花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatin C5)：0.11，矢车菊素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷：
0.30。
将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表1。
表1
[表1]
NA：无法分析·测定
*平均值(n＝23)
3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′，5′-二葡萄糖苷(ternatin C5)，峰3为矢车菊素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷，通过导入的风铃草F3′5′H与蝶豆A3′5′GT的表达从而成为改变成作为目标的花色苷的结构。而且，通过作为主要色素的花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-
3′，5′-二葡萄糖苷(ternatin C5)与花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatin C5)的累积，菊花可表达蓝色。
花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′，5′-二葡萄糖苷(ternatinC5)、花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatinC5)、矢车菊素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷等新合成的花色苷的累积还可通过薄层色谱(TLC)检测。在距离TLC Cellulose Glass Plate(10×20cm，Millipore)的下侧1.5cm的位置滴加10％乙酸花瓣提取液并风干后，在加入了展开剂BAW(丁醇：乙酸：水＝4：1：2(v/v/v))的展开槽中从原点展开至7cm的位置。展开后使板干燥并在荧光灯下及UV光(CSN-15AC，Cosmo Bio，254/360nm)下检测。各花色苷的Rf值如下所示。
花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′，5′-二葡萄糖苷(ternatin C5)：0.15，花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatin C5)：0.11，矢车菊素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷：
0.30。
将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表1。
表1
[表1]
NA：无法分析·测定
*平均值(n＝23)
[0036] [实施例2：pB423向菊花品种“SEI ARABELLA”(系统编号T34)的导入(使在菊花F3H启动子1k与农杆菌nos终止子控制下的蝶豆A3′5′GT基因及在菊花F3H启动子1k与在拟南芥HSP终止子控制下的风铃草F3′5′H基因共表达)][1]载体的构建
按照实施例1制作pB423(pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H)。
按照实施例1制作pB423(pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H)。
[0037] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB423的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将三文鱼粉色系中的中轮马先蒿花型的菊花品种“SEI ARABELLA”(Inochio精兴园有限公司；系统编号T34)转化，从而得到47个系统的转化体。用色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果可确认34个系统(72％)的花色向蓝色方向变化。在其中的27个系统中可确认作为主要花色苷的花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′，5′-二葡萄糖苷(ternatin C5)及花翠素
3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatin C5)的累积。在这些系统中花色向RHS标准比色卡的蓝色组或紫罗兰色-蓝色组的颜色改变。与“大平”同样，在“SEI ARABELLA”中也能够以72％这样的高比例得到蓝色菊花。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表2。
表2
[表2]
NA：无法分析·测定
3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatin C5)的累积。在这些系统中花色向RHS标准比色卡的蓝色组或紫罗兰色-蓝色组的颜色改变。与“大平”同样，在“SEI ARABELLA”中也能够以72％这样的高比例得到蓝色菊花。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表2。
表2
[表2]
NA：无法分析·测定
[0038] [实施例3：pB423向菊花系统“T37”的导入(使在菊花F3H启动子1k与农杆菌nos终止子控制下的蝶豆A3′5′GT基因及在菊花F3H启动子1k与拟南芥HSP终止子控制下的风铃草F3′5′H基因共表达)][1]载体的构建
根据实施例1制作pB423(pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H)。
根据实施例1制作pB423(pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H)。
[0039] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB423的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将粉色系中的小轮绒球状花型的菊花系统“T37”(测试由日本精兴园有限公司提供的繁育品系)转化，从而得到97个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果可确认58个系统(60％)的花色向蓝色方向改变。使用其中的9个系统可确认作为主要花色苷的花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′，5′-二葡萄糖苷(ternatin C5)及花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatin C5)的累积。它们的花色向紫罗兰色-蓝色组改变。与“大平”、“SEI ARABELLA”同样，在“T37”中也能够以60％这样的高比例得到蓝色菊花。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表3。
表3
[表3]
NA：无法分析·测定
表3
[表3]
NA：无法分析·测定
[0040] [实施例4：pB425向菊花品种“大平”的导入(使在菊花F3H启动子1k及拟南芥HSP终止子控制下的蝶豆A3′5′GT基因及在菊花F3H启动子1k及在农杆菌nos终止子控制下的风铃草F3′5′H基因共表达][1]载体的构建
制作用于连接菊花F3′H抑制盒、CtAGS、CtA3′5′GT、DFR表达盒等多个基因抑制/表达盒的风铃草F3′5′H表达双元载体pB315(pBCam2)。连接将pBI121-FASS-CmF3H1k用SpeI与EcoICRI消化所得到的双元载体的DNA片段与将pCR ADHNF-Campanula F3′5′H(日本专利
5697040号公报)的KpnI消化产物进行平滑末端化后用XbaI消化所得到的约1.7kb的DNA片段，从而得到pB315(pBI121-FASS-CmF3Hpro1k：NtADH-5′UTR-风铃草F3′5′H：NOSter；
pBCam2)。
制作用于连接菊花F3′H抑制盒、CtAGS、CtA3′5′GT、DFR表达盒等多个基因抑制/表达盒的风铃草F3′5′H表达双元载体pB315(pBCam2)。连接将pBI121-FASS-CmF3H1k用SpeI与EcoICRI消化所得到的双元载体的DNA片段与将pCR ADHNF-Campanula F3′5′H(日本专利
5697040号公报)的KpnI消化产物进行平滑末端化后用XbaI消化所得到的约1.7kb的DNA片段，从而得到pB315(pBI121-FASS-CmF3Hpro1k：NtADH-5′UTR-风铃草F3′5′H：NOSter；
pBCam2)。
[0041] 将在参考例1中得到的pBSII-ADH-CtA3′5′GT用NheI与EcoICRI消化所得到的DNA片段与将pMCE5-2(FASS-CmF3Hp-AtHSPt)用NheI与EcoICRI消化所得到的载体的片段连接，从而得到pMCE5-2 ADHNF-CtA3′5′GT。通过连接将pMCE5-2 ADHNF-CtA3′5′GT用FseI与PmeI消化所得到的CmF3Hp1k：ADHNF-CtA3′5′GT：AtHSPt盒与将pB315用FseI与SwaI消化所得到的双元载体的DNA片段，从而得到pB425(pBCam2+CtA3′5′GT)。
[0042] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB425的农杆菌(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将粉色系中的中轮菊的菊花品种“大平”(通过花卉研究所测试通过无菌培养的遗传资源)转化，从而得到42个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果发现23个系统(55％)的花色向蓝色方向变化。其中的11个系统(全体的26％)显示色相角290°以下的蓝色。而且12个系统(全体的29％)显示RHS标准比色卡的紫罗兰色-蓝色组的花色。在具有这些蓝色花特征的系统中，确认了作为主要花色苷的花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′，5′-二葡萄糖苷(ternatinC5)及花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatinC5)的累积。这样通过使来自蝶豆的A3′5′GT基因与来自风铃草的F3′5′H基因的2个基因表达，可制作蓝色菊花。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表4。
表4
[表4]
*平均值(n＝23)
NA：无法分析·测定
表4
[表4]
*平均值(n＝23)
NA：无法分析·测定
[0043] [实施例5：pB433向菊花品种“大平”的导入(使在菊花F3H启动子1k与农杆菌nos终止子控制下的蝶豆A3′5′GT基因、在菊花F3H启动子1k与拟南芥HSP终止子控制下的风铃草F3′5′H基因及荷兰鸢尾DFR基因共表达][1]载体的构建
通过将以下两种DNA片段混合而用作模板，即通过以包含来自荷兰鸢尾(Iris
hollandica)花被片的DFR基因(Plant Cell Physiol 48(2007)1589，AB332098)的质粒pSPB909为模板，将IrisDFR_ADH_ORF_Fd(5′-CAAGAAAAATAAATGATGAGCCCCGTTGTC-3′，下划线部分为退火成IhDFR的序列；序列号12)与IrisDFR_NdeI Rv(5 ′-
CATATGTACCTCCCGTTCGCTTC-3′；序列号13)作为引物使用的PCR进行增幅的DNA片段以及通过以pBI221 ADH-221为模板，将XbaI-ADH-Fd(5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-
3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；序列号14)与IrisDFR_ORF_ADH_Rv(5′-GGGGCTCATCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；序列号15)作为引物使用的PCR进行增幅的DNA片段，并将XbaI-ADH-Fd(5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；
