一株可产高活力褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌及其应用
专利汇可以提供一株可产高活力褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一株可产高活 力 褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌及其应用，该芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.16120，利用该芽孢杆菌制备褐藻寡糖的方法包括以下步骤：1、活化、驯化培养菌株；2、获取 种子 菌株；3、制备种子液；4、获取褐藻胶裂解酶粗酶液；5、获取初解溶液：将褐藻胶裂解酶粗酶液以1:100的体积比加入到海藻浆中，40℃ 水 浴中酶解至少24h，然后升温至120℃，灭活1h；6、获取褐藻寡糖：将初解溶液依次进行 膜过滤 、浓缩、 冷冻干燥 。本发明筛选得到的芽孢杆菌可产高活力褐藻胶裂解酶，对底物海藻浆的转化率高，在制备褐藻寡糖时，不仅提高了生产效率，还降低了生产成本。，下面是一株可产高活力褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌及其应用专利的具体信息内容。
1.一株可产高活力褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌（Bacillus sp.），其特征在于，该芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年07月17日，保藏编号为CGMCC No.16120。
2.利用权利要求1所述的芽孢杆菌制备褐藻寡糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将权利要求1所述的芽孢杆菌先在分离纯化培养基上进行活化，然后在液体发酵培养基中进行驯化培养；
步骤2：在对数生长期时对菌株进行稀释分离，然后涂布到分离纯化培养基的表面，之后挑取种子菌株；
步骤3：将挑取出来的种子菌株接数环于液体发酵培养基中，培养得到种子液；
步骤4：按2%的接种量将上述种子液接入到液体发酵培养基中，震荡培养，得到褐藻胶裂解酶粗酶液；
步骤5：将褐藻胶裂解酶粗酶液以1:100的体积比加入到海藻悬液中，40℃水浴中酶解至少24h，然后升温至120℃，灭活1h，得初解溶液；
步骤6：将初解溶液依次进行膜过滤、浓缩、冷冻干燥，制得褐藻寡糖。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤1中，所述分离纯化培养基的配方为：
蛋白胨5g/L、酵母浸粉10g/L、琼脂20g/L，调pH 值至7.3±0.1。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤1中，所述液体发酵培养基的配方为：
海藻酸钠2-10g/L、硫酸铵2-6g/L、硫酸镁 0.5-2g/L、磷酸氢二钾1-4g/L、硫酸亚铁
0.01-0.05g/L，调pH 值至7.3±0.1。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述液体发酵培养基的配方为：
海藻酸钠10g/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸亚铁0.03g/L，调pH 值至7.3±0.1。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤3中，培养温度为30℃，培养时间为
24h。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤4中，培养温度为30℃，摇床的转速为220r/min，培养时间为24h。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤5中，海藻悬液是由40目大小的铜藻粉末和水以1g:20ml的比例混合而成的。
一株可产高活力褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌及其应用
技术领域
背景技术
发明内容
一株可产高活力褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌（Bacillus sp.），其特征在于，该芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年07月17日，保藏编号为CGMCC No.16120。
步骤2：在对数生长期时对菌株进行稀释分离，然后涂布到分离纯化培养基的表面，之后挑取种子菌株；
步骤3：将挑取出来的种子菌株接数环于液体发酵培养基中，培养得到种子液；
步骤4：按2%的接种量将上述种子液接入到液体发酵培养基中，震荡培养，得到褐藻胶裂解酶粗酶液；
步骤5：将褐藻胶裂解酶粗酶液以1:100的体积比加入到海藻悬液中，40℃水浴中酶解至少24h，然后升温至120℃，灭活1h，得初解溶液；
步骤6：将初解溶液依次进行膜过滤、浓缩、冷冻干燥，制得褐藻寡糖。
0.01-0.05g/L，调pH 值至7.3±0.1。
（2）利用保藏编号为CGMCC No.16120的芽孢杆菌制备褐藻寡糖时，由于该芽孢杆菌可产高活力褐藻胶裂解酶，所以生产成本低、生产效率高。
附图说明
图3是最终褐藻寡糖的TLC检测结果。
具体实施方式
2017年03月13日，从烟台獐子岛海边养殖场取得腐烂海带样品，通过初筛和复筛，筛选分离得到了一株出发菌株，初筛和复筛的详细过程如下：
（1）褐藻胶裂解酶产生菌株的初筛
使用研钵将采摘回来的腐烂海带样品研碎，制成样品液。取5只15mL试管，编号1至5，分别加入4.5mL无菌水，1号试管中加入0.5mL样品液，充分混合后用1000μL移液枪吸取0.5mL稀释液移入下一支试管，依次进行梯度稀释，将样品稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五个梯度。选取各样品10-3、 10-4、10-5三个浓度梯度，用200μL移液枪吸取100μL，涂布于Alg平板培养基上，30℃下恒温培养48 h，待平板上长出菌落后，依据单菌落周围形成透明圈的大小，判断菌株降解海藻酸钠能力的强弱，选取降解海藻酸钠能力强的菌株进行复筛。
分离纯化培养基的配方：蛋白胨5 g/L、酵母浸粉10g/L、琼脂20g/L，调pH 值至7.3±
0.1。
在300mL三角瓶中装入100 mL 液体发酵培养基，每一实验组均按2%（体积分数）的接种量将种子液接入到液体发酵培养基中，于30℃、220r/min摇瓶培养36h，将发酵液于4℃、
6000r/min离心10min，得上清液（褐藻胶裂解酶粗酶液）及菌体，取一部分菌体，将这部分菌体用玻璃珠研磨，然后分别测定上清液、细胞完整的菌体、细胞破碎的菌体的酶活力。
上清液酶活力 10.4 EU 10.0 EU 10.5EU
菌体（细胞完整）酶活力 1.9 EU 1.6 EU 1.8 EU
菌体（细胞破碎）酶活力 0.2 EU 0.1 EU 0.1 EU
由上述测定结果可知，驯化后的菌株产生的褐藻胶裂解酶主要存在于发酵液（褐藻胶裂解酶粗酶液）中，这表明该褐藻胶裂解酶属于胞外酶，在菌体内合成，并随着发酵分泌到液体培养介质中。
菌株驯化前，菌落在分离纯化培养基上无透明圈；菌株驯化后，菌落在分离纯化培养基上存在明显的透明圈。
16SrDNA，运用NCBI中的Blast 程序与数据库中的细菌16S rDNA序列进行了相似性比对，比对结果：该菌株为芽孢杆菌（Bacillus sp.）。
0.01-0.05g/L，调pH 值至7.3±0.1。
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