一种用于防治根结线虫的含信号蛋白组合物及其制备方法和应用
阅读：536发布：2020-05-13
专利汇可以提供一种用于防治根结线虫的含信号蛋白组合物及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于农业 植物 保护 领域，特别是涉及一种用于防治根结 线虫 的含 信号 蛋白组合物及其制备方法和应用。该组合物包含活性组分A信号蛋白，活性组分B生防菌孢子粉，活性组分C非熏蒸型杀线剂；本发明为一种以 生物 防治为主、 化学防治 为辅的根结线虫防治方法，通过提高作物抗逆能 力 、提高作物生长活力、减弱根结线虫侵染能力和侵染后的生成固定取食位点能力等多个方面，达到联合作用来防治根结线虫的目的；该组合物的成分在一定配比范围内表现出明显的协同增效作用，与包含成分的单独使用相比明显提高防治效果，减少用药剂量，减少了少量合成化学物质对生态环境可能造成的残留。，下面是一种用于防治根结线虫的含信号蛋白组合物及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种用于防治根结线虫的含信号蛋白组合物，其特征在于，该组合物包含A、B、C三种活性组分，其中活性组分A为信号蛋白，活性组分B为生防菌孢子粉，活性组分C为非熏蒸型杀线剂；
所述信号蛋白为超敏蛋白-HP；所述生防菌孢子粉为无花果拟盘多毛孢固体发酵所得的发酵物与孢子混合物-SP；所述非熏蒸型杀线剂为硫代磷酸酯类非熏蒸型杀线剂imicyafos-IM。
2.根据权利要求1所述的含信号蛋白组合物，其特征在于，所述信号蛋白、生防菌孢子粉和非熏蒸型杀线剂重量配比为1 10:50 200:10 100。
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3.根据权利要求1或2所述的含信号蛋白组合物，其特征在于，所述生防菌孢子粉采用以下方法发酵而成：
（1）将无花果拟盘多毛孢菌种在PDA斜面上划线，28℃下活化数代；
（2）选取生长旺盛、颜色鲜亮的斜面培养菌物，加入0.5%吐温无菌水，用玻璃棒搅动混匀后，计数板测定浓度并配置成107个/ml浓度的孢子液；
（3）采用塑料瓶进行固体发酵，将固体发酵培养基灭菌冷却后接种孢子液6ml，28℃下固体发酵，7天后将固体发酵产物置于30 35℃条件下干燥24小时，称取干燥完全的发酵产~
物，检测孢子数量不低于10亿个/克。
4.根据权利要求3所述的含信号蛋白组合物，其特征在于，所述固体发酵培养基的配方为麸皮50g、葡萄糖0.5g、硫酸铵0.25g、磷酸二氢钾0.025g，加入去离子水60g。
5.根据权利要求1-4任一项所述的含信号蛋白组合物，其特征在于，所述组合物由活性成分和农药助剂制成农药上允许的任一剂型。
6.根据权利要求5所述的含信号蛋白组合物，其特征在于，该组合物由1 85%重量份的~
活性成分与99 15%重量份的农药助剂或辅料组成农药上允许的剂型。
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7.根据权利要求5或6所述的含信号蛋白组合物，其特征在于，所述剂型为颗粒剂、可湿性粉剂、水分散粒剂。
8.根据根据权利要求4-7任一项所述的含信号蛋白组合物，其特征在于，所述农药助剂选自自载体、溶剂、分散剂、润湿剂、胶粘剂、增稠剂、粘合剂或表面活性剂中的一种或几种。
9.根据权利要求1所述的含信号蛋白组合物，其特征在于，该组合物中还可以含有其它植物根际促生菌和食线虫真菌。
10.一种如权利要求1-9任一项所述的含信号蛋白组合物在防治根结线虫、促进蔬菜作物生长活力方面的应用。
一种用于防治根结线虫的含信号蛋白组合物及其制备方法和
应用
技术领域
