滋养节杆菌Ar13及其作为植物根际促生菌的应用
阅读：297发布：2020-10-28
专利汇可以提供滋养节杆菌Ar13及其作为植物根际促生菌的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一株滋养节杆菌Ar13(Arthrobacter pascens)及其作为 植物 根际 促生菌的应用。本发明的菌株Ar13保藏编号为CGMCC No.5853，该菌株及含有该菌株的菌剂具有促生防病的效果，能够促进作物的生长和产量提高，对平板、 温室 小麦纹枯病的防治效果分别为94.20％、46.60％；与清 水 相比使绿豆根伸长量、鲜重量，茎长伸长量分别增加297％、35.3％、111％；温室中对小麦、大豆的促生效果均高于井冈霉素及植物生长素IAA-10-8μg/ml稀释液。本发明提供的菌株Ar13及其菌剂在使用过程中无污染，无公害，可广泛应用于植物病害 生物 防治和促生领域，具有较好的经济效益和社会效益。，下面是滋养节杆菌Ar13及其作为植物根际促生菌的应用专利的具体信息内容。
1.滋养节杆菌(Arthrobacter pascens)菌株Ar13，其保藏编号为CGMCC No.5853。
2.含有权利要求1所述滋养节杆菌Ar13的菌剂。
3.含有权利要求1所述滋养节杆菌Ar13的生物肥料。
4.权利要求1所述的滋养节杆菌Ar13或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的生物肥料在促进植物生长中的应用。
5.权利要求1所述的滋养节杆菌Ar13或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的生物肥料在抑制植物病原微生物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的植物病原微生物为小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、西瓜枯萎菌(Fusarium ox ysporum f.sp.niveum)、桃褐腐病菌(Monilinia laxa)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)和小长喙霉菌(Ceratocystis fimbriata)。
7.权利要求1所述的滋养节杆菌Ar13或权利要求2所述的菌剂在制备植物促生剂中的应用。
8.权利要求1所述的滋养节杆菌Ar13或权利要求2所述的菌剂在制备植物防病剂中的应用。
9.如权利要求4-8任一所述的应用，其特征在于，所述的植物为绿豆、大豆和/或小麦。
10.权利要求1所述的滋养节杆菌Ar13或权利要求2所述的菌剂在制备生物肥料中的应用。
滋养节杆菌Ar13及其作为植物根际促生菌的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及滋养节杆属菌株及其应用，具体地，涉及滋养节杆菌(Arthrobacter pascens)Ar13及其作为植物根际促生菌的应用。
背景技术
[0002] 农业生产中，农药和化肥的大量使用在提高作物产量的同时也产生了极大的环境问题，使用植物根际促生菌作为生物肥料，被视为一种可减少农业化肥的替代品。随着现代生物科学技术的进步，人们对微生物-植物共生系统给予了高度重视，并在多个方面有广泛的研究与应用植物根际环境中的微生物与植物存在共生关系，表现在植物的生长发育、营养物质的吸收利用、病害控制等方面，通过调整根际环境中的有益微生物菌株数量与质量，即可实现农作物高产、稳产。
