技术领域
[0001] 本
发明涉及一种以富含氨基酸废水为基料的双菌发酵制备生物色素的方法，属于
微生物发酵领域。
背景技术
[0002] 大幅度提高生物色素、生物香料等食品与
饲料添加剂的规模化生产和应用水平，是目前发展的需要。近年来，世界各国相继制定法规，淘汰大部分有毒的化学合成色素，那些具有着色功能、营养和保健功效、并能赋予食品新功能的天然色素将具有广阔的市场前景。世界上天然色素年交易额在13亿美元，年需求量约为1.5万吨左右，并且以每年11％的速度递增。当前，天然色素的大部分品种来自于
植物提取，但因原料综合利用率低、成本高、技术水平低、资源浪费严重等问题，其发展受限制。微生物发酵生产生物色素的工艺，具有原料简单易得、发酵周期短、设备利用率高、加工成本低、易于规模化、环保安全等优点。因此，采用微生物发酵生产生物色素的工艺是21世纪色素技术的主流。
[0003] 在影响生物色素合成的主要因素中，菌种和培养条件最为关键。优良的菌种决定了目标产物的
基础产量和特殊的结构。培养条件的优化可以使得目标产物的量得到提升。所以提高生物色素的产量，一般的策略是筛选好菌种，或者是优化培养条件。当菌种
选定之后，培养条件优化就显得格外重要，也是控制成本、优化提纯的重要过程。培养条件的优化中，培养基优化是首要任务，其中
碳源和氮源是决定生物色素产量的关键因素，占据了物料成本80％以上。因此，选择廉价的高效原料是降低成本重要途径。另一方面，在工农业生产过程中会产生大量的废水，这些废水如何处理也是当前亟待解决的问题。如
味精的生产过程，每生产 1吨味精需排放15吨左右的废水，这些废液中各种氨基酸4.0-6.0％，属于典型的很难处理的高浓度有机废水，严重影响了自然环境。如何合理化利用是当前需要解决的问题。
[0004] 黑木
耳(Auricularia auricula)是一种常见的传统药食兼用
真菌，具有补血、抗
辐射、提高免疫
力等保健功能。黑木耳的主要活性成分有黑色素、木耳多糖等。黑色素是由多酚和吲哚等化合物
氧化聚合而成，呈红、黑或红棕等
颜色，具有抗氧化、抗病毒、抗衰老和增强人体免疫力等保健功能，是极具发展潜力的天然
功能性食品着色剂。以黑木耳菌为出发菌株生产黑色素已有报道，如CN102766658A公开了一种发酵法制备黑木耳黑色素的生产工艺及其产品，该
专利以麦麸汁为主要成分，添加干酪素、
硫酸铜、
磷酸二氢
钾等组成发酵培养基，接种黑木耳菌丝体，经液体深层发酵，分离纯化和
冷冻干燥制得黑木耳黑色素，产量为900～ 1100mg/L。该工艺存在成本高、产量低的问题。CN106916861A公开了一种同时生产木耳多糖和黑色素的方法，具体步骤为：1)菌种活化；2)摇瓶
种子培养；3)发酵培养；4)分离纯化木耳黑色素；5)分离纯化木耳多糖。该工艺黑木耳菌可同时产生木耳黑色素和木耳多糖，直接从发酵液中提取黑色素和木耳多糖。该工艺仍然存在发酵成本高、产量低等问题。
发明内容
[0005] 本发明克服了上述
现有技术的不足，提供了一种以富含氨基酸废水为基料的双菌发酵制备生物色素的方法。本发明利用富含氨基酸废水制备发酵培养基，继而利用双菌种耦合发酵生产色素，将富含氨基酸废水的处理、废水资源化应用高效结合，降低生产生物色素的成本。生产的生物色素，具有产量高，环保，生态可接受强等特点，对蛋白有很好的
染色效果。生产过程中无三废，经济效益高。
[0006] 本发明的技术方案是：一种以富含氨基酸废水为基料的双菌发酵制备生物色素的方法，其特征是，以粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)和黑木耳(Auricularia auricula)为发酵菌种，以富含氨基酸废水配制发酵培养基，于25～32℃振荡发酵培养，所得发酵液经提取、浓缩得到生物色素。
[0007] 所述发酵培养基如下(g/L)：玉米糖浆1-30、麸皮等带有
纤维素的
生物质1-4、维生素B 1-5、维生素C 1-5、KH2PO4 1-5、NaNO3 0.1-1、
