一种用于提高家畜肌肉中脂肪含量的富含雌马酚的生物饲料
添加剂的制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 肌肉中脂肪含量，包括肌间脂肪和肌内脂肪，对肌肉的营养特性、状态(嫩度、多汁性等)、
风味、口感和加工特性影响很大，是畜禽肉品质的重要指标。富含肌间脂肪和肌内脂肪的家畜
酮体具有更高的市场价格，因此如何提高肌肉中脂肪含量是动物营养领域的重要科技任务之一。常用肉用家畜品种(肉猪、肉
牛和肉用羊)以瘦肉型为主，存在肌肉中脂肪含量低和肉品质风味较差的问题。单纯饲喂高脂饲料会导致脂肪在皮下、肝脏和腹部沉积，对肌肉中脂肪含量提高不明显，造成成本升高和缺乏经济效益。
[0003] 异黄酮主要来源于豆科
植物如大豆、苜蓿等，已从豆科植物中分离得到800多种异黄酮。异黄酮是植物次生代谢产物，是黄酮类化合物的简单同分异构体，由于其化学结构与雌二醇相似，属于植物雌
激素类。异黄酮已被广泛报道具有各种生理和药理作用，包括抗癌、抗
氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗糖尿病和心脏
预防作用。近期文献表明黄豆
苷元能够促进肌间脂肪沉积。雌马酚是由肠道细菌降解黄豆甙和黄豆苷元形成的一种活性降解产物，一小部分雌马酚也可以由肠道
微生物代谢金雀木黄酮产生。在肠道，黄豆甙首先被肠粘膜上皮刷状缘细胞膜或细菌的β-
葡萄糖苷酶
水解以分离糖苷部分并有效释放具有生物活性的黄豆苷元。黄豆苷元通过中间产物二氢黄豆苷元及进一步经脱氧反应转化为雌马酚。雌马酚的分子结构类似于雌二醇(β-estradiol)，具有雌激素样活性，对人类几乎不存在
副作用，而雌马酚的生物活性要显著高于黄豆苷元等异黄酮前体，且雌马酚比黄豆甙和黄豆苷元更易消化吸收。
[0004] 但由黄豆苷元转化为雌马酚的转化效率仅达到约50％。也有利用化学合成的方法生产雌马酚，但价格较昂贵，在家畜生产中难以广泛应用。
发明内容
[0005] 本发明的目的是为了解决现有黄豆苷元转化为雌马酚的转化效率低以及缺乏提高肌肉中脂肪含量的生物饲料添加剂的问题，提供一种用于提高家畜肌肉中脂肪含量的富含雌马酚的生物饲料添加剂的制备方法。
[0006] 本发明一种用于提高家畜肌肉中脂肪含量的富含雌马酚的生物饲料添加剂的制备方法：一、将
大豆粉和苜蓿草粉按照
质量比(5-9)：3的比例混合制成
发酵培养基干粉，加
溶剂配制成发酵培养基干粉质量百分浓度为15～20％的液体发酵培养基；溶剂为浓度为0.10～0.15mmol/L的丁酸钠水溶液；
[0007] 二、向液体发酵培养基中接种枯草芽孢杆菌，需氧发酵20-26h，然后原位升温至85-90℃灭菌0.3-1h，再接种动物双歧杆菌乳酸亚种和肠膜明串珠菌肠膜亚种，厌氧发酵
24-36h，然后原位升温至85-90℃灭菌0.3-1h，获得富含雌马酚的发酵产物；
[0008] 三、向富含雌马酚的发酵产物中添加软脂酸和油酸，软脂酸和油酸的添加量之和为发酵培养基干粉质量的10-12％，即得到富含雌马酚的生物饲料添加剂。
[0009] 本发明包含以下有益效果：
[0010] 本发明以大豆和苜蓿为混合原料，并添加促进由黄豆苷元转化为雌马酚的营养底物丁酸钠，配制成液体发酵培养基，通过枯草芽孢杆菌预发酵降解
纤维素和异黄酮甙，再利用动物双歧杆菌和肠膜明串珠菌肠膜亚种协同发酵降解黄豆苷元产生雌马酚。发酵终产物中黄豆苷元转化为雌马酚的转化效率达到60％以上(63.4％)，转化率显著高于国内同类产品(最高约为50％)。并进一步添加脂肪合成前体(等质量比的软脂酸和油酸)，总的添加量为原有发酵液干物质含量的10-12％，雌马酚和
脂肪酸形成合理配比，动物实验表明本研究研发的富含雌马酚的生物饲料添加剂能够显著促进肌肉中的脂肪含量，改善肉品质。
[0011] 本发明为家畜生产提供了促进肌肉中的脂肪含量和改善肉品质的饲料添加剂，适用于瘦肉型猪、牛和羊育肥出栏前快速提高肌肉中的脂肪含量和改善肉品质，为养殖企业带来优质产品和创造更多的效益。此外，断奶仔猪常存在肠道菌群微
生物群落发育不完善，降解异黄酮甙和黄豆苷元产生雌马酚的能
力不足的问题。本法获得的富含雌马酚的微生物代谢产物，可以作为饲料添加剂用于幼畜如断奶仔猪的生长需求。
附图说明
[0012] 图1是
实施例1获得的生物饲料添加剂中黄豆苷元和雌马酚含量的检测结果图；
[0013] 图2是实施例1
荧光染色观察雌马酚促进肌肉细胞内脂滴形成情况图；
[0014] 图3是实施例1出栏生猪的肌肉中脂肪含量的检测结果图。
具体实施方式
[0015] 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