[0003] 植物根际促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria，简称PGPR)，是寄居于植物根际、根表的微生物，能够直接或间接的促进植物的生长和发育。PGPR以其特有的病害生防潜力和对生态环境的维护作用，近年来已受到国内外越来越多的青睐。传统的研究主要研究有益菌株的活体应用能力，现代研究则趋向于利用生物技术研究促生和生防机制，了解其促生功能的本质，从而为更加合理有效地应用PGPR开辟了更加广阔的空间。目前，已从土壤中分离的根际细菌中获得了大量的植物根际促生菌，尤以荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)在很多植物的根际都占有绝对优势，可达60％-93％的比例。澳大利亚、美国、欧盟合作组织、日本等多个国家都开展了PGPR的专项研究，也在促进植物生长、增加作物产量，有效地用于植物病害的生物防治方面积累了大量的事实。
[0004] 有关植物根际促生菌制剂的研究与应用尤为活跃，主要涉及促进植物生长和防治作物病虫害这两个方面。促生作用指PGPR合成的次生代谢产物等增强植物对营养元素、水分的吸收。同时，PGPR可通过对病原微生物的生物防治，减轻或抑制有害根际微生物间接促进植物生长。PGPR对病原菌的作用机制则主要有：竞争和定殖、产嗜铁素、抗生作用、系统诱导抗性等。目前，国内外PGPR制剂应用广泛，最早成功地应用和商业化生产的PGPR是枯草芽饱杆菌A13，A13能抑制植物病原菌，促进多种植物生长，用A13处理种子，可以提高胡萝卜产量48％，燕麦产量33％和花生产量37％。商业化最成功的产品是Agrobacteriumradiobacter K84，目前美国上市的荧光假单孢菌类PGPR生物制剂就有8种以上。
[0005] 节杆菌(Arthrobacter sp.)为革兰氏阳性菌，在自然界中广泛存在，模式种为球形节杆菌(Artrobacter globiformis)。节杆菌在生活史中细胞形态有显著变化，幼龄菌体完全或大部分是杆状或不规则杆状，老细胞则缩短为球形或类球形；呼吸代谢，从不发酵代谢；可利用葡萄糖或其他糖产生少量酸或不产酸；接触酶阳性；细胞壁不含有消旋二氨基庚二酸和阿拉伯糖；专性好氧菌，通常生长在加生物素的简单培养基中，氧化代谢。最适生长温度20～35℃；节杆菌属菌种可应用于有机物污染的土壤修复、提高植物氮磷钾营养物质的吸收、可促进植物生长提高产量等。该菌属的部分菌种还可产生黄嘌呤氧化酶、脂肪酶、烟碱脱氢酶和谷胺酰胺合成酶，在工业上有较高的应用价值。
[0006] 小麦纹枯病(Rhizoctonia cerealis)又称立枯病、尖眼斑病，主要发生在世界各温带小麦区。病田病株率一般为10％-20％，轻者可减产5％-10％，重者减产20％-40％，并造成枯孕穗、枯白穗，更严重的是导致田区颗粒无收。防治小麦纹枯病主要采用化学防治技术，即喷洒农药，以三唑类药剂及井冈霉素为主。然而，化学药剂虽能有效防治病害，但对小麦产量仍存在不同程度负面影响，且化学药剂的使用不可避免带来土壤环境的污染和药物残留问题。国内外关于节杆菌属菌株作为PGPR菌株，尤其是作为小麦纹枯病的生防菌株及其表现出的优良促生作用的研究几乎为空白，在菌株的作用机制及应用方面也比较落后，因此该菌属菌株的研究，尤以其促生防病潜能为开发和利用生物肥料及农药的理论和应用上的支持，具有深远的经济、社会、生态价值。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一株对植物具有生物防病和促生作用的滋养节杆菌及其应用。
[0008] 本发明提供的菌株Ar13于2012年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.5853，分类名为滋养节杆菌(Arthrobacter pascens)。
[0009] 滋养节杆菌Ar13为革兰氏染色阳性，菌株Ar13在NA培养基(牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，NaCl 5g/l，琼脂15g/l)上培养。培养过程中有明显杆、球状周期变化。菌体长椭圆形，具有一根极生鞭毛，最适生长温度28℃，pH中性，其单菌落在NA培养基上为浅白色菌落，发亮白色光泽。
[0010] 本发明提供了含有滋养节杆菌Ar13的菌剂。
[0011] 进一步，本发明提供了含有滋养节杆菌Ar13的生物肥料。