序列号14)与IrisDFR_NdeI Rv(5′-CATATGTACCTCCCGTTCGCTTC-3′；序列号13)用作引物的PCR，使烟草ADH-5′UTR 94bp直接连接于荷兰鸢尾DFR基因的起始密码子的DNA片段增幅，并克隆成pCR-bluntII-TOPO从而得到pCR-ADHNF-IhDFR-5′。通过连接将该质粒用SalI与EcoRV消化所得到的DNA片段与将pSPB 909用SalI与EcoRV消化所得到的质粒的DNA片段，从而得到pUC El2-35Sp：ADHNF-IrisDFR：D8t。连接将该质粒的XhoI消化产物进行平滑末端化后用NheI消化的DNA片段与将pMCE5-2用NheI与EcoICRI消化所得到的质粒的DNA片段，从而得到pMCE5-2 ADHNF-IhDFR。连接将pMCE5-2-ADHNF-IhDFR用AscI与PmeI消化所得到的表达盒与用AscI与SwaI消化所得到的pB423双元载体的DNA片段，从而得到pB433(pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H+IhDFR)。
通过将以下两种DNA片段混合而用作模板，即通过以包含来自荷兰鸢尾(Iris
hollandica)花被片的DFR基因(Plant Cell Physiol 48(2007)1589，AB332098)的质粒pSPB909为模板，将IrisDFR_ADH_ORF_Fd(5′-CAAGAAAAATAAATGATGAGCCCCGTTGTC-3′，下划线部分为退火成IhDFR的序列；序列号12)与IrisDFR_NdeI Rv(5 ′-
CATATGTACCTCCCGTTCGCTTC-3′；序列号13)作为引物使用的PCR进行增幅的DNA片段以及通过以pBI221 ADH-221为模板，将XbaI-ADH-Fd(5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-
3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；序列号14)与IrisDFR_ORF_ADH_Rv(5′-GGGGCTCATCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；序列号15)作为引物使用的PCR进行增幅的DNA片段，并将XbaI-ADH-Fd(5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；
序列号14)与IrisDFR_NdeI Rv(5′-CATATGTACCTCCCGTTCGCTTC-3′；序列号13)用作引物的PCR，使烟草ADH-5′UTR 94bp直接连接于荷兰鸢尾DFR基因的起始密码子的DNA片段增幅，并克隆成pCR-bluntII-TOPO从而得到pCR-ADHNF-IhDFR-5′。通过连接将该质粒用SalI与EcoRV消化所得到的DNA片段与将pSPB 909用SalI与EcoRV消化所得到的质粒的DNA片段，从而得到pUC El2-35Sp：ADHNF-IrisDFR：D8t。连接将该质粒的XhoI消化产物进行平滑末端化后用NheI消化的DNA片段与将pMCE5-2用NheI与EcoICRI消化所得到的质粒的DNA片段，从而得到pMCE5-2 ADHNF-IhDFR。连接将pMCE5-2-ADHNF-IhDFR用AscI与PmeI消化所得到的表达盒与用AscI与SwaI消化所得到的pB423双元载体的DNA片段，从而得到pB433(pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H+IhDFR)。
[0044] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB433的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将粉色系中的中轮菊的菊花品种“大平”(通过花卉研究所测试通过无菌培养的遗传资源)转化，从而得到55个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果发现花色向蓝色方向变化的39个系统(71％)中的31个系统(全体的56％)显示色相角290°以下的蓝色。而且，33个系统(全体的60％)显示RHS标准比色卡的紫罗兰色-蓝色组的花色。在具有这些蓝色花特征的系统中确认了作为主要花色苷的花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′，
5′-二葡萄糖苷(ternatin C5)及花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatin C5)的累积。通过使来自风铃草F3′5′H基因的终止子成为拟南芥HSP，与使用农杆菌nos终止子的情况(实施例4、12-18)相比，能够以高比例来制作蓝色菊花。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表5。
表5
[表5]
*平均值(n＝23)
NA：无法分析·测定
5′-二葡萄糖苷(ternatin C5)及花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatin C5)的累积。通过使来自风铃草F3′5′H基因的终止子成为拟南芥HSP，与使用农杆菌nos终止子的情况(实施例4、12-18)相比，能够以高比例来制作蓝色菊花。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表5。
表5
[表5]
*平均值(n＝23)
NA：无法分析·测定
[0045] [实施例6：pB434向菊花品种“大平”的导入(使在菊花F3H启动子1k与农杆菌nos终止子控制下的蝶豆A3′5′GT基因、在菊花F3H启动子1k与拟南芥HSP终止子控制下的风铃草F3′5′H基因及飞燕草DFR基因共表达][1]载体的构建
通过将以下两种DNA片段混合而用作模板，即通过以包含来自飞燕草(Delphinium×belladonna“Volkerfrieden”)萼片的DFR基因的质粒pDbDFR4-8(GenBank accession no.AB221083)为模板，将DbDFR_ADH_ORF_Fd(5′-CAAGAAAAATAAATGACTGTAGAAACTGTTTGTG-
3′；下划线部分为退火成DbDFR的序列；序列号16)与DbDFR_NcoI_Rv(5′-
CCATGGTGTACTTATAGTTGAATCC-3′；序列号17)作为引物使用的PCR进行增幅的DNA片段以及通过以pBI221 ADH-221为模板将XbaI-ADH-Fd(5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-
3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；序列号14)与DbDFR_ORF_ADH_Rv(5′-TTCTACAGTCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；序列号18)作为引物使用的PCR进行增幅的DNA片段，并以XbaI-ADH-Fd(5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；
序列号14)与DbDFR_NcoI_Rv(5′-CCATGGTGTACTTATAGTTGAATCC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；序列号17)为引物，使用PrimeStar(Takara Bio)作为DNA聚合酶的PCR，从而得到烟草ADH-5′UTR 94bp直接连接于飞燕草DFR基因的起始密码子的DNA片段。
进行了在该平滑末端的增幅产物中附加dA的反应后，TA克隆成pCR2.1(Invitrogen)从而得到pCR-ADHNF-DbDFR-5′。连接将该质粒用SmaI与NcoI消化所得到的片段与将pDbDFR4-8用SmaI与NcoI消化所得到的质粒的DNA片段，从而得到pBS-ADHNF-DbDFR。连接将该质粒的XhoI消化产物进行平滑末端化后用SpeI消化的DNA片段与将pMCE5-2用NheI与EcoICRI消化所得到的质粒的DNA片段，从而得到pMCE5-2 ADHNF-DbDFR。连接将pMCE5-2 ADHNF-DbDFR用AscI与PmeI消化所得到的表达盒与用AscI与SwaI消化所得到的pB423双元载体的DNA片段，从而得到pB434(pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H+DbDFR)。
通过将以下两种DNA片段混合而用作模板，即通过以包含来自飞燕草(Delphinium×belladonna“Volkerfrieden”)萼片的DFR基因的质粒pDbDFR4-8(GenBank accession no.AB221083)为模板，将DbDFR_ADH_ORF_Fd(5′-CAAGAAAAATAAATGACTGTAGAAACTGTTTGTG-
3′；下划线部分为退火成DbDFR的序列；序列号16)与DbDFR_NcoI_Rv(5′-
CCATGGTGTACTTATAGTTGAATCC-3′；序列号17)作为引物使用的PCR进行增幅的DNA片段以及通过以pBI221 ADH-221为模板将XbaI-ADH-Fd(5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-
3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；序列号14)与DbDFR_ORF_ADH_Rv(5′-TTCTACAGTCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；序列号18)作为引物使用的PCR进行增幅的DNA片段，并以XbaI-ADH-Fd(5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；
序列号14)与DbDFR_NcoI_Rv(5′-CCATGGTGTACTTATAGTTGAATCC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；序列号17)为引物，使用PrimeStar(Takara Bio)作为DNA聚合酶的PCR，从而得到烟草ADH-5′UTR 94bp直接连接于飞燕草DFR基因的起始密码子的DNA片段。
进行了在该平滑末端的增幅产物中附加dA的反应后，TA克隆成pCR2.1(Invitrogen)从而得到pCR-ADHNF-DbDFR-5′。连接将该质粒用SmaI与NcoI消化所得到的片段与将pDbDFR4-8用SmaI与NcoI消化所得到的质粒的DNA片段，从而得到pBS-ADHNF-DbDFR。连接将该质粒的XhoI消化产物进行平滑末端化后用SpeI消化的DNA片段与将pMCE5-2用NheI与EcoICRI消化所得到的质粒的DNA片段，从而得到pMCE5-2 ADHNF-DbDFR。连接将pMCE5-2 ADHNF-DbDFR用AscI与PmeI消化所得到的表达盒与用AscI与SwaI消化所得到的pB423双元载体的DNA片段，从而得到pB434(pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H+DbDFR)。
[0046] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB434的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将粉色系中的中轮菊的菊花品种“大平”(通过花卉研究所测试通过无菌培养的遗传资源)转化从而得到12个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果发现8个系统(67％)的花色向蓝色方向变化，8个系统(全体的67％)显示出色相角290°以下的蓝色。而且7个系统(全体的58％)显示RHS标准比色卡的紫罗兰色-蓝色组的花色。在具有这些蓝色花特征的系统中，确认了作为主要花色苷的花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′，5′-二葡萄糖苷(ternatinC5)及花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatinC5)的累积。通过使来自风铃草F3′5′H基因的终止子成为拟南芥HSP，与使用农杆菌nos终止子的情况(实施例4、
12-18)相比，能够以高比例制作蓝色菊花。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表6。
表6
[表6]
*平均值(n＝23)
NA：无法分析·测定
12-18)相比，能够以高比例制作蓝色菊花。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表6。
表6
[表6]
*平均值(n＝23)
NA：无法分析·测定
[0047] [实施例7：pB435向菊花品种“大平”的导入(使在菊花F3H启动子1k与农杆菌nos终止子控制下的蝶豆A3′5′GT基因、在菊花F3H启动子1k与阿拉伯芥HSP终止子控制下的风铃草F3′5′H基因及蝶豆DFR基因共表达][1]载体的构建
