技术领域
[0001] 本
发明属于对虾饲料领域，具体涉及一种免制粒对虾发酵饲料。
背景技术
[0002] 我国对虾养殖业已经形成完整的产业体系，随着工厂化养殖
密度和规模不断扩大，各种
疾病频繁发生，由弧菌属引起的细菌性疾病，给对虾养殖业造成了巨大的经济损失，目前已严重制约了我国乃至全世界对虾养殖的发展。养殖者通常大量使用抗生素药物，虽然短期内取得了成效，但随之导致病原
微生物耐药性增强、微
生物群落多样性下降、药物残留、养殖环境恶化等问题。饲料经过微生物发酵处理，不仅可以提高其营养吸收
水平，降低有毒有害物质含量，达到促进养殖动物生长的目的。此外，原料经过微生物发酵，会产生浓烈的
香味，对养殖动物有诱食作用，促进对虾
摄食。目前对虾发酵饲料发酵工艺主要为在现有的对虾配合饲料中添加芽孢杆菌类、
酵母菌类、曲霉类和乳酸菌类等进行厌
氧发酵(厌氧袋或者塑料
薄膜密封)，此工艺主要存在以下问题：1、芽孢杆菌、酵母菌和曲霉类为好氧菌，如果直接厌氧发酵，这部分好氧菌没有充分发挥菌种本身的作用，饲料原料通过好氧发酵，可产生大量的蛋白酶、肽类和糖类，为后期的厌氧发酵
能量。2、现有的配合颗粒饲料不是无菌料，添加这些菌种直接发酵，可能会带入致病菌或者有害菌增多，发酵料产品
质量得不到保障，饲喂对虾，无论是对养殖动物或养殖水环境都存在潜在的致病
风险。
发明内容
[0003] 本发明的目的是提供一种免制粒对虾发酵饲料。
[0004] 本发明的免制粒对虾发酵饲料，是通过以下方法制备的：
[0005] 将玉米
破碎成玉米碎，将黄豆破碎成黄豆碎；
[0006] 按质量分数计，将玉米碎20％-26％，黄豆碎32-45％，鱼粉15-20％，对虾预混合饲料0.5％-1％，余量为麸皮，加水至水分重量含量为38-40％，混合均匀，再灭菌后得到固体培养基；
[0007] 在固体培养基中接种枯草芽孢杆菌、
酿酒酵母菌、
植物乳杆菌、粪肠球菌，然后放入无菌培养房中28-32℃恒温好氧培养50-80h，好氧发酵结束后，装入厌氧袋中28-32℃恒温厌氧发酵，发酵时间为60-90h，由此获得免制粒对虾发酵饲料。
[0008] 优选，所述的接种枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌、粪肠球菌是接种枯草芽孢杆菌菌液、酿酒酵母菌液、植物乳杆菌菌液、粪肠球菌菌液，所述的枯草芽孢杆菌菌液、9
酿酒酵母菌菌液、植物乳杆菌菌液、粪肠球菌菌液的活菌数都在1.0×10cfu/mL以上。
[0009] 所述的将玉米破碎成玉米碎，将黄豆破碎成黄豆碎，其根据对虾不同生长阶段口径进行破碎，优选为粒径为0.5-0.9mm的颗粒。
[0010] 所述的枯草芽孢杆菌菌液是通过以下方法制备：
[0011] 挑取枯草芽孢杆菌接种到LB培养基中，37℃摇床活化16h；然后将活化好的的菌液按质量比3％接种量接种到一级
种子培养基中，37℃培养24h得到枯草芽孢杆菌菌液，所述的一级种子培养基为：按质量分数计，包括
葡萄糖0.5％，玉米
淀粉1.5％，
豆粕粉2％，酵母粉0.5％，
硫酸镁0.2％，
磷酸氢二
钾0.2％，硫酸锰0.03％，
碳酸
钙0.24％，余量为水，pH7.0±0.2。
[0012] 所述的植物乳杆菌菌液是通过以下方法制备的：
[0013] 将植物乳杆菌接种到MRS培养基中，37℃静置活化24h，然后将活化好的菌液按质量比5％的比例，接种到一级种子培养基中，37℃培养24h，制备得植物乳杆菌菌液，所述的一级种子培养基为：按质量分数计，包括葡萄糖0.5％，糖蜜0.5％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，乙酸钠0.5％，
磷酸氢二钾0.2％，硫酸锰0.05％，余量为水，pH6.8±0.2。
[0014] 所述的粪肠球菌菌液是通过以下方法制备的：
