一种高特异性3-甲基喹恶啉-2-羧酸多克隆抗体的制备方法
专利汇可以提供一种高特异性3-甲基喹恶啉-2-羧酸多克隆抗体的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种高特异性3-甲基喹恶啉-2- 羧酸 (MQCA)多克隆 抗体 的制备方法，属于免疫分析技术。所述多克隆抗体是由3-甲基喹恶啉-2-羧酸(MQCA)半 抗原 与载体蛋白结合，免疫动物制成，所述3-甲基喹恶啉-2-羧酸(MQCA)半抗原是采用活化酯法将3-甲基喹恶啉-2-羧酸(MQCA)与4- 氨 基丁酸连接制成。本发明制备的3-甲基喹恶啉-2-羧酸(MQCA)多克隆抗体具有较高的特异性，填补了3-甲基喹恶啉-2-羧酸(MQCA)高特异性多克隆抗体制备研究方向的空白。，下面是一种高特异性3-甲基喹恶啉-2-羧酸多克隆抗体的制备方法专利的具体信息内容。
1.一种高特异性3-甲基喹恶啉-2-羧酸多克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤；
1)3-甲基喹恶啉-2-羧酸半抗原的制备：
称取100～200mg 3-甲基喹恶啉-2-羧酸加入干燥的圆底烧瓶中，向其中加入5～7mL四氢呋喃，使其完全溶解，再加入300～400mg EDC和400～500mg NHS，常温磁力搅拌过夜，制备成A液，取100～150mg 4-氨基丁酸，溶解于4～5mL 0.05mol/L，pH 9.6的碳酸钾缓冲溶液，制备成B液；将B液加入到A液中，继续搅拌反应2小时，停止反应后，用三氯甲烷进行萃取，收集有机相；将收集的有机相在35℃下进行旋转减压蒸馏，蒸馏完成得到粉色物质，用1～3mL展开剂，将得到的物质溶解，用毛细管点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边
1.0～1.5cm，样品点直径一般不大于2mm，点间距离可视斑点扩散情况决定，将点连成线即可；点样时必须注意勿损伤薄层表面；将点好样品的薄层板放入展开缸的展开剂中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，密闭，待展开至距离另一底边2～3cm即可，取出薄层板，晾干，在暗箱三用紫外线分析仪254nm下观察，将需要的条带刮下来，收集所有薄层板的硅胶沙，将收集的硅胶沙浸泡于乙酸乙酯中，涡旋震荡，离心，取有机相，用0.22μm的有机膜将有机相过滤，重复洗涤3～5遍；收集有机相进行45℃旋转减压蒸发，收集沉淀，进行真空干燥；
得到的物质即为3-甲基喹恶啉-2-羧半抗原；
2)3-甲基喹恶啉-2-羧酸半抗原与载体蛋白偶联制备免疫原：
5～15mg半抗原置于小棕瓶中，放入转子，加100～300uL N,N-二甲基甲酰胺中将其搅拌溶解，再加入10～20mg EDC和10～20mg NHS，磁力搅拌常温过夜，制备成A液；将15～30mg KLH置于25ml圆底烧瓶中，溶解于5～6mL 0.05mol/L，pH 9.6的碳酸钠缓冲溶液中，制成B液；将A液缓慢滴加反应液B中，每1～2分钟滴加5～10uL，边滴加边搅拌，加完后，4℃搅拌过夜；次日将上清液置于透析袋中，在4℃下用PBS透析3天，每8h换一次透析液；透析后，得到免疫原1，即Hapten-KLH；称取20～30mg半抗原置于小棕瓶中，放入转子，加100～300uL N,N-二甲基甲酰胺中将其搅拌溶解，再加入30～35mg EDC和15～30mg NHS，磁力搅拌常温过夜，制备成A液；将15～30mg OVA置于25mL圆底烧瓶中，溶解于2～6mL0.05mol/L，pH 9.6碳酸钠缓冲溶液中，制成B液；将A液缓慢滴加反应液B中，每2分钟滴加5uL，边滴加边搅拌，加完后，4℃搅拌过夜。次日将上清液置于透析袋中，在4℃下用PBS透析3天，每8h换一次透析液；透析后，得到免疫原2即，Hapten-OVA，称取10～30mg半抗原置于小棕瓶中，放入转子，加
100～300uL N,N-二甲基甲酰胺中将其搅拌溶解。再加入10～30mg EDC和10～15mg NHS，磁力搅拌常温过夜，制备成A液，将10～30mg BSA置于25mL圆底烧瓶中，溶解于2～6mL
0.05mol/L，pH 9.6碳酸钠缓冲溶液中，制成B液，将A液缓慢滴加反应液B中，每2分钟滴加
