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核酸适配体在识别并结合整合素α4中的应用

阅读：201发布：2024-01-11

专利汇可以提供核酸适配体在识别并结合整合素α4中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了核酸适配体在识别并结合整合素α4中的应用。本发明首次发现核酸适配体Sgc-4e可以特异性识别并结合整合素α4，并利用核酸适配体Sgc-4e与整合素α4的特异性结合作用建立了检测整合素α4的方法。通过实验证明：本发明的核酸适配体Sgc-4e具有亲和力高、特异性强、无免疫原性和无毒性等特点，基于核酸适配体Sgc-4e建立的检测整合素α4的方法可为治疗多发性硬化症提供了新的策略。，下面是核酸适配体在识别并结合整合素α4中的应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.核酸适配体或其衍生物在识别并结合或辅助识别并结合整合素α4中的应用；
或核酸适配体或其衍生物在制备识别并结合或辅助识别并结合整合素α4的产品中的应用；
所述核酸适配体为序列1所示的单链DNA分子。
2.核酸适配体或其衍生物在识别并结合或辅助识别并结合活性整合素α4中的应用；
或核酸适配体或其衍生物在制备识别并结合或辅助识别并结合活性整合素α4的产品中的应用；
所述核酸适配体为序列1所示的单链DNA分子。
3.核酸适配体或其衍生物在检测或辅助检测与抗整合素α4的抗体结合的物质中的应用；
或核酸适配体或其衍生物在制备检测或辅助检测与抗整合素α4的抗体结合的物质的产品中的应用；
所述核酸适配体为序列1所示的单链DNA分子。
4.核酸适配体或其衍生物在检测或辅助检测待测样品是否含有整合素α4中的应用；
或核酸适配体或其衍生物在检测或辅助检测待测样品中整合素α4的含量中的应用；
或核酸适配体或其衍生物在制备检测或辅助检测待测样品是否含有整合素α4的产品中的应用；
或核酸适配体或其衍生物在制备检测或辅助检测待测样品中整合素α4的含量的产品中的应用；
所述核酸适配体为序列1所示的单链DNA分子。
5.核酸适配体或其衍生物在制备诊断和/或治疗多发性硬化症的产品中的应用；
所述核酸适配体为序列1所示的单链DNA分子。
6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于：所述衍生物为如下(1)-(6)中任一所述的核酸适配体的衍生物：
(1)将序列1所示的核酸适配体删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
(2)将序列1所示的核酸适配体进行核苷酸取代或修饰，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
(3)将序列1所示的核酸适配体的骨架改造为硫代磷酸脂骨架，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
(4)由序列1所示的核酸适配体编码的RNA分子，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体衍生物；
(5)由序列1所示的核酸适配体编码的肽核酸，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
(6)将序列1所示的核酸适配体的一端或中间接上信号分子和/或活性分子和/或功能基团，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
所述(6)中的功能基团为生物素基团或荧光基团。
7.根据权利要求1-6中任一所述的应用，其特征在于：所述待测样品为细胞；所述细胞具体为大鼠肺泡上皮细胞RAEC、人胚胎肺纤维细胞MRC-5、人肺泡上皮细胞A549、人宫颈癌细胞Hela、人肝癌细胞Huh-7、人膀胱癌细胞T24、人肝细胞癌细胞SK-Hep-1、人乳腺癌细胞MCF-7、人乳腺癌细胞MCF-7R、人卵巢癌细胞SKOV-3、人白血病细胞K562、人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人类上皮癌细胞A431、人类T细胞白血病细胞Jurkat E6-1、人回盲肠腺癌细胞HCT-8、人胚胎肾细胞HEK-293、人前列腺癌细胞PC-3、人类T细胞淋巴瘤Hut-78或人结肠癌细胞LoVo。
8.一种产品，其活性成分为序列1所示的核酸适配体或其衍生物；所述产品的用途为如下1)-6)中的至少一种：
1)识别并结合或辅助识别并结合整合素α4；
2)识别并结合或辅助识别并结合活性整合素α4；
3)检测或辅助检测待测样品的整合素α4的含量；
4)检测或辅助检测待测样品中是否含有整合素α4；
5)检测或辅助检测与抗整合素α4的抗体结合的物质；
6)诊断和/或治疗多发性硬化症。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于：所述衍生物为如下(1)-(6)中任一所述的核酸适配体的衍生物：
(1)将序列1所示的核酸适配体删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
(2)将序列1所示的核酸适配体进行核苷酸取代或修饰，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
(3)将序列1所示的核酸适配体的骨架改造为硫代磷酸脂骨架，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
(4)由序列1所示的核酸适配体编码的RNA分子，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体衍生物；
(5)由序列1所示的核酸适配体编码的肽核酸，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
(6)将序列1所示的核酸适配体的一端或中间接上信号分子和/或活性分子和/或功能基团，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；
所述(6)中的功能基团为生物素基团或荧光基团。
10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于：所述待测样品为细胞；所述细胞具体为大鼠肺泡上皮细胞RAEC、人胚胎肺纤维细胞MRC-5、人肺泡上皮细胞A549、人宫颈癌细胞Hela、人肝癌细胞Huh-7、人膀胱癌细胞T24、人肝细胞癌细胞SK-Hep-1、人乳腺癌细胞MCF-7、人乳腺癌细胞MCF-7R、人卵巢癌细胞SKOV-3、人白血病细胞K562、人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人类上皮癌细胞A431、人类T细胞白血病细胞Jurkat E6-1、人回盲肠腺癌细胞HCT-8、人胚胎肾细胞HEK-293、人前列腺癌细胞PC-3、人类T细胞淋巴瘤Hut-78或人结肠癌细胞LoVo。