[0012] 本发明提供滋养节杆菌Ar13或含有滋养节杆菌Ar13的菌剂和生物肥料在促进植物生长中的应用。
[0013] 本发明提供滋养节杆菌Ar13或含有滋养节杆菌Ar13的菌剂和生物肥料在抑制植物病原微生物中的应用。
[0014] 其中，所述的植物病原微生物为小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、西瓜枯萎菌(Fusarium ox ysporum f.sp.niveum)、桃褐腐病菌(Monilinia laxa)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)和/或小长喙霉菌(Ceratocystis fimbriata)。
[0015] 本发明提供滋养节杆菌Ar13或含有滋养节杆菌Ar13的菌剂在制备植物促生剂中的应用。
[0016] 本发明提供滋养节杆菌Ar13或含有滋养节杆菌Ar13的菌剂在制备植物防病剂中的应用。
[0017] 其中，所述的植物为绿豆、大豆和/或小麦。
[0018] 本发明提供了滋养节杆菌Ar13或含有滋养节杆菌Ar13的菌剂在制备生物肥料中的应用。
[0019] 本发明提供了以滋养节杆菌Ar13为有效成分的制剂在农业上的应用。
[0020] 本发明提供的滋养节杆菌菌株Ar13对多种植物病原菌具有明显的抑制作用，同时对植物生长具有显著的促进作用，能够促进作物的生长和产量提高，对平板、温室小麦纹枯病的防治效果分别为94.20％、46.60％；与清水相比使绿豆根伸长量、鲜重量，茎长伸长量分别增加297％、35.3％、111％；温室中对小麦、大豆的促生效果均高于井冈霉素及植物-8生长素IAA-10 μg/ml稀释液。本发明提供的菌株Ar13及其菌剂在使用过程中无污染，无公害，可广泛应用于植物病害生物防治和促生领域，具有较好的经济效益和社会效益。
附图说明
附图说明
[0021] 图1为Ar13 16S rDNA PCR扩增结果，其中泳道1为电泳所用的Marker，泳道2为阴性对照，泳道3为Ar13菌株电泳结果。
[0022] 图2为Ar13菌株的16S rDNA序列系统发育地位。
[0023] 图3为菌株Ar13在脱脂牛奶平板上产蛋白酶检测。
[0024] 图4为菌株Ar13在CAS平板上产嗜铁素检测。
[0025] 图5为Ar13对小麦纹枯病平板防治效果图，其中A：小麦纹枯病菌；B：阴性对照；C：20％井冈霉素；D：Ar13菌液。
[0026] 图6为Ar13对小麦纹枯病温室防治效果图，其中A：小麦纹枯病菌；B：阴性对照；C：20％井冈霉素；D：Ar13菌液。
[0027] 图7为滋养节杆菌Ar13在DF(+Trp)和DF(-Trp)液体培养基中的产IAA能力图，其中菱形表示Ar13菌株在DF(+Trp)中产IAA能力，三角形表示Ar13菌株在DF(-Trp)中产IAA能力。
[0028] 图8为滋养节杆菌Ar13对绿豆的促生效果图，其中从左向右处理依次编号为1、2、-0 -1 -23、4、5、6、7、8、9、10、11、12；其中1：清水、2：Ar13菌液的IAA稀释液10 、3：10 、4：10 、5：
-3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10
10 、6：10 、7：10 、8：10 、9：10 、10：10 、11：10 、12：10 μg/ml浓度。
-3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10
10 、6：10 、7：10 、8：10 、9：10 、10：10 、11：10 、12：10 μg/ml浓度。
[0029] 图9为滋养节杆菌Ar13对温室盆栽大豆的促生效果图，其中A：IAA-10-8μg/ml；B：Ar13；C：阴性对照(清水)。
[0030] 图10为滋养节杆菌Ar13对小麦的促生效果图，其中A：IAA-10-8μg/ml；B：Ar13；C：阴性对照(清水)。
具体实施方式
[0032] 若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0033] 实施例1滋养节杆菌Ar13菌株的培养和鉴定