5uL，边滴加边搅拌，加完后，4℃搅拌过夜，次日将上清液置于透析袋中，在4℃下用PBS透析
3天，每8h换一次透析液。透析后，得到免疫原3即，Hapten-BSA；
3)免疫动物，制得3-甲基喹恶啉-2-羧酸多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的一种高特异性3-甲基喹恶啉-2-羧酸多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤1)中，称取188mg 3-甲基喹恶啉-2-羧酸加入干燥的圆底烧瓶中，向其中加入6mL四氢呋喃，使其完全溶解，再加入383mg EDC和460mg NHS，常温磁力搅拌过夜，制备成A液，取103mg 4-氨基丁酸，溶解于5mL 0.05mol/L，pH 9.6的碳酸钾缓冲溶液，制备成B液，将B液加入到A液中，继续搅拌反应2小时，停止反应后，用三氯甲烷进行萃取，收集有机相；将收集的有机相在35℃下进行旋转减压蒸馏，蒸馏完成得到粉色物质，用2-3mL展开剂；
将得到的物质溶解，用毛细管点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边1.0～1.5cm，样品点直径一般不大于2mm，点间距离可视斑点扩散情况决定，将点连成线即可，点样时必须注意勿损伤薄层表面。将点好样品的薄层板放入展开缸的展开剂中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，密闭，待展开至距离另一底边2-3cm即可，取出薄层板，晾干；在暗箱三用紫外线分析仪254nm下观察，将需要的条带刮下来，收集所有薄层板的硅胶沙，将收集的硅胶沙浸泡于乙酸乙酯中，涡旋震荡，离心，取有机相，用0.22μm的有机膜将有机相过滤，重复洗涤3-5遍，收集有机相进行45℃旋转减压蒸发，收集沉淀，进行真空干燥，得到的物质即为
3-甲基喹恶啉-2-羧酸半抗原。
3.根据权利要求1所述的一种高特异性3-甲基喹恶啉-2-羧酸多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤2)中，称取10mg步骤1)制备的半抗原置于小棕瓶中，放入转子，加200uL N,N-二甲基甲酰胺中将其搅拌溶解，再加入14mg EDC和8.4mg NHS，磁力搅拌常温过夜，制备成A液，将20mg KLH置于25mL圆底烧瓶中，溶解于4mL 0.05mol/L，pH 9.6碳酸钠缓冲溶液中，制成B液。将A液缓慢滴加反应液B中，每2分钟滴加5uL，边滴加边搅拌，加完后，4℃搅拌过夜，次日将上清液置于透析袋中，在4℃下用PBS透析3天，每8h换一次透析液；透析后，得到免疫原1即，Hapten-KLH，称取22mg步骤1)制备的半抗原置于小棕瓶中，放入转子，加
200uL N,N-二甲基甲酰胺中将其搅拌溶解；再加入33mg EDC和20mg NHS，磁力搅拌常温过夜，制备成A液；将20mg OVA置于25mL圆底烧瓶中，溶解于4mL 0.05mol/L，pH 9.6碳酸钠缓冲溶液中，制成B液；将A液缓慢滴加反应液B中，每2分钟滴加5uL，边滴加边搅拌，加完后，4℃搅拌过夜，次日将上清液置于透析袋中，在4℃下用PBS透析3天，每8h换一次透析液；透析后，得到免疫原2即，Hapten-OVA；称取15mg步骤1)制备的半抗原置于小棕瓶中，放入转子，加200uL N,N-二甲基甲酰胺中将其搅拌溶解，再加入21mg EDC和12mg NHS，磁力搅拌常温过夜，制备成A液，将20mg BSA置于25mL圆底烧瓶中，溶解于4mL 0.05mol/L，pH 9.6碳酸钠缓冲溶液中，制成B液；将A液缓慢滴加反应液B中，每2分钟滴加5uL，边滴加边搅拌，加完后，
4℃搅拌过夜；次日将上清液置于透析袋中，在4℃下用PBS透析3天，每8h换一次透析液。透析后，得到免疫原3即，Hapten-BSA。
4.根据权利要求1所述的一种高特异性3-甲基喹恶啉-2-羧酸多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤3)中，免疫过程包括如下步骤；