通过将以下两种DNA片段混合而用作模板，即通过以包含来自蝶豆(Clitoria
ternatea“Double Blue”)花瓣的DFR基因的质粒pBSCtDFR20(GenBank accession no.AB185901)为模板将CtDFR_ADH_ORF_Fd(5′-CAAGAAAAATAAATGGATTCAGCAGCTGAAGTG-3′；
下划线部分为退火成CtDFR的序列；序列号19)与CtDFR_SphI_Rv(5′-
GCATGCTCTCATTATGTCAAG-3′；序列号20)作为引物使用的PCR进行增幅的DNA片段与通过以pBI221 ADH-221为模板将XbaI-ADH-Fd(5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；序列号14)与CtDFR_ORF_ADH_Rv(5′-TGCTGAATCCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；序列号21)作为引物使用的PCR进行增幅的DNA片段，并以XbaI-ADH-Fd(5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；
序列号14)与CtDFR_SphI_Rv(5′-GCATGCTCTCATTATGTCAAG-3′；序列号20)为引物，使用PrimeStar(Takara Bio)作为DNA聚合酶的PCR，得到烟草ADH-5′UTR 94bp直接连接于蝶豆DFR基因的起始密码子的DNA片段。进行了在该平滑末端的增幅产物上附加dA的反应后，TA克隆成pCR2.1(Invitrogen)从而得到pCR-ADHNF-CtDFR-5′。连接将该质粒用XbaI与SphI消化所得到的片段与将pBSCtDFR20用XbaI与SphI消化所得到的质粒的DNA片段，从而得到pBS-ADHNF-CtDFR。连接将该质粒的XhoI消化产物进行平滑末端化后用XbaI消化的DNA片段(090616-2)与将pMCE5-2用NheI与EcoICRI消化所得到的质粒的DNA片段，从而得到pMCE5-2 ADHNF-CtDFR。连接将pMCE5-2 ADHNF-CtDFR用AscI与PmeI消化所得到的表达盒与用AscI与SwaI消化所得到的pB423双元载体的DNA片段，从而得到pB435(pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H+CtDFR)。
通过将以下两种DNA片段混合而用作模板，即通过以包含来自蝶豆(Clitoria
ternatea“Double Blue”)花瓣的DFR基因的质粒pBSCtDFR20(GenBank accession no.AB185901)为模板将CtDFR_ADH_ORF_Fd(5′-CAAGAAAAATAAATGGATTCAGCAGCTGAAGTG-3′；
下划线部分为退火成CtDFR的序列；序列号19)与CtDFR_SphI_Rv(5′-
GCATGCTCTCATTATGTCAAG-3′；序列号20)作为引物使用的PCR进行增幅的DNA片段与通过以pBI221 ADH-221为模板将XbaI-ADH-Fd(5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；序列号14)与CtDFR_ORF_ADH_Rv(5′-TGCTGAATCCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；序列号21)作为引物使用的PCR进行增幅的DNA片段，并以XbaI-ADH-Fd(5′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；
序列号14)与CtDFR_SphI_Rv(5′-GCATGCTCTCATTATGTCAAG-3′；序列号20)为引物，使用PrimeStar(Takara Bio)作为DNA聚合酶的PCR，得到烟草ADH-5′UTR 94bp直接连接于蝶豆DFR基因的起始密码子的DNA片段。进行了在该平滑末端的增幅产物上附加dA的反应后，TA克隆成pCR2.1(Invitrogen)从而得到pCR-ADHNF-CtDFR-5′。连接将该质粒用XbaI与SphI消化所得到的片段与将pBSCtDFR20用XbaI与SphI消化所得到的质粒的DNA片段，从而得到pBS-ADHNF-CtDFR。连接将该质粒的XhoI消化产物进行平滑末端化后用XbaI消化的DNA片段(090616-2)与将pMCE5-2用NheI与EcoICRI消化所得到的质粒的DNA片段，从而得到pMCE5-2 ADHNF-CtDFR。连接将pMCE5-2 ADHNF-CtDFR用AscI与PmeI消化所得到的表达盒与用AscI与SwaI消化所得到的pB423双元载体的DNA片段，从而得到pB435(pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H+CtDFR)。
[0048] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB435的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将粉色系中的中轮菊的菊花品种“大平”(通过花卉研究所测试通过无菌培养的遗传资源)转化，从而得到34个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果发现28个系统(82％)的花色向蓝色方向变化。23个系统(全体的68％)显示色相角290°以下的蓝色，而且22个系统(全体的65％)在RHS标准比色卡的测色中显示蓝色组或紫罗兰色-蓝色组的花色。在具有这些蓝色花特征的系统中，确认了作为主要花色苷的花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′，5′-二葡萄糖苷(ternatin C5)及花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatin C5)的累积。通过使来自风铃草F3′5′H基因的终止子成为拟南芥HSP，与使用农杆菌nos终止子的情况(实施例4，12-18)相比，能够以高比例制作蓝色菊花。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表7。
表7
[表7]
*平均值(n＝23)
NA：无法分析·测定
表7
[表7]
*平均值(n＝23)
NA：无法分析·测定
[0049] [实施例8：pB428向菊花品种“SEI SHAWL”(测试由日本精兴园有限公司提供的品种；系统编号S39)的导入(在菊花F3H启动子1k及农杆菌nos终止子控制下抑制菊花内源性F3′H基因的同时，在菊花F3H启动子1k及拟南芥HSP终止子控制下使风铃草F3′5′H基因及蝶豆A3′5′GT基因共表达)][1]载体的构建
将通过以来自菊花“ARIETTA”舌状花瓣的cDNA为模板，以CmF3′H_full_ORF_F(5′-ATGAACATTTTACCTTTCGTATTTTATG-3′；序列号22)与CmF3′H_full_ORF_R(5′-
TTAAATACTTTCATATACGTGGG-3′；序列号23)为引物，使用LA Taq作为DNA聚合酶的PCR进行增幅的菊花F3′H ORFTA克隆成pCR2.1，从而得到pCR2.1-CmF3′H-ORF1。将通过以该质粒为模板将CmF3′H_3′-Fd for dsRNA(5′-CACCCCGAACTCATTCGTCATCCAC-3′；序列号24)与CmF3′H_
3′-Rv for dsRNA(5′-TCAATCCATACGCTTCTTCCATG-3′；序列号25)作为引物使用的PCR进行增幅的成为RNAi触发子的DNA片段(序列号38)连接于pENTR-D/TOPO(Invitrogn)，从而得到pENTR-CmF3′H-C。使pENTR-CmF3′H-C与pANDA35K(http：//bsw3.naist.jp/simamoto/pANDA/real/pANDA_top.htm)进行LR反应，从而得到pANDA-CmF3′H-C IR。连接将该质粒用XbaI与EcoICRI消化所得到的约2.5kb的DNA片段与将pBI121-FASS-CmF3H1k用SpeI与EcoICRI消化所得到的双元载体的DNA片段，从而得到pB319(pBF3′H-Ci)。
连接将pMCE5-2用NheI与EcoICRI消化所得到的质粒的DNA片段与将pCR ADHNF-
Campanula F3′5′H(日本专利5697040号公报)的KpnI消化产物进行平滑末端化后用XbaI消化所得到的约1.7kb的DNA片段，从而得到pMCE5-2 ADHNF-CamF3′5′H。连接将该质粒用FseI与PmeI消化所得到的表达盒与用FseI与SwaI消化所得到的pB319的双元载体片段，从而得到pB332(pBF3′H-Ci+CamF3′5′H)。
将通过以来自菊花“ARIETTA”舌状花瓣的cDNA为模板，以CmF3′H_full_ORF_F(5′-ATGAACATTTTACCTTTCGTATTTTATG-3′；序列号22)与CmF3′H_full_ORF_R(5′-
TTAAATACTTTCATATACGTGGG-3′；序列号23)为引物，使用LA Taq作为DNA聚合酶的PCR进行增幅的菊花F3′H ORFTA克隆成pCR2.1，从而得到pCR2.1-CmF3′H-ORF1。将通过以该质粒为模板将CmF3′H_3′-Fd for dsRNA(5′-CACCCCGAACTCATTCGTCATCCAC-3′；序列号24)与CmF3′H_
3′-Rv for dsRNA(5′-TCAATCCATACGCTTCTTCCATG-3′；序列号25)作为引物使用的PCR进行增幅的成为RNAi触发子的DNA片段(序列号38)连接于pENTR-D/TOPO(Invitrogn)，从而得到pENTR-CmF3′H-C。使pENTR-CmF3′H-C与pANDA35K(http：//bsw3.naist.jp/simamoto/pANDA/real/pANDA_top.htm)进行LR反应，从而得到pANDA-CmF3′H-C IR。连接将该质粒用XbaI与EcoICRI消化所得到的约2.5kb的DNA片段与将pBI121-FASS-CmF3H1k用SpeI与EcoICRI消化所得到的双元载体的DNA片段，从而得到pB319(pBF3′H-Ci)。
连接将pMCE5-2用NheI与EcoICRI消化所得到的质粒的DNA片段与将pCR ADHNF-
Campanula F3′5′H(日本专利5697040号公报)的KpnI消化产物进行平滑末端化后用XbaI消化所得到的约1.7kb的DNA片段，从而得到pMCE5-2 ADHNF-CamF3′5′H。连接将该质粒用FseI与PmeI消化所得到的表达盒与用FseI与SwaI消化所得到的pB319的双元载体片段，从而得到pB332(pBF3′H-Ci+CamF3′5′H)。
[0050] 连接将pB332(pBF3′H-Ci+CamF3′5′H)用FseI与SwaI消化所得到的双元载体的DNA片段与将pMCE5-2 ADHNF-CtA3′5′GT用FseI与PmeI消化所得到的CmF3Hp1k：ADHNF-CtA3′5′GT：AtHSPt盒，从而得到pB428(pBF3′H-Ci+CamF3′5′H+CtA3′5′GT)。
[0051] 使用导入了pB428的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将粉色系中的大轮马先蒿花型的菊花品种“SEI SHAWL”(由日本精兴园有限公司提供的品种；系统编号S39)转化，从而得到10个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果确认了6个系统(60％)的花色向蓝色方向变化，在3个系统(全体的30％)中可确认花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′，5′-二葡萄糖苷(ternatinC5)及花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatinC5)的累积。花色改变为蓝色组或紫罗兰色-蓝色组(图5)。通过使来自风铃草F3′5′H基因的终止子成为拟南芥HSP，与使用农杆菌nos终止子的情况(实施例4、12-18)相比，能够以高比例制作蓝色菊花。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表8。
表8
[表8]
表8
[表8]
[0052] [实施例9：pB428向菊花系统“T27”的导入(在菊花F3H启动子1k及农杆菌nos终止子控制下抑制菊花内源性F3′H基因的同时，在菊花F3H启动子1k及拟南芥HSP终止子控制下使风铃草F3′5′H基因及蝶豆A3′5′GT基因共表达)][1]载体的构建
按照实施例8制作pB428(pBF3′H-Ci+CamF3′5′H+CtA3′5′GT)。
