技术领域
[0001] 本
发明涉及一种养鱼水环境中有害菌检测技术，尤其是基于微流控芯片的养鱼水环境有害菌实时检测方法与装置。
背景技术
[0002] 我国是
水产养殖大国，目前，养殖产量面临着严重的病害威胁，水产养殖病害在300种以上，每年约1/10 的养殖面积发生病害，每年因病害损失的养殖产量约占30%，直接经济损失都超过百亿元，其中细菌性鱼病的发病率和致死率都接近或超过50%。因此，鱼病的实时监测成为水产养殖业的研究热点。
专利申请号为200410041911.5公开了一种采用
图像处理的鱼病自动诊断方法及其装置，该方法将计算机数字图形处理技术应用到水产养殖领域中，该装置通过摄像头将鱼池的画面实时拍摄下来，然后传送给视频
图像采集卡，图像采集卡负责将模拟图像
信号转换成计算机能处理的数字图像信号，将病鱼的白色腹部与背景分割开，通过统计白色区域部分的数目和大小，进行鱼病判断，采取措施。该方法虽然具备了较好的自动化性，但是该方法的鱼病监测是建立在鱼塘出现了部分泛塘死亡现象后的快速预警，并不能对鱼病的发生进行提前预判。
[0003] 有害菌的传播介质主要是水，有害菌游离于水中或者
吸附于营养物质颗粒上，经过鱼的呼吸作用达到鱼的腮内，或者通过鱼的进食进入鱼的体内，从而使鱼类感染。因此，要想提高细菌性鱼病的预判
力，应该及时在鱼群细菌性感染之前，发现养鱼水环境中的有害菌。目前的养鱼水环境有害菌快速检测方法有细菌学检验方法、分子
生物学检测方法以及免疫学检测方法，这些方法虽然能够对水中的有害菌进行检测，但样品的配置及检测环节较为复杂，因此只能作为一种离线检测方式来使用。
[0004] 微流控芯片是近年来发展的一种将生物和化学等领域中所涉及的样品反应、分离和检测等基本操作单元集成到一
块数十平方厘米甚至更小的芯片上的新技术。
发明内容
[0005] 本发明的目的是针对目前养鱼水环境有害菌在线检测方法的滞后性
缺陷，针对养鱼水环境的特殊性，基于先进的微流控芯片技术，提出一种基于微流控芯片的养鱼水环境有害菌实时检测方法与装置，实时在线对原始水样中有害菌的含量进行监测，对细菌性鱼病的发生做到提前预警。
[0006] 本发明基于微流控芯片的养鱼水环境有害菌实时检测装置采用的技术方案是：包括原始水样预处理结构和电动混合微流控芯片，原始水样预处理结构包括原始水样细菌脱附处理结构及吸附推抽式过滤结构，原始水样细菌脱附处理结构底部连接水
泵和原始水样进水口、顶部连接
密度较大非生物颗粒输出管道和吸附推抽式过滤结构；电动混合微流控芯片具有微混合室、细菌样品入口及致敏乳胶入口，细菌样品入口及致敏乳胶入口共同通过汇聚流动微通道连通微混合室的输入端，微混合室通过其输出端口连接全反射毛细管；致敏乳胶入口通过输出毛细管与分时选择组合注射结构相连接，细菌样品入口通过毛细连接管与吸附推抽式过滤结构相连；分时选择组合注射结构包括由 ~T个
注射泵组成的注射泵组，各注射泵均通过多输入单输出汇聚
阀连接所述输出毛细管；在所述微混合室的壁面两边设置两排各N个
电极，分别为电极a~y和电极A~Y，两排N个电极均连接由3个控制电源α、β、ω组成的电源组，电极a, B, c...W, x, Y与控制电源α相联接，电极A, b, C...w, X, y与控制电源β相联接；在所述全反射毛细管与电动混合微流控芯片的连接端设有
光源，光源通过
导线连接所述控制电源ω，全反射毛细管另一端设有光电装换器，光电转换器依次连接
数据采集卡和计算机。