[0034] 1、菌株的分离和培养
[0035] 从中国农业大学桓台县华北集约化农业生态系统试验站小麦实验田中采集表层6cm土样，取5g的土溶解到在45ml无菌生理盐水的三角瓶中，28℃，120rpm摇床震荡10min后静止10min，取100μl的上清液加入到装有900μl生理盐水的Eppendorf管中，进行连-2 -3 -4
续梯度稀释。分别取以上土壤悬浮液和10 ，10 ，10 倍土壤悬浮液稀释液100μl在NA培养基(牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，NaCl 5g/l，琼脂15g/l)平板上均匀涂板，超净工作台内吹干，每个浓度重复3次，28℃温箱内培养36h，用无菌牙签挑取细菌单菌落划线纯化，将分离的菌株命名为Ar13。
续梯度稀释。分别取以上土壤悬浮液和10 ，10 ，10 倍土壤悬浮液稀释液100μl在NA培养基(牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，NaCl 5g/l，琼脂15g/l)平板上均匀涂板，超净工作台内吹干，每个浓度重复3次，28℃温箱内培养36h，用无菌牙签挑取细菌单菌落划线纯化，将分离的菌株命名为Ar13。
[0036] 2、菌株的鉴定
[0037] 1.1菌体形态特征革兰氏染色阳性，菌株Ar13培养过程中有明显杆、球状周期变化。菌体长椭圆形，具有一根极生鞭毛。
[0038] 1.2生理生化特性将分离纯化的菌株Ar13进行生化试验，结果显示分离菌株为革兰氏阳性菌，严格好氧，其过氧化酶、氧化酶、葡萄糖氧化产酸产气、硝酸盐还原、果糖利用、α-半乳糖酶、明胶液化、卵磷脂酶均称阳性反应，淀粉水解、脲酶利用、反硝化、酯酶、精氨酸双水解、柠檬酸盐利用、酒石酸盐利用、VP测定均称阴性反应(见表1)；可以利用D-半乳糖、松二糖、D-棉子糖、D-蜜二糖、D-果糖、D-甘露糖、α-环糊精、L-阿拉伯糖、糊精、吐温40、吐温80、α-D-葡萄糖、蔗糖、甲基丙酮酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸、糖原、D-阿洛酮糖18种碳源，对乙酸、丙酸、甘油、赤藻糖醇等65种碳源不能利用，对纤维二糖、D-海藻糖、腺苷等12种碳源的利用处于临界状态。
[0039] 表1、Ar13生理生化特性
[0040]
[0041] Note：“+”为阳性，“-”为阴性，“{/}”为弱阳性，NA：没有报道，a：Arthrobacter pascens DSM20545；b：BIOLOG鉴定结果
[0042] 1.3 16S rDNA序列分析
[0043] 提取分离的菌株Ar13的基因组，用16S扩增通用引物8F：5′-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′；和1506R：5′CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′。在如下PCR体系中扩增：50μl扩增体系，含有0.5μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)，引物8F(10mM)0.5μl，引物1506R(10mM)0.5μl，模板DNA(10ng/μl)1.0μl，扩增缓冲液buffer 5.0μl，dNTP(10mM)2.0μl，无菌ddH2O 40.5μl。扩增条件：94℃5min预变性，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃充分延伸5min，4℃保存。扩增产物(1504bp)经用1％的琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，电泳结果见图1，用OMEGA公司的纯化试剂盒Gel Extraction Kit纯化回收后连接TaKaRa公司的T载体pMD18-T，选取白色菌落。在Invitrogen公司用ABI 3730 DNA测序仪进行测序，将测序结果用BLAST程序在GenBank中进行序列比对分析，并运用MEGA 4.0构建菌株系统发育树。结果表明该菌株Ar13的16S rDNA序列与目前发表的节杆菌属滋养节杆菌(Arthrobacter pascens)相似性达99.7％。