说明书全文

核酸适配体在识别并结合整合素α4中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术与临床医学技术领域，具体涉及核酸适配体在识别并结合整合素α4中的应用。

背景技术

[0002] 核酸适配体(aptamer)是一类能与靶标物质的特异性相互作用的单链DNA、RNA、肽核酸或化学修饰的核酸序列，通常由15-80个核苷酸组成。核酸适配体可以形成特定的三维结构与靶标分子高亲和力结合，如发卡、假结、G-四链体等结构，高特异性地结合作用是通过范德华力、氢键、静电作用和疏水作用等分子间相互作用实现的。其具有亲和力高、特异性好、无免疫原性、易合成、改造与修饰、生物化学稳定性好、能可逆变性与复性等特性，所以被称之为“化学抗体”。

[0003] 核酸适配体可被应用在一些疾病的诊断和检测、药物靶点定位、新药研发和运输相关药物分子等领域，目前，用于治疗癌症、艾滋病等疾病的核酸适配体也不断涌现。例如，由Eyetch/Pfizer开发的靶向VEGF的核酸适配体(商品名Macugen)2004年已获得FDA的批准，成功地用于治疗年龄相关的黄斑变性。近年提出的利用细胞-SELEX技术筛选特异性核酸适配体，进而发现肿瘤标志物的方法具有好的应用前景。但目前只有极少数成功的例子，其中的瓶颈问题就在于位于细胞膜上的核酸适配体靶分子的纯化/鉴定。

[0004] 整合素α4又称CD49d，与整合素β1亚单位(CD29)组成α4β1整合素。主要表达于胸腺细胞、单核细胞、淋巴细胞等，配体是VCAM-1和纤连蛋白，能为T细胞活化和增殖提供协同刺激信号，参与淋巴细胞间黏附以及白细胞向炎症部位迁移，同时其也表达于一些实体瘤表面。研究表明：血栓的形成、白细胞的转移、血管发生和肿瘤细胞的转移都与整合蛋白的激活有关，其中，CD49d的异常表达与某些血液疾病的发病及预后有关，如CD49d与慢性淋巴细胞性白血病(Chronic lymphoid leukemia，CLL)预后关系密，所以CD49d被作为基于流式细胞仪分析慢性淋巴细胞白血病的生物标志物。

[0005] 多发性硬化症(MS)是一种常见的慢性、炎症性、脱髓鞘的中枢神经系统疾病，损害中枢神经系统的髓鞘质，从而造成神经功能缺损，这种损伤往往会导致严重残疾。每100000人中有2-150人发病，全世界有超过一百万人受到该种疾病的困扰，种族和地理纬度的不同其发病率也不同。那他珠单抗(Natalizumab)是ELAN公司研究开发的人源化单抗，作用靶点整合素α4，2004年被美国FDA批准，2006年被欧盟EMA批准，目前已经在加拿大、瑞士、澳大利亚等65个以上国家被批准上市，商品名Tysabri，主要用于多发性硬化症的治疗。

发明内容

[0006] 本发明的一个目的是提供核酸适配体或其衍生物的新用途。

[0007] 本发明提供了核酸适配体或其衍生物在识别并结合或辅助识别并结合整合素α4中的应用；

[0008] 或核酸适配体或其衍生物在制备识别并结合或辅助识别并结合整合素α4的产品中的应用；

[0009] 所述核酸适配体为序列1所示的单链DNA分子。

[0010] 本发明还提供了核酸适配体或其衍生物在识别并结合或辅助识别并结合活性整合素α4中的应用；

[0011] 或核酸适配体或其衍生物在制备识别并结合或辅助识别并结合活性整合素α4的产品中的应用；

[0012] 所述核酸适配体为序列1所示的单链DNA分子。

[0013] 本发明还提供了核酸适配体或其衍生物在检测或辅助检测与抗整合素α4的抗体结合的物质中的应用；

[0014] 或核酸适配体或其衍生物在制备检测或辅助检测与抗整合素α4的抗体结合的物质的产品中的应用；

[0015] 所述核酸适配体为序列1所示的单链DNA分子。

[0016] 本发明还提供了核酸适配体或其衍生物在检测或辅助检测待测样品是否含有整合素α4中的应用；

[0017] 或核酸适配体或其衍生物在检测或辅助检测待测样品中整合素α4的含量中的应用；

[0018] 或核酸适配体或其衍生物在制备检测或辅助检测待测样品是否含有整合素α4的产品中的应用；

[0019] 或核酸适配体或其衍生物在制备检测或辅助检测待测样品中整合素α4的含量的产品中的应用；

[0020] 所述核酸适配体为序列1所示的单链DNA分子。

[0021] 本发明还提供了核酸适配体或其衍生物在制备诊断和/或治疗多发性硬化症的产品中的应用；

[0022] 所述核酸适配体为序列1所示的单链DNA分子。

[0023] 上述应用中，所述衍生物为如下(1)-(6)中任一所述的核酸适配体的衍生物：

[0024] (1)将序列1所示的核酸适配体删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；

[0025] (2)将序列1所示的核酸适配体进行核苷酸取代或修饰，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；

