枝孢瓶霉菌株LJ1及其应用
阅读：941发布：2020-05-12
专利汇可以提供枝孢瓶霉菌株LJ1及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 生物 技术领域，特别涉及枝孢瓶霉菌株LJ1及其应用。本发明公开了保藏编号为CGMCC NO.18140的枝孢瓶霉属菌株Cladophiaphora sp.LJ1，该菌株具有能够有效防治香蕉枯萎病，在香蕉枯萎病的抗性实验中，平皿共生实验中防治效果达88.89％，盆栽实验防治效果达53.67％；同时该菌株具有广谱的促生作用，可有效促进西红柿苗(茄科 植物 )和 铁 皮石斛苗(蓝科植物)的生长。，下面是枝孢瓶霉菌株LJ1及其应用专利的具体信息内容。
1.一种枝孢瓶霉属(Cladophiaphora sp.)菌株LJ1，保藏编号为CGMCC NO.18140。
2.根据权利要求1所述的枝孢瓶霉属(Cladophiaphora sp.)菌株LJ1，其特征在于，所述菌株从甘蔗根围土壤分离而得。
3.如权利要求1-2任意一项所述的枝孢瓶霉属(Cladophiaphora sp.)菌株LJ1在防治枯萎病上的应用；所述枯萎病为香蕉枯萎病。
4.如权利要求1-2任意一项所述的枝孢瓶霉属(Cladophiaphora sp.)菌株LJ1在促进被子植物生长上的应用；所述被子植物选自西红柿和/或铁皮石斛。
5.一种应用如权利要求1-2任意一项所述的枝孢瓶霉属(Cladophiaphora sp.)菌株LJ1对香蕉枯萎病进行防治的方法，所述方法为：将菌株LJ1接种到香蕉组培苗和/或植株中；所述接种方法为将香蕉组培苗直接接种于培养LJ1菌株的培养基中和/或将活化后的LJ1菌液浇灌到香蕉组培苗和/或植株的根系。
6.一种应用如权利要求1-2任意一项所述的枝孢瓶霉属(Cladophiaphora sp.)菌株LJ1促进被子植物生长的方法，所述方法为：将菌株LJ1接种到被子植物的组培苗和/或植株中；所述接种方法为将被子植物的组培苗直接接种于培养LJ1菌株的培养基中；所述被子植物选自西红柿和/或铁皮石斛。
枝孢瓶霉菌株LJ1及其应用
【技术领域】
[0002] 近几十年来，化肥和农药的使用对于保障粮食增产稳产起到了巨大的推动作用，但由于化学化肥、农药的长期不合理使用，严重威胁了环境和农产品安全。因此，寻找经济高效、与环境相容性好的农业新方法、新技术是解决当前环境污染、食品安全危机的迫切需求。而充分利用和发挥生态系统中微生物对农作物的促生和抗病虫功能，对提高农作物的生产能力，保护和改善农业生态环境，促进农业的可持续发展具有重要的生态和经济意义。内生真菌(Endophytic fungi)广泛存在于健康植物组织器官中，具有极其丰富的物种多样性和功能多样性。作为一类未被充分研究的微生物资源，内生真菌资源种类繁多，包括不少稀有、特殊(或新的分类单元)的菌株，其生态功能也逐渐被人们所发现和揭示。申请人在内生真菌研究领域取得了较好的成果，例如申请号为201410220964.7发明名称为《一种DSE菌株及其在甘蔗生产上的应用》的内生真菌，该真菌由申请人从广西北部湾红树植物分离而得，属于Devriesiasp属，具有促进铁皮石斛生长的作用；申请号为201610652927.2发明名称为《防治香蕉枯萎病的内生真菌L-14及其应用》的内生真菌，该真菌由申请人从土壤中诱捕分离获得，属于Schizothecium属，具有防治香蕉枯萎病的作用；可见，内生真菌在农业自然环境保护中具有广阔的开发利用前景。为了充分发掘内生真菌的生态功能，有必要进一步在丰富多样的内生真菌种质资源中筛选获得更多更优异的优良菌株，为其开发利用提供资源保障。
【发明内容】
【发明内容】
[0003] 鉴于上述发掘更多性状优良促生内生真菌，促进内生真菌种质资源的开发利用，本发明目的在于提供一种枝孢瓶霉菌株(Cladophiaphora sp.)LJ1及其在促进被子植物生长、防治香蕉枯萎病上的应用。