实验采用6只新西兰大白兔，雄性，月龄3个月，体重1.5公斤左右，按免疫原种类进行编号，三种免疫原Hapten-KLH、Hapten-OVA和Hapten-BSA各免疫两只动物作为平行对照，饲养于标准实验动物房，连续观察一周，确定其状态良好后，开始进行免疫，实验采用多点皮下注射法进行免疫；
三种免疫原Hapten-KLH、Hapten-OVA和Hapten-BSA各取1mg溶于1mL新鲜配置的生理盐水中，与相同体积的弗氏完全佐剂乳化后进行初次免疫；三种免疫原Hapten-KLH、Hapten-OVA和Hapten-BSA各取1mg溶于1mL新鲜配置的生理盐水中，再与等体积弗氏不完全佐剂乳化后用于加强免疫；首次免疫两周后进行第一次加强免疫，此后每两周再进行一次加强免疫；分别于第三、四次免疫后8-10天后，由兔子的耳静脉采血，利用间接竞争ELISA进行抗血清效价和特异性的测定；第五次免疫后的8-10天股动脉采全血，前一天实验动物需禁食，但要保证饮水供应充足，采得的全血经4℃，10000r/min离心处理后收集全部血清，-20℃保存备用。
5.根据权利要求1所述的一种高特异性3-甲基喹恶啉-2-羧酸多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述展开剂由氯仿、乙酸乙酯和乙酸组成，氯仿、乙酸乙酯和乙酸的体积比为
13:6:1。
6.一种使用权利要求1～5任一权利要求所述的一种高特异性3-甲基喹恶啉-2-羧酸多克隆抗体的制备方法制备的抗体用于3-甲基喹恶啉-2-羧酸多克隆抗体效价及亲和性的测定方法，其特征在于：包括如下步骤，
1)包被，先用碳酸盐缓冲液稀释待包被的包被原，把稀释好的包被原稀释液加入到酶标板的微孔中，每孔添加50～150μL稀释液，加完后把酶标板置于20～40℃条件下反应2～
5h后，弃去孔中液体，向酶标板中加入200～300μL洗涤液PBST缓冲液，在震荡器上震荡1～
3min，弃去洗涤液，即为洗板1次，重复洗板2～5次；优选的，把稀释好的包被原稀释液加入酶标板的微孔中，每微孔添加100μL；加完后把酶标板置于37℃条件下反应3h，弃去孔中液体，向酶标板中加入250μL的洗涤液PBST缓冲液，在震荡器上震荡2min；弃去洗涤液，即为洗板1次，重复洗板3次，优选的，重复洗板3次；
2)封闭：向酶标板的每个微孔中加入150～250μL封闭液，加完后把酶标板置于20～40℃条件下，0.5～1.5h后取出酶标板弃去封闭液，重复洗板2～5次；优选的，向酶标板的每个微孔中加入200μL封闭液，加完后把酶标板置于37℃条件下，1h后取出酶标板弃去封闭液，重复洗板3次；所述封闭液为含有质量浓度为0.5％脱脂乳粉的磷酸盐缓冲溶液；
3)竞争反应：向酶标板的每个微孔先加入50～150μL的磷酸盐缓冲液或1000μg/L的标准品稀释液，然后再向其中加入50～150μL梯度稀释的抗血清溶液，抗血清是用磷酸盐缓冲溶液进行稀释的，酶标板被置于20～40℃条件下孵育0.5～1.5h之后，重复洗板2～5次；优选的，向酶标板的每个微孔先加入50μL的磷酸盐缓冲液或1000μg/L的标准品稀释液，然后再向其中加入50μL梯度稀释的抗血清溶液；酶标板被置于37℃条件下孵育1h之后，重复洗板4次；
4)加入酶标二抗，向酶标板的每个微孔中加入50～150μL酶标二抗稀释液，酶标二抗用磷酸盐缓冲溶液进行稀释，其稀释倍数为15000～25000倍，加完后把酶标板置于20～40℃条件下，0.5～1.5h后取出酶标板弃去孔中液体，重复洗板2～5次；优选的，向酶标板的每个微孔中加入100μL酶标二抗，其稀释倍数为20000倍，加完后把酶标板置于37℃条件下，0.5h后取出酶标板弃去孔中液体，重复洗板5次；所述酶标二抗为HRP-标记羊抗兔二抗；
5)显色，向酶标板的每个微孔中加入50～150μL显色液，加完后把酶标板置于20～40℃条件下，0.5～1.5h后取出；优选的，向酶标板的每个微孔中加入100μL显色液，加完后把酶标板置于37℃条件下，0.5h后取出；
6)终止并读数，向酶标板的每个微孔中加入50～150μL终止液，在双波长方式下用酶标仪读取酶标板中每个微孔的吸光度值；优选的，向酶标板的每个微孔中加入50μL终止液，在双波长方式450～650nm下用酶标仪读取酶标板中每个微孔的吸光度值，选取吸光度值在