[0026] (3)将序列1所示的核酸适配体的骨架改造为硫代磷酸脂骨架，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；

[0027] (4)由序列1所示的核酸适配体编码的RNA分子，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体衍生物；

[0028] (5)由序列1所示的核酸适配体编码的肽核酸，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；

[0029] (6)将序列1所示的核酸适配体的一端或中间接上信号分子和/或活性分子和/或功能基团，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；

[0030] 所述(6)中的功能基团为生物素基团或荧光基团。

[0031] 上述应用中，所述核酸适配体的衍生物为在上述核酸适配体的5’端或3’端标记荧光基团或生物素基团。

[0032] 上述应用中，所述核酸适配体的衍生物为在上述核酸适配体的5’端标记荧光基团或生物素基团。

[0033] 上述应用中，所述待测样品为细胞；所述细胞具体为大鼠肺泡上皮细胞RAEC、人胚胎肺纤维细胞MRC-5、人肺泡上皮细胞A549、人宫颈癌细胞Hela、人肝癌细胞Huh-7、人膀胱癌细胞T24、人肝细胞癌细胞SK-Hep-1、人乳腺癌细胞MCF-7、人乳腺癌细胞MCF-7R、人卵巢癌细胞SKOV-3、人白血病细胞K562、人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人类上皮癌细胞A431、人类T细胞白血病细胞Jurkat E6-1、人回盲肠腺癌细胞HCT-8、人胚胎肾细胞HEK-293、人前列腺癌细胞PC-3、人类T细胞淋巴瘤Hut-78或人结肠癌细胞LoVo。

[0034] 本发明的另一个目的是提供一种产品。

[0035] 本发明提供的产品的活性成分为序列1所示的核酸适配体或其衍生物；所述产品的用途为如下1)-6)中的至少一种：

[0036] 1)识别并结合或辅助识别并结合整合素α4；

[0037] 2)识别并结合或辅助识别并结合活性整合素α4；

[0038] 3)检测或辅助检测待测样品的整合素α4的含量；

[0039] 4)检测或辅助检测待测样品中是否含有整合素α4；

[0040] 5)检测或辅助检测与抗整合素α4的抗体结合的物质；

[0041] 6)诊断和/或治疗多发性硬化症。

[0042] 上述产品中，所述衍生物为如下(1)-(6)中任一所述的核酸适配体的衍生物：

[0043] (1)将序列1所示的核酸适配体删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；

[0044] (2)将序列1所示的核酸适配体进行核苷酸取代或修饰，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；

[0045] (3)将序列1所示的核酸适配体的骨架改造为硫代磷酸脂骨架，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；

[0046] (4)由序列1所示的核酸适配体编码的RNA分子，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体衍生物；

[0047] (5)由序列1所示的核酸适配体编码的肽核酸，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；

[0048] (6)将序列1所示的核酸适配体的一端或中间接上信号分子和/或活性分子和/或功能基团，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；

[0049] 所述(6)中的功能基团为生物素基团或荧光基团。

[0050] 上述应用中，所述核酸适配体的衍生物为在上述核酸适配体的5’端或3’端标记荧光基团或生物素基团。

[0051] 上述应用中，所述核酸适配体的衍生物为在上述核酸适配体的5’端标记荧光基团或生物素基团。

[0052] 上述产品中，所述待测样品为细胞；所述细胞具体为大鼠肺泡上皮细胞RAEC、人胚胎肺纤维细胞MRC-5、人肺泡上皮细胞A549、人宫颈癌细胞Hela、人肝癌细胞Huh-7、人膀胱癌细胞T24、人肝细胞癌细胞SK-Hep-1、人乳腺癌细胞MCF-7、人乳腺癌细胞MCF-7R、人卵巢癌细胞SKOV-3、人白血病细胞K562、人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人类上皮癌细胞A431、人类T细胞白血病细胞Jurkat E6-1、人回盲肠腺癌细胞HCT-8、人胚胎肾细胞HEK-293、人前列腺癌细胞PC-3、人类T细胞淋巴瘤Hut-78或人结肠癌细胞LoVo。

[0053] 本发明首次发现核酸适配体Sgc-4e可以特异性识别并结合整合素α4，并利用核酸适配体Sgc-4e与整合素α4的特异性结合作用建立了检测整合素α4的方法。通过实验证明：本发明的核酸适配体Sgc-4e具有亲和力高、特异性强、无免疫原性和无毒性等特点，基于核酸适配体Sgc-4e建立的检测整合素α4的方法可为治疗多发性硬化症提供了新的策略。附图说明

[0054] 图1为Sgc-4e-Bio提取的整合素α4蛋白代表性的多肽的ESI-MS和MS/MS图谱。2+ 2+
图1A为重型同位素标记的[M+2H] 离子ESI-MS谱图；图1B为轻型同位素标记的[M+2H]
2+
离子ESI-MS谱图；图1C为重型同位素标记的[M+2H] 离子MS/MS谱图，其中，R*表示重型
2+
同位素标记的精氨酸；图1D为轻型同位素标记的[M+2H] 离子MS/MS谱图。