酵母粉1-3、蛋白胨2-7、可溶性
淀粉2-8、CaCO3 1-8、 (NH4)2SO4 1-4、MgSO4 0-2、K2HPO4 0.1-2、CuSO4 0.001-0.01、FeSO40-0.1，余量为富含氨基酸的废水，pH调至7.5-8.5。
[0008] 所述富含氨基酸的废水，包括味精生产过程形成的废水、奶制品工厂生产过程形成的废水、阿胶制备过程形成的废水以及屠宰场废水等，这些废水经过过滤处理去除固体杂质，经过浓缩或掺水稀释，
蛋白质和氨基酸总含量控制到1±0.5％。
[0009] 本发明的技术方案具有包括以下步骤：
[0010] (1)一级种子液：分别将粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)和黑木耳(Auricularia auricula) 接种于种子培养基中25-32℃培养，作为一级种子液；
[0011] 种子培养基制备：以富含氨基酸的废水为基料，每取200毫升，加入
葡萄糖5-15g、蛋白胨2-12g、CaCl2 0.05-0.2g、维生素B 0-0.1g、维生素C 0-0.1g，pH 7.0-8.0。在115℃高温、高压下灭菌30mim，冷却备用。
[0012] (2)二级种子液：分别将一级种子液与种子培养基按体积比10-20:100进行扩大培养，作为用于大规模培养的二级种子液；
[0013] (3)发酵培养：将粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的二级种子液按照10-20:100的体积比接种于发酵培养基中；在29-31℃恒温、100-150rpm转速，振荡发酵培养3-5天；然后调节至25-27℃恒温，150-200rpm转速下，振荡发酵培养3-5天；按照发酵液体积的5-15％，补充已灭菌的发酵培养基；接着接种黑木耳(Auricularia auricula)的二级种子液(按体积比 10-15％的接种量)，在25-27℃恒温、100-150rpm转速，振荡发酵培养3-5天；然后调节至 27-29℃恒温，150-200rpm转速下，振荡发酵培养3-5天；
[0014] (4)将步骤(3)所得到的发酵液经色素提纯和浓缩，具体为：发酵液经过滤除菌后用 HCl调节pH＝1-3，过夜收集沉淀；用0.1mol/L NaOH的
乙醇溶液重溶后取上清；再用HCl 调节到pH＝1-3，沉降后取沉淀；然后经过水清洗和无水乙醇清洗后，得到纯品。
[0015] 本发明利用富含氨基酸的废水来合成生物色素。发酵过程涉及到粗糙脉孢菌作为起始接种菌，利用其几个方面功能来提高黑木耳合成色素的量：1.生物色素的合成一般通过甲羟戊酸路径，粗糙脉孢菌具有完整且高效的表达强度，可以为黑木耳合成生物色素提供大量的前体物质；2.粗糙脉孢菌可以分泌
纤维素酶和漆酶，这使得发酵的生物质可以得到扩展，有利于快速黑木耳生成生物色素。
[0016] 相比现有技术，本发明的优势在于：
[0017] 1双菌发酵
[0018] 本发明采用双菌种耦合发酵生产色素，粗糙脉孢菌为起始接种菌之一，为黑木耳合成生物色素提供大量的前体物质，并通过分泌纤维素酶和漆酶加快黑木耳生成生物色素，发酵合成得到的黑色生物色素产量得到大幅度提高，同时对蛋白有很好的染色效果，可以用于日化行业，如
染发剂等。
[0019] 2、富含氨基酸废水的处理
[0020] 在生物色素的合成中，氨基酸是碳源和氮源，也是色素的特征生物质。选择富含氨基酸的废水作为微生物发酵的原料生产生物色素，通过微生物的作用处理了味精行业、
牛奶、其他食品等行业所产生的富含氨基酸废水，并充分利用了废水中的氨基酸、纤维素等生物质中可循环利用的有利资源，提供了一条经济效益和社会效益俱好的治理有机废水方式的同时，还可以得到附加值高的
生物材料。利用高浓度有机废水生产生物色素的工艺路线，一方面能够有效降低了天然色素生产的成本，另一方面实现废水的资源化利用，有效降低了废
水处理经费，提高工厂经济效益，实现了可持续环保发展。
[0021] 3、安全环保