[0004] 为达到上述目的，本发明筛选出一种枝孢瓶霉(Cladophiaphora sp.)菌株LJ1，其保藏编号为CGMCC NO.18140。属于真菌界，Cladophiaphora属，未知种。所述内生真菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.18140，保藏日期为2019年07月04日。
[0005] 该菌株在PDA平板培养基上的菌落形态如图1和图2所示，25℃下培养10天后菌落直径15mm左右，呈圆形至近圆形，褐色，间杂白色，绒毡状，不产分生孢子。
[0006] 进一步的，上述菌株从甘蔗根围土壤分离而得。
[0007] 本发明还包括一种分离枝孢瓶霉属(Cladophiaphora sp.)菌株LJ1的分离方法，该方法为采用无菌的的西红柿苗作为诱捕植物，种植在甘蔗根围土壤中进行诱捕，诱捕结束后从西红柿苗的的根部组织中采用1/2CM培养基进行菌株分离得到菌株LJ1。
[0008] 进一步的，所述1/2CM培养基的成分为：玉米粉琼脂8.5g，琼脂粉15g，蒸馏水1000mL。
[0009] 本发明还包括上述枝孢瓶霉属(Cladophiaphora sp.)菌株LJ1在防治枯萎病上的应用。
[0010] 进一步的，所述枯萎病为香蕉枯萎病。
[0011] 本发明还包括上述枝孢瓶霉属(Cladophiaphora sp.)菌株LJ1在促进被子植物生长上的应用。
[0012] 进一步的，所述被子植物选自西红柿和/或铁皮石斛。
[0013] 本发明还包括一种应用上述枝孢瓶霉属(Cladophiaphora sp.)菌株LJ1对香蕉枯萎病进行防治的方法，所述方法为：将菌株LJ1接种到香蕉组培苗和/或植株中；所述接种方法为将香蕉组培苗直接接种于培养LJ1菌株的培养基中和/或将活化后的LJ1菌液浇灌到香蕉组培苗和/或植株的根系。
[0014] 本发明还包括一种应用上述枝孢瓶霉属(Cladophiaphora sp.)菌株LJ1促进被子植物生长的方法，所述方法为：将菌株LJ1接种到被子植物的组培苗和/或植株中；所述接种方法为将被子植物的组培苗直接接种于培养LJ1菌株的培养基中。
[0015] 本发明具有以下有益效果：
[0016] 本申请的菌株枝孢瓶霉菌株属(Cladophiaphora sp.)LJ1能够有效防治香蕉枯萎病，在香蕉枯萎病的抗性实验中，平皿共生实验中防治效果达88.89％，盆栽实验防治效果达53.67％；同时该菌株具有广谱的促生效果，将LJ1接种于西红柿苗和铁皮石斛苗后，可有效促进西红柿苗(茄科植物)和铁皮石斛苗(蓝科植物)的生长。【附图说明】
[0017] 图1为本发明LJ1菌株在PDA培养基生长的菌落形态背面图；
[0018] 图2为本发明LJ1菌株在PDA培养基生长的菌落形态正面图；
[0019] 图3为本发明LJ1的ITS系统发育树图；
[0020] 图4为本发明LJ1菌株对西红柿苗的促生作用图；图中左边为未接种LJ1的CK组；右边为接种了LJ1的处理组；
[0021] 图5为本发明LJ1菌株对铁皮石斛苗的促生作用图；图中左边为未接种LJ1的CK组；右边为接种了LJ1的处理组；
[0022] 图6为本发明LJ1在西红柿根部的定殖情况。【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图和实施例和试验对本发明作进一步说明。
[0024] 实施例1：
[0025] 本发明提供了一株枝孢瓶霉(Cladophiaphora sp.)菌株LJ1，其保藏编号为CGMCC NO.18140。属于真菌界，Cladophiaphora属，未知种。所述内生真菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.18140，保藏日期为2019年07月04日。