[0016] 具体实施方式一：本实施方式一种用于提高家畜肌肉中脂肪含量的富含雌马酚的生物饲料添加剂的制备方法：一、将大豆粉和苜蓿草粉按照质量比(5-9)：3的比例混合制成发酵培养基干粉，加溶剂配制成发酵培养基干粉质量百分浓度为15～20％的液体发酵培养基；溶剂为浓度为0.10～0.15mmol/L的丁酸钠水溶液；
[0017] 二、向液体发酵培养基中接种枯草芽孢杆菌，需氧发酵20-26h，然后原位升温至85-90℃灭菌0.3-1h，再接种动物双歧杆菌乳酸亚种和肠膜明串珠菌肠膜亚种，厌氧发酵
24-36h，然后原位升温至85-90℃灭菌0.3-1h，获得富含雌马酚的发酵产物；
[0018] 三、向富含雌马酚的发酵产物中添加软脂酸和油酸，软脂酸和油酸的添加量之和为发酵培养基干粉质量的10-12％，即得到富含雌马酚的生物饲料添加剂。
[0019] 本实施方式中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(ATCC6633)，动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)(ATCC 27536)和肠膜明串珠菌肠膜亚种(Leuconostoc.mesenteroidessubsp.mesenteroides)(ATCC8293)，均购自美国ATCC菌种保藏管理中心。
[0020] 本实施方式以大豆和苜蓿为混合原料，并添加促进由黄豆苷元转化为雌马酚的营养底物丁酸钠，配制成液体发酵培养基，通过枯草芽孢杆菌预发酵降解
纤维素和异黄酮甙，再利用动物双歧杆菌和肠膜明串珠菌肠膜亚种协同发酵降解黄豆苷元产生雌马酚。发酵终产物中由黄豆苷元转化为雌马酚的转化效率达到60％以上(63.4％)，转化率显著高于国内同类产品(最高约为50％)。并进一步添加脂肪合成前体(等质量比的软脂酸和油酸)，总的添加量为原有发酵液干物质含量的10-12％，雌马酚和脂肪酸形成合理配比，动物实验表明本研究研发的富含雌马酚的生物饲料添加剂能够显著促进肌肉中的脂肪含量，改善肉品质。
[0021] 本实施方式为家畜生产提供了促进肌肉中的脂肪含量和改善肉品质的饲料添加剂，适用于瘦肉型猪、牛和羊育肥出栏前快速提高肌肉中的脂肪含量和改善肉品质，为养殖企业带来优质产品和创造更多的效益。此外，断奶仔猪常存在肠道菌群微生物群落发育不完善，降解异黄酮甙和黄豆苷元产生雌马酚的能力不足的问题。本法获得的富含雌马酚的微生物代谢产物，可以作为饲料添加剂用于幼畜如断奶仔猪的生长需求。
[0022] 具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：大豆粉的目数为80-100目。其他与具体实施方式一相同。
[0023] 具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：苜蓿草粉制备方法为：将紫花苜蓿鲜草收割后铡成2cm长的小段，用
烘干机在不低于800℃下进行干燥，将
含水量降至不高于12％，用饲料
粉碎机粉碎，目数为100目。其他与具体实施方式一或二相同。
[0024] 具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：枯草芽孢杆菌的活菌数为1.0～2.0×108CFU/mL，接种量为1～3％。其他与具体实施方式一至三之一相同。
[0025] 具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：动物双歧杆菌乳酸亚种和肠膜明串珠菌肠膜亚种的接种总量为1～3％，动物双歧杆菌乳酸亚种和肠膜明串珠菌肠膜亚种接种的菌数比为4：1。其他与具体实施方式一至四之一相同。
[0026] 具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：动物双歧杆菌乳酸亚种活菌数为3～5×107CFU/mL，肠膜明串珠菌肠膜亚种活菌数为1.0～2.0×108CFU/mL。其他与具体实施方式一至五之一相同。
[0027] 具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：动物双歧杆菌乳酸亚种活菌数为3～5×107CFU/mL，肠膜明串珠菌肠膜亚种活菌数为1.0～2.0×108CFU/mL。其他与具体实施方式一至五之一相同。
[0028] 具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：软脂酸和油酸的质量比为1:1。其他与具体实施方式一至七之一相同。