[0022] 本发明利用富含氨基酸废水制备发酵培养基，继而利用双菌种耦合，所合成的生物色素具有安全环保、生态接受性强、无污染等特点。减少化学合成色素对环境的污染和对人身体健康的伤害。
[0023] 综上，本发明利用富含氨基酸废水制备发酵培养基，继而利用双菌种耦合发酵生产色素，将富含氨基酸废水的处理、废水资源化应用高效结合，降低生产生物色素的成本。生产的生物色素，具有产量高，环保，生态可接受强等特点，对蛋白有很好的染色效果。生产过程中无三废，经济效益高。
附图说明
[0024] 图1为粗糙脉孢菌(左)和黑木耳(右)在PDA培养基上的菌落形态图；
[0025] 图2为粗糙脉孢菌(左)和黑木耳(右)在500ml摇瓶(200ml培养基)培养后一级种子液图；
[0026] 图3为粗糙脉孢菌(左)和黑木耳(右)在500ml摇瓶(200ml培养基)培养后二级种子液；
[0027] 图4为在1000ml摇瓶中发酵后发酵液状态图；
[0028] 图5为在20L
发酵罐中发酵后发酵液状态图；
[0029] 图6为在200L发酵罐中发酵后发酵液状态图；
[0030] 图7为生物色素蛋白染色效果(右边为未染色的
脱脂牛奶，左边为染色后脱脂牛奶)。
具体实施方式
[0032] (1)种子培养基制备
[0033] 从斜面保存管中将粗糙脉孢菌(Neurospora crassa ATCC10815)和黑木耳(Auricularia auricula)分别接种于PDA平板在28℃下培养10天，菌落形态如图(图1)。在10天的培养过程中，配制种子培养基；
[0034] 种子培养基：牛奶厂废水(过滤去除杂质后，主要成分氨基酸和蛋白总含量0.6％，油脂 0.02％)200毫升，加入葡萄糖6g、蛋白胨4g、CaCl2 0.07g、维生素B 0.1g、维生素C 0.1g、调节pH 7.0-8.0。培养基在115℃高温、高压下灭菌30mim。
[0035] (2)一级种子液的制备
[0036] 在PDA平板上各挑取0.5mm×0.5mm菌
块8块，分别接种于200mL的种子培养基中，26℃， 150rpm摇瓶培养3天，作为一级种子液(图2)。
[0037] (3)二级种子液的制备
[0038] 然后将一级种子液，按照15:100的体积比加入到200ml新鲜的灭菌后的种子培养基中， 26℃，150rpm摇瓶培养6天，作为二级种子液，种子培养后发酵液如图所示(图3)。
[0039] (4)发酵培养
[0040] 发酵培养基1000毫升(g/L)：玉米糖浆16、麸皮4、维生素B 3、维生素C 3、KH2PO4 4、 NaNO3 0.5、酵母粉1.2、蛋白胨2.5、可溶性淀粉4.7、CaCO3 2.6、(NH4)2SO4 3.4、MgSO4 1.2、 K2HPO4 0.3、CuSO4 0.004、FeSO4 0.03，余量为富含氨基酸的废水(同种子培养基)，pH调至 7.5-8.5，在115℃下灭菌。
[0041] 将粗糙脉孢菌(Neurospora crassa ATCC10815)的二级种子液按照15:100的体积比接种在上述发酵培养基中，在30℃恒温、140rpm转速，振荡发酵培养4天；然后调节至26℃恒温， 180rpm转速下，振荡发酵培养4天；按照发酵液体积的10％，补充已灭菌的发酵培养基进行补料；接着按照体积比10％的接种量将黑木耳(Auricularia auricula)的二级种子液转接进去，在26℃恒温、150rpm转速，振荡发酵培养4天；最后调节至28℃恒温，200rpm转速下，振荡发酵培养4天(图4)。
[0042] 以不加粗糙脉孢菌(Neurospora crassa ATCC10815)二级种子液的发酵为对照。
[0043] (5)提纯、浓缩
[0044] 经过上述条件下培养，得到的发酵液经过滤除菌后用HCl调节pH＝2，过夜沉降；在5000 rpm离心10min收集沉淀；用0.1mol/L NaOH的乙醇溶液重溶后5000rpm离心10min取上清；再用HCl调节到pH＝2，沉降后5000rpm离心10min取沉淀；沉淀中加入水振荡均匀后离心取沉淀，最后在无水乙醇振荡均匀后离心取沉淀，得到粉末，称量得黑色素产量为1.07g/L。