[0015] 将粪肠球菌接种到MRS培养基中，37℃静置活化24h，然后将活化好的菌液按质量比5％的比例，接种到一级种子培养基中，37℃培养24h，制备得粪肠球菌菌液，所述的一级种子培养基为：按质量分数计，包括葡萄糖0.5％，糖蜜0.5％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸锰0.05％，余量为水，pH6.8±0.2。
[0016] 所述的酿酒酵母菌菌液是通过以下方法制备的：
[0017] 挑取酿酒酵母斜面菌种接种到PDA液体培养基中，28℃摇床活化24h，然后将活化好的菌液按质量比2％接种量接种到一级种子培养基中，28℃培养24h得到酿酒酵母菌菌液，所述的一级种子培养基为：按质量分数计，包括葡萄糖2％，
蔗糖2％，大豆蛋白胨3％，酵母粉1％，磷酸氢二钾0.5％，尿素0.5％，余量为水，pH6.0±0.2。
[0018] 针对目前发酵虾料的存在的问题，本发明根据对虾不同生长阶段，首先将各种饲料原料先破碎分级达到适合对虾摄食的粒径后，按对虾营养需求复配原料，通过高温蒸煮冷却，分阶段无菌接种不同类型菌种，通过先好氧再厌氧二次发酵饲料原料，制备免制粒发酵对虾饲料，节约生产成本，提高饲料原料的营养价值，降低植物蛋白源的
抗营养因子，改善对虾肠道和养殖水环境微生物菌群结构，增强对虾
机体免疫
力，提高对虾成活率；同时发酵虾料投入养殖
水体饲喂对虾，可原位调控养殖水环境，降低养殖环境污染。此外，免制粒对虾发酵饲料通过本工艺发酵后，饲料无有害菌或致病菌污染，同时该饲料比常规配合饲料可保质期延长4-6个月。
[0019] 本发明的免制粒对虾发酵饲料的
粗蛋白由30-35％提高至39-42％，生物肽含量约由1％-2％提高至9-12％，pH值由5.9-6.2降低至4.4-4.7，芽孢杆菌总数＞1×109cfu/g，乳酸菌总数＞1×109cfu/g。本发明发酵生产制得的对虾发酵料饲喂对虾，可提高对虾特定生长率和
蛋白质效率，显著提高了对虾成活率，降低饲料系数(P＜0.05)，提高对虾血清
碱性磷酸酶活性，显著提高血清超氧化物歧化酶、溶菌酶活性(P＜0.05)；可降低养殖水体
氨氮和亚
硝酸盐氮浓度。
[0020] 因此，与
现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0021] 1、对虾饲料免制粒，节约生产加工成本；
[0022] 2、通过先好氧再厌氧二次发酵技术，提高饲料营养价值及原料的利用率，改善养殖水环境；
[0023] 3、促进对虾对饲料消化吸收和利用，改善对虾肠道健康，提高对虾免疫力和存活率，减少对虾养殖中抗生素使用。
附图说明：
[0024] 图1是对虾生长率、蛋白质效率、饲料系数、成活率图；
[0025] 图2是对虾免疫指标图(每组第一根柱子为CK，第二根柱子为T)；
[0026] 图3是养殖水体中氨氮浓度图；
[0027] 图4是养殖水体中亚硝酸盐氮浓度图。具体实施方式：
[0028] 以下
实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0029] 以下实施例中使用的枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、植物乳杆菌、粪肠球菌购自广东省微生物菌种保藏中心，其编号分别为GDMCC 1.372、GDMCC 2.167、GDMCC 1.191、GDMCC 1.612。
[0030] 实施例1：
[0031] (1)发酵菌种的制备
[0032] 制备枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、植物乳杆菌、粪肠球菌种子液，其活菌数在1.0×109cfu/mL以上；
[0033] a、枯草芽孢杆菌种子液的制备
[0034] 挑取枯草芽孢杆菌接种到LB培养基中，37℃摇床活化16h；然后将活化好的的菌液按质量比3％接种量接种到一级种子培养基中，37℃摇床培养24h得到枯草芽孢杆菌种子液。所述的一级种子培养基为：按质量分数计，包括葡萄糖0.5％，玉米淀粉1.5％，豆粕粉2％，酵母粉0.5％，