[0007] 本发明基于微流控芯片的养鱼水环境有害菌实时检测方法采用的技术方案是依次按如下步骤：1）开启水泵，将养鱼水环境的原始水样抽入原始水样细菌脱附处理结构后开启原始水样细菌脱附处理结构，密度较大的非生物微颗粒排出，密度较小的细菌微颗粒送入吸附推抽式过滤结构。2）开启吸附推抽式过滤结构，将体积较大的非生物微颗粒滤除，将处理后的原始水样送入电动混合微流控芯片的细菌样品入口。3）开启电源组，通过控制电源α、β向各对应电极发出控制
电压信号对微混合室进行电动混合。4）开启控制电源ω、光源及光电转换器，光源发射的光经过全反射毛细管的多次反射进入光电转换器，对液体进行吸光度检测。5）开启第 号注射泵，将检测第一种细菌的致敏乳胶
试剂注入致敏乳胶入口，当从细菌样品入口输入的样品含有病原菌，在经电动混合后充分发生免疫凝集反应，在全反射毛细管处的吸光度发生变化，吸光度变化量通过数据采集卡传送给计算机，计算机利用凝集反应造成的
混合液吸光度变化来判断凝集反应的程度，转换成养鱼水环境有害菌的浓度输出；反之，当从细菌样品入口输入的样品不含病原菌，吸光度无变化。6）停止第号注射泵，延时一段时间再开启第 号注射泵，将检测第二种细菌的致敏乳胶试剂注入致敏乳胶入口；如此重复步骤5）的检测过程直至最后的第T号注射泵检测完毕。
[0008] 本发明与已有技术相比，具有如下优点：1、本发明有效地将免疫凝集技术、微流控芯片技术以及光电检测技术综合应用到养鱼水环境有害菌在线检测上，解决传统有害菌离线检测方法复杂度高、检测时间长及时效性差的难题。
[0009] 2、本发明有效地提供了养鱼水环境原始水样的自动化提取过程，解决了原始水产养殖环境不能直接采用微流控芯片检测难题。
[0010] 3、本发明将不同菌种的致敏乳胶试剂进行分时施用到微流控芯片中，从而使得一片微流控芯片在不增加光电检测设备的
基础上能够同时检测多种病原菌含量，解决了常规方法检测单一的难题。
[0011] 4、本发明通过采用改变避免电势来提高混合过程，解决了被动式微混合器加工难度大且容易
结垢堵塞的难题。
[0012] 5、本发明通过在检测口设置全反射毛细管来增加光程的方法提高检测敏感度，从而避免了常规光电检测方法因为检测光程短造成的检出限高的难题。
[0013] 6、本发明装置的工作过程为全自动化检测，可以实现养鱼水环境有害菌的远程在线监控与提前预警，解决常规检测方法难以实现自动化在线检测的难题。
附图说明
[0014] 图1是本发明基于微流控芯片的养鱼水环境有害菌实时检测装置整体示意图；图2是图1中原始水样预处理结构9的结构放大示意图；
图3是图1中分时选择组合注射结构3的结构放大示意图。
[0015] 图4是图1中电动混合微流控芯片8的结构放大示意图；图5是图4中电动混合微流控芯片8的控制混合过程示意图；
图6是本发明基于微流控芯片的养鱼水环境有害菌实时检测方法的
流程图；
附图中各部件的序号和名称：1.注射泵；2.多输入单输出汇聚阀；3.分时选择组合注射结构；4.电源组；5.光源；6.全反射毛细管；7.光电转换器；8.电动混合微流控芯片；
9.原始水样预处理结构；10.废液排放管；11.数据采集卡；12.计算机；13.原始水样细菌脱附处理结构；14.吸附推抽式过滤结构；15.水泵；16.原始水样进水口；17.密度较大非生物颗粒输出管道；18.磁力搅拌子；19.导线；20.连接管；21.旋转
磁场发生器；22.毛细连接管；23.汇聚流动微通道；24.毛细管；25.输出端口；26.毛细管；27.微混合室；28.致敏乳胶入口；29.细菌样品入口。
具体实施方式
[0016] 参见图1和图2，为本发明基于微流控芯片的养鱼水环境有害菌实时检测装置结构，该装置包含原始水样预处理结构9、致敏乳胶试剂的分时选择组合注射结构3、电动混合微流控芯片8等组成。整个装置从液体进样到检测结果输出实现了养鱼水环境有害菌的在线全自动化监测过程。