0.8～1.2范围内的抗血清稀释度，即为抗血清效价；对于抗血清特异性的测定，确定抗血清效价后，测定标准品浓度为1000μg/L的抑制率，按以下公式计算其抑制率，其中：OD阴性对照是不加标准品的吸光度值；OD空白是不加标准品和抗血清的吸光度值；OD阳性对照加标准品的吸光度值。
一种高特异性3-甲基喹恶啉-2-羧酸多克隆抗体的制备方法
技术领域
背景技术
发明内容
将A液缓慢滴加 反应液B中，每2分钟滴加5uL，边滴加边搅拌，加完后，4℃搅拌 过夜。次日将上清液置于透析袋中，在4℃下用PBS透析3天，每 8h换一次透析液。透析后，得到免疫原2即，Hapten-OVA。称取10～ 30mg步骤1)制备的半抗原置于小棕瓶中，放入转子，加100～300 uL N,N-二甲基甲酰胺中(DMF)将其搅拌溶解。再加入10～30mg EDC和10～15mg NHS，磁力搅拌常温过夜，制备成A液。将10～ 30mg BSA置于25mL圆底烧瓶中，溶解于2～6mL
0.05mol/L，pH 9.6 碳酸钠缓冲溶液中，制成B液。将A液缓慢滴加反应液B中，每2 分钟滴加
5uL，边滴加边搅拌，加完后，4℃搅拌过夜。次日将上清 液置于透析袋中，在4℃下用PBS透析3天，每8h换一次透析液。 透析后，得到免疫原3即，Hapten-BSA。
0.05mol/L，pH 9.6碳酸钠缓冲溶液中，制 成B液。将A液缓慢滴加反应液B中，每2分钟滴加
5uL，边滴加 边搅拌，加完后，4℃搅拌过夜。次日将上清液置于透析袋中，在4℃ 下用PBS透析3天，每8h换一次透析液。透析后，得到免疫原2即，Hapten-OVA。称取15mg步骤1)制备的半抗原置于小棕瓶中，放入 转子，加200uL N,N-二甲基甲酰胺中(DMF)将其搅拌溶解。再 加入21mg EDC和12mg NHS，磁力搅拌常温过夜，制备成A液。 将20mg BSA置于25mL圆底烧瓶中，溶解于4mL 0.05mol/L，pH 9.6 碳酸钠缓冲溶液中，制成B液。将A液缓慢滴加反应液B中，每2 分钟滴加5uL，边滴加边搅拌，加完后，4℃搅拌过夜。次日将上清 液置于透析袋中，在4℃下用PBS透析3天，每8h换一次透析液。 透析后，得到免疫原3即，Hapten-BSA。
具体实施方式
将B液加入到A液中，继续搅拌反应2小时，停止反应后，用 三氯甲烷进行萃取，收集有机相。
将收集的有机相在35℃下进行旋 转减压蒸馏，蒸馏完成得到粉色物质。用2-3mL展开剂(氯仿：乙 酸乙酯：乙酸为13:6:1)将得到的物质溶解，用毛细管点样于薄层板 上，一般为圆点，点样基线距底边1.0～1.5cm，样品点直径一般不 大于2mm，点间距离可视斑点扩散情况决定，将点连成线即可。点 样时必须注意勿损伤薄层表面。将点好样品的薄层板放入展开缸的展 开剂中，浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜，密闭，待展开至距 离另一底边2-3cm即可。取出薄层板，晾干。在暗箱三用紫外线分 析仪254nm下观察，将需要的条带刮下来，收集所有薄层板的硅胶 沙，将收集的硅胶沙浸泡于乙酸乙酯中，涡旋震荡，离心，取有机相， 用0.22μm的有机膜将有机相过滤，重复洗涤3-5遍。收集有机相进 行45℃旋转减压蒸发，收集沉淀，进行真空干燥。得到的物质即为 3-甲基喹恶啉-2-羧酸(MQCA)半抗原。
5uL，边滴加边搅拌，加完 后，4℃搅拌过夜。次日将上清液置于透析袋中，在4℃下用PBS透 析3天，每8h换一次透析液。透析后，得到免疫原2即，Hapten-OVA。 称取15mg 3-甲基喹恶啉-2-羧酸半抗原置于小棕瓶中，放入转子，加 200uL N,N-二甲基甲酰胺中(DMF)将其搅拌溶解。再加入21mg EDC和12mg NHS，磁力搅拌常温过夜，制备成A液。将20mg BSA 置于25mL圆底烧瓶中，溶解于4mL 0.05mol/L，pH 9.6碳酸钠缓冲 溶液中，制成B液。将A液缓慢滴加反应液B中，每2分钟滴加5uL， 边滴加边搅拌，加完后，4℃搅拌过夜。次日将上清液置于透析袋中， 在4℃下用PBS透析3天，每8h换一次透析液。透析后，得到免 疫原3即，Hapten-BSA。
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