按照实施例8制作pB428(pBF3′H-Ci+CamF3′5′H+CtA3′5′GT)。
[0053] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB428的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将粉色系中的小轮绒球状花型的菊花系统“T27”(测试由日本精兴园有限公司提供的繁育品系)转化，从而得到10个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果确认了6个系统(60％)的花色向蓝色方向变化。在其中的4个系统(全体的40％)中可确认作为主要花色苷的花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′，5′-二葡萄糖苷(ternatinC5)及花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatinC5)的累积(图5)。在这些个系统中花色改变为紫罗兰色-蓝色组。通过使来自风铃草F3′5′H基因的终止子成为拟南芥HSP，与使用农杆菌nos终止子的情况(实施例4、12-18)相比，能够以高比例制作蓝色菊花。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表9。
表9
[表9]
表9
[表9]
[0054] [实施例10：pB428向菊花品种“SEI ARABELLA”(系统编号T34)的导入(在菊花F3H启动子1k及农杆菌nos终止子控制下抑制菊花内源性F3′H基因的同时，在菊花F3H启动子1k及拟南芥HSP终止子控制下使风铃草F3′5′H基因及蝶豆A3′5′GT基因共表达)][1]载体的构建按照实施例8制作pB428(pBF3′H-Ci+CamF3′5′H+CtA3′5′GT)。
[0055] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB428的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将三文鱼粉色系中的中轮马先蒿花型的菊花品种“SEI ARABELLA”(Inochio精兴园有限公司；系统编号T34)转化，从而得到3个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果可确认在3个系统(100％)中花色向蓝色方向变化。在其中的2个系统(全体的
67％)中，可确认作为主要花色苷的花翠素3-(6-丙二酰)葡萄糖苷3′，5′-二葡萄糖苷(ternatin C5)及花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatin C5)的累积(图5)。这些系统的花色改变为紫罗兰色-蓝色组。通过使来自风铃草F3′5′H基因的终止子成为拟南芥HSP，与使用农杆菌nos终止子的情况(实施例4，12-18)相比，以高比例制作蓝色菊花。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表10。
表10
[表10]
67％)中，可确认作为主要花色苷的花翠素3-(6-丙二酰)葡萄糖苷3′，5′-二葡萄糖苷(ternatin C5)及花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatin C5)的累积(图5)。这些系统的花色改变为紫罗兰色-蓝色组。通过使来自风铃草F3′5′H基因的终止子成为拟南芥HSP，与使用农杆菌nos终止子的情况(实施例4，12-18)相比，以高比例制作蓝色菊花。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表10。
表10
[表10]
[0056] [实施例11：pB428向菊花系统“T57”的导入(在菊花F3H启动子1k及农杆菌nos终止子控制下抑制菊花内源性F3′H基因的同时，在菊花F3H启动子1k及拟南芥HSP终止子控制下使风铃草F3′5′H基因及蝶豆A3′5′GT基因共表达)][1]载体的构建
按照实施例8制作pB428(pBF3′H-Ci+CamF3′5′H+CtA3′5′GT)。
按照实施例8制作pB428(pBF3′H-Ci+CamF3′5′H+CtA3′5′GT)。
[0057] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB428的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将三文鱼粉色系中的中轮马先蒿花型的菊花系统“T57”(测试由日本精兴园有限公司提供的繁育品系)转化，从而得到1个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果可确认花色向蓝色方向变化，可确认作为主要花色苷的花翠素3-(6-丙二酰)葡萄糖苷3′，5′-二葡萄糖苷(ternatin C5)及花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatin C5)的累积。该系统的花色向紫罗兰色-蓝色组改变，测色值如以下表11所示。
表11
[表11]
表11
[表11]
[0058] [实施例12：pB436向菊花品种“大平”的导入(使在菊花F3H启动子1k及农杆菌nos终止子控制下的风铃草F3′5′H基因、在菊花F3H启动子1k及拟南芥HSP终止子控制下的蝶豆A3′5′GT基因及荷兰鸢尾DFR基因共表达)][1]载体的构建
连接将在实施例5中得到的pMCE5-2 ADHNF-IhDFR用AscI与PmeI消化所得到的表达盒与用AscI与SwaI消化所得到的pB425双元载体的DNA片段，从而得到pB436(pBCam2+CtA3′5′GT+IhDFR)。
连接将在实施例5中得到的pMCE5-2 ADHNF-IhDFR用AscI与PmeI消化所得到的表达盒与用AscI与SwaI消化所得到的pB425双元载体的DNA片段，从而得到pB436(pBCam2+CtA3′5′GT+IhDFR)。
[0059] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB436的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将粉色系中的中轮菊的菊花品种“大平”(通过花卉研究所测试通过无菌培养的遗传资源)转化，从而得到57个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果发现32个系统(56％)的花色向蓝色方向变化。16个系统(全体的28％)显示出色相角290°以下的蓝色，而且14个系统(全体的25％)在RHS标准比色卡中显示紫罗兰色-蓝色组的花色。在具有这些蓝色花特征的系统中，确认了作为主要花色苷的花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′，
5′-二葡萄糖苷(ternatinC5)及花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatinC5)的累积。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表12。
表12
[表12]
*平均值(n＝23)
NA：无法分析·测定
5′-二葡萄糖苷(ternatinC5)及花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatinC5)的累积。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表12。
表12
[表12]
*平均值(n＝23)
NA：无法分析·测定
[0060] [实施例13：pB437向菊花品种“大平”的导入(使在菊花F3H启动子1k及农杆菌nos终止子控制下的风铃草F3′5′H基因、在菊花F3H启动子1k及拟南芥HSP终止子控制下的蝶豆A3′5′GT基因及飞燕草DFR基因共表达)][1]载体的构建
连接将在实施例6中得到的pMCE5-2 ADHNF-DbDFR用AscI与PmeI消化所得到的表达盒与用AscI与SwaI消化所得到的pB425双元载体的DNA片段，从而得到pB437(pBCam2+CtA3′5′GT+DbDFR)。
连接将在实施例6中得到的pMCE5-2 ADHNF-DbDFR用AscI与PmeI消化所得到的表达盒与用AscI与SwaI消化所得到的pB425双元载体的DNA片段，从而得到pB437(pBCam2+CtA3′5′GT+DbDFR)。
[0061] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB437的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将粉色系中的中轮菊的菊花品种“大平”(通过花卉研究所测试通过无菌培养的遗传资源)转化，从而得到38个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果发现21个系统(55％)的花色向蓝色方向变化。其中的9个系统(全体的24％)显示色相角290°以下的蓝色，而且8个系统(全体的21％)在RHS标准比色卡中显示紫罗兰色-蓝色组的花色。在具有这些蓝色花特征的系统中，确认了作为主要花色苷的花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-
3′，5′-二葡萄糖苷(ternatinC5)及花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatinC5)的累积。
将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表13。
表13
[表13]
*平均值(n＝23)
NA：无法分析·测定
3′，5′-二葡萄糖苷(ternatinC5)及花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatinC5)的累积。
将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表13。
表13
[表13]
*平均值(n＝23)
NA：无法分析·测定
[0062] [实施例14：pB438向菊花品种“大平”的导入(使在菊花F3H启动子1k及农杆菌nos终止子控制下的风铃草F3′5′H基因、在菊花F3H启动子1k及拟南芥HSP终止子控制下的蝶豆A3′5′GT基因及蝶豆DFR基因共表达)][1]载体的构建
连接将在实施例7中得到的pMCE5-2 ADHNF-CtDFR用AscI与PmeI消化所得到的表达盒与通过AscI与SwaI消化所得到的pB425双元载体的DNA片段，从而得到pB438(pBCam2+CtA3′
5′GT+CtDFR)。
连接将在实施例7中得到的pMCE5-2 ADHNF-CtDFR用AscI与PmeI消化所得到的表达盒与通过AscI与SwaI消化所得到的pB425双元载体的DNA片段，从而得到pB438(pBCam2+CtA3′
5′GT+CtDFR)。
[0063] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB438的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)。将粉色系中的中轮菊的菊花品种“大平”(通过花卉研究所测试通过无菌培养的遗传资源)转化，从而得到55个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果发现34个系统(62％)的花色向蓝色方向变化。其中的13个系统(全体的24％)显示色相角290°以下的蓝色。而且18个系统(全体的33％)显示RHS标准比色卡的紫罗兰色-蓝色组的花色。在具有这些蓝色花特征的系统中，确认了作为主要花色苷的花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-
3′，5′-二葡萄糖苷(ternatin C5)及花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatin C5)的累积。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表14。
表14
[表14]
*平均值(n＝23)
3′，5′-二葡萄糖苷(ternatin C5)及花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatin C5)的累积。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表14。
表14
[表14]
*平均值(n＝23)
[0064] [实施例15：pB426向菊花品种“大平”的导入(使在菊花F3H启动子1k及农杆菌nos终止子控制下的风铃草F3′5′H基因、在菊花F3H启动子1k及拟南芥HSP终止子控制下的飞燕草DFR基因及蝶豆A3′5′GT基因共表达)][1]载体的构建