背景技术
[0002] 根结线虫（Meloidogynespp.）是一种土传病害，它寄主十分广泛，可侵染几乎所有的维管束类植物，因此绝大多数蔬菜作物都是它的良好寄主。根结线虫生活周期中，除了侵染态的二龄幼虫，其它时期都在植物根部或卵壳内。一龄幼虫在卵壳内形成，经过一次蜕皮后形成带有口针的二龄幼虫，二龄幼虫用口针刺破卵壳进入土壤。侵染态的二龄幼虫在土壤间隙的水中游动，寻找合适的寄主并在寄主根尖处侵染到根的内部，在根部的维管束附近停止细胞间穿梭。在这里，二龄幼虫分泌特殊物质刺激周围植物细胞进行不正常分裂形成巨大细胞，之后根结线虫便以此巨大细胞为固定取食点，不再移动。二龄幼虫进行三次蜕皮后形成成熟的雌虫和雄虫，雄虫逸出根外不再产生危害，雌虫在固定取食位点吸取水分和营养，20 40天后在雌虫尾部、根的表皮处分泌形成卵囊，完成世代周期。~
[0003] 根结线虫通过固定取食位点大量吸取寄主营养和水分，这严重影响寄主对水分和营养的吸收；此外，根结线虫侵染过程中对植物根系造成的机械损伤也使寄主更易受到例如立枯病、枯萎病等其它土传病害的多重侵害，导致作物的复合染病。在当今中国农业生产中，尤其是在保护地设施蔬菜种植过程中，在集约化种植和品牌效应等多种因素的影响下，连茬复种现象广泛存在，为根结线虫的世代繁衍提供了良好的温床，也使得根结线虫病害日益严重。据统计，在辽宁、河北、山东、江苏等地的保护地温室大盆中，1-2年新建大棚根结线虫发病率为16.7-20%，而4年以上的老棚根结线虫发病率可高达87.5%，且随着大棚使用年限的增高，发病的严重程度也逐渐加重。根结线虫病害已经成为保护地蔬菜种植的头号病害。目前，我国设施蔬菜种植面积约为5900万亩，占全国蔬菜总产值的62.7%。根结线虫病害发生面积约为2000万亩，占设施蔬菜总种植面积的三分之一。据预测，中国每年因根结线虫危害蔬菜造成的损失约为50亿元，根结线虫病害已经成为影响国计民生的重要病害。
[0004] 考虑到人类生活环境和健康等因素，近年来绝大多数传统非熏蒸型杀线剂陆续被限制生产和使用，这导致市场上可使用的防治根结线虫药物品种十分稀少，这些杀线剂的反复使用使线虫抗药性和微生物降解作用不断增强，导致防治效率逐年下降，根结线虫病害已经成为中国设施蔬菜种植中最难控制的病害。
[0005] 在根结线虫病害防治中，化学防治方法因其高效、快速、使用方便等特点一直是设施蔬菜种植中防治根结线虫的主要方式。生物菌剂因其绿色、无残留等特点而广受关注，但因其防治效率不稳定的缺陷常常作为根结线虫的辅助手段来使用。化学防治主要是指非熏蒸型杀线剂的使用，生物防治主要是利用一些食线虫真菌等生防菌和一些促植物生长根际细菌（Plant Growth-Promoting Rhizobacteria，PGPR ），它们可以直接或间接地抑制根结线虫的孵化和侵染。当前面临的主要问题是，由于环保和人体健康等原因，绝大部分传统杀线剂已被停止或限制使用，这直接导致了市场上登记的杀线剂品种较少、价格较高。截止到2019年在国内登记使用的非熏蒸型杀线剂只有氟吡菌酰胺、阿维菌素、噻唑膦三种药物。此外，单一品种杀线剂的长期频繁使用产生的抗药性和微生物降解等问题减弱了这些杀线剂的使用效果。农户在利益的驱动下往往会选择提高农药的使用量，这造成了生产成本的提高和农药残留的不符合标准。而目前市场上作为辅助作用的生物菌剂，由于其机理多是通过真菌捕食作用和根部益生作用，其防治效果十分依赖其定殖能力，因此不同生境下防治效果很不稳定。同时，普通根结线虫病害防治药物的使用本身往往造成作物的药害，减少作物生物量和产量。因此，市场上亟需一种囊括生物菌剂、非熏蒸型杀线剂的高效、复合、绿色防治组合物，通过在根结线虫不同的生命周期阶段作用，达到综合治理高效防治的效果，同时能减少药害、促进作物活力，最终达到防治增产的目的。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于针对目前市场上抗根结线虫药物品种单一、大多数药物已登记时间较长、药效较低、生物化学农药组合较少等现状，提供一种的高效、复合、绿色的用于防治根结线虫的含信号蛋白组合物，该药物在提供高效的防治效果的前提下可显著减少非熏蒸型杀线剂的使用量，同时可避免根结线虫抗药性的产生、提高作物活力和生物量。