[0055] 图2为用Sgc-4e-FAM和anti-CD49d-PE或anti-CD29-PE抗体共染色的Jurkat E6-1细胞的流式细胞仪检测结果。其中，L45-FAM是荧光素标记的对照核酸序列；IgG-PE是对照抗体。

[0056] 图3为抗整合素α4抗体或核酸适配体Sgc-4e分别与野生型K562细胞或转染后稳定表达整合素α4的K562细胞的流式细胞仪检测结果。

[0057] 图4为核酸适配体Sgc-4e、对照核酸序列L45和对照核酸适配体Sgc-3b的Western blot分析结果。

[0058] 图5为核酸适配体Sgc-4e在含不同离子的溶液中与表达整合素α4的Jurkat E6-1细胞的结合情况。其中，L45是对照核酸序列。

具体实施方式

[0059] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0060] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0061] Jurkat E6-1细胞来源于ATCC，产品目录号为TIB-152TM。

[0062] 结合缓冲液(pH＝7.4)是由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在溶剂中的浓度为：137mM NaCl、2.7mM KCl、2mM KH2PO4、10mM Na2HPO4、5mM MgCl2、1mM CaCl2。

[0063] 细胞裂解液为含有2％(体积分数)Triton X-100、0.5％(体积分数)SDS、5mM EDTA、0.1mM PMSF和2μg/mL蛋白酶抑制剂混合物(pepstatin、leupeptin和aprotinin)的结合缓冲液。

[0064] 实施例1、核酸适配体Sgc-4e特异性性识别并结合整合素α4的鉴定[0065] 一、核酸适配体Sgc-4e及其衍生物的制备

[0066] 1、核酸适配体Sgc-4e的合成

[0067] 通过DNA合成仪合成核酸适配体Sgc-4e，核酸适配体Sgc-4e的核苷酸序列如下：5’-TCACTTATTCAATTCGAGTGCGGATGCAAACGCCAGACAGGGGGACAGGAGA TAAGTGA-3’(序列1)；根据试验的需要可以在核酸适配体Sgc-4e的5’端或3’端上标记不同的分子(如生物素和荧光素等)，得到核酸适配体Sgc-4e的衍生物。

[0068] 2、DNA脱保护

[0069] 用冷氨水脱保护后，然后把DNA溶解在TEAA溶液当中。

[0070] 3、DNA纯化

[0071] 通过PAGE或高效液相色谱仪纯化。

[0072] 4、DNA干燥

[0073] 通过离心浓缩干燥。

[0074] 5、溶解测定浓度备用。

[0075] 二、核酸适配体Sgc-4e特异性性识别并结合整合素α4β1的鉴定[0076] 1、Jurkat E6-1细胞的同位素标记

[0077] 重型同位素标记的Jurkat E6-1细胞：向不含赖氨酸和精氨酸的RPMI 1640的培13 15
养基中分别加入重型同位素标记的赖氨酸([ C6, N2]-L-赖氨酸)和重型同位素标记的精
13
氨酸([ C6]-L-精氨酸)，使重型同位素标记的赖氨酸和重型同位素标记的精氨酸在培养基中的浓度分别为0.274mM和0.575mM。培养细胞6-7代后备用。

[0078] 轻型同位素标记的Jurkat E6-1细胞：向不含赖氨酸和精氨酸的RPMI 1640的培12 14
养基中分别加入轻型同位素标记的赖氨酸([ C6, N2]-L-赖氨酸)和轻型同位素标记的精
12
氨酸([ C6]-L-精氨酸)，使轻型同位素标记的赖氨酸和轻型同位素标记的精氨酸在培养基中的浓度分别为0.274mM和0.575mM。培养细胞6-7代后备用。

[0079] 2、生物素标记的核酸适配体Sgc-4e和生物素标记的对照核酸序列L45的制备[0080] (1)生物素标记的核酸适配体Sgc-4e(Sgc-4e-Bio)

[0081] 生物素标记的核酸适配体Sgc-4e为在核酸适配体Sgc-4e的5’端偶联生物素基团得到的，用结合缓冲液溶解Sgc-4e-Bio，依据紫外吸收标定浓度(100nM)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。

[0082] (2)生物素标记的核酸适配体L45(L45-Bio)

[0083] 生物素标记的对照核酸序列L45为在对照核酸序列L45的5’端偶联生物素基团得到的，用结合缓冲液溶解L45-Bio，依据紫外吸收标定浓度(100nM)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。对照核酸序列L45的核苷酸序列：TTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN。

[0084] 3、核酸适配体Sgc-4e靶标蛋白的提取

[0085] (1)分别取1×108个指数生长期的重型同位素标记的Jurkat E6-1细胞和轻型同位素标记的Jurkat E6-1细胞，PBS洗涤后，分别与4mL生物素标记的Sgc-4e(Sgc-4e-Bio)(100nM)或生物素标记的对照核酸序列L45(L45-Bio)孵育30分钟，然后加入甲醛固定10分钟。

[0086] (2)PBS洗涤2遍，加入1mL的细胞裂解液，孵育1小时。

[0087] (3)2000rpm离心去除沉淀，收集上清，加入链霉亲和素修饰的琼脂糖微球(购自GE公司，货号：17-5113-01)，孵育1小时。

[0088] (4)用PBS洗涤上述步骤(3)孵育后的链霉亲和素修饰的琼脂糖微球，洗涤5次，分别得到生物素标记的核酸适配体Sgc-4e提取的重型同位素标记的蛋白、对照核酸序列L45提取的轻型同位素标记的蛋白、生物素标记的核酸适配体Sgc-4e提取的轻型同位素标记的蛋白和对照核酸序列L45提取的重型同位素标记的蛋白。