[0026] 上述枝孢瓶霉菌在广西柳州市柳江县穿山镇甘蔗地甘蔗根围土壤(N24°01′25.86″，E109°24′59.97″，海拔95.5米)进行土壤采集并分离。
[0027] 分离方法采用诱捕法，具体为采用无菌的的西红柿苗作为诱捕植物，种植在甘蔗根围土壤中进行诱捕，诱捕结束后从西红柿苗的的根部组织中采用1/2CM培养基进行菌株分离得到菌株LJ1。
[0028] 进一步的，所述1/2CM培养基的成分为：玉米粉琼脂8.5g，琼脂粉15g，蒸馏水1000mL。
[0029] 将上述分离得到的作物促生内生真菌进行如下检测：
[0030] 1、菌株的形态学分类
[0031] 该菌株在PDA平板培养基上的菌落形态如图1和图2所示，25℃下培养10天后菌落直径15mm左右，呈圆形至近圆形，褐色，间杂白色，绒毡状，不产孢
[0032] 2、分子生物学鉴定
[0033] 采用TIANgel一管便捷式MasterMix试剂盒,直接使用真菌菌丝进行PCR。使用通用引物(如序列表SEQ ID NO:1-4)ITS1(5-'TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和LR5(5-'TCCTGAGGGAAACTTCG-3’)扩增rDNA的ITS1-5.8S-ITS4-28S序列(ITS+LSU)；NS1(5-'GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’)和NS4(5-'CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3’)扩增rDNA的18S rRNA(SSU)序列。
[0034] PCR反应体系为：TIANgel一管便捷式MasterMix 9μL，20μmol/L正反引物各1μL，模板DNA 1μL，超纯水定容至25μL。
[0035] PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min,53℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸10min。PCR扩增产物测序由上海生工生物工程技术有限公司完成。
[0036] 将上述测序结果进行修正、剪切后，最终获得ITS序列597bp，LSU序列907bp和SSU序列1068bp，在NCBI网站上用BLASTN程序进行比对，比对结果显示ITS序列与Cladophiaphora sp.的相似性为98.49％；LSU序列与Cladophiaphora sp.的相似性为99.78％；SSU序列与Cladophiaphora sp.的相似性为99.78％；
[0037] 步骤(5)聚类分析：采用ITS序列构建系统发育树(如图3所示)，发现该菌株与菌株Cladophialophora chaetospira(CBS 114747、CBS491.70、CBS514.63)以70％的支持率聚为一支，但是由于该菌株不产孢，鉴于目前所掌握的鉴定信息，还不能鉴定到种，因此，将其鉴定为Cladophiaphora属的一个未知种。
[0038] 实施例2：
[0039] 对香蕉枯萎病的防治作用：
[0040] 1、平皿防治效果：
[0041] (1)LJ1与香蕉组培苗的共培养：
[0042] 将菌株LJ1活化后接种与OMA培养基(MgSO4·7H2O 1.0g，KH2PO4 1.5g，NaNO3 1.0g，燕麦粉10g，琼脂粉11g，蒸馏水1 000mL)中培养10d，备用；然后选择长势一致的无菌香蕉组培苗移栽至菌落上，每个菌落移栽1株组培苗，每皿移栽3个，并命名为处理组；同时，将香蕉组培苗移栽至不接种LJ1的培养平皿上(每皿3个)，并命名为CK组；将处理组和CK组放入培养箱中在相同条件下进行共培养，培养条件为：26℃，光照强度为180μmol/m2·s2，光照时间为16h/d；培养时间为20d。