[0044] 综合菌体形态、生理生化特性、Biolog碳源代谢谱和16S rDNA基因序列，将分离的菌株Ar13鉴定为：滋养节杆菌(Arthrobacter pascens)，系统发育树见图2。该菌株Ar13于2012年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.5853，分类名为滋养节杆菌(Arthrobacter pascens)。
[0045] 实施例2滋养节杆菌Ar13抑菌谱分析
[0046] 用打空器打取5mm直径的靶标病原真菌接种于PDA平板中央，滋养节杆菌Ar13与靶标菌成180°接种于靶标菌两测2.5cm处，本实施例使用的靶标菌分别为小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、西瓜枯萎菌(Fusarium oxysporum f.sp.rniveum)、桃褐腐病菌(Monilinia laxa)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)、小长喙霉菌(Ceratocystis fimbriata)，上述致病菌来源于中国农业大学植物病理系。25℃培养5天后测量病原真菌菌落直径。以接种靶标真菌而不接种滋养节杆菌Ar13的PDA平板为对照。
[0047] 抑制生长率按照如下公式计算：抑制生长率＝(C-T)/C×100％；C：对照真菌生长直径，T：接种滋养节杆菌后真菌生长直径。
[0048] 对病原细菌平板抑制检测方法。用双层培养法检测假单胞对病原细菌的抑制情-8况。用King`B培养基活化假单胞后用生理盐水配成10 CFU/ml的菌悬液，用移液枪吸取
5μl接种于King`B平板中央，培养48h后用3ml的氯仿以其蒸汽杀死菌体。将活化好的靶-8
标细菌配成10 CFU/ml的菌悬液，吸取50μl菌悬液加入到加入3ml融化后冷却到50℃的水琼脂(0.7％琼脂，pH7.0)中，迅速混匀，立即倒入三氯甲烷杀死Pa40菌体的培养基上，铺成均匀的薄层，28℃培养36小时，观察抑菌圈的情况。
5μl接种于King`B平板中央，培养48h后用3ml的氯仿以其蒸汽杀死菌体。将活化好的靶-8
标细菌配成10 CFU/ml的菌悬液，吸取50μl菌悬液加入到加入3ml融化后冷却到50℃的水琼脂(0.7％琼脂，pH7.0)中，迅速混匀，立即倒入三氯甲烷杀死Pa40菌体的培养基上，铺成均匀的薄层，28℃培养36小时，观察抑菌圈的情况。
[0049] 滋养节杆菌(Arthrobacter pascens)Ar13对部分病原真菌抑制结果如表2所示对桃褐腐病菌的抑菌率达到50％以上；对小长喙霉、西瓜枯萎菌、辣椒疫霉菌也有较强的平板抑制能力，抑菌率在42％-49％之间。
[0050] 表2滋养节杆菌Ar13对几种病原真菌的平板抑制率
[0051]
[0052] 菌株Ar13对供试菌株棉花角斑病菌、茄青枯病菌、丁香假单胞菌、发根土壤杆菌、葡萄土壤杆菌、根癌土壤农杆菌、褶皱假单胞菌、洋葱伯克霍尔德病菌对等病原细菌均未表现出拮抗作用。
[0053] 实施例3滋养节杆菌Ar13生防相关性状检测
[0054] 本实施例根据现有技术中蛋白酶、嗜铁素成为判断生防能力的关键因素之一来进行检测。具有拮抗作用的物质包括抑菌肽类、几丁质酶、葡聚糖酶等蛋白酶，主要通过分解病原细胞壁的特点发挥抑制作用；嗜铁素则是微生物通过与病原菌竞争铁离子，使得病原菌缺乏铁元素而不能生长繁殖从而达到防止目的。
[0055] 蛋白酶检测：用脱脂牛奶平板(胰蛋白胨5g，酵母抽提物2.5g，葡萄糖1g，7％的脱脂牛奶250ml，琼脂15g，用水补足1000ml)检测蛋白酶。把Ar13接种到平板中央，28℃培养72h，菌落周围有透明圈，如图3所示，滋养节杆菌(Arthrobacterpascens)Ar13 CGMCCNo.5853产生蛋白酶。