[0017] 本发明养鱼水环境的原始水样预处理结构9，实现养鱼水环境原始水样的预处理，如图2，原始水样预处理结构9包括两个基本结构，即养鱼水环境原始水样细菌脱附处理结构13以及用于水样大尺度微颗粒过滤的吸附推抽式过滤结构14。原始水样细菌脱附处理结构13与原始水样进水口16相连，具体地将原始水样进水口16连接在原始水样细菌脱附处理结构13的底部，在原始水样细菌脱附处理结构13的顶部连接密度较大非生物颗粒输出管道17和连接管20，原始水样细菌脱附处理结构13经连接管20连接吸附推抽式过滤结构14，吸附推抽式过滤结构14通过毛细连接管22与电动混合微流控芯片8的细菌样品入口29相连。在原始水样进水口16和原始水样细菌脱附处理结构13之间连接水泵15。原始水样细菌脱附处理结构13的内腔底部设置磁力搅拌子18，磁力搅拌子18与旋转磁场发生器21相连，由旋转磁场发生器21驱动磁力搅拌子18旋转。
[0018] 养鱼水环境原始水样细菌脱附处理结构13通过水泵15将养鱼水环境的原始水样从管道以及原始水样进水口16吸入，由原始水样进水口16
抽取的原始水样经过原始水样细菌脱附结构13处理后通过连接管20送入吸附推抽式过滤结构14。原始水样细菌脱附处理结构13为磁力搅拌工作方式，通过细菌脱附处理结构13底部内安装的旋转磁场发生器21驱动磁力搅拌子18不断旋转，根据密度分离介质在
离心力的作用下形成密度梯度分布调整转速，将吸附在微物质颗粒表面细菌与颗粒进行分离，密度较大的非生物颗粒向两边分流，最终从密度较大非生物颗粒输出管道17排出，而密度较小的生物微颗粒将保留在中间流，最终从连接管20送入吸附推抽式过滤结构14，从而保证检测的准确性。吸附推抽式过滤结构14能够将大颗粒物质滤除，吸附推抽式过滤结构14通过毛细连接管22将处理好的液体样品送入电动混合微流控芯片8的输入端细菌样品入口29。
[0019] 本发明上述的吸附推抽式过滤结构14的具体实施方式以及工作方式参照专利申请号为201110393768.6、名称为“养鱼水环境微流控检测的进样方法与进样装置”，这里不再赘述。
[0020] 如图1和图4所示，电动混合微流控芯片8具有微混合室27和两个入口，这两个入口分别是细菌样品入口29以及致敏乳胶入口28，细菌样品入口29以及致敏乳胶入口28共同通过汇聚流动微通道23连通微混合室27的输入端，微混合室27通过其输出端口25连接全反射毛细管6。也可以在汇聚流动微通道23的合适
位置设置宽度尺寸稍大的通道作为微混合室27。致敏乳胶入口28通过输出毛细管24与分时选择组合注射结构3相连接，分时选择组合注射结构3能够将用于不同病原菌检测的致敏乳胶试剂分时注入到电动混合微流控芯片8中的致敏乳胶入口28。电动混合微流控芯片8能够通过
电场对样品溶液与致敏乳胶试剂进行扰动混合，使得致敏乳胶试剂与样品溶液充分混合与凝集反应。 [0021] 如图5所示，在微混合室27的壁面两边设置两排各N个电极，分别为电极a~y和电极A~Y，电极的数量多少可以根据
流体液体的扩散系数来仿真确定。两排N个电极均通过导线19连接电源组4，电源组4由3个控制电源组成，3个控制电源分别是控制电源α、β、ω。两排N个电极具体联接方式为：电极a, B, c...W, x, Y通过导线19与电源组4中的控制电源α相联接；电极A, b, C...w, X, y通过导线与电源组4中的控制电源β相联接。电极的数量和控制电源的联接方式也可以根据具体的控制效果而定。根据微通道壁面电势变化对微通道液体具有的扰动搅拌影响的原理，通过不同电极的电势施加
算法来扰动微混合室27内的菌液与致敏乳胶试剂的液体流态，使微混合室27内的
层流液体出现混沌
