一株兼有高效解磷固氮及抑制病原真菌生长的产酸克雷伯氏菌
阅读：53发布：2020-10-28
专利汇可以提供一株兼有高效解磷固氮及抑制病原真菌生长的产酸克雷伯氏菌专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一株兼有高效解磷固氮及抑制病原 真菌 生长的产酸克雷伯氏菌，涉及一株克雷伯氏菌菌株。本 发明 提供了克雷伯氏菌菌株，不仅具有高效稳定的解磷固氮、营养促生的功能同时还具有抑制多种 植物 病原真菌的能 力 。本发明的一株兼有高效解磷固氮及抑制病原真菌生长的产酸克雷伯氏菌属于产酸克雷伯氏菌ASP-15，保藏在中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2010年12月17日，保藏号为CGMCC No.4488。本发明的产酸克雷伯氏菌ASP-15可取代单一功能的解磷、固氮菌株，可单独或与其它微生物菌株复合形成微生物制剂。，下面是一株兼有高效解磷固氮及抑制病原真菌生长的产酸克雷伯氏菌专利的具体信息内容。
一株兼有高效解磷固氮及抑制病原真菌生长的产酸克雷伯
氏菌
技术领域
[0001] 本发明涉及一株克雷伯氏菌菌株。
背景技术
[0002] 植物促生菌(planggrowth-promoting rhizobacteria PGPR）是一类寄居在植物根系周围的的微生物，以促生、营养和抗病等令人感兴趣的特点使得人们在近些年将其作为研制和开发的热点，已表现出良好的开发应用前景。对PGPR的研究主要集中在细菌分泌植物促生物质，对豆科结瘤的促生作用，对促进植物出芽的作用，对土传病害的生物调控作用等四个方面。
[0003] 大量的研究证实PGPR促生菌广泛存在于多种植物的根际。目前，已从20多个种属的根际细菌中鉴定出了具有防病促生潜能的PGPR菌，其中主要包括假单孢菌属(psendomonas)和芽孢杆菌属(Bacillus)。此外，还包括产碱菌属(Alccaligenes)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属（Azotobacter)、固氮螺菌属(Azospirillum)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、哈夫尼菌属(Hafnia)、黄杆菌属(Flavobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、黄单孢菌属（Xanthomonas)和慢生型根瘤菌属（Bradyrhizobium)等。
[0004] 从目前整个有关PGPR相关研究来看，PGPR的促生作用主要是通过以下途径完成：生物固氮；解磷细菌促进植物对磷的吸收；嗜铁素促进植物对铁的吸收和对病原菌的抑制作用；分泌植物激素对植物根部生长和根部形态学的积极作用；促进豆科植物与根瘤菌的共生效应；促进植物与有益根际真菌（如丛枝菌根（AM））的共生等。
[0005] 目前对PGPR研究侧重点仍然限于假单孢菌属和芽孢杆菌属等少数的种属，关于其他种属的报道很少，研究也不够深入。应用的菌株极少具有多种功能集于一体的，我国的PGPR的应用基础研究十分薄弱，函待加强。随着生物技术的不断发展，广谱性和适应能力强的优良菌株的选育，PGPR的最佳培养基配方、制剂的最佳类型，应用的合理剂量，与杀虫剂、除草剂、杀线虫剂配合施用等一系列的问题将逐一得到解决。微生物制剂由单一功能向多功能发展(如肥药合一)，与矿质元素或有机养分的合理复合等，也是当前一个研究和发展趋势。拓宽PGPR菌株的研究范围，筛选优良高效的PGPR菌株，PGPR高效培养物的获得，将是PGPR研究的新领域与新课题。此外，新型PGPR的组成和生产工艺复合菌剂的研制、开发和应用是目前微生物制剂一个热点方向。
发明内容
[0006] 本发明提供了一株克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ASP-15菌株，具有营养和促生作用，具有较高的解磷、固氮作用，还对多种植物病原真菌具有抑制作用，具有ACC脱氨酶，分泌铁载体的能力。
[0007] 本发明的一株兼有高效解磷固氮及抑制病原真菌生长的产酸克雷伯氏菌，它为产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ASP-15，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2010年12月17日，保藏号为CGMCC No.4488。。
[0008] 本发明产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ASP-15为革兰氏阴性菌，短杆状，长为0.3~1.5μm×0.6~6.0μm，宽为0.3~0.4μm，单个或成短链状排列，有荚膜，无芽孢，革兰氏反应阴性（G-）；在牛肉膏蛋白胨培养基上为圆形，稍呈半球形，直径为2~4mm，闪光，乳白色至淡黄色，边缘整齐粗糙，最适生长温度：28~30℃，最适生长pH为7.0~7.2。
[0011] 本发明的产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ASP-15通过16SrDNA序列比对分析，与克雷伯氏菌属（Klebsiella）的16SrDNA序列的同源性最高，相似性为99%，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定产酸克雷伯氏菌ASP-15属于克雷伯氏菌（Klebsiella），为产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ASP-15菌株。