[0007] 本发明还提供了一种含信号蛋白组合物在根结线虫防治、促进蔬菜作物生长活力方面的应用。
[0008] 本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：本发明提供了一种用于防治根结线虫的含信号蛋白组合物，该组合物包含A、B、C三种活性组分，其中活性组分A为信号蛋白，活性组分B为生防菌孢子粉，活性组分C为非熏蒸型杀线剂；
所述信号蛋白为超敏蛋白-HP；所述生防菌孢子粉为无花果拟盘多毛孢固体发酵所得的发酵物与孢子混合物-SP；所述非熏蒸型杀线剂为硫代磷酸酯类非熏蒸型杀线剂imicyafos-IM。
所述信号蛋白为超敏蛋白-HP；所述生防菌孢子粉为无花果拟盘多毛孢固体发酵所得的发酵物与孢子混合物-SP；所述非熏蒸型杀线剂为硫代磷酸酯类非熏蒸型杀线剂imicyafos-IM。
[0009] 进一步的，所述信号蛋白、生防菌孢子粉和非熏蒸型杀线剂重量配比为1 10:50~ ~200:10 100。
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[0010] 本发明所使用的生防菌孢子粉采用以下方法发酵而成：（1）将无花果拟盘多毛孢菌种在PDA斜面上划线，28℃下活化数代；
（2）选取生长旺盛、颜色鲜亮的斜面培养菌物，加入0.5%吐温无菌水，用玻璃棒搅动混匀后，计数板测定浓度并配置成107个/ml浓度的孢子液；
（3）采用塑料瓶进行固体发酵，将固体发酵培养基灭菌冷却后接种孢子液6ml，28℃下固体发酵，7天后将固体发酵产物置于30 35℃条件下干燥24小时，称取干燥完全的发酵产~
物，检测孢子数量不低于10亿个/克。
（2）选取生长旺盛、颜色鲜亮的斜面培养菌物，加入0.5%吐温无菌水，用玻璃棒搅动混匀后，计数板测定浓度并配置成107个/ml浓度的孢子液；
（3）采用塑料瓶进行固体发酵，将固体发酵培养基灭菌冷却后接种孢子液6ml，28℃下固体发酵，7天后将固体发酵产物置于30 35℃条件下干燥24小时，称取干燥完全的发酵产~
物，检测孢子数量不低于10亿个/克。
[0012] 本发明提供的组合物由活性成分和农药助剂制成农药上允许的任一剂型。
[0013] 进一步的，所述组合物由1 85%重量份的活性成分与99 15%重量份的农药助剂或~ ~辅料组成农药上允许的剂型。
[0014] 上述剂型为颗粒剂、可湿性粉剂、水分散粒剂。
[0016] 进一步的，该组合物中还可以含有其它植物根际促生菌（PGPR）微生物菌剂。
[0017] 本发明还提供了一种上述含信号蛋白组合物在防治根结线虫、促进蔬菜作物生长活力方面的应用。
[0018] 为充分发挥本发明的优势效果，本发明的组合物还可以与其他诸如植物生长根际促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria， PGPR）的生防菌、农药或肥料混合使用。
[0019] 本发明所使用的无花果拟盘多毛孢菌种购自中国普通微生物菌种生物菌种保藏管理中心，编号为CGMCC3.15140，经活化后单菌固态纯种发酵得到。