对流，直至完全混合状态，从而使免疫凝集程度达到最大。图5设置了浓度为0和浓度为1的两种液体，微通道壁面电极分别为a~c、A~C。电源联接方式为：电极a、B、c与控制电源α相连，电极A、b、C与控制电源β相连。控制电源α和β分别同时输出正弦和余弦变化的两种不同的电压信号。从图5中可以看出，经过0.49秒的电动扰动，输出端口25处的液体
颜色已经基本为0.5（绿色），达到了均匀混合的程度。
[0022] 如图1和图3所示的分时选择组合注射结构3，分时选择组合注射结构3包括由~T个注射泵1组成的注射泵组、相应数量的毛细管26以及一个多输入单输出汇聚阀2。注射泵1为普通针管式注射泵，各注射泵1的针头分别与毛细管26相连，各毛细管26均通过多输入单输出汇聚阀2连接一根毛细管24，多输入单输出汇聚阀2将多路输入汇聚成一路并且通过毛细管24输出。这样在不同时段开通不同的注射泵1可以输出不同的致敏乳胶试剂，通过不同时刻分时向电动混合微流控芯片8注入致敏乳胶试剂，以检测不同有害菌种的存在浓度。
[0023] 如图1，全反射毛细管6与废液排放管10相连。混合反应后的液体经过全反射毛细管6进入废液排放管10排出。全反射毛细管10为TeflonAF2400液芯波
导管。在全反射毛细管6与电动混合微流控芯片8的连接端装有光源5，光源5通过导线19连接电源组4中的控制电源ω，在全反射毛细管6另一端装有光电装换器7，光电转换器7与数据采集卡11相连，采集卡11再连接计算机12。光源5、全反射毛细管6以及光电转换器7构成长光程光电检测结构，由光源5发出的光经过在全反射毛细管6内多次反射最后到达光电转换器7。当微流控芯片8内发生免疫凝集反应时。通过全反射毛细管6的液体的吸光度会发生变化，并将变化量通过数据采集卡11传送给计算机12，计算机12利用凝集反应造成的混合液吸光度变化来判断凝集反应的程度，从而最终转换成养鱼水环境有害菌的浓度输出。
[0024] 参见图1-6，整个装置的工作流程是：首先开启水泵15，水泵15将养鱼水环境的原始水样抽入原始水样细菌脱附处理结构13，此时开启原始水样细菌脱附处理结构13，细菌脱附处理结构13内的磁力搅拌子18开始高速旋转，将密度较大的非生物微颗粒旋向外围而细菌等微颗粒则在结构中央旋转。随着水泵15的继续工作，密度较大的非生物微颗粒从输出管道17中排出，而密度较小的细菌等微颗粒则通过连接管20送入吸附推抽式过滤结构14，此时开启吸附推抽式过滤结构14工作，吸附推抽式过滤结构14将体积较大的非生物微颗粒滤除，并开始将处理后的原始水样送入电动混合微流控芯片8的细菌样品入口29。此时开启微通道壁面电极控制电源组4，电源组4的各控制电源分别向各对应电极发出控制电压信号，进行电动混合控制。之后开启光源5的供电控制电源ω、光源5以及光电转换器7对流经全反射毛细管6的液体进行吸光度检测。光源5发射的光经过全反射毛细管6的多次反射，最终进入光电转换器7，增大检测光程能够有效提高免疫凝集检测的敏感度，最终降低养鱼水环境有害菌的检出限。之后开启第 号注射泵，将检测第一种细菌的致敏乳胶试剂注入电动混合微流控芯片8的致敏乳胶入口28，当从细菌样品入口29输入的样品含有病原菌，在经电动混合微流控芯片8的电动混合后会充分发生免疫凝集反应，液体变浑浊，在全反射毛细管6处的吸光度发生变化，光电转换器7通过数据采集卡11将信号传递给计算机12。当从细菌样品入口29输入的样品不含病原菌，吸光度没有变化，则检测到的光电检测信号不发生变化。之后停止第 号注射泵，延时一段时间，让微混合室27通道冲洗一下后，开启第 号注射泵，将检测第二种细菌的致敏乳胶试剂注入致敏乳胶入口28，重复上述检测过程。待最后一只注射泵第T号检测完毕后，结束并关闭整个系统。