[0089] 4、正向和反向实验

[0090] (1)正向实验：将生物素标记的核酸适配体Sgc-4e提取的重型同位素标记的蛋白与对照核酸序列L45提取的轻型同位素标记的蛋白混合，得到生物素标记的核酸适配体Sgc-4e提取的重型同位素标记的蛋白和对照核酸序列L45提取的轻型同位素标记的混合体系。

[0091] (2)反向实验：将生物素标记的核酸适配体Sgc-4e提取的轻型同位素标记的蛋白与对照核酸序列L45提取的重型同位素标记的蛋白混合，得到生物素标记的核酸适配体Sgc-4e提取的轻型同位素标记的蛋白和对照核酸序列L45提取的重型同位素标记的混合体系。

[0092] 5、蛋白的酶解和LC-MS鉴定

[0093] (1)DTT还原：分别向生物素标记的核酸适配体Sgc-4e提取的重型同位素标记的蛋白和对照核酸序列L45提取的轻型同位素标记的混合体系、生物素标记的核酸适配体Sgc-4e提取的轻型同位素标记的蛋白和对照核酸序列L45提取的重型同位素标记的混合体系中加入200μL 20mM二硫苏糖醇(DTT)，56℃反应45min。

[0094] (2)IAA烷基化：将步骤(1)的产物离心，弃上清(去除DTT)，向沉淀中分别加入200μL 55mM碘乙酰胺(IAA)，在37℃避光反应30min。

[0095] (3)将步骤(2)的产物离心，弃上清(去除IAA)，向沉淀中加入5μg质谱用胰蛋白酶(Promega公司，产品目录号：V5111)，37℃酶切过夜，得到酶切后的多肽。

[0096] (4)酶切后的多肽经过真空浓缩后，加入100ul水，利用Ziptip C18微柱脱盐。质谱分析前，放置-20℃冰箱。

[0097] (5)利用LTQ-Orbitrap Velos质谱仪(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)对步骤(4)的产物进行分析鉴定。

[0098] (6)数据搜索分析：将原始的质谱数据，利用MaxQuant搜索引擎(版本号：1.3.0.5)在IPI蛋白数据库(版本号：3.68)中检索。数据库搜索的一些参数如下：固定化修饰为半胱氨酸上的烷基化修饰，可变修饰为甲硫氨酸上的氧化修饰和蛋白质N端的乙酰化修饰。允许2个漏切位点，母离子容错量为20ppm，MS/MS碎片离子质量误差为0.5Da。
对于鉴定候选的蛋白，有2个或多于2个的独特的多肽鉴定出，且后验标准误差(PEP)小于-5
10 。候选蛋白需在正向实验和反向实验中同时被鉴定出。

[0099] 表1、利用SILAC鉴定出的结合核酸适配体Sgc-4e或对照核酸序列L45的蛋白质[0100]

[0101]

[0102] [a]PEP代表后验概率误差；[b]代表两次正向实验和两次反向实验比值的平均值与标准偏差。

[0103] 结果如表1所示：SILAC(稳定同位素标记技术)实验鉴定出20个蛋白，核酸适配体Sgc-4e与对照核酸序列L45提取蛋白丰度比值大于2的是踝蛋白1、整合素α4和整合素β1，其余包括7个内源性生物素化蛋白的比值都小于2。而踝蛋白1是细胞内蛋白，可以与膜蛋白整合素α4β1相互作用，引起胞内信号向胞外信号传导。说明核酸适配体Sgc-4e可以特异性的识别并结合整合素α4β1；核酸适配体Sgc-4e是与整合素α4还是整合素β1结合下述试验予以证明。其中，整合素α4质谱结果如图1所示：在正向实验中，重型2+
同位素标记的整合素α4被鉴定出(m/z 512.3是[M+2H] 离子的单一同位素峰)，图1C是其MS/MS谱图；在反向实验中，只有轻型同位素标记的整合素α4被鉴定出(m/z 508.3是
2+
[M+2H] 离子的单一同位素峰)，图1D是其MS/MS谱图。

[0104] 二、流式分析法检测核酸适配体Sgc-4e与整合素α4β1的结合

[0105] 1、核酸适配体溶液和抗体溶液的制备及细胞株的处理

[0106] (1)荧光素标记的核酸适配体Sgc-4e溶液(Sgc-4e-FAM)(100nM)的制备[0107] 荧光素标记的核酸适配体Sgc-4e为在核酸适配体Sgc-4e的5’端偶联荧光素基团得到的，用结合缓冲液溶解Sgc-4e-FAM，依据紫外吸收标定浓度(100nM)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。

[0108] (2)PE标记的抗整合素α4抗体溶液(anti-CD49d-PE)(1.25μg/mL)的制备[0109] PE标记的抗整合素α4抗体(anti-CD49d-PE)是eBioscience公司的产品，每个测试加入0.125μg，终浓度为1.25μg/mL。