[0056] 嗜铁素的检测：CAS培养基(嗜铁素检测用培养基)(Schwyn and Neilands，1987)：由4种溶液组成【溶液1～3及酸水解酪素(casamimo acid)】，4种溶液混合前单独灭菌。
[0057] 溶液1CAS/HDTMA溶液
[0058] 1)CAS溶液：60.5mg CAS(铬天青)溶解在50ml水中；
[0059] 2)铁溶液：1mMFeCl3·6H2O溶解于10mM HCl中，pH为2.0；
[0060] 3)HDTMA溶液：72.9mg溴化十六碳烷基三甲氨溶解于40ml水中。
[0061] 把溶液1)与10ml溶液2)混合后加入溶液3)中并搅拌均匀，把得到的蓝黑色液体灭菌，该液体即CAS/HDTMA溶液。
[0062] 溶液2Salts/Buffer溶液
[0063] 1)Salts(750ml)：K2PO4 0.3g，NaCl 0.5g，NH4Cl 1.0g，
[0064] 2)Pipes：30.24g，溶解于Salts中，以50％(W/V)KOH调节pH至6.8，加入15.0g琼脂定容至800ml，高压灭菌冷却至50℃。
[0065] 溶液3(750ml)：葡萄糖2g，甘露醇2g，MgSO4·7H2O 493mg，CaCl211mg，H3BO3 1.4mg，ZnSO4·7H2O 1.2mg，MnSO4·2H2O 1.17mg，Na2MoO4·2H2O 1mg，CuSO4 40μg；高压灭菌。
[0066] 溶液3冷却至50℃后加入溶液2与30ml过滤除菌的10％(W/V)casamimo acid混合，再加入溶液1，缓慢搅拌(避免产生泡沫)，铺平板。将活化好的Pa40穿刺接种于平板上。28℃培养24、48、60、72h观察菌落周围是否产生黄色晕圈，如有黄色晕圈表示产生嗜铁素。如图4所示，滋养节杆菌(Arthrobacterpascens)Ar13 CGMCCNo.5853能够产生嗜铁素。
[0067] 实施例4滋养节杆菌(Arthrobacter pascens)Ar13对小麦纹枯病的防治效果试验
[0068] 1、Ar13对小麦纹枯病的平板防效检测
[0069] 用灭菌打孔器将小麦纹枯病菌Rhizoctonia cerealis打孔，用灭菌接种针接到PDA平板上，于25℃恒温培养箱中培养，7天左右长满整个平板后待用。待纹枯病菌生长到第4天，用NA培养基将4株生防菌株(在山东省桓台县小麦试验地分离的对小麦纹枯病有良好防效的4株菌，分别编号为Ar13、Ar16、Ar17、Ar22)活化24h，用灭菌牙签将已活化的菌株接到制备好的PDA液体培养基中，28℃摇床160rpm摇培72h。待菌株摇培到36h，将小麦种子(鲁麦301)用两层纱布包好放入大培养皿中，清水浸湿。于28℃恒温培养箱中培养，隔天用清水浸湿一次。培养36h左右待种子露白。挑选大小均匀且饱满露白一致的小-8麦种子。将供试菌悬液用无菌生理盐水稀释到10 CFU/ml，取5ml放入9mm直径的无菌指形管中，分别以无菌生理盐水作为阴性对照，以20％井冈霉素可湿性粉剂稀释100倍作为阳性对照，浸种3h。后摆放在制备好的纹枯病菌平板上，再铺满无菌蛭石。每个平板10粒，每个菌株做3个重复。放入25℃，12h光照的日光温室中培养。7天后计算出苗情况，15天后调查病情指数和发病率并计算防效。Ar13对小麦纹枯病的平板防效效果见表3与图5。
结果表明，Ar13对小麦纹枯病有明显的防治作用，相对阴性对照组，经过菌剂处理的幼苗根长增加、须根多。平板防治效果表明，Ar13菌株的防治效果与20％井冈霉素的效果最优，防效分别为94.20％、96.17％。
结果表明，Ar13对小麦纹枯病有明显的防治作用，相对阴性对照组，经过菌剂处理的幼苗根长增加、须根多。平板防治效果表明，Ar13菌株的防治效果与20％井冈霉素的效果最优，防效分别为94.20％、96.17％。
[0070] 表3接种不同作物根际促生菌对小麦幼苗生防效果的影响