[0020] 本发明的组合物可以制备成农药上可接受的粉剂、散粒剂、可湿性粉剂、颗粒剂等剂型。由于生防菌和IM杀线剂缺乏内吸性，本发明的组合物使用时直接作用于作物地下部分，主要指灌根、穴施等方法。可用已知的方法将本发明的组合物制备成各种剂型，可以将有效成分与助剂，如溶剂、固体载体，需要时可以与表面活性剂一起均匀混合、研磨，制备成所需要的剂型。所述助剂包括分散剂、崩解剂、粘结剂、载体等，都是农业领域制剂中常用或允许使用的各种成分，并无特别限定，具体成分和用量根据配方要求通过试验确定等。
[0021] 发明人在研究中发现，某些植物内生真菌的发酵物、非熏蒸型杀线剂在联合施用时具有协同增效作用，可以高效抑制根结线虫侵染态的二龄幼虫（J2）对寄主根系的侵染，生物防治和化学防治在适当的条件下可以起到良好的互补和协同作用，在提高药效的同时，相对减少了药物施用的量。普通杀线剂往往对根结线虫的卵孵化抑制作用不强，而生防菌的添加可良好弥补这一缺陷。此外，在组合物中加入一定量的植物抗逆信号蛋白能产生显著增效作用，进一步大幅减少根结线虫在植物体内的定殖、根瘿的形成、根结线虫雌虫的产卵数，并增强植株活力。生防菌、杀线剂和信号蛋白可分别在根结线虫的卵、二龄幼虫、侵染后定殖形成根瘿这三个阶段形成防护作用，因此三者的科学混配可起到“立体”的防治效果。经研究表明，本发明中抗逆信号蛋白、生物菌剂、非熏蒸型杀线剂在一定复配比例范围内，对设施蔬菜种植中根结线虫病害的防治还具有显著增效作用，在实际使用过程中，对危害黄瓜、番茄等茄科和葫芦科蔬菜的南方根结线虫有较好的防治效果。
[0022] 本发明的目的在于提供一种植物抗逆信号蛋白的组合物作为制备防治蔬菜根结线虫引起的病害药物的应用，同时提高作物活力。本发明提供的组合物对蔬菜作物的根结线虫病害有特效。
[0023] 本发明的优点为：（1）本发明组合物是植物抗逆信号蛋白、植物内生菌和少量的毒性小却能高效抑制根结线虫侵染态二龄幼虫活力的非熏蒸型杀线剂的有效复配而成，是一种以生物防治为主、化学防治为辅的根结线虫防治方法。
[0024] （2）本发明组合物可以提高作物抗逆能力、提高作物生长活力、减弱根结线虫侵染能力和侵染后的生成固定取食位点能力，通过多个方面联合作用来达到防治根结线虫的目的。因此化学合成药物的使用只是防治策略的一环，这减少了化学合成药物的使用，使该组合中的主要成分为天然存在的、无毒物质。
[0025] （3）本发明中，组合物的成分在一定配比范围内表现出明显的协同增效作用，与包含成分的单独使用相比明显提高防治效果，减少用药剂量，减少了少量合成化学物质对生态环境可能造成的残留。
[0026] （4）本发明组合物中的大部分主要成分都不直接作用于根结线虫，只是通过信号传导或生物菌剂复杂代谢物和共生作用达到防治根结线虫的目的，因此该组合物不易产生抗药性，这有效减少本组合药物的使用次数并延长其市场寿命。
[0028] 图1为IM对二龄幼虫的毒力测试。
[0029] 图2为SP对南方根结线虫二龄幼虫的毒力测试。
[0030] 图3为杀线威对南方根结线虫二龄幼虫的毒力测试。
[0031] 图4为不同药物对南方根结线虫卵孵化的抑制试验（括号数字为孵化出幼虫的静止率）。
[0032] 图5为组合药物对根结和生物量的影响（括号内为茎增长率）。
具体实施方式
[0033] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰明白，本发明以以下具体实施例进行说明，但本发明绝非限于以下例子。以下所述仅为本发明中典型类型实施例，仅仅用于解释本发明，但不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内，因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