[0029] 具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：富含雌马酚的生物饲料添加剂制备完成取出后液态罐装保存，或300℃以上干燥粉碎后常温保存。其他与具体实施方式一至八之一相同。
[0030] 具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：所述的富含雌马酚的生物饲料添加剂用于提高家畜肌肉中脂肪含量的方法是在家畜出栏前2周，按所获得的生物饲料添加剂干重占饲喂日粮质量的3-5％添加饲喂。其他与具体实施方式一至九之一相同。
[0031] 通过以下实施例验证本发明的效果：
[0032] 实施例一、本实施例一种用于提高家畜肌肉中脂肪含量的富含雌马酚的生物饲料添加剂的制备方法：一、将大豆粉和苜蓿草粉按照质量比7：3的比例混合制成发酵培养基干粉，加溶剂配制成发酵培养基干粉质量百分浓度为15％的液体发酵培养基；溶剂为浓度为0.10mmol/L的丁酸钠水溶液；购置市售大豆粉(80-100目)，将紫花苜蓿鲜草收割后铡成约
2cm长的小段，立即用烘干机在800℃以上进行干燥，将含水量降至12％以下，用饲料粉碎机粉碎(细度达到100目)。
[0033] 二、向液体发酵培养基中接种1％的枯草芽孢杆菌，于37℃需氧发酵24h，然后原位升温至85℃灭菌0.5h，再接种动物双歧杆菌乳酸亚种和肠膜明串珠菌肠膜亚种，于37℃厌氧发酵24h，然后原位升温至85℃灭菌0.5h，获得富含雌马酚的发酵产物；枯草芽孢杆菌的活菌数为1.0～2.0×108CFU/mL，接种量为1％；动物双歧杆菌乳酸亚种和肠膜明串珠菌肠膜亚种的接种总量为1％，动物双歧杆菌乳酸亚种和肠膜明串珠菌肠膜亚种接种的菌数比7
为4：1；动物双歧杆菌乳酸亚种活菌数为3～5×10CFU/mL，肠膜明串珠菌肠膜亚种活菌数为1.0～2.0×108CFU/mL。
[0034] 三、向富含雌马酚的发酵产物中添加等质量比的软脂酸和油酸，软脂酸和油酸的添加量为发酵培养基干粉质量的10％，即得到富含雌马酚的生物饲料添加剂，制备完成取出后液态罐装保存，或300℃以上干燥粉碎后常温保存。
[0035] 本实施例生物饲料添加剂应用于提高家畜肌肉中脂肪含量的方法。在家畜出栏前2周，按所获得的生物饲料添加剂(液态或干粉)干重占饲喂日粮质量比的3％添加饲喂。
[0036] 本实施例发酵培养基来源：大豆或大豆粉购置东北地产大豆或美国进口大豆；紫花苜蓿鲜草购置市场或农户。所用发酵菌种来源：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(ATCC6633)，动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)(ATCC 27536)和肠膜明串珠菌肠膜亚种(Leuconostoc.mesenteroidessubsp.mesenteroides)(ATCC8293)，均购自美国ATCC菌种保藏管理中心。
[0037] 应用高效液相色谱和商品化ELISA
试剂盒(酶标仪，450nm)检测发酵原料和获得的生物饲料添加剂中黄豆苷元(Daidzein)和雌马酚(S-(–)Equol)含量。生物饲料添加剂中黄豆苷元和雌马酚含量的检测结果如图1所示：Pre-fermentation：发酵前样品，Post-fermentation：发酵后样品，n＝5。结果表明发酵产物中黄豆苷元含量由1.208mg/g降为0.417mg/g，雌马酚含量由0.029mg/g提高为0.766mg/g，表明63.4％的黄豆苷元经发酵后转变为雌马酚。实验结果表明，通过本发酵工艺流程，黄豆苷元转化为雌马酚的转化效率达到
60％以上。
[0038] BODIPY脂质染色法观察雌马酚作用于C2C12肌肉细胞后细胞内脂滴的形成情况。结果如图2所示，Blank：正常培养细胞组；FAs：fatty acids，添加脂肪酸组；Equol：添加雌马酚S-(–)Equol组；FAs+Equol，同时添加脂肪酸和雌马酚组；DAPI：细胞核DNA染料；
BODIPY：脂质染料；Merge：为细胞核DNA染色与脂滴染色的合图。标尺＝35μm。实验结果表明，雌马酚具有显著促进依赖于脂肪酸的肌肉细胞内甘油三酯沉积的作用。
[0039] 甘油三酯检测试剂盒分析出栏生猪(长白猪，育肥5个半月)饲喂获得的生物饲料添加剂后肌肉中脂肪含量变化(％湿重)，对照组(n＝15)为饲喂发酵前样品，Equol组(n＝15)为饲喂本生物饲料添加剂，每日100g/头，连续饲喂15日，出栏生猪的肌肉中脂肪含量的检测结果如图3所示，*表示差异显著(p<0.05)。结果表明Equol组肌肉中脂肪含量(湿重)为
9.685％，比对照组(6.896％)显著提高，证明富含雌马酚的生物饲料添加剂具有显著提高出栏生猪的肌肉中脂肪含量的效果。