连接将在实施例6中得到的pMCE5-2 ADHNF-DbDFR用FseI与PmeI消化所得到的表达盒与用FseI与SwaI消化所得到的pB315双元载体的DNA片段，从而得到pBCam2+DbDFR。连接将该双元载体用FseI与SwaI消化所得到的DNA片段与将pMCE5-2 ADHNF-CtA3′5′GT用FseI与PmeI消化所得到的CmF3Hp1k：ADHNF-CtA3′5′GT：AtHSPt盒，从而得到pB426(pBCam2+DbDFR+CtA3′5′GT)。
连接将在实施例6中得到的pMCE5-2 ADHNF-DbDFR用FseI与PmeI消化所得到的表达盒与用FseI与SwaI消化所得到的pB315双元载体的DNA片段，从而得到pBCam2+DbDFR。连接将该双元载体用FseI与SwaI消化所得到的DNA片段与将pMCE5-2 ADHNF-CtA3′5′GT用FseI与PmeI消化所得到的CmF3Hp1k：ADHNF-CtA3′5′GT：AtHSPt盒，从而得到pB426(pBCam2+DbDFR+CtA3′5′GT)。
[0065] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB426的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将粉色系中的中轮菊的菊花品种“大平”(通过花卉研究所测试通过无菌培养的遗传资源)转化，从而得到47个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果发现28个系统(60％)的花色向蓝色方向变化。其中的9个系统(全体的19％)显示色相角290°以下的蓝色，而且10个系统(全体的21％)在RHS标准比色卡的测色中显示紫罗兰色-蓝色组的花色。在具有这些蓝色花特征的系统中，确认了作为主要花色苷的花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′，5′-二葡萄糖苷(ternatinC5)及花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatinC5)的累积。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表15。
表15
[表15]
*平均值(n＝23)
NA：无法分析·测定
表15
[表15]
*平均值(n＝23)
NA：无法分析·测定
[0066] [实施例16：pB427向菊花品种“大平”的导入(使在菊花F3H启动子1k及农杆菌nos终止子控制下的风铃草F3′5′H基因、在菊花F3H启动子1k及拟南芥HSP终止子控制下的蝶豆DFR基因及蝶豆A3′5′GT基因共表达)][1]载体的构建
连接将在实施例7中得到的pMCE5-2 ADHNF-CtDFR用FseI与PmeI消化所得到的表达盒与用FseI与SwaI消化所得到的pB315双元载体的DNA片段，从而得到pBCam2+CtDFR。连接将该双元载体用FseI与SwaI消化所得到的DNA片段与将pMCE5-2 ADHNF-CtA3′5′GT用FseI与PmeI消化所得到的CmF3Hp1k：ADHNF-CtA3′5′GT：AtHSPt盒，从而得到pB427(pBCam2+CtDFR+CtA3′5′GT)。
连接将在实施例7中得到的pMCE5-2 ADHNF-CtDFR用FseI与PmeI消化所得到的表达盒与用FseI与SwaI消化所得到的pB315双元载体的DNA片段，从而得到pBCam2+CtDFR。连接将该双元载体用FseI与SwaI消化所得到的DNA片段与将pMCE5-2 ADHNF-CtA3′5′GT用FseI与PmeI消化所得到的CmF3Hp1k：ADHNF-CtA3′5′GT：AtHSPt盒，从而得到pB427(pBCam2+CtDFR+CtA3′5′GT)。
[0067] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB427的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将粉色系中的中轮菊的菊花品种“大平”(通过花卉研究所测试通过无菌培养的遗传资源)转化，从而得到24个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果发现15个系统(63％)的花色向蓝色方向变化。其中的4个系统(全体的17％)显示色相角290°以下的蓝色，显示RHS标准比色卡的紫罗兰色-蓝色组的花色。在具有这些蓝色花特征的系统中，确认了作为主要花色苷的花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′，5′-二葡萄糖苷(ternatinC5)及花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatinC5)的累积。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表16。
表16
[表16]
*平均值(n＝23)
NA：无法分析·测定
表16
[表16]
*平均值(n＝23)
NA：无法分析·测定
[0068] [实施例17：pB419向菊花品种“大平”的导入(使在菊花F3H启动子1k及农杆菌nos终止子控制下的风铃草F3′5′H基因、在菊花F3H启动子1k及拟南芥HSP终止子控制下的蝶豆AGS基因及蝶豆A3′5′GT基因共表达)][1]载体的构建
连接将pBSII-ADH-CtA3′5′GT用NheI与EcoICRI消化所得到的DNA片段与将pMCE5-2(FASS-CmF3Hp-AtHSPt)用NheI与EcoICRI消化所得到的载体的片段，从而得到pMCE5-2 ADHNF-CtA3′5′GT。连接将该质粒用FseI与PmeI消化所得到的表达盒与用FseI与SwaI消化所得到的pB420(pBCam2+CtAGS；参考例4)的双元载体片段，从而得到pB419(pBCam2+CtAGS+CtA3′5′GT)。
连接将pBSII-ADH-CtA3′5′GT用NheI与EcoICRI消化所得到的DNA片段与将pMCE5-2(FASS-CmF3Hp-AtHSPt)用NheI与EcoICRI消化所得到的载体的片段，从而得到pMCE5-2 ADHNF-CtA3′5′GT。连接将该质粒用FseI与PmeI消化所得到的表达盒与用FseI与SwaI消化所得到的pB420(pBCam2+CtAGS；参考例4)的双元载体片段，从而得到pB419(pBCam2+CtAGS+CtA3′5′GT)。
[0069] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB419的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将粉色系中的中轮菊的菊花品种“大平”(通过花卉研究所测试通过无菌培养的遗传资源)转化，从而得到20个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果发现12个系统(60％)的花色向蓝色方向变化。其中的5个系统(全体的25％)显示色相角290°以下的蓝色。而且3个系统(全体的15％)在RHS标准比色卡中显示紫罗兰色-蓝色组的花色。在具有这些蓝色花特征的系统中，确认了作为主要花色苷的花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-
3′，5′-二葡萄糖苷(ternatin C5)及花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatin C5)的累积。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表17。
表17
[表17]
*平均值(n＝23)
NA：无法分析·测定
3′，5′-二葡萄糖苷(ternatin C5)及花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatin C5)的累积。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表17。
表17
[表17]
*平均值(n＝23)
NA：无法分析·测定
[0070] [实施例18：pB432向菊花品种“大平”的导入(使在菊花F3H启动子1k及农杆菌nos终止子控制下的风铃草F3′5′H基因、在菊花F3H启动子1k及拟南芥HSP终止子控制下的蝶豆AGS基因、蝶豆A3′5′GT基因及荷兰鸢尾DFR基因共表达)][1]载体的构建
连接将pMCE5-2-ADHNF-DbDFR用FseI与PmeI消化所得到的表达盒与用FseI与SwaI消化所得到的pB419(pBCam2+CtAGS+CtA3′5′GT)的双元载体片段，从而得到pB432(pBCam2+CtAGS+CtA3′5′GT+IhDFR)。
连接将pMCE5-2-ADHNF-DbDFR用FseI与PmeI消化所得到的表达盒与用FseI与SwaI消化所得到的pB419(pBCam2+CtAGS+CtA3′5′GT)的双元载体片段，从而得到pB432(pBCam2+CtAGS+CtA3′5′GT+IhDFR)。
[0071] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB432的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将粉色系中的中轮菊的菊花品种“大平”(通过花卉研究所测试通过无菌培养的遗传资源)转化，从而得到47个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果发现23个系统(49％)的花色向蓝色方向变化。其中的12个系统(全体的26％)显示色相角290°以下的蓝色。而且13个系统(全体的28％)显示RHS标准比色卡的蓝色组或紫罗兰色-蓝色组的颜色。在具有这些蓝色花特征的系统中，确认了作为主要花色苷的花翠素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷-3′，5′-二葡萄糖苷(ternatin C5)及花翠素3，3′，5′-三葡萄糖苷(preternatin C5)的累积。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表18。
表18
[表18]
*平均值(n＝23)
表18
[表18]
*平均值(n＝23)
[0072] [实施例19：pB423向菊花品种“SEI SHAWL”的导入(使在菊花F3H启动子1k与农杆菌nos终止子控制下的蝶豆A3′5′GT基因及在菊花F3H启动子1k与拟南芥HSP终止子控制下的风铃草F3′5′H基因共表达)][1]载体的构建
根据实施例1制作pB423(pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H)。
根据实施例1制作pB423(pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H)。
[0073] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB423的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将粉色系中的大轮马先蒿花型的菊花品种“SEI SHAWL”(Inochio精兴园有限公司)转化，从而得到2个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果制作了1个系统(50％)色相角290°以下且显示RHS标准比色卡的紫罗兰色-蓝色组的蓝色菊花。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表19。
表19
[表19]
NA：无法分析·测定
表19
[表19]
NA：无法分析·测定
[0074] [实施例20：pB423向菊花品种“CANDELA TIERRA”的导入(使在菊花F3H启动子1k与农杆菌nos终止子控制下的蝶豆A3′5′GT基因及在菊花F3H启动子1k与拟南芥HSP终止子控制下的风铃草F3′5′H基因共表达)][1]载体的构建
根据实施例1制作pB423(pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H)。
根据实施例1制作pB423(pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H)。
[0075] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB423的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将粉色系的马先蒿花型的菊花品种“CANDELA TIERRA”(Inochio精兴园有限公司)转化，从而得到3个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果可制作1个系统(33％)显示RHS标准比色卡的紫罗兰色-蓝色组的蓝色菊花。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表20。