[0034] （一）信号蛋白、植物内生菌和非熏蒸型杀线剂对根结线虫防治的室内测定1. 根结线虫二龄幼虫的毒力测试
研究对象采用北方冬暖大棚中最常见根结线虫——南方根结线虫（M. incognita），线虫最初从寿光市留吕镇冬暖大棚的番茄病根中采集，后经形态学、同工酶和寄主试验鉴定为南方根结线虫小种2（Meloidogyne incognita race 2）。在病根上挑取饱满、大粒单卵囊，将其接种到生长20天左右、长出三叶一心、无菌土栽培的“粉冠一号”番茄苗的根部，恒温培养箱（25℃，光照16h/8h）中进行保种和繁殖。然后，取接种后生长60天左右的番茄病根，自来水清洗表层土壤；解剖镜下挑取400 600个卵块，用0.5%次氯酸钠溶液浸泡并剧烈~
震荡3.5min；分别过150、45、25μm筛网（美国Spectrum Lab公司生产），用无菌水清洗数次后收集到样品瓶中备用。卵孵化抑制试验中用到的卵为48h内新提取的卵。孵化二龄幼虫时，将提取的卵置于自制孵化器中，在孵化池中加无菌水至刚好没过筛网，封口膜密封孵化池，置于培养箱（27℃）中孵化。收集24h内孵化出的二龄幼虫，立即用于实验分析。本实例中信号蛋白选用但不仅限于超敏蛋白、生防菌选用但不仅限于无花果拟盘多毛孢菌、非熏蒸型杀线剂选用但不仅限于有机磷类杀线剂imicyafos。
研究对象采用北方冬暖大棚中最常见根结线虫——南方根结线虫（M. incognita），线虫最初从寿光市留吕镇冬暖大棚的番茄病根中采集，后经形态学、同工酶和寄主试验鉴定为南方根结线虫小种2（Meloidogyne incognita race 2）。在病根上挑取饱满、大粒单卵囊，将其接种到生长20天左右、长出三叶一心、无菌土栽培的“粉冠一号”番茄苗的根部，恒温培养箱（25℃，光照16h/8h）中进行保种和繁殖。然后，取接种后生长60天左右的番茄病根，自来水清洗表层土壤；解剖镜下挑取400 600个卵块，用0.5%次氯酸钠溶液浸泡并剧烈~
震荡3.5min；分别过150、45、25μm筛网（美国Spectrum Lab公司生产），用无菌水清洗数次后收集到样品瓶中备用。卵孵化抑制试验中用到的卵为48h内新提取的卵。孵化二龄幼虫时，将提取的卵置于自制孵化器中，在孵化池中加无菌水至刚好没过筛网，封口膜密封孵化池，置于培养箱（27℃）中孵化。收集24h内孵化出的二龄幼虫，立即用于实验分析。本实例中信号蛋白选用但不仅限于超敏蛋白、生防菌选用但不仅限于无花果拟盘多毛孢菌、非熏蒸型杀线剂选用但不仅限于有机磷类杀线剂imicyafos。
[0035] 试验操作如下：试验在24孔培养板中进行，每孔试验体系总体积为1ml，每孔二龄幼虫为50±10条。HP的处理浓度分别为0、0.01、0.1、1mg/L；SP处理浓度分别为0、5、10、20、40 mg/L的浓度；IM处理浓度分别为0、0.1、1、10mg/L。参比药物选用已被限制使用的药物杀线威。对照组用无菌水代替药液，无菌水为去离子水经高温高压灭菌得到（下同）。试验体系中分别加入不同量的HP、SP、IM、杀线威和无菌水，培养箱中27℃温育72h后，在体视显微镜（德国蔡司，V20）下观察二龄幼虫，20秒的观察时间内无肉眼可见运动即判定为失去侵染能力。每个浓度重复4次，每个处理做三次试验。统计学分析：二龄幼虫死亡率对药物处理浓度做非线性回归，得到拟合度良好的Logistic曲线，并根据回归方程计算EC50值。之后复配试验中试验方法和单剂试验方法相同，选用浓度为0、5、10、20、40 mg/L和0、0.1、1、10mg/L浓度梯度。计算各配比EC50后，用孙云沛法计算混剂的共毒系数（CTC），以此来评价复配组合物对根结线虫二龄幼虫的活性。复配制剂的共毒系数（CTC）≥120表现为增效作用；CTC≤80表现为拮抗作用；80＜CTC＜120表现为相加作用。图1、图2及图3分别为IM、SP、杀线威对二龄幼虫的毒力测试曲线。HP、SP和IM对南方根结线虫二龄幼虫的室内毒力测定如表1所示。