[0012] 本发明产酸克雷伯氏菌ASP-15具有营养和促生作用，具有较高的解磷、固氮作用，还对多种植物病原真菌具有抑制作用，具有ACC脱氨酶，分泌铁载体的能力，除对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的抑制较抑菌率较弱18.2%外，对拟枝孢镰刀菌（Fusarium sporotrichiodes）、交链孢菌（Alternaria）基生根串珠霉（Thielaviopsis basicola），灰葡萄孢菌属（Botrytis cinerea）、棒孢菌属（Corynespora）炭疽菌属（Colletotrichum）等病原真菌抑菌率达57.8%～84.8%以上；对病原菌生长的抑制主要是由其菌体细胞的快速生长，营养竞争，抢占生态位引起的。
[0013] 本发明的产酸克雷伯氏菌应用范围广泛，可取代单一功能的解磷、固氮菌株，可单独或与其它微生物菌株复合形成微生物制剂，应用于农业生产。
[0014] 本发明所涉及的产酸克雷伯氏菌株（Klebsiella oxytoca）ASP-15属于植物促生菌的范畴，虽为单一菌株但却具有多重的功效，不仅具有高效稳定的解磷固氮、营养促生的功能同时还具有抑制多种植物病原真菌的能力，克服了目前国内应用的大部分微生物制剂所用菌株功能单一、种属单一与效果不稳定的弊病。配合其它农用微生物菌株，组成复合微生物制剂，更能强化微生物制剂的应用效果，丰富微生物制剂的功能，使微生物制剂同时具有了肥料、生防、促生等作用，符合农用微生物肥料由单一功能向复合多功能方向发展的趋势，同时由于菌株的多功能特点，在生产应用中还可极大地降低生产成本。
[0015] 本发明所涉及产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ASP-15，它属于克雷伯氏菌属（Klebsiella），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2010年12月17日，保藏号为CGMCCNo.4488。附图说明
[0017] 图2为本发明的产酸克雷伯氏菌ASP-15菌株革兰氏染色的G-的显微镜放大100倍的照片。
具体实施方式
[0018] 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
[0019] 具体实施方式一：本实施方式一株兼有高效解磷固氮及抑制病原真菌生长的产酸克雷伯氏菌，它为产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ASP-15，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2010年12月17日，保藏号为CGMCC No.4488。
[0020] 本实施方式产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ASP-15为革兰氏阴性菌，短杆状，长为0.3~1.5μm×0.6~6.0μm，宽为0.3~0.4μm，单个或成短链状排列，有荚膜，无芽孢，革兰氏反应阴性（G-）（如图1和2所示）；在牛肉膏蛋白胨培养基上为圆形，稍呈半球形，直径2~4mm，闪光，乳白色至淡黄色，边缘整齐粗糙，最适生长温度：28~30℃，最适生长pH：7.0~7.2。
[0021] 参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》对产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ASP-15进行生理生化鉴定：明胶水解试验阴性，吲哚试验阴性，V．P反应阳性，M．R反应阴性。
[0022] 本实施方式产酸克雷伯氏菌ASP-15具有营养和促生作用，具有较高的解磷、固氮作用，还对多种植物病原真菌具有抑制作用，具有ACC脱氨酶，分泌铁载体的能力，除对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的抑制较抑菌率较弱18.2%外，对拟枝孢镰刀菌（Fusarium sporotrichiodes）、交链孢菌（Alternaria）基生根串珠霉（Thielaviopsis basicola），灰葡萄孢菌属（Botrytis cinerea）、棒孢菌属（Corynespora）炭疽菌属（Colletotrichum）等病原真菌抑菌率达57.8%～84.8%以上；对病原菌生长的抑制主要是由其菌体细胞的快速生长，营养竞争，抢占生态位引起的。
[0023] 本实施方式的产酸克雷伯氏菌应用范围广泛，可取代单一功能的解磷、固氮菌株，可单独或与其它微生物菌株复合形成微生物制剂，应用于农业生产。
[0024] 本实施方式所涉及的产酸克雷伯氏菌株（ASP-15）属于植物促生菌的范畴，虽为单一菌株但却具有多重的功效，不仅具有高效稳定的解磷固氮、营养促生的功能同时还具有抑制多种植物病原真菌的能力，克服了目前国内应用的大部分微生物制剂所用菌株功能单一、种属单一与效果不稳定的弊病。配合其它农用微生物菌株，组成复合微生物制剂，更能强化微生物制剂的应用效果，丰富微生物制剂的功能，使微生物制剂同时具有了肥料、生防、促生等作用，符合农用微生物肥料由单一功能向复合多功能方向发展的趋势，同时由于菌株的多功能特点，在生产应用中还可极大地降低生产成本。