表20
[表20]
NA：无法分析·测定
表20
[表20]
NA：无法分析·测定
[0076] [实施例21：pB423向菊花系统“T10”的导入(使在菊花F3H启动子1k与农杆菌nos终止子控制下的蝶豆A3′5′GT基因及在菊花F3H启动子1k与拟南芥HSP终止子控制下的风铃草F3′5′H基因共表达)][1]载体的构建
根据实施例1制作pB423(pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H)。
根据实施例1制作pB423(pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H)。
[0077] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB423的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将红色系中的马先蒿花型的菊花系统“T10”(测试由Inochio精兴园有限公司提供的繁育品系)转化，从而得到
3个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果制作了1个系统(33％)显示RHS标准比色卡的紫罗兰色-蓝色组的蓝色菊花。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表21。
表21
[表21]
NA：无法分析·测定
3个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果制作了1个系统(33％)显示RHS标准比色卡的紫罗兰色-蓝色组的蓝色菊花。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表21。
表21
[表21]
NA：无法分析·测定
[0078] [实施例22：pB423向菊花系统“T24”的导入(使在菊花F3H启动子1k与农杆菌nos终止子控制下的蝶豆A3′5′GT基因及在菊花F3H启动子1k与拟南芥HSP终止子控制下的风铃草F3′5′H基因共表达)][1]载体的构建
根据实施例1制作pB423(pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H)。
根据实施例1制作pB423(pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H)。
[0079] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB423的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将粉色系中的大轮花型的厚物菊花系统“T24”(测试由Inochio精兴园有限公司提供的繁育品系)转化，从而得到4个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果可制作1个系统(25％)色相角290°以下且显示RHS标准比色卡的紫罗兰色-蓝色组的蓝色菊花。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表22。
表22
[表22]
NA：无法分析·测定
表22
[表22]
NA：无法分析·测定
[0080] [实施例23：pB423向菊花系统“T27”的导入(使在菊花F3H启动子1k与农杆菌nos终止子控制下的蝶豆A3′5′GT基因及在菊花F3H启动子1k与拟南芥HSP终止子控制下的风铃草F3′5′H基因共表达)][1]载体的构建
根据实施例1制作pB423(pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H)。
根据实施例1制作pB423(pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H)。
[0081] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB423的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将粉色系中的绒球状花型的菊花系统“T27”(测试由Inochio精兴园有限公司提供的繁育品系)转化，从而得到
21个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果可制作11个系统(52％)显示色相角290°以下的蓝色菊花，17个系统(81％)显示RHS标准比色卡的紫罗兰色-蓝色组的蓝色菊花。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值适于以下表23。
表23
[表23]
21个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果可制作11个系统(52％)显示色相角290°以下的蓝色菊花，17个系统(81％)显示RHS标准比色卡的紫罗兰色-蓝色组的蓝色菊花。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值适于以下表23。
表23
[表23]
[0082] [实施例24：pB423向菊花系统“T44”的导入(使在菊花F3H启动子1k与农杆菌nos终止子控制下的蝶豆A3′5′GT基因及在菊花F3H启动子1k与拟南芥HSP终止子控制下的风铃草F3′5′H基因共表达)][1]载体的构建
根据实施例1制作pB423(pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H)。
根据实施例1制作pB423(pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H)。
[0083] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB423的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将粉色系中的绒球状花型的菊花系统“T44”(测试由Inochio精兴园有限公司提供的繁育品系)转化，从而得到
12个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果可制作4个系统(33％)显示色相角290°以下的蓝色菊花，3个系统(25％)显示RHS标准比色卡的紫罗兰色-蓝色组的蓝色菊花。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表24。
表24
[表24]
NA：无法分析·测定
12个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果可制作4个系统(33％)显示色相角290°以下的蓝色菊花，3个系统(25％)显示RHS标准比色卡的紫罗兰色-蓝色组的蓝色菊花。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表24。
表24
[表24]
NA：无法分析·测定
[0084] [实施例25：pB423向菊花系统“T57”的导入(使在菊花F3H启动子1k与农杆菌nos终止子控制下的蝶豆A3′5′GT基因及在菊花F3H启动子1k与拟南芥HSP终止子控制下的风铃草F3′5′H基因共表达)][1]载体的构建
根据实施例1制作pB423(pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H)。
根据实施例1制作pB423(pBCtA3′5′GT+CamF3′5′H)。
[0085] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB423的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将粉色系中的马先蒿花型的菊花系统“T57”(测试由Inochio精兴园有限公司提供的繁育品系)转化，从而得到
2个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果可制作2个系统(100％)色相角290°以下且显示RHS标准比色卡的紫罗兰色-蓝色组的蓝色菊花。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表25。
表25
[表25]
2个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果可制作2个系统(100％)色相角290°以下且显示RHS标准比色卡的紫罗兰色-蓝色组的蓝色菊花。将确认了花色向蓝色方向改变的转化体的测色值示于以下表25。
表25
[表25]
[0086] [参考例1：pB248向菊花系统“94-765”的导入(在菊花F3H启动子500及农杆菌nos终止子的控制下使来自蝶豆的A3′5′GT基因表达)][1]载体的构建
通过将以下两种DNA片段混合而用作模板，即通过以包含蝶豆A3′5′GT基因的日本专利第4418865号公报记载的pBSCtBGT1DB24质粒为模板，以ADH-3′5′GT-Fd(5′-
CAAGAAAAATAAATGGAAAACAATAAGCATGTC-3′；下划线部分为退火成Ct3′5′GT编码区的序列；
序列号26)与Hind-Ct3′5′GT-Rv(5′-AAGCTTGCGTTTTTAGCATCATTC-3′；序列号27)用作引物的PCR增幅的DNA片段以及通过以pBI221 ADH-221为模板以XbaI-ADH-Fd(5′-
ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；
序列号14)与Ct3′5′GT-ADH-Rv(5′-ATTGTTTTCCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；序列号28)用作引物的PCR增幅的DNA片段，并将XbaI-ADH-Fd与Hind-Ct3′5′GT-Rv用作引物的PCR，可得到烟草ADH-5′UTR 94bp与蝶豆A3′
5′GT基因的起始密码子直接连接的DNA片段。连接将该DNA片段TA克隆成pCR2.1后用XbaI与HindIII消化所得到的约600bp的DNA片段与将pBlueScript II SK(+)用XbaI与HindIII消化所得到的载体的DNA片段，从而得到pBSII-ADH-5′-CtBGT1-HindIII。连接将该质粒用HindIII与XhoI消化所得到的质粒的DNA片段与将pBSCtBGT1DB24用HindIII与XhoI消化所得到的DNA片段，从而得到pBSII-ADH-CtA3′5′GT。将通过以该质粒为模板将NheI-ADH-Fd2(5′-GCTAGCGTCTATTTAACTCAGTATTCAGAAAC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；序列号29)与Ct3′5′GT-SacI-Rv(5′-GAGCTCTTAGCTAGAGGAAATCATTTCCAC-3′；下划线部分为退火成Ct3′5′GT编码区的序列；序列号30)用作引物PCR增幅的平滑末端的DNA产物克隆成pCR-Blunt II-TOPO(Invitrogen)，从而得到pCR ADHNF-CtA3′5′GT。连接将该质粒用NheI与EcoICRI消化所得到的约1450bp的ADHNF-CtA3′5′GT DNA片段与将pBI121 HANS-CmF3Hp500-X(日本专利第5697040号公报)用XbaI与EcoICRI消化所得到的双元载体的DNA片段，从而得到pB248(pBI121 CmF3Hp500：ADHNF-蝶豆A3′5′GT：NOSt)。
通过将以下两种DNA片段混合而用作模板，即通过以包含蝶豆A3′5′GT基因的日本专利第4418865号公报记载的pBSCtBGT1DB24质粒为模板，以ADH-3′5′GT-Fd(5′-
CAAGAAAAATAAATGGAAAACAATAAGCATGTC-3′；下划线部分为退火成Ct3′5′GT编码区的序列；
序列号26)与Hind-Ct3′5′GT-Rv(5′-AAGCTTGCGTTTTTAGCATCATTC-3′；序列号27)用作引物的PCR增幅的DNA片段以及通过以pBI221 ADH-221为模板以XbaI-ADH-Fd(5′-
ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；
序列号14)与Ct3′5′GT-ADH-Rv(5′-ATTGTTTTCCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；序列号28)用作引物的PCR增幅的DNA片段，并将XbaI-ADH-Fd与Hind-Ct3′5′GT-Rv用作引物的PCR，可得到烟草ADH-5′UTR 94bp与蝶豆A3′