[0036] 据图1-3显示，IM、SP和杀线威对二龄幼虫的EC50值分别为，2.66、9.71和10.65mg/L。HP对二龄幼虫无显著致死或致麻痹作用（图表未显示），而SP和IM均可对二龄幼虫表现出显著活性，且活性优于已被限制使用的传统高效杀线剂杀线威（oxamyl）。此外，本试验中二龄幼虫作用时间为72h，而之前实验结果表明2h和24h的作用时间下IM和SP的EC50值远大于杀线威（数据未显示），这表明本组合物中所用主要成分的急性毒性较低，生物安全性更好。
[0037] 由于HP对二龄幼虫无毒性作用，因此我们只做了发酵物和杀线剂的混配毒性测定，来考察两者的共毒效应，如表1。结果表明在无花果拟盘多毛孢菌固体发酵物和imicyafos在混配比例在2:1、5:1、10:1、和20:1时，在两者显示出十分显著的协同增效作用，协同系数分别为186.11、185.03、169.37和120.42。
[0038] 表1 超敏蛋白、无花果拟盘多毛孢菌发酵物和Imicyafos对南方根结线虫二龄幼虫的室内毒力测定2. 对根结线虫卵孵化抑制作用的测定
本试验在12孔微孔板中完成，取新鲜提取的南方根结线虫卵置于孔内，每孔放置约500颗，用无菌水清洗干净后加入药液，除HP为1mg/L外，其它成分终浓度均为10mg/L，组合物中HP、SP和IM含量比为1:20:10。每个处理6个重复，对照中用无菌水代替药液。7天后镜检，计数孵出的二龄幼虫，计算孵化率和孵出的二龄幼虫的静止率。试验采用完全随机设计，试验进行三次。方差分析检验重复性，结果表明P＞0.2，重复性良好。
本试验在12孔微孔板中完成，取新鲜提取的南方根结线虫卵置于孔内，每孔放置约500颗，用无菌水清洗干净后加入药液，除HP为1mg/L外，其它成分终浓度均为10mg/L，组合物中HP、SP和IM含量比为1:20:10。每个处理6个重复，对照中用无菌水代替药液。7天后镜检，计数孵出的二龄幼虫，计算孵化率和孵出的二龄幼虫的静止率。试验采用完全随机设计，试验进行三次。方差分析检验重复性，结果表明P＞0.2，重复性良好。
[0039] 根据图4，试验结果表明HP和IM均对卵的孵化无显著抑制作用， SP和杀线威对卵孵化有抑制作用，SP抑制作用最强，此时卵孵化率为15.36%，跟对照的25.35%相比抑制率达到39.41%。单剂作用下孵化出的二龄幼虫静止率IM最高达到62.95%，这说明本发明组合物中的成分单独作用时，对卵的作用主要发生在二龄幼虫通过口针刺破卵壳逸出之后。当HP、SP、和IM共同作用时，卵孵化率和孵出二龄幼虫的静止率均达到最低，卵孵化率降至3.34%，抑制率达到86.82%，孵化出的二龄幼虫静止率达到93.25%。组合物通过抑制卵孵化和抑制孵化出的二龄幼虫运动的双重作用，达到极佳的防治效果，防治效果显著优于传统杀线剂杀线威。
[0040] 3. 农药组合物在盆栽条件下对根结线虫的防治效果试验本试验在室外盆栽中进行，将生长30天、长出3叶1心的番茄苗（测试品种为“粉冠”）测量株高、根长、鲜重后，移入装有灭菌的混合沙质土壤（田园土、草炭、河沙体积百分含量分别为12.5%、37.5%和50%）的苗盆，苗盆直径6-8cm、高度16-18cm。配置浓度为1000个/ml的南方根结线虫的二龄幼虫虫液（制作方法同上），然后加入药液10ml，覆土。试验分三组，分别为对照、杀线威、HP、SP、IM、HP+SP+IM。试验方法如下：在苗的周围均匀等距打孔，每孔深度