[0110] (3)荧光素标记的对照核酸序列溶液(L45-FAM)(100nM)的制备

[0111] 荧光素标记的对照核酸序列L45-FAM为在对照核酸序列L45-FAM的5’端偶联荧光素基团得到的，用缓冲液溶解L45-FAM，依据紫外吸收标定浓度(100nM)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。对照核酸序列L45的核苷酸序列：TTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN。

[0112] (4)PE标记的鼠IgG1K同型对照免疫球蛋白溶液(lgG-PE)(1.25μg/mL)的制备[0113] PE标记的鼠IgG1K同型对照免疫球蛋白是eBioscience公司的产品，每个测试加入0.125μg，终浓度为1.25μg/mL。

[0114] (5)PE标记的抗整合素β1抗体溶液(anti-CD29-PE)(1.25μg/mL)的制备[0115] PE标记的抗整合素β1抗体(anti-CD29-PE)是eBioscience公司的产品，每个测试加入0.125μg，终浓度为1.25μg/mL。

[0116] (6)Jurkat E6-1细胞的培养

[0117] 将人白血病Jurkat E6-1细胞在含10％FBS、1％的青霉素和链霉素的RPMI 1640培养基中，37℃、5％的二氧化碳的条件下细胞培养箱中培养。取指数生长的细胞，直接吹散4
后用洗涤缓冲液洗涤，平均分为若干份，每份细胞数为5×10个。

[0118] 2、实验分组及处理

[0119] 将上述Jurkat E6-1细胞分别按照如下六组进行处理：

[0120] 第一组：在含有lgG-PE(1.25μg/mL)与L45-FAM(100nM)的100μL结合缓冲液中孵育Jurkat E6-1细胞；

[0121] 第二组：在含有anti-CD49d-PE(1.25μg/mL)与L45-FAM(100nM)的100μL结合缓冲液中孵育Jurkat E6-1细胞；

[0122] 第三组：在含有anti-CD49d-PE(1.25μg/mL)与Sgc-4e-FAM(100nM)的100μL结合缓冲液中孵育Jurkat E6-1细胞；

[0123] 第四组：在含有lgG-PE(1.25μg/mL)与Sgc-4e-FAM(100nM)的100μL结合缓冲液中孵育Jurkat E6-1细胞；

[0124] 第五组：在含有anti-CD29-PE(1.25μg/mL)与L45-FAM(100nM)的100μL结合缓冲液中孵育Jurkat E6-1细胞；

[0125] 第六组：在含有anti-CD29-PE(1.25μg/mL)与Sgc-4e-FAM(100nM)的100μL结合缓冲液中孵育Jurkat E6-1细胞。

[0126] 3、流式细胞仪分析

[0127] 用流式细胞仪分别对上述六组处理后的细胞进行分析。上述每组实验设置三个独立重复实验。

[0128] 流式细胞仪的检测结果如图2所示：第一组为对照抗体(lgG-PE)和对照核酸序列(L45-FAM)与细胞结合的情况；第二组为在对照核酸序列(L45-FAM)存在的情况下，抗整合素α4抗体(anti-CD49d-PE)与细胞结合的情况；第三组为抗整合素α4抗体anti-CD49d-PE和核酸适配体Sgc-4e-FAM同时存在的情况下与细胞结合的情况；第四组为在对照抗体(lgG-PE)存在的情况下，核酸适配体Sgc-4e-FAM与细胞结合的情况；第五组为在对照核酸序列(L45-FAM)存在的情况下，抗整合素β1抗体(anti-CD29-PE)与细胞结合的情况；第六组为抗整合素β1抗体anti-CD29-PE和核酸适配体Sgc-4e-FAM同时存在的情况下与细胞结合的情况。由于整合素α4和β1亚基在细胞膜表面形成异二聚体，核酸适配体Sgc-4e可以与抗整合素α4或β1抗体共结合于细胞表面，核酸适配体结合与其抗体结合呈良好线性关系，说明核酸适配体Sgc-4e可以与整合素α4β1结合，而与其抗体结合不互相影响。为了进一步验证核酸适配体Sgc-4e是与整合素α4还是整合素β1结合，进行了如下试验。

[0129] 四、流式分析法证明核酸适配体Sgc-4e与整合素α4的结合

[0130] 1、pcDNA3.1-α4重组载体的构建

[0131] 将序列3所示的编码人整合素α4(ITGA4)的DNA序列插入pcDNA3.1载体(Life Technologies公司)的NotI和XhoI酶切位点间，得到pcDNA3.1-α4重组载体。

[0132] 对pcDNA3.1-α4重组载体进行测序验证：结果表明pcDNA3.1-α4重组载体为将序列3所示的DNA序列插入pcDNA3.1载体的NotI和XhoI酶切位点间，且保持pcDNA3.1载体的其他序列不变得到的载体。该载体表达序列2所示的整合素α4。

[0133] 2、将5μg的pcDNA3.1-α4重组载体利用 Cell LineKit V试剂盒(Amaxa,Lonza)电转染至K562细胞中，转染后的细胞在含有0.8g/L遗传霉素(G418)的RPMI1640培养基的细胞培养液中培养，得到稳定表达整合素α4β1的K562细胞。

[0134] 3、进一步利用抗整合素α4抗体anti-CD49d-PE在流式细胞仪上将稳定表达整合素α4β1的K562细胞分选得到高表达整合素α4β1的K562细胞。