不加入粗糙脉孢菌(Neurospora crassa ATCC10815)发酵样品的黑色素产量为0.19g/L。
[0045] 实施例2：
[0046] (1)种子培养基制备
[0047] 从斜面保存管中将粗糙脉孢菌(Neurospora crassa ATCC10815)和黑木耳(Auricularia auricula)分别接种于PDA平板在28℃下培养10天。在10天的培养过程中，配制种子培养基；
[0048] 种子培养基：富含氨基酸的废水牛奶厂废水(过滤去除杂质后，主要成分氨基酸和蛋白总含量0.6％，油脂0.02％)2000毫升，加入葡萄糖60g、蛋白胨30g、CaCl2 0.6g、维生素B 0.5 g、维生素C 0.5g，调节pH 7.0-8.0。培养基在在115℃高温、高压下灭菌30mim。
[0049] (2)一级种子液的制备
[0050] 在PDA平板上各挑取0.5mm×0.5mm菌块20块，分别接种于2000mL的种子培养基中， 26℃，150rpm培养4天，作为一级种子液。
[0051] (3)二级种子液的制备
[0052] 然后将一级种子液，分别按照15:100的体积比加入到20L的发酵罐中，每个发酵罐装有新鲜的灭菌后的种子培养基约12L，在26℃，150rpm搅拌速度下，通入除菌后的空气(速率是0.4vvm)培养6天，作为二级种子液(图5)。
[0053] (4)发酵培养
[0054] 在200L的不锈
钢发酵罐中配制发酵培养基100升(g/L)：玉米糖浆24、秸秆3、维生素 B 3、维生素C 3、KH2PO4 4、NaNO30.5、酵母粉2、蛋白胨3、可溶性淀粉4、CaCO3 5、(NH4)2SO4 3、MgSO4 1、K2HPO4 0.1、CuSO4 0.01、FeSO4 0.01，余量为富含氨基酸的废水(同种子培养级)，pH调制7.5-8.5。
[0055] 将粗糙脉孢菌(Neurospora crassa ATCC10815)的二级种子液全部接种在上述200L的发酵罐中(图6)，每个发酵罐装有新鲜的灭菌后的发酵培养基约100L，在30℃恒温、
140rpm转速搅拌，通气(气速率是0.4vvm)发酵4天；然后调节至26℃恒温，180rpm转速下搅拌，通气(气速率是0.3vvm)培养4天；按照发酵液体积的10％，补充已灭菌的发酵培养基进行补料；同时将黑木耳(Auricularia auricula)的二级种子液全部转接进去，在26℃恒温、
150rpm转速，搅拌通气(气速率是0.3vvm)发酵4天；最后调节至28℃恒温，200rpm转速下，搅拌发酵4 天。
[0056] 以不加粗糙脉孢菌(Neurospora crassa ATCC10815)二级种子液的发酵为对照。
[0057] (5)提纯、浓缩
[0058] 经过上述条件下发酵罐的发酵得到的发酵液，在施加0.4MPa压力下通过3μm孔径的过滤袋得到除菌后清澈发酵液，导入储存罐中在搅拌的条件下用HCl调节pH＝2后，快速
泵入到下一步过滤袋(1μm孔径)中，过夜收集沉淀。除去过滤液后，用少量的0.1mol/L NaOH的乙醇溶液反复冲洗过滤袋，重溶过滤袋上的沉淀，得到干净的、浓缩的重溶滤液。将重溶滤液再用HCl调节到pH＝2，过滤收集沉淀，沉淀经过纯水清洗和无水乙醇清洗后过滤收集沉淀，得到粉末，称量得黑色素产量为3.24g/L。不加入粗糙脉孢菌(Neurospora crassa ATCC10815) 发酵样品的黑色素产量为0.31g/L。
[0059] 试验例：
[0060] 取0.1g生物色素，用5毫升的NaOH-尿素的水溶液(总浓度1％，NaOH和尿素的
质量比为1:3)溶解，待用。配制10％的脱脂奶粉溶液10毫升，将5毫升色素溶液倒入10毫升的牛奶中，不添加其他的化学药剂，常温静置1小时，观察染色情况，如图7所示，可见脱脂牛奶蛋白非常容易被本发明的生物色素染色。