硫酸镁0.2％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸锰，0.03％，碳酸钙0.24％，余量为水，pH7.0±0.2，其配制方法是将上述各成分混合均匀，调pH值，然后121℃高温灭菌30min制得。
[0035] b、植物乳杆菌、粪肠球菌种子液的制备：将植物乳杆菌、粪肠球菌分别接种到MRS培养基中，37℃静置活化24h，然后将活化好的菌液按质量比5％的比例，接种到一级种子培养基中，37℃静止培养24h制得植物乳杆菌、粪肠球菌种子液。所述的一级种子培养基为：按质量分数计，包括葡萄糖0.5％，糖蜜0.5％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸锰0.05％，余量为水，pH6.8±0.2。其配制方法是将上述各成分混合均匀，调pH值，然后121℃高温灭菌30min制得。
[0036] c、酿酒酵母种子液的制备
[0037] 挑取酿酒酵母斜面菌种接种到PDA液体培养基中，28℃摇床活化24h；然后将活化好的菌液按质量比2％接种量接种到一级种子培养基中，28℃摇床培养24h得到酿酒酵母种子液。所述的一级种子培养基为：按质量分数计，包括葡萄糖2％，蔗糖2％，大豆蛋白胨3％，酵母粉1％，磷酸氢二钾0.5％，尿素0.5％，余量为水，pH6.0±0.2。其配制方法是将上述各成分混合均匀，调pH值，然后121℃高温灭菌30min制得。
[0038] 2、发酵饲料原料破碎、分级过筛、混合：分别破碎饲料原料玉米和黄豆，得到玉米碎和黄豆碎，分级过筛得到粒径为0.5-0.9mm的颗粒。然后按如下质量配比称取：玉米碎25％，黄豆碎45％，鱼粉15％，麸皮14％，对虾预混合饲料(成熟商品，广东碧德生物科技有限公司)1％，加水至水分质量含量为38％(即为玉米碎、黄豆碎、鱼粉、麸皮和对虾预混合饲料等总质量的38％)，用混合机混合均匀得到固体培养基。
[0039] 3、蒸煮灭菌固体培养基、风冷
[0040] 将以上配制好的固体培养基121℃高温蒸煮灭菌30min，经过风冷机冷却32℃待用。
[0041] 4、接种发酵
[0042] 将发酵待用的菌种枯草芽孢杆菌种子液、酿酒酵母种子液、植物乳杆菌种子液、粪肠球菌种子液按照体积比例为：1:1:2:2的比例接种到固体培养基中，4个种子液总的接种量是固体培养基湿重的15％，将各菌种的
混合液通过接种机接种到冷却至32℃无菌培养基中，放入无菌培养房中28℃恒温好氧培养50h。好氧发酵结束后，装入厌氧袋中32℃恒温厌氧发酵，发酵时间为60h，得到对虾发酵饲料。
[0043] 5、检测结果
[0044] 分别在接种后0h，好氧发酵50h及厌氧发酵60h测定对虾发酵料常规理
化成分及微生物指标，理化指标的检测方法：酸度/pH(pH计直接测定)、粗蛋白(GB/T 6432凯氏定氮法)、粗脂肪(索氏抽提法)、游离氨基酸(电位滴定法)、生物肽(GB/T 22492-2008)。微生物指标：乳酸菌活菌数(GB 4789.35-2010)、枯草芽孢杆菌活菌数(GB/T 26428-2010)、酿酒酵母活酵母数(GB/T 22547-2008)。
[0045] 表1对虾发酵料发酵前后理化及微生物指标的变化
[0046]
[0047] 结果显示，饲料原料经过二次发酵(先好氧再厌氧)，与发酵前相比饲料粗蛋白、生物活性肽、游离氨基酸提高了分别19.17％、395.90％和133.33％，发酵后有饲料中有益微生物快速增殖。
[0048] 实施例2：
[0049] (1)发酵菌种的制备(同实施例1)
[0050] 制备枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、植物乳杆菌、粪肠球菌种子液，其活菌数在1.0×109cfu/mL以上；