3cm，然后用移液器均匀加入南方根结线虫虫液1ml，然后加入药液，覆土。处理组浓度均为
10mg/L，组合物中HP、SP和IM含量比为1:20:10。对照用无菌水代替药液。试验采取完全随机试验设计，每个处理12个重复。试验在自然条件下进行，按需浇水。40天后取样，测株高、根鲜重、根结数。本试验在2017年8月-10月完成。
3cm，然后用移液器均匀加入南方根结线虫虫液1ml，然后加入药液，覆土。处理组浓度均为
10mg/L，组合物中HP、SP和IM含量比为1:20:10。对照用无菌水代替药液。试验采取完全随机试验设计，每个处理12个重复。试验在自然条件下进行，按需浇水。40天后取样，测株高、根鲜重、根结数。本试验在2017年8月-10月完成。
[0041] 如图5所示，尽管HP对二龄幼虫无致死或致麻痹作用，在室外盆栽条件下对根瘿数也无显著抑制作用，但是HP可显著促进感染根结线虫番茄的生长活力，茎增长率达到94.83%，显著优于对照的85.76%。SP在抑制根结方面和杀线威相当，根结数分别为106.58和
109.31，和对照的296.37相比抑制率分别达到64.04%和63.12%。IM在所有单剂中抑制根结的能力最强，根结数为54.73，抑制率为81.53%。IM、杀线威尽管对根结数有显著抑制作用，但是也表现出显著药害作用，茎增长率和对照相当，分别为85.66%和83.72%。在组合物处理中，无论是根结抑制率还是茎增长率均为所有处理组中最优结果，根结数为1.67，根结抑制率为99.43%，茎增长率为116.91%和完全健康生长的番茄植株相当，组合物表现出各成分显著的协同增效作用。
109.31，和对照的296.37相比抑制率分别达到64.04%和63.12%。IM在所有单剂中抑制根结的能力最强，根结数为54.73，抑制率为81.53%。IM、杀线威尽管对根结数有显著抑制作用，但是也表现出显著药害作用，茎增长率和对照相当，分别为85.66%和83.72%。在组合物处理中，无论是根结抑制率还是茎增长率均为所有处理组中最优结果，根结数为1.67，根结抑制率为99.43%，茎增长率为116.91%和完全健康生长的番茄植株相当，组合物表现出各成分显著的协同增效作用。
[0042] 4.不同比例组合物盆栽条件下对根结线虫防治的测定本试验试验方法和试验时间同上。试验设六个处理组和对照组，对照组用无菌水代替药液。处理组组合物总浓度均为10mg/L。试验步骤同上，40天后检测根结数、根茎比、茎高，并计算茎增长率和根结抑制率，检测结果如表2所示。
[0043] 试验结果表明，信号蛋白、生防菌和非熏蒸型杀线剂在1:20:10的比例下，根结抑制率最高，达到98.02%，此时植株的生长活力也接近最高，茎增长率为106.48%。此外，在1:100:50-1:10:5的配比下，染病作物均获得较好的防治效果和较好的生长活力，该配比对于之后的田间试验有很好的指导价值。
[0044] 表2（二）含信号蛋白组合物的制剂实施例
实施例1：可湿性粉剂对番茄根结线虫的防治
配方：20%组合物（0.65%HP、13.0%SP、6.35%IM）、2.5%壬基酚聚氧乙烯醚（润湿剂）、2.5%木质素磺酸钠（分散剂）、0.5%环氧大豆油（助悬剂和稳定剂），余量为滑石粉（填料）。上述原料经混合、超微气流粉碎、混合工艺步骤制备。此外，19.35%（13.0%SP、6.35%IM）可湿性粉剂配方不同之处在于未添加HP，其余相同。5%HP可湿性粉剂中活性成分只包含5%HP，19.2%IM可湿性粉剂中活性成分只包含19.2%的IM，其余辅料和助剂相同。70.1%SP可湿性粉剂中只包含70.1%的无花果拟盘多毛孢菌发酵物，其余辅料和助剂相同。
实施例1：可湿性粉剂对番茄根结线虫的防治