[0071]
[0072] 注：20％井冈霉素为水剂
[0073] 2、Ar13对小麦纹枯病的温室防效检测
[0074] 小麦纹枯病菌液、生防菌(Ar13、Ar16、Ar17、Ar22)菌悬液和小麦种子制备、处理方法同Ar13平板防效检测。后将小麦纹枯病菌接入玉米砂培养基中，置室温培养，前两天要稍加摇动，使菌丝生长均匀。菌丝长满(10天左右)后取出。将玉米砂繁殖的病菌与无菌土(草碳、蛭石、砂土、腐殖酸土以体积比1∶1∶1∶1混合)按1∶30的体积比混合均匀，制成盆栽使用菌土。将生防菌菌悬液浸泡过的麦种播种于装盆栽使用菌土的花盆(直径12cm，高14cm)中，每盆种10粒。以无菌生理盐水浸泡种子接种盆栽使用菌土作为阴性对照，以20％井冈霉素可湿性粉剂稀释100倍浸泡种子接种栽使用菌土作为阳性对照，每个处理做3个重复。出苗后20天调查发病情况，调查病情指数和发病率并计算防效。阳性对照中，尤以Ar13菌株的防治效果最优，防效达46.60％。Ar13对小麦纹枯病的温室防效效果见表3与图6。
[0076] 1、促生物质IAA浓度的检测
[0077] 将活化的Ar13菌株接种于IAA检测DF培养基(无色氨酸或含500μg/ml色氨酸，DF(+Trp)和DF(-Trp))中，于28℃恒温气候箱中培养。吸取5ml培养液，10,000rpm离心15min，取2ml上清液于试管中，加入100μl Solution I(10mM磷酸)及4ml Solution II(1ml 0.5M FeCl3溶于50ml 35％HClO4))反应液混匀。混合液于室温中反应25min，观察其颜色变化，颜色变为红色即为阳性反应，检测OD530nm处吸光值，在标准曲线上比对并计算IAA产量。
[0078] IAA标准曲线的制作：称取0.01g IAA纯品(Sigma)溶于1ml无水乙醇中，混匀后吸取100μl加去离子水稀释至1ml，混匀后再吸取100μl加去离子水稀释至1ml，得100μg/ml IAA母液。然后分别配制下列浓度梯度IAA水溶液：5，10，15，20，25，30μg/ml。
以去离子水做空白对照。检测不同浓度IAA溶液在530nm处吸光值，绘制IAA含量标准曲线。如图7所示，滋养节杆菌(Arthrobacter pascens)Ar13 CGMCCNo.5853分别在含色氨酸的DF(+Trp)液体培养基和不含色氨酸的DF(-Trp)液体培养基在不同培养时间下产IAA量变化曲线图。
以去离子水做空白对照。检测不同浓度IAA溶液在530nm处吸光值，绘制IAA含量标准曲线。如图7所示，滋养节杆菌(Arthrobacter pascens)Ar13 CGMCCNo.5853分别在含色氨酸的DF(+Trp)液体培养基和不含色氨酸的DF(-Trp)液体培养基在不同培养时间下产IAA量变化曲线图。
[0079] 2、Ar13对绿豆的促生试验
[0080] 绿豆(绿珍珠)种子用70％乙醇处理30s，用清水冲洗5-6遍，去除表面残留，晾-0 -1 -2 -3 -4干备用。将生防菌菌悬液中IAA浓度用DF(+Trp)培养基稀释到10 、10 、10 、10 、10 、-5 -6 -7 -8 -9 -10
10 、10 、10 、10 、10 、10 μg/ml，以DF(+Trp)培养基作为对照。相应处理中浸种3h，并将滤纸浸湿作为绿豆种子的生长基质。28℃、湿度70％的人工气候箱中黑暗培养。4天后测量根长、茎长和鲜重，观察侧根长势。见表4、图8。与阴性对照组相比，Ar13对绿豆幼苗有较为显著的促进作用，接种幼苗表现为根长、茎长伸长、鲜重量均较阴性对照组增加，其-8
中尤以IAA浓度为10 的菌液稀释液促生效果最佳，与清水相比根伸长为297％，鲜重增加为35.3％，茎长伸长为111％。
10 、10 、10 、10 、10 、10 μg/ml，以DF(+Trp)培养基作为对照。相应处理中浸种3h，并将滤纸浸湿作为绿豆种子的生长基质。28℃、湿度70％的人工气候箱中黑暗培养。4天后测量根长、茎长和鲜重，观察侧根长势。见表4、图8。与阴性对照组相比，Ar13对绿豆幼苗有较为显著的促进作用，接种幼苗表现为根长、茎长伸长、鲜重量均较阴性对照组增加，其-8