[0043] (2)致病培养基制备：
[0044] 将镰刀菌(病原菌)活化后接于水琼脂培养基上，每皿接种3个菌块，28℃培养4d获得治病培养基待用。
[0045] (3)平皿防效实验：
[0046] 将步骤(1)获得的LJ1-香蕉组培苗(处理组)和不含LJ1的香蕉组培苗(CK组)一同移栽至步骤(2)的致病培养基中，然后放入培养箱中，于28℃，光强180μmol/m2·s2，湿度80％条件下培养15d。对照直接接入带有镰刀菌的水琼脂平板上。观察并记录各处理的病级情况，计算病情指数和防治效果。
[0047] 对平皿苗的病情分级标准如下：
[0048] 0级-外观无可见症状；
[0049] 1级-香蕉植株长势无明显受阻，全株黄萎面积不超35％；
[0050] 2级-香蕉植株弱小，全株黄萎面积达35％-80％；
[0051] 3级-香蕉植株全株黄萎面积达80％以上，甚至全株枯死。
[0052] 2、盆栽防治效果：
[0053] (1)LJ1菌液的制备
[0054] 将活化后的LJ1接种于PDB液体培养基中，25℃下120rpm震荡培养14d，用灭菌纱布过滤收集菌丝，灭菌水洗涤菌丝数次后，将菌丝打碎配制成5×105cfu·mL-1的菌液。。
[0055] (2)致病菌悬浮液制备
[0056] 将镰刀菌活化后，配制成浓度为1×106cfu·mL-1的孢子液。
[0057] (3)盆栽防效实验：
[0058] 本实验在广西农业科学院微生物研究所网室内进行；取长势一致的香蕉幼苗(3-4叶)统一栽种于营养杯中，采用无病自然土种植；将香蕉幼苗均分为两组，一组为处理组，一组为对照组(CK组)；然后向处理组中的香蕉苗根部浇灌步骤(1)的LJ1菌液50mL；同步向对照组(CK)组浇灌蒸馏水50mL；之后按照同样处理方法每隔15d浇灌一次，共灌根三次。于最后一次灌根结束10d后，对处理组和CK组的香蕉苗同时进行伤根接种镰刀菌孢子悬浮液；放入人工气候培养箱中进行培养，在同等培养条件下观察香蕉苗植株发病情况，接种约后25d解剖香蕉植株球茎，观察记录香蕉苗病级，并计算防效，每个处理3个重复，每个重复10株香蕉苗。
[0059] 对盆栽苗的病情分级标准如下：
[0060] 0级-球茎健康无变色；
[0061] 1级：球茎变色面积占球茎面积的20％以下；
[0062] 2级-球茎变色面积占球茎面积的20％-40％；
[0063] 3级-球茎变色面积占球茎面积的40％-60％；
[0064] 4级-球茎变色面积占球茎面积的60％-80％；
[0065] 5级-球茎变色面积占球茎面积80％以上，甚至全部球茎变色坏死。
[0066] 上述平皿防治效果与盆栽防治效果的防效计算公式均相同，具体如下：
[0067]
[0068]
[0069] 通过上述公式的计算，本申请实验菌株LJ1对香蕉枯萎病的防治效果如表1所示：
[0070] 表1菌株LJ1对香蕉枯萎病的防治效果
[0071] 处理 平均平皿病情指数 平均平皿防治效果 平均盆栽病情指数 平均盆栽防治效果LJ1 0.11 88.89％ 0.17 53.67％CK 1.00 — 0.37 —
[0072] 由表1可见，在香蕉中接种LJ1菌株能提高香蕉对香蕉枯萎病的抗性，平皿共生实验中防治效果达88.89％，盆栽实验防治效果达53.67％。
[0073] 实施例3：
[0074] 对西红柿的促生作用：
[0075] 具体方法包括如下步骤：
[0076] (1)使用OMA培养基培养枝孢瓶霉属菌株LJ1，得到LJ1菌落；
[0077] (2)将饱满的西红柿种子进行表面消毒、催芽两天后移栽至步骤(1)培养好的LJ1菌落上，在每个菌落上分别移栽1株无菌苗，每皿3株苗；将接种了LJ1的培养皿组命名为处理组；同时，同步将无菌苗移栽到未接种步骤(1)菌株的空白OMA培养基上，每皿3株苗命名为CK组；