[0051] 2、发酵饲料原料破碎、分级过筛、混合：破碎饲料原料玉米和黄豆，分别得到玉米碎和黄豆碎，分级过筛得到粒径为0.5-0.9mm的颗粒。然后按如下重量配比称取：玉米碎20％，黄豆碎40％，鱼粉20％，麸皮19％，对虾预混合饲料1％，加水至水分质量含量为40％，用混合机混合均匀得到固体培养基。
[0052] 3、蒸煮灭菌固体培养基、风冷
[0053] 将以上配制好的固体培养基121℃高温蒸煮灭菌30min，经过风冷机冷却34℃待用。
[0054] 4、接种发酵
[0055] 将发酵待用的菌种枯草芽孢杆菌种子液、酿酒酵母种子液、植物乳杆菌种子液、粪肠球菌种子液按照体积比例为：1:1:2:2的比例接种到固体培养基中，4个种子液总的接种量是固体培养基湿重的15％，通过接种机接种到冷却至34℃无菌的固体培养基中，放入无菌培养房中30℃恒温好氧培养60h，好氧发酵结束后，装入厌氧袋中32℃恒温厌氧发酵，发酵时间为70h，由此得到对虾发酵饲料。
[0056] 5、检测结果
[0057] 分别在接种后0h，好氧发酵60h及厌氧发酵70h测定对虾发酵料常规理化成分及微生物指标，理化指标的检测方法：酸度/pH(pH计直接测定)、粗蛋白(GB/T 6432凯氏定氮法)、粗脂肪(索氏抽提法)、游离氨基酸(电位滴定法)、生物肽(GB/T 22492-2008)。微生物指标：乳酸菌活菌数(GB 4789.35-2010)、枯草芽孢杆菌活菌数(GB/T 26428-2010)、酿酒酵母活酵母数(GB/T 22547-2008)。
[0058] 表2对虾发酵料发酵前后理化及微生物指标的变化
[0059]
[0060]
[0061] 结果显示，饲料原料经过二次发酵(先好氧再厌氧)，与发酵前相比饲料粗蛋白、生物活性肽、游离氨基酸提高了分别22.09％、345.42％和138.71％，发酵后饲料中有益微生物快速增殖。
[0062] 实施例3：
[0063] 1、发酵菌种的制备(同实施例1)
[0064] 制备枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、植物乳杆菌、粪肠球菌种子液，其活菌数在1.0×109cfu/mL以上。
[0065] 2、发酵饲料原料破碎、分级过筛、混合：破碎饲料原料玉米和黄豆，分别得到玉米碎和黄豆碎，分级过筛得到粒径为0.5-0.9mm的颗粒。然后按如下重量配比称取：玉米碎26％，黄豆碎32％，鱼粉20％，麸皮21.5％，对虾预混合饲料0.5％，加水至水分质量含量为
40％，用混合机混合均匀得到固体培养基。
[0066] 3、蒸煮灭菌固体培养基、风冷
[0067] 将以上配制好的固体培养基121℃高温蒸煮灭菌30min，经过风冷机冷却32℃待用。
[0068] 4、接种发酵
[0069] 将发酵待用的菌种枯草芽孢杆菌种子液、酿酒酵母种子液、植物乳杆菌种子液、粪肠球菌种子液按照体积比例为：1:1:2:2的比例接种到固体培养基中，4个种子液总的接种量是固体培养基湿重的15％，通过接种机接种到冷却至32℃无菌固体培养基中，放入无菌培养房中32℃恒温好氧培养70h。好氧发酵结束后，装入厌氧袋中28℃恒温厌氧发酵，发酵时间为80h，由此得到对虾发酵饲料。
[0070] 5、检测结果
[0071] 分别在接种后0h，好氧发酵70h及厌氧发酵80h测定对虾发酵料常规理化成分及微生物指标，理化指标的检测方法：酸度/pH(pH计直接测定)、粗蛋白(GB/T 6432凯氏定氮法)、粗脂肪(索氏抽提法)、游离氨基酸(电位滴定法)、生物肽(GB/T 22492-2008)。微生物指标：乳酸菌活菌数(GB 4789.35-2010)、枯草芽孢杆菌活菌数(GB/T 26428-2010)、酿酒酵母活酵母数(GB/T 22547-2008)。
[0072] 表3对虾发酵料发酵前后理化及微生物指标的变化
[0073]