[0025] 具体实施方式二：本实施方式的产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ASP-15由黑龙江地域的玉米根际土壤筛选得到。筛选按以下步骤进行：将采集的作物根际土，风干、研碎、过筛，取其中10.0g过筛后的土壤于带有玻璃珠的100mL无菌水中制成样品菌悬-1液，此悬液的浓度为10 ，在恒温振荡器上以200转/min充分震荡30min，从该样品菌悬液-2
中取5mL加入到45mL的无菌水三角瓶中制成菌悬液的浓度为10 ，再以同样的方法进行-4 -2 -3 -4
10倍的梯度稀释，直至稀释液的浓度为10 为止。取其中10 、10 和10 浓度的菌悬液各
0.1mL于葡萄糖一天门冬酰胺培养基（磷细菌分离培养基）和DN培养基（固氮菌分离培养基）中，30℃恒温培养，观察颜色变化及透明圈大小，进行初筛，直至获得单菌落，即得产酸克雷伯氏菌ASP-15。
中取5mL加入到45mL的无菌水三角瓶中制成菌悬液的浓度为10 ，再以同样的方法进行-4 -2 -3 -4
10倍的梯度稀释，直至稀释液的浓度为10 为止。取其中10 、10 和10 浓度的菌悬液各
0.1mL于葡萄糖一天门冬酰胺培养基（磷细菌分离培养基）和DN培养基（固氮菌分离培养基）中，30℃恒温培养，观察颜色变化及透明圈大小，进行初筛，直至获得单菌落，即得产酸克雷伯氏菌ASP-15。
[0026] 对筛选得到的产酸克雷伯氏菌ASP-15进行分子鉴定，按以下步骤进行：用热破壁法提取菌株的总DNA，采用细菌的16SrDNA通用引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后利用胶回收试剂盒（购买自TIANGEN天根生化科技公司）回收纯化PCR产物，之后进行克隆、转化，筛选阳性克隆子菌落，经扩大培养后委托北京Invitrogen生命科技有限公司测序。
[0027] 产酸克雷伯氏菌ASP-15的16SrDNA序列长度为1575bp（如序列表Seq ID No：1所示），其序列提交至GenBank，以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，该序列与克雷伯氏菌属（Klebsiella）的16SrDNA序列的同源性最高，保守区相似性为99%，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定产酸克雷伯氏菌ASP-15属于克雷伯氏菌属（Klebsiella），为产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）。
[0028] PCR引物购买自上海生工生物技术有限公司，其他试剂购自于大连宝生物工程有限公司。
[0029] 对本实施方式的产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ASP-15进行功能验证：
[0030] 1）产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ASP-15解磷功效检测，具体方法如下：
[0031] 以卵磷脂作为有机磷源，以Ca3(PO4)2作为无机磷源，（培养基成分参见农业行业标准NY412-2000）用于菌株解磷性能的测定，将产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ASP-15以0.5%接种量接种于有机磷、无机磷液体培养基中，在温度为30℃，转速为180r/min的条件下振荡培养72h，将培养后的发酵液加入0.3g的无磷活性炭脱色约30min，然后以12000r/min的速度4℃离心20min，取上清液，采用钼锑钪比色法，利用Lambda 20分光光度计在680nm下进行速效磷含量的测定。
[0032] 结果为本实施方式的产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ASP-15在无机磷发酵液中，速效磷含量为0.656%；有机磷发酵液中，速效磷含量为2.167%；说明该菌株具有降解有机及无机难溶性磷为植物可吸收利用速效磷的功效，为作物提供磷素营养，有利于农作物的吸收利用，对农作物的生长有良好的促进作用。速效磷含量的测定具体方法参见农业行业标准NY412-2000。
[0033] 2）产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ASP-15固氮功效检测，具体方法如下：
[0034] 挑取经培养18h的产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ASP-15菌株斜面1~26 7
环，加入9mL无菌水中，制成具体浓度为10~10cfu/mL的菌悬液，用注射器吸取1mL菌悬液放入5mL固氮培养基的血清小瓶中，在28℃恒温培养72h后，换上密封橡胶圈，用螺丝套夹紧后，吸出2mL空气，加入等量乙炔气，28℃恒温培养72h，采用乙炔还原法气相色谱测定固氮酶活性，计算乙炔乙烯峰高比换算成乙烯生成量，计量单位为umol/(mL.h)，以不接种菌注有的C2H4血清小瓶为对照，用日本岛津公司的GC-14B气相色谱仪测定生成量，色谱分析条件：玻璃色谱柱4mm×2000mm，担体为GDX502，柱温60℃，FID检测器温度100℃，进样口温度100℃；气体流量：载气(N2)70kPa，H266kPa，空气48kPa；