中尤以IAA浓度为10 的菌液稀释液促生效果最佳，与清水相比根伸长为297％，鲜重增加为35.3％，茎长伸长为111％。
[0081] 表4接种Ar13产IAA菌液的不同稀释浓度绿豆幼苗生长的影响
[0082]
[0083] 3、Ar13对大豆、小麦的促生试验
[0084] 将菌株在改良523斜面(配方：蔗糖10g，酵母膏10g，K2HPO4 2.0g，MgSO4·7H2O0.3g，CaCO3 5.0g，NaCl 2.0g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2)上活化24h后制备成
10-8CFU/ml的菌悬液，按0.1％接种量分别接种于DF(+Trp)、DF(-Trp)液体培养基的锥形瓶中，170rpm、28℃于恒温摇床上培养72h。配制最适催芽浓度10-8μg/ml的IAA纯品溶液作为阳性对照，并以DF(+Trp)、DF(-Trp)液体培养基、清水分别作为对照。大豆、小麦种子用
70％乙醇处理30s，用清水冲洗5-6遍，去除表面残留，晾干备用。将生防菌菌悬液中IAA浓度用DF(+Trp)培养基也稀释到10-8μg/ml，以DF(+Trp)培养基作为对照。相应处理中浸种3h，按照50mlHoagland营养液/1000g土沙混合样、50ml菌液/500g土沙混合样的比例混匀土样进行播种。每盆定苗至4颗，每个处理设3个重复。42天后收获植物样，测量植物样地上部分鲜重、根鲜重及株高，并进行统计分析。
10-8CFU/ml的菌悬液，按0.1％接种量分别接种于DF(+Trp)、DF(-Trp)液体培养基的锥形瓶中，170rpm、28℃于恒温摇床上培养72h。配制最适催芽浓度10-8μg/ml的IAA纯品溶液作为阳性对照，并以DF(+Trp)、DF(-Trp)液体培养基、清水分别作为对照。大豆、小麦种子用
70％乙醇处理30s，用清水冲洗5-6遍，去除表面残留，晾干备用。将生防菌菌悬液中IAA浓度用DF(+Trp)培养基也稀释到10-8μg/ml，以DF(+Trp)培养基作为对照。相应处理中浸种3h，按照50mlHoagland营养液/1000g土沙混合样、50ml菌液/500g土沙混合样的比例混匀土样进行播种。每盆定苗至4颗，每个处理设3个重复。42天后收获植物样，测量植物样地上部分鲜重、根鲜重及株高，并进行统计分析。
[0085] 综合分析，在小麦株高上，Ar13菌液、IAA-10-8μg/m1、清水处理相互之间差异显著；Ar13菌液比IAA-10-8μg/ml和清水分别增加了22.5％和11.1％。在大豆株高上，三种处理差异不显著；在小麦、大豆茎叶鲜重上，Ar13菌液与IAA-10-8μg/ml、清水三种处理之间差异均不显著；在小麦根重上，Ar13菌液与IAA-10-8μg/ml、清水处理分别差异显著；Ar13处理比IAA-10-8μg/ml、清水处理增加小麦根重分别达47.3％、69.7％。在大豆根重上，Ar13菌液与IAA-10-8μg/ml、清水处理分别差异显著；Ar13菌液比IAA-10-8μg/ml、清水处理分别增加大豆根重分别达36.4％、43.2％。结果见表5、表6、图9、图10。此外，将
10-8CFU/ml的菌液1∶30到1∶50倍对小麦和大豆拌种后阴干播种，田间试验结果表明本发明的滋养节杆菌Ar13对小麦的产量增产14％～17％，对大豆田间增产11％～13％。
10-8CFU/ml的菌液1∶30到1∶50倍对小麦和大豆拌种后阴干播种，田间试验结果表明本发明的滋养节杆菌Ar13对小麦的产量增产14％～17％，对大豆田间增产11％～13％。
[0086] 表5Ar13对大豆生长的促生作用
[0087]
[0088] 表6Ar13对小麦生长的促生作用
[0089]
[0090] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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