[0074] 结果显示，饲料原料经过二次发酵(先好氧再厌氧)，与发酵前相比饲料粗蛋白、生物活性肽、游离氨基酸提高了分别24.37％、394.18％和120.69％，发酵后饲料中有益微生物快速增值。
[0075] 实施例4：
[0076] 将实施例1制得的对虾发酵饲料饲喂规格约1cm虾苗，该试验组记为T，同时以投喂颗粒配合饲料(未发酵，即按质量分数，将玉米碎25％，黄豆碎45％，鱼粉15％，麸皮14％，对虾预混合饲料1％，加水至水分为38％，用混合机混合均匀后再经制粒机制粒得到颗粒配合饲料)为对照组，记为CK，试验设2个处理组，每个处理组设3个重复，每个重复放苗300尾/㎡，试验养殖8周，试验水源为南沙十七涌河水，经过滤、消毒后使用，其
盐度为2‰，试验池为铺膜池，底面积为5㎡，水深1m。池顶设置
遮阳网布防止暴晒。池中设置微孔增氧管15米平均分散在池底，配2台0.75kw增氧鼓风机，轮流不间断充氧。试验结束后，测定对虾生长、饲料利用、成活率及免疫指标，结果如图1和图2所示，本发明的对虾发酵饲料可提高对虾特定生长率和蛋白质效率，显著提高了对虾成活率，降低饲料系数(P＜0.05)，提高对虾血清碱性磷酸酶活性，显著提高血清超氧化物歧化酶、溶菌酶活性(P＜0.05)。
[0077] 实施例5：
[0078] 将实施例1制得的对虾发酵饲料饲喂规格约1cm虾苗，该试验组记为T，同时以投喂颗粒配合饲料(未发酵，同实施例4)为对照组，记为CK(图3和4中的C)，试验设2个处理组，每个处理组设3个重复，每个重复放苗300尾/㎡，试验养殖8周，试验水源为南沙十七涌河水，经过滤、消毒后使用，其盐度为2‰，试验池为铺膜池，底面积为5㎡，水深1m。池顶设置遮阳网布防止暴晒。池中设置微孔增氧管15米平均分散在池底，配2台0.75kw增氧鼓风机，轮流不间断充氧。试验期间每周监测养殖水体理化指标氨氮和亚硝酸盐(氨氮、亚硝酸盐是养殖水体主要污染物，过高的浓度会导致水体恶化，严重危害养殖动物生理健康和生长速度)的浓度变化，结果如下图3和图4所示。结果显示投喂对虾发酵饲料组，养殖水体中氨氮和亚硝酸盐氮浓度呈下降趋势。
[0079] 实施例6：
[0080] 将实施例1制得的对虾发酵饲料(水分37.89％)和颗粒配合饲料(未发酵，即按质量分数，将玉米碎25％，黄豆碎45％，鱼粉15％，麸皮14％，对虾预混合饲料1％，加水至水分为38％，用混合机混合均匀再经制粒机制粒得到颗粒配合饲料，水分11.12％)在常温下保存，分别记为试验组和对照组，试验设2个处理组，每个处理组设3个重复，存放在室温条件下，分别在1月、2月、3月、6月、9月、12月进行感官检验。未发酵的颗粒配合饲料在保存期6月进行感官检验时，已出现结
块现象并伴有哈味，显示该饲料已变质，而发酵后的对虾饲料有浓郁的发酵酱香味，饲料松散性好。存放12月后，对虾发酵饲料型松散性好，有浓郁的发酵酱香味，未出现霉变的情况，常规营养理化指标检测结果：水分26.27％，脂肪8.20％，粗蛋白质38.36％，酸溶蛋白10.33，生物活性肽9.6％；微生物指标检测：枯草芽孢杆菌活菌数2.2×108cfu/g，乳酸菌活菌数1.3×107cfu/g。
[0081] 实施例7：
[0082] 试验设两个处理组，处理组1为发酵工艺不经过好氧发酵，直接一次厌氧发酵，其他发酵条件和接种量同实施例1，制得对虾发酵饲料组，记试验组Ⅰ；处理组2为实施例1制得的对虾发酵饲料，记试验组Ⅱ。检测结果如下表4：
[0083] 表4
[0084]
[0085] 表4中的发酵前指的是未发酵的固体培养基
[0086] 结果显示：发酵结束后，试验组Ⅱ粗蛋白、酸溶蛋白和生物活性肽含量分别比试验组Ⅰ提高了6.81％、54.39％和68.58％，结果表明，本发明先好氧再厌氧二次发酵工艺可有效提供了饲料的营养价值。
[0087] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以
权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