配方：20%组合物（0.65%HP、13.0%SP、6.35%IM）、2.5%壬基酚聚氧乙烯醚（润湿剂）、2.5%木质素磺酸钠（分散剂）、0.5%环氧大豆油（助悬剂和稳定剂），余量为滑石粉（填料）。上述原料经混合、超微气流粉碎、混合工艺步骤制备。此外，19.35%（13.0%SP、6.35%IM）可湿性粉剂配方不同之处在于未添加HP，其余相同。5%HP可湿性粉剂中活性成分只包含5%HP，19.2%IM可湿性粉剂中活性成分只包含19.2%的IM，其余辅料和助剂相同。70.1%SP可湿性粉剂中只包含70.1%的无花果拟盘多毛孢菌发酵物，其余辅料和助剂相同。
[0045] 该实施例应用于番茄根结线虫的防治。试验于2018年4-7月在山东省寿光市留吕镇一个使用多年、严重感染根结线虫病害的番茄温室大棚中进行，经检测该温室土壤为肥沃壤土，pH7.1呈微碱性，有机质含量为2.1%。通过贝曼法测定地表15cm以上土壤中根结线虫的数量约为19个/kg。用密度梯度离心法测定卵的浓度约为64个/kg。本试验采取小区随机重复设计，每个小区9垄，垄间距约为0.8m，每垄移栽三叶一心的番茄苗18株，移栽后马上按照随机设计编号进行灌根。灌根时将20%可湿性粉剂按1:2000稀释溶解成悬浊液，然后灌根，每株灌根药液分别为2.5、5、7.5、10ml，折合有效成分用量分别为300、600、900和1200g a.i./hm2。其它可湿性粉剂用类似的方法进行灌根。30天后检测防治效果，检测方法和项目同上。结果见表3。
[0046] 表3根据田间试验结果（表3）表明，组合物中的成分单独使用时，对根结线虫有一定防治作用，但防治效果较差，HP对根结的抑制率最低为16.89%。IM单独使用时表现出良好的根结抑制作用，根结抑制率为80.93%，但是作物生长效果较差，茎增长率和染病作物相当。20%组合物可湿性粉剂对番茄南方根结线虫防治效果表现最好，组合物的协同增效作用十分显著，有效成分用量在300-1200 g a.i./hm2时，防治作用明显，根结抑制率分别达到80.58%、
87.92%、92.57%和93.12%，同时表现出对作物生长活力的促进作用，茎增长率分别为
138.23%、137.41%、139.76%和126.38%。
87.92%、92.57%和93.12%，同时表现出对作物生长活力的促进作用，茎增长率分别为
138.23%、137.41%、139.76%和126.38%。
[0047] 实施例2 20%可湿性粉剂对黄瓜根结线虫的防治配方同上，该实施例应用于黄瓜根结线虫的防治。试验于2018年6-7月在山东省寿光市一个使用多年、严重感染根结线虫病害的黄瓜温室大棚中进行，该大棚中根结线虫主要为南方根结线虫，含有少量花生根结线虫。试验方法和设计同上，所用试验对象为黄瓜苗，品种为“冬威”。30天后检测防治效果，检测项目包括根结数、黄瓜倒二叶片面积（叶面积=叶长×叶宽×0.743）、株高、黄瓜产量。具体结果见表4。
[0048] 表4研究结果表明（表4），在单剂处理中HP处理对黄瓜根结线虫防效最低为28.85%，19.2%IM可湿性粉剂防效较高，为82.35%。20%含信号蛋白组合物的可湿性粉剂对于黄瓜根结线虫的防效和促进作物生长活力方面均为最好，一次施用后30天时对黄瓜根结抑制率（防效）可达93.24%，倒二叶片面积和株高分别为73.79cm2和144.50，与其他单剂处理相比显示出组合物之间良好的协同增效作用。药物组合使用时黄瓜苗根系发达、根结少、植株生长旺盛，未显示明显药害，而且使用安全，具有良好应用价值，该浓度已经达到产业化开发利用的浓度要求。
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