[0135] 4、将上述高表达整合素α4β1的K562细胞或K562细胞分别进行如下四组进行处理：

[0136] 第一组：在含有anti-CD49d-PE(1.25μg/mL)的100μL结合缓冲液中孵育K562细胞；

[0137] 第二组：在含有anti-CD49d-PE(1.25μg/mL)的100μL结合缓冲液中孵育稳定表达整合素α4β1的K562细胞；

[0138] 第三组：在含有Sgc-4e-FAM(100nM)的100μL结合缓冲液中孵育K562细胞；

[0139] 第四组：在含有Sgc-4e-FAM(100nM)的100μL结合缓冲液中孵育稳定表达整合素α4β1的K562细胞。

[0140] 5、流式细胞仪进行分析

[0141] 用流式细胞仪分别对上述四组处理后的细胞进行分析。上述每组实验设置三个独立重复实验。

[0142] 结果如图3所示：K562细胞高表达整合素β1，但是不表达整合素α4蛋白，稳定表达整合素α4β1的K562细胞可以同时表达整合素α4和整合素β1。从图中可以看出，anti-CD49d-PE抗体可以结合转染整合素α4的K562细胞(K562-α4β1)，但不结合野生型的K562细胞(K562-WT)；而核酸适配体Sgc-4e-FAM同样可以结合转染整合素α4的K562细胞(K562-α4β1)，也不结合野生型的K562细胞(K562-WT)。说明了核酸适配体Sgc-4e可以特异性结合整合素α4。

[0143] 实施例2、核酸适配体Sgc-4e在测定不同类型细胞的整合素α4表达情况中的应用

[0144] 为了明确核酸适配体Sgc-4e在不同的细胞中测定整合素α4(NP_000876)表达的情况，分别利用荧光标记核酸适配体Sgc-4e和抗整合素α4抗体通过流式细胞仪测定不同待测细胞的整合素α4的表达情况。具体步骤如下：

[0145] 一、荧光素标记的核酸适配体Sgc-4e溶液(Sgc-4e-FAM)的制备

[0146] 荧光素标记的核酸适配体Sgc-4e为在核酸适配体Sgc-4e的5’端偶联荧光素基团得到的，用结合缓冲液溶解Sgc-4e-FAM，依据紫外吸收标定浓度(100nM)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。

[0147] 二、细胞株的预处理

[0148] 分别取如下16种细胞株的生长对数期的细胞各一皿：大鼠肺泡上皮细胞(RAEC)、人胚胎肺纤维细胞(MRC-5)、人肺泡上皮细胞(A549)、人宫颈癌细胞(Hela)、人肝癌细胞(Huh-7)、人膀胱癌细胞(T24)、人肝细胞癌细胞(SK-Hep-1)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、耐药人乳腺癌细胞(MCF-7R)、人卵巢癌细胞(SKOV-3)、人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人类上皮癌细胞(A431)、人回盲肠腺癌细胞(HCT-8)、人胚胎肾细胞(HEK-293)、人前列腺癌细胞(PC-3)、人结肠癌细胞(LoVo)，用0.2％EDTA消化成单分散细胞悬液后，用洗涤缓冲液洗4
涤，分为若干份，每份细胞数为5×10个；分别将悬浮生长的人白血病细胞(Jurkat E6-1)、人白血病细胞(K562)、人类T细胞淋巴瘤(Hut-78)直接吹散后用洗涤缓冲液洗涤2遍，平
4
均分为若干份，每份细胞数为5×10个。

[0149] 三、流式细胞仪检测

[0150] 将实施例2的步骤一制备的荧光素标记的核酸适配体Sgc-4e(Sgc-4e-FAM)、荧光素标记的对照核酸序列L-45(L45-FAM)、对照抗体(lgG-PE)和抗整合素α4抗体(购自：eBioscience公司，产品目录号：12-0499)分别与19种不同来源的细胞系混合，分别得到混合液，将混合液在冰上孵育30min，用洗涤缓冲液洗涤两遍，过400目筛网后，上流式细胞仪进行检测。

[0151] 用BD公司的FACSCalibur流式细胞仪收集第一通道的荧光强度数据，作为细胞表面的荧光强度。每个样品的仪器测得荧光强度扣除细胞自发荧光，得到每个样品结合在细胞表面的核酸适体的荧光强度。设定一个阈值，使得细胞百分数有大于95％的对照核酸序列L-45处理的细胞荧光强度值低于该阈值。细胞荧光强度值大于该阈值的视为核酸适体与细胞能特异性结合。以细胞与核酸适体结合后荧光强度超过这一阈值的细胞百分数作为衡量核酸适体与细胞结合能力强弱。其中，无：待测细胞与核酸适体结合后的荧光强度超过这一阈值的细胞百分数小于15％；中等：待测细胞与核酸适体结合后的荧光强度超过这一阈值的细胞百分数为15-50％；强：待测细胞与核酸适体结合后的荧光强度超过这一阈值的细胞百分数为50-80％；非常强：待测细胞与核酸适体结合后的荧光强度超过这一阈值的细胞百分数大于80％。

[0152] 19种不同来源的待测细胞系的检测结果如表2所示：从表中可以看出，核酸适配体Sgc-4e测定结果与抗整合素α4抗体测定结果完全一致。说明核酸适配体Sgc-4e可以替代抗整合素α4抗体测定整合素α4的检测。