环，加入9mL无菌水中，制成具体浓度为10~10cfu/mL的菌悬液，用注射器吸取1mL菌悬液放入5mL固氮培养基的血清小瓶中，在28℃恒温培养72h后，换上密封橡胶圈，用螺丝套夹紧后，吸出2mL空气，加入等量乙炔气，28℃恒温培养72h，采用乙炔还原法气相色谱测定固氮酶活性，计算乙炔乙烯峰高比换算成乙烯生成量，计量单位为umol/(mL.h)，以不接种菌注有的C2H4血清小瓶为对照，用日本岛津公司的GC-14B气相色谱仪测定生成量，色谱分析条件：玻璃色谱柱4mm×2000mm，担体为GDX502，柱温60℃，FID检测器温度100℃，进样口温度100℃；气体流量：载气(N2)70kPa，H266kPa，空气48kPa；
[0035] 结果为本实施方式的产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ASP-15的固氮酶活性为45.2C2H4μmol/mL.h。说明该菌株生长中可产生固氮酶，具有固定转化氮素的功效，能为作物提供氮素营养，有利于农作物的吸收利用，对农作物的生长有良好的促进作用。
[0036] 3）产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ASP-15抑病功效检测，具体方法如下：
[0037] 挑取经培养18h的产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ASP-151~2环于无菌水中，振荡均匀，吸取0.05mL菌悬液放入PDA土豆汁平板上，用玻璃刮刀涂匀后，在平板中心接种病原菌，同时，将病原菌接种于不加菌悬液的空白PDA平板上作为对照，涂布菌块至直径为0.5cm，3次重复，30℃恒温培养5~7d观察生长状况，测定各平板上病原菌菌落直径，依下列公式计算抑菌率：
[0038] 其中：
[0039] A—接种菌的处理组病原菌菌落直径，cm
[0040] B—对照组病原菌菌落直径，cm
[0041] 0.5—接种点病原菌菌落直径，cm
[0042] 测定结果如表1所示，结果表明：产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ASP-15，除对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporurn）的抑制较抑菌率较弱18.2%外，对拟枝孢镰刀菌（Fusarium sporotrichiodes）、交链孢菌（Alternaria）基生根串珠霉（Thielaviopsis basicola），灰葡萄孢菌属（Botrytis cinerea）、棒孢菌属（Corynespora）、炭疽菌属（Colletotrichum）等病原真菌抑菌率达58.4％~84.8%。
[0043] 表1产酸克雷伯氏菌对病原菌生长的影响
[0044]
[0045] 4）验证产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ASP-15是否可产生ACC脱氨酶，具体方法如下：
[0046] 挑取经培养18h的产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ASP-151～2环于9mL6 7
去离子水中，振荡均匀，制成菌体浓度为10~10cfu/mL的菌悬液，吸取0.5mL菌悬液移入
100mL的ADF(含3mmol/L ACC作为唯一氮源)培养液中，在温度为28℃，转速为150r/min条件下振荡培养20~24h，吸取0.02mL培养后的发酵菌悬液涂布于ADF平板上，重复3次，然后在28℃培养3d，发现ASP-15菌株在ADF的培养基中可以正常生长，即可以利用ACC作为唯一氮源，证明ASP-15具有ACC脱氨酶。
去离子水中，振荡均匀，制成菌体浓度为10~10cfu/mL的菌悬液，吸取0.5mL菌悬液移入
100mL的ADF(含3mmol/L ACC作为唯一氮源)培养液中，在温度为28℃，转速为150r/min条件下振荡培养20~24h，吸取0.02mL培养后的发酵菌悬液涂布于ADF平板上，重复3次，然后在28℃培养3d，发现ASP-15菌株在ADF的培养基中可以正常生长，即可以利用ACC作为唯一氮源，证明ASP-15具有ACC脱氨酶。
[0047] 5）验证产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ASP-15是否具有铁载体能力[0048] 挑取经培养18h的产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）ASP-151～2环加入到6 7
9mL的去离子水中，振荡均匀，制成菌体浓度为10~10cfu/mL的菌悬液，吸取0.05mL于CAS（chrome azurol S，络天青）培养基琼脂平板上，涂匀，3次重复，在温度为28℃条件下培养
48h，发现产酸克雷伯氏菌在CAS琼脂平板上生长良好，在菌落周围有较为明显的橘黄色透明晕圈，说明ASP-15有分泌铁载体的能力。
9mL的去离子水中，振荡均匀，制成菌体浓度为10~10cfu/mL的菌悬液，吸取0.05mL于CAS（chrome azurol S，络天青）培养基琼脂平板上，涂匀，3次重复，在温度为28℃条件下培养
48h，发现产酸克雷伯氏菌在CAS琼脂平板上生长良好，在菌落周围有较为明显的橘黄色透明晕圈，说明ASP-15有分泌铁载体的能力。
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