5′GT基因的起始密码子直接连接的DNA片段。连接将该DNA片段TA克隆成pCR2.1后用XbaI与HindIII消化所得到的约600bp的DNA片段与将pBlueScript II SK(+)用XbaI与HindIII消化所得到的载体的DNA片段，从而得到pBSII-ADH-5′-CtBGT1-HindIII。连接将该质粒用HindIII与XhoI消化所得到的质粒的DNA片段与将pBSCtBGT1DB24用HindIII与XhoI消化所得到的DNA片段，从而得到pBSII-ADH-CtA3′5′GT。将通过以该质粒为模板将NheI-ADH-Fd2(5′-GCTAGCGTCTATTTAACTCAGTATTCAGAAAC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；序列号29)与Ct3′5′GT-SacI-Rv(5′-GAGCTCTTAGCTAGAGGAAATCATTTCCAC-3′；下划线部分为退火成Ct3′5′GT编码区的序列；序列号30)用作引物PCR增幅的平滑末端的DNA产物克隆成pCR-Blunt II-TOPO(Invitrogen)，从而得到pCR ADHNF-CtA3′5′GT。连接将该质粒用NheI与EcoICRI消化所得到的约1450bp的ADHNF-CtA3′5′GT DNA片段与将pBI121 HANS-CmF3Hp500-X(日本专利第5697040号公报)用XbaI与EcoICRI消化所得到的双元载体的DNA片段，从而得到pB248(pBI121 CmF3Hp500：ADHNF-蝶豆A3′5′GT：NOSt)。
[0087] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB248的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将深红色系中的中轮菊的菊花系统“94-765”(测试由日本精兴园有限公司提供的繁育品系)转化，从而得到23个系统的转化体。其中，将15个系统的舌状花瓣所包含的花色苷色素使用高效液相色谱通过以下条件分析。色谱柱使用Inertsil ODS-2(粒径5μm，4.6×250mm，GL Sciences)，流速
0.8ml/min，进行20分钟流动相从包含1.5％磷酸的5％乙酸、6.25％乙腈变为包含1.5％磷酸的20％乙酸、25％乙腈的线性浓度梯度洗脱后，用包含1.5％磷酸及20％乙酸的25％乙腈进行5分钟的等度洗脱。检测使用Agilent 1100串联二极管阵列检测器(GL Sciences)，检测从250nm到600nm的波长区域。分析的结果可确认在12个系统中具有认为作为宿主花瓣的主要花色苷的矢车菊素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷及矢车菊素3-(3″，6″-二丙二酰)葡萄糖苷分别结合1个葡萄糖基的2个主要色素的矢车菊素3-(6-丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷及矢车菊素3-(3″，6″-二丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷(各自的HPLC分析的洗脱时间(tR)：
9.4分钟及7.2分钟)。然而，无法得到与原本的94-765有大的花色变化的系统，任一个转化系统均显示RHS标准比色卡的红色-紫色组的花色(表26)。仅通过菊花F3H启动子500(长度约500b)使蝶豆的A3′5′GT基因表达无法得到蓝色菊花(图6)。
表26
[表26]
*：+：检测，trace：微量，-非检测，9.4tR：矢车菊素3-(3.6-二丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷.7.2tR：矢车菊素3-(3-丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷
**：平均值(n＝14)
NA：无法分析、测定
0.8ml/min，进行20分钟流动相从包含1.5％磷酸的5％乙酸、6.25％乙腈变为包含1.5％磷酸的20％乙酸、25％乙腈的线性浓度梯度洗脱后，用包含1.5％磷酸及20％乙酸的25％乙腈进行5分钟的等度洗脱。检测使用Agilent 1100串联二极管阵列检测器(GL Sciences)，检测从250nm到600nm的波长区域。分析的结果可确认在12个系统中具有认为作为宿主花瓣的主要花色苷的矢车菊素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷及矢车菊素3-(3″，6″-二丙二酰)葡萄糖苷分别结合1个葡萄糖基的2个主要色素的矢车菊素3-(6-丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷及矢车菊素3-(3″，6″-二丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷(各自的HPLC分析的洗脱时间(tR)：
9.4分钟及7.2分钟)。然而，无法得到与原本的94-765有大的花色变化的系统，任一个转化系统均显示RHS标准比色卡的红色-紫色组的花色(表26)。仅通过菊花F3H启动子500(长度约500b)使蝶豆的A3′5′GT基因表达无法得到蓝色菊花(图6)。
表26
[表26]
*：+：检测，trace：微量，-非检测，9.4tR：矢车菊素3-(3.6-二丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷.7.2tR：矢车菊素3-(3-丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷
**：平均值(n＝14)
NA：无法分析、测定
[0088] [参考例2：pB249向菊花系统“94-765”的导入(在菊花F3H启动子1k及农杆菌nos终止子的控制下使来自蝶豆的A3′5′GT基因表达)][1]载体的构建
连接将pBI121 HANS-CmF3Hp1k-S(日本专利第5697040号公报)通过SpeI与EcoICRI消化所得到的双元载体的DNA片段与将pCR ADHNF-CtA3′5′GT通过NheI与EcoICRI消化所得到的ADHNF-蝶豆A3′5′GT的DNA片段，从而得到pB249(pBI121 CmF3Hp1k：ADHNF-蝶豆A3′5′GT：
NOSt)。
连接将pBI121 HANS-CmF3Hp1k-S(日本专利第5697040号公报)通过SpeI与EcoICRI消化所得到的双元载体的DNA片段与将pCR ADHNF-CtA3′5′GT通过NheI与EcoICRI消化所得到的ADHNF-蝶豆A3′5′GT的DNA片段，从而得到pB249(pBI121 CmF3Hp1k：ADHNF-蝶豆A3′5′GT：
NOSt)。
[0089] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB249的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将深红色系中的中轮菊的菊花系统“94-765”(测试由日本精兴园有限公司提供的繁育品系)转化，从而得到25个系统的转化体。其中，使用参考例1的方法分析18个系统中的舌状花瓣所包含的花色苷色素，结果可确认17个系统中具有认为矢车菊素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷及矢车菊素3-(3″，
6″-二丙二酰)葡萄糖苷分别结合了1个葡萄糖基的2个主要色素。而且，无法得到与原本的
94-765有大的花色变化的系统，任一个均显示红色-紫色组的花色(表27)。仅通过F3H启动子1k(长度约1kb)使蝶豆的A3′5′GT基因表达无法得到蓝色菊花(图6)。
表27
[表27]
*：+：检测，trace：微量，-非检测，9.4tR：矢车菊素3-(3，6-二丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷.7.2tR：矢车菊素3-(3-丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷
**：平均值(n＝14)
NA：无法分析、测定
6″-二丙二酰)葡萄糖苷分别结合了1个葡萄糖基的2个主要色素。而且，无法得到与原本的
94-765有大的花色变化的系统，任一个均显示红色-紫色组的花色(表27)。仅通过F3H启动子1k(长度约1kb)使蝶豆的A3′5′GT基因表达无法得到蓝色菊花(图6)。
表27
[表27]
*：+：检测，trace：微量，-非检测，9.4tR：矢车菊素3-(3，6-二丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷.7.2tR：矢车菊素3-(3-丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷
**：平均值(n＝14)
NA：无法分析、测定
[0090] [参考例3：pB250向菊花系统“94-765”的导入(在菊花F3H启动子1k及农杆菌nos终止子的控制下使来自蝶豆的A3′5′GT基因、来自蝶豆的AGS基因及来自蝶豆的A3′AT基因共表达)][1]载体的构建
通过将以下两种DNA片段混合而用作模板，即通过以包含编码蝶豆1-O-酰基葡萄糖合成酶(CtAGS，UDP-葡萄糖：羟基桂皮酸1-O-葡萄糖基转移酶，图2)的CtAGS基因的日本专利第4418865号公报记载的pBSII-CtGT11-4-14为模板，将ADH-CtHCAGT-Fd(5′-
CAAGAAAAATAAATGGGGTCTGAAGCTTCGTTTC-3′；下划线部分为退火成CtAGS基因编码区的序列；序列号31)与StuI-CtHCAGT-Rv(5′-AGGCCTCATGTTCACAAACTTC-3′；序列号32)用作引物的PCR增幅的DNA片段以及通过以pBI221 ADH-221为模板将XbaI-ADH-Fd(5′-
ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；
序列号14)与CtHCAGT-ADH-Rv(5′-TTCAGACCCCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；序列号33)用作引物的PCR增幅的DNA片段，并将XbaI-ADH-Fd(序列号14)与StuI-CtHCAGT-Rv(序列号32)用作引物的PCR，从而得到烟草ADH-5′UTR 94bp直接连接于CtAGS基因的起始密码子的DNA片段。连接将该DNA片段TA克隆成pCR2.1(Invitrogen)后用XbaI与StuI消化所得到的约850bp的DNA片段与将pBSII-CtGT11-4-14用XbaI与StuI消化所得到的载体片段，从而得到pBSII-ADH-CtAGS。连接将该质粒的XhoI消化产物进行平滑末端化后用XbaI消化所得到的DNA片段与将pMCE5用NheI与EcoICRI消化所得到的载体片段，从而得到pMCE5-ADH-AGS。连接将该质粒用AscI与PmeI消化所得到的基因表达盒AscI-CmF3Hp1k：NtADH-5′UTR：CtAGS：nost-PmeI的DNA片段与将pB249(pBI121 CmF3Hp1k：ADHNF-蝶豆A3′5′GT：NOSt)用SwaI与AscI消化所得到的双元载体DNA片段pMCE5-ADH-CtAGS，从而得到pBI121-CtBGT+AGS。
通过将以下两种DNA片段混合而用作模板，即通过以包含编码蝶豆1-O-酰基葡萄糖合成酶(CtAGS，UDP-葡萄糖：羟基桂皮酸1-O-葡萄糖基转移酶，图2)的CtAGS基因的日本专利第4418865号公报记载的pBSII-CtGT11-4-14为模板，将ADH-CtHCAGT-Fd(5′-
CAAGAAAAATAAATGGGGTCTGAAGCTTCGTTTC-3′；下划线部分为退火成CtAGS基因编码区的序列；序列号31)与StuI-CtHCAGT-Rv(5′-AGGCCTCATGTTCACAAACTTC-3′；序列号32)用作引物的PCR增幅的DNA片段以及通过以pBI221 ADH-221为模板将XbaI-ADH-Fd(5′-
ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；
序列号14)与CtHCAGT-ADH-Rv(5′-TTCAGACCCCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；序列号33)用作引物的PCR增幅的DNA片段，并将XbaI-ADH-Fd(序列号14)与StuI-CtHCAGT-Rv(序列号32)用作引物的PCR，从而得到烟草ADH-5′UTR 94bp直接连接于CtAGS基因的起始密码子的DNA片段。连接将该DNA片段TA克隆成pCR2.1(Invitrogen)后用XbaI与StuI消化所得到的约850bp的DNA片段与将pBSII-CtGT11-4-14用XbaI与StuI消化所得到的载体片段，从而得到pBSII-ADH-CtAGS。连接将该质粒的XhoI消化产物进行平滑末端化后用XbaI消化所得到的DNA片段与将pMCE5用NheI与EcoICRI消化所得到的载体片段，从而得到pMCE5-ADH-AGS。连接将该质粒用AscI与PmeI消化所得到的基因表达盒AscI-CmF3Hp1k：NtADH-5′UTR：CtAGS：nost-PmeI的DNA片段与将pB249(pBI121 CmF3Hp1k：ADHNF-蝶豆A3′5′GT：NOSt)用SwaI与AscI消化所得到的双元载体DNA片段pMCE5-ADH-CtAGS，从而得到pBI121-CtBGT+AGS。