[0153] 表2、分别利用抗整合素α4抗体和核酸适配体测定不同类型细胞整合素α4的表达

[0154]

[0155]

[0156] 实施例3、二价离子对核酸适配体Sgc-4e与整合素α4的结合的影响2+ 2+ 2+

[0157] 整合素α4的活性受二价离子(特别是Mg 、Ca 或Mn )调控，为了证明核酸适配体Sgc-4e可以与具有活性整合素α4结合，研究了二价离子对核酸适配体Sgc-4e与整合素α4的结合情况的影响。

[0158] 一、荧光素标记的核酸适配体Sgc-4e溶液(Sgc-4e-FAM)的制备

[0159] 荧光素标记的核酸适配体Sgc-4e为在核酸适配体Sgc-4e的5’端偶联荧光素基团得到的，用结合缓冲液溶解Sgc-4e-FAM，依据紫外吸收标定浓度为100nM后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。

[0160] 二、将上述Jurkat E6-1细胞分别按照如下五组进行处理：

[0161] 第一组：在含有L45-FAM(100nM)的100μL结合缓冲液中孵育Jurkat E6-1细胞；

[0162] 第二组：在无二价离子、含有Sgc-4e-FAM(100nM)的100μL缓冲溶液中孵育Jurkat E6-1细胞；2+

[0163] 第三组：在只含有Mg 离子、Sgc-4e-FAM(100nM)的100μL缓冲溶液中孵育Jurkat E6-1细胞；2+

[0164] 第四组：在只含有Ca 离子、Sgc-4e-FAM(100nM)的100μL缓冲溶液中孵育Jurkat E6-1细胞；2+

[0165] 第五组：在只含有Mn 离子、Sgc-4e-FAM(100nM)的100μL缓冲溶液中孵育Jurkat E6-1细胞；

[0166] 上述缓冲溶液由20mM Hepes(pH 7.4)和140mM NaCl组成。

[0167] 2、流式细胞仪进行分析

[0168] 用流式细胞仪分别对上述五组处理后的细胞进行分析。上述每组实验设置三个独立重复实验。

[0169] 结果如图4所示：在无二价离子存在时，整合素α4无活性，核酸适配体Sgc-4e不2+ 2+ 2+
与整合素α4结合；而在Mg 、Ca 或Mn 存在时，整合素α4具有活性，核酸适配体Sgc-4e与整合素α4高特异性结合。

[0170] 实施例4、核酸适配体Sgc-4e pull-down细胞裂解液中的整合素α4[0171] 为了明确核酸适配体Sgc-4e在Western blot、Co-IP等方面的应用，利用生物素标记的核酸适配体Sgc-4e pull-down细胞裂解液中的整合素α4。

[0172] 一、生物素标记的核酸适配体Sgc-4e溶液(Sgc-4e-FAM)的制备

[0173] 荧光素标记的核酸适配体Sgc-4e为在核酸适配体Sgc-4e的5’端偶联荧光素基团得到的，用结合缓冲液溶解Sgc-4e-FAM，依据紫外吸收标定浓度为100nM后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。

[0174] 二、蛋白提取

[0175] 1、各取2×107个指数生长人白血病细胞(Jurkat E6-1)，PBS洗涤后，分别与对照核酸序列L45、对照核酸适配体Sgc-3b或核酸适配体Sgc-4e孵育30min，然后加入1％的甲醛交联10min。

[0176] 核酸适配体Sgc-3b的核苷酸序列：5’-CTTATTCAATTCCCGTGGGAAGGCTATAGAGGGGCCAGTCTATGAATAAG-3’；

[0177] 对照核酸序列L45的核苷酸序列：TTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN。

[0178] 2、用结合缓冲液洗涤2遍后，分别加入1mL的细胞裂解液震荡孵育60min。

[0179] 3、7000rpm离心，取上清分别加入20ul链霉亲和素琼脂糖微球，震荡孵育60min，然后洗涤5遍。

[0180] 三、Western blot

[0181] 1、微球分别加入1×SDS上样缓冲溶液，在95℃加热变性30min，然后上样，150V 电压电泳；

[0182] 2、利用Trans-Blot Turbo转移系统(伯乐公司)在4℃将蛋白转膜至PVDF膜，然后利用含5％牛奶的PBS-T(PBS with 0.1％Tween)溶液在4℃封闭孵育6小时；

[0183] 3、然后加入抗CD-49d抗体(兔抗人抗体ab81280，1：4000稀释，Abcam，)4℃过夜孵育；

[0184] 4、洗涤三遍后，加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗室温孵育1小时；

[0185] 5、震荡洗涤三次，加入Pierce ECL Western Blotting底物反应5min，显影。

[0186] 结果如图5所示：核酸适配体Sgc-4e pull-down的样品在150kD处有条带，表明核酸适配体Sgc-4e可以pull-down整合素α4，而对照核酸序列L45或对照核酸适配体Sgc-3b却不能够pull-down整合素α4。说明核酸适配体Sgc-4e可以替代抗整合素α4抗体用于Western blot、Co-IP、ELISA中。

[0187] 抗整合素α4的抗体那他珠单抗(Natalizumab)是一种已在临床上应用的治疗多发性硬化的抗体药物，而核酸适配体Sgc-4e可与具有活性形式的整合素α4结合，因此其具有开发治疗多发性硬化的药物或制品的用途。

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