[0078] (3)将步骤(2)的处理组与CK组一起放入培养箱中进行共培养，培养温度为26℃，光照强度为180μmol/m2·s2，光照时间为16h/d。
[0079] (4)上述步骤(2)的每个处理重复4次；14d后观察西红柿苗的生长情况，将西红柿苗根部洗净后放入50℃烘箱中烘烤3d称量干重。
[0080] 经实验表明，14d后西红柿苗的生长情况如图4所示，图4中左边为未接种LJ1的CK组，右边为接种了LJ1的处理组，明显的右图西红柿苗的长势明显优于左图，说明LJ1能有效促进西红柿的生长。
[0081] 上述干重称量结果如表2所示：
[0082] 表2本申请促生菌株对西红柿苗生长的影响
[0083] 处理 干重(mg)处理组 9.5
CK 8.3
CK 8.3
[0084] 由表2可知，处理组的干重明显高于CK组，说明，本申请的LJ1菌株可有效提高西红柿的干重，促进西红柿生长。
[0085] 图6是LJ1在西红柿根部的定殖情况图，可见，西红柿根部细胞组织内有大量菌丝的分布殖，说明LJ1能很好的定殖在西红柿体内，并能建立良好的互惠共生关系。
[0086] 实施例4：
[0087] 对铁皮石斛的促生作用：
[0088] (1)将供试菌株活化后接种于OMA(燕麦粉10g/L，琼脂18g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，KH2PO4 1.5g/L，NaNO3 1g/L)上，每皿接种3个菌块，培养10d待菌落长大后备用；
[0089] (2)选择长势一致的无菌铁皮石斛组培苗移栽至菌落上，在每皿的3个菌落上分别移栽3株组培苗，并将接种了LJ1菌株的培养皿命名为处理组；同时，同步将无菌苗接种到不接种LJ1的空白燕麦培养基上(培养基成分与步骤(1)完全一致)，并命名为CK组；
[0090] (3)将步骤(2)的处理组和CK组一起放入培养箱中进行共培养，培养条件为26℃，光照强度为180μmol/m2·s2，光照时间为16h/d。
[0091] (4)上述步骤(2)进行4个重复的处理，培养60d后，测量株高等生长指标，将根部培养基洗净后在50℃烘箱中烘烤3d以上称量干重。
[0092] 经实验表明，60d后铁皮石斛苗的生长情况如图5所示，图5中左边为未接种LJ1的CK组，右边为接种了LJ1的处理组，明显的右图铁皮石斛苗的长势明显优于左图，说明LJ1能有效促进铁皮石斛的生长。
[0093] 本实施例还对铁皮石斛的株高、茎径、根长、分蘖、鲜重和干重进行测量或计算；并采用Microsoft excel 2003和DPS 7.05版数据统计分析软件进行分析，采用Student's T检验进行比较。得到的实验结果如表3所示：
[0094] 表3菌株LJ1对铁皮石斛组培苗生长的影响
[0095] 处理 株高(cm) 茎径(mm) 根长(cm) 分蘖(个) 鲜重(g) 干重(g)处理组 4.11±0.59 2.25±0.29 6.98±.21* 2.11±1.13 0.48±0.24 0.14±0.05CK 3.75±1.01 1.84±0.61 4.54±1.76 1.94±0.49 0.39±0.10 0.09±0.03
[0096] 说明：同列数据后*表示差异达5％显著水平。
[0097] 由表3可知，处理组的株高、茎径、根长、分蘖、鲜重和干重均优于CK组，说明本申请的枝孢瓶霉LJ1能有效促进铁皮石斛生长。
[0098] 综上所述，本申请的枝孢瓶霉LJ1属于新菌株，能起到防治香蕉枯萎病的作用，同时，还能有效促进西红柿和铁皮石斛等被子植物的生长，是一种性能良好的植物有益内生真菌，兼具抗病和促生的功能。
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