[0091] 通过将以下两种DNA片段混合而用作模板，即通过以包含认为具有3′AT活性及5′AT活性(图2)的蝶豆A3′AT基因的日本专利第4418865号公报记载的作为CtSCPL1cDNA克隆之 一 的 p B S I I - C t A T 1 - 1 9 为 模 板 ，将 A D H - C t A T 1 - F d ( 5 ′-CAAGAAAAATAAATGGCAGCCTTCAGTTCAAC-3′；下划线部分为退火成CtAT1的区域；序列号34)与Pst-CtAT1-Rv(5′-CTGCAGCATCTGTTCTAGCATAA-3′；序列号35)用作引物的PCR增幅的DNA片段以 及通 过以 pB I2 21 A DH -2 21 为模 板将 Xba I -A DH -Fd (5 ′-ACGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；
序列号14)与CtAT1-ADH-Rv(5′-GAAGGCTGCCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；序列号36)用作引物的PCR增幅的DNA片段，并通过将XbaI-ADH-Fd(序列号14)与Pst-CtAT1-Rv(序列号35)用作引物的PCR，使NtADH-5′UTR 94bp直接连接于CtAT基因的起始密码子的DNA片段增幅。将该DNA片段与XbaI与PstI消化并与将pBSII-CtAT1-19用SpeI与PstI消化所得到的DNA片段连接，从而得到pBSII-ADHNF-CtAT1-
19。连接将该质粒用NotI与XhoI消化所得到的约1.6kb的DNA片段与将用EcoRI消化后进行自身连接而环状化的edpCR2.1用NotI与XhoI消化所得到的质粒片段，从而得到pCR-ADHNF-CtAT1-19。而且，连接将pBSII-ADHNF-CtAT1-19用EcoICRI与SalI消化所得到的约1.6kb的DNA片段与用SmaI与SalI消化的pMCE5质粒的DNA片段，从而得到pMCE5-ADH-CtAT1。
序列号14)与CtAT1-ADH-Rv(5′-GAAGGCTGCCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3′；下划线部分为退火成NtADH-5′UTR 94bp的序列；序列号36)用作引物的PCR增幅的DNA片段，并通过将XbaI-ADH-Fd(序列号14)与Pst-CtAT1-Rv(序列号35)用作引物的PCR，使NtADH-5′UTR 94bp直接连接于CtAT基因的起始密码子的DNA片段增幅。将该DNA片段与XbaI与PstI消化并与将pBSII-CtAT1-19用SpeI与PstI消化所得到的DNA片段连接，从而得到pBSII-ADHNF-CtAT1-
19。连接将该质粒用NotI与XhoI消化所得到的约1.6kb的DNA片段与将用EcoRI消化后进行自身连接而环状化的edpCR2.1用NotI与XhoI消化所得到的质粒片段，从而得到pCR-ADHNF-CtAT1-19。而且，连接将pBSII-ADHNF-CtAT1-19用EcoICRI与SalI消化所得到的约1.6kb的DNA片段与用SmaI与SalI消化的pMCE5质粒的DNA片段，从而得到pMCE5-ADH-CtAT1。
[0092] 连接将pBI121-CtBGT+AGS用SwaI与AscI消化所得到的双元载体的DNA片段与将pMCE5-ADH-CtAT1用AscI与PmeI消化所得到的表达盒(AscI-CmF3Hp1k：NtADH-5′UTR：Ct3′AT：nost-PmeI)的DNA片段，从而得到通过菊花F3H启动子1k与农杆菌nos终止子的控制使蝶豆A3′5′GT、蝶豆AGS及蝶豆3′AT共表达的双元载体pB250。
[0093] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB250的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将在深红色系中的中轮菊的菊花系统“94-765”(测试由日本精兴园有限公司提供的繁育品系)转化，从而得到
11个系统的转化体。其中，通过与参考例1相同的分析方法确认了9个系统的舌状花瓣中具有原本的花色苷色素、认为矢车菊素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷及矢车菊素3-(3″，6″-二丙二酰)葡萄糖苷分别与1个葡萄糖基结合的2个主要色素，通过来自蝶豆的AGS及来自蝶豆的A3′AT的基因产物的作用，无法得到使经芳香族酰基进行修饰的矢车菊素糖苷在花瓣中累积的系统。而且，无法得到与原本的94-765有大的花色变化的系统，任一个均显示红色-紫色组的花色(表28)。通过用菊花F3H启动子使蝶豆的A3′5′GT基因、酰基葡萄糖合成酶基因及A3′AT基因表达的方法无法得到蓝色菊花(图6)。
表28
[表28]
*：+：检测，trace：微量，-非检测，9.4tR：矢车菊素3-(3.6-二丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷，7.2tR：矢车菊素3-(3-丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷
**；平均值(n＝14)
NA：无法分析、测定
11个系统的转化体。其中，通过与参考例1相同的分析方法确认了9个系统的舌状花瓣中具有原本的花色苷色素、认为矢车菊素3-(6″-丙二酰)葡萄糖苷及矢车菊素3-(3″，6″-二丙二酰)葡萄糖苷分别与1个葡萄糖基结合的2个主要色素，通过来自蝶豆的AGS及来自蝶豆的A3′AT的基因产物的作用，无法得到使经芳香族酰基进行修饰的矢车菊素糖苷在花瓣中累积的系统。而且，无法得到与原本的94-765有大的花色变化的系统，任一个均显示红色-紫色组的花色(表28)。通过用菊花F3H启动子使蝶豆的A3′5′GT基因、酰基葡萄糖合成酶基因及A3′AT基因表达的方法无法得到蓝色菊花(图6)。
表28
[表28]
*：+：检测，trace：微量，-非检测，9.4tR：矢车菊素3-(3.6-二丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷，7.2tR：矢车菊素3-(3-丙二酰)葡萄糖苷-3′-葡萄糖苷
**；平均值(n＝14)
NA：无法分析、测定
[0094] [参考例4：pB420向菊花品种“大平”的导入(在菊花F3H启动子1k与农杆菌nos终止子的控制下使来自风铃草的F3′5′H基因与来自蝶豆的AGS基因共表达)][1]载体的构建
连接将在参考例3中得到的pBSII-ADH-CtAGS用XhoI消化后进行平滑末端处理，其后用XbaI消化所得到的DNA片段与将pMCE5-2(FASS-CmF3Hp-AtHSPt)用NheI与EcoICRI消化所得到的载体的片段，从而得到pMCE5-2 ADHNF-CtAGS。连接将该质粒用Fse与PmeI消化所得到的表达盒与用FseI与SwaI消化所得到的pB315(pBCam2)的双元载体片段，从而得到pB420(pBCam2+CtAGS)。
连接将在参考例3中得到的pBSII-ADH-CtAGS用XhoI消化后进行平滑末端处理，其后用XbaI消化所得到的DNA片段与将pMCE5-2(FASS-CmF3Hp-AtHSPt)用NheI与EcoICRI消化所得到的载体的片段，从而得到pMCE5-2 ADHNF-CtAGS。连接将该质粒用Fse与PmeI消化所得到的表达盒与用FseI与SwaI消化所得到的pB315(pBCam2)的双元载体片段，从而得到pB420(pBCam2+CtAGS)。
[0095] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB420的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将粉色系中的中轮菊的菊花品种“大平”(通过花卉研究所测试通过无菌培养的遗传资源)转化，从而得到40个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果发现17个系统的花色向蓝色方向变化。然而，在蓝色最强的系统中也为色相角317度且显示RHS标准比色卡的紫色-紫罗兰色组的花色，与仅使F3′5′H基因表达的情况为相同程度(表29)。在使F3′5′H基因与来自蝶豆的酰基葡萄糖合成酶基因(CtAGS)共表达的导入基因构建物中，无法得到色相角230°～290°且/或显示紫罗兰色-蓝色组/蓝色组花色的蓝色菊花。
表29
[表29]
NA：无法分析、测定
*平均值(n＝23)
表29
[表29]
NA：无法分析、测定
*平均值(n＝23)
[0096] [参考例5：pB430向菊花品种“大平”的导入(在菊花F3H启动子1k及农杆菌nos终止子的控制下使来自风铃草的F3′5′H基因、来自蝶豆的AGS基因及来自荷兰鸢尾的DFR基因共表达)][1]载体的构建
连接将pMCE5-2-ADHNF-DbDFR用FseI与PmeI消化所得到的表达盒与用FseI与SwaI消化所得到的pB420(pBCam2+CtAGS)的双元载体片段，从而得到pB430(pBCam2+CtAGS+IhDFR)。
连接将pMCE5-2-ADHNF-DbDFR用FseI与PmeI消化所得到的表达盒与用FseI与SwaI消化所得到的pB420(pBCam2+CtAGS)的双元载体片段，从而得到pB430(pBCam2+CtAGS+IhDFR)。
[0097] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB430的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将粉色系中的中轮菊的菊花品种“大平”(通过花卉研究所测试通过无菌培养的遗传资源)转化，从而得到54个系统的转化体。通过色彩分光计(CD100，横河仪器)与RHS标准比色卡进行测色，结果发现33个系统(63％)的花色向蓝色方向变化。然而，蓝色最强的系统的色相角为315度，即使通过RHSCC测色也仅得到紫罗兰色组或紫色-紫罗兰色组的系统，与仅使F3′5′H基因表达时的花色变化没有区别(表30)。在使F3′5′H基因与来自蝶豆的酰基葡萄糖合成酶基因(CtAGS)及来自荷兰鸢尾的DFR基因共表达的导入基因构建物中，无法得到色相角230°～290°且/或显示紫罗兰色-蓝色组/蓝色组花色的蓝色菊花。
表30
[表30]
NA：无法分析、测定
*平均值(n＝23)
表30
[表30]
NA：无法分析、测定
*平均值(n＝23)
[0098] [参考例6：pB249向菊花品种“大平”的导入(在菊花F3H启动子1k及农杆菌nos终止子的控制下使来自蝶豆的A3′5′GT基因表达)][1]载体的构建
按照参考例2得到pB249(pBI121 CmF3Hp1k：ADHNF-蝶豆A3′5′GT：NOSt)。
按照参考例2得到pB249(pBI121 CmF3Hp1k：ADHNF-蝶豆A3′5′GT：NOSt)。
[0099] [2]转化体的获得及其花色的测定使用导入了pB249的农杆菌EHA105(由Dr.Elizabeth E.Hood出售)，将粉色系中的中轮菊的菊花品种“大平”转化，从而得到26个系统的转化体。无法得到与原本的“大平”有大的花色变化的系统，即使在发现了花色稍有变化的系统中也显示紫色组75的花色(表31)。与参考例2的“94-765”的情况相同，仅通过F3H启动子1k(长度约1kb)使蝶豆的A3′5′GT基因表达无法得到蓝色菊花。
表31
[表31]
NA：无法分析、测定
表31
[表31]
NA：无法分析、测定
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
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| 天麻种子的低温处理方法 | 2020-05-19 | 62 |
| 苹果苗木繁育的方法及其应用 | 2020-05-20 | 144 |
| 一种退化湖泊稳定性水生植被恢复的方法 | 2020-05-15 | 273 |
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| 一种繁殖扁秆藨草营养球茎的方法 | 2020-05-11 | 265 |
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