皱褶假单胞菌P94及其应用
阅读：44发布：2020-11-22
专利汇可以提供皱褶假单胞菌P94及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种皱褶假单胞(Pseudomonas corrugata)新菌株P94 GMCC No.1895分离于北京远郊番茄 温室 大棚 土壤 ，该菌株产生与抗菌相关的HCN、蛋白酶及与 植物 促生相关的 磷酸 脂酶和生长素(IAA)。对部分植物病原 真菌 (Botrytis cinerea、Ceratocystisfimbriata、Monilinia laxa、Magnaporthe grisea、Pythiumaphanidermatum、Phytophthora capsici)、部分植物病原细菌(Pseudomonas syringae、Acidovorax avenae、Ralstonia solanacearum)有平板抑制作用。以温室番茄和黄瓜为指示植物检测了P94对灰霉病的防治效果，结果表明，P94对番茄灰霉病和黄瓜灰霉病均有较好的防治效果，防效分别为86.3%和78.4%，并对番茄和黄瓜有良好的促生作用，能提高产量22%～28%。，下面是皱褶假单胞菌P94及其应用专利的具体信息内容。
技术领域
本发明涉及一株微生物新菌株及其应用，具体地说是皱褶假单 胞菌P94及其在植物促生、病害生物防治中的应用。
背景技术
由灰葡萄孢侵染引起的蔬菜灰霉病是一种全球性分布的重要植 物病害。对茄果类、浆果类、瓜类的产量造成重大损失。自20世纪 80年代以来，随着我国保护地面积的不断扩大，蔬菜灰霉病危害日 趋严重。大棚的小气候环境十分有利于蔬菜灰霉病的发生，成为我 国保护地蔬菜的最重要的病害之一。病原菌葡萄孢多从开放的残花 侵入，引起花瓣腐烂，并长出一层灰褐色霉层，再向幼果扩展，病 部呈水浸状，逐渐腐烂呈黄褐色，表面密生霉层，严重时导致多半 个果实腐烂。低温、高湿、光照不足、通气不良均有利于灰霉病的 发生。
目前生产上蔬菜灰霉病主要依赖化学防治控制。用于防治蔬菜 灰霉病的杀菌剂主要有三类：苯并咪唑类、二甲酰胺类、N-苯氨基 甲酸酯类。自20世纪70年代以来，相继采用苯并咪唑类如多菌灵、 甲基托布津、苯来特等；二甲酰胺类如腐霉利、异菌脲、菌核净等； 氨基甲酸酯类如乙霉威等多种杀菌剂防治灰霉病。但由于频繁大剂 量使用这些杀菌剂，并且葡萄孢遗传变异大，适应性强，葡萄孢已 对常用的多种药剂产生了不同程度的抗性，导致防治效果下降。在 蔬菜作物上，除了抗药性的问题，化学杀菌剂的使用也引起了环境、 食品安全、残留、药害等多种问题。苯并咪唑类在许多国家和地区 已经限制使用，上世纪70年代以来人们开始关注利用有益微生物防 治蔬菜灰霉病。目前，用于防治蔬菜灰霉病的生防真菌近十多种， 研究和应用较广的主要是木霉和酵母等，如绿色木霉(Trichoderma viride)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、拟康木霉(Trichoderma pseudokoningii)、木素木霉(Trichoderma lignorum)、出芽梗短霉 (Aureobasidium pullulans)、浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)、 胶粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、粘帚霉(Gliocladium sp.)、链孢粘 帚霉(Gliocladium catenulatum)等；研究和应用于蔬菜灰霉病的生防 细菌有十多种，主要有芽孢杆菌(Bacillus sp.)、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、多粘芽杆菌(Bacillus polymyxa)、地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis Bacillus)、乳芽孢杆菌(Lactobacillus sp.)、短 体芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)等；放线菌链 霉菌科链霉菌属产生的武夷菌素(wuyiencin)、磷氮霉素 (phosphazomyzin)、白肽霉素(albopeptin)、变构霉素(tautomycin)、 变构菌素(tautomycein)和鱼时霉素(ezomycin S)等抗生素对灰霉病 均有较好的防治效果。但利用皱褶假单孢应用于蔬菜灰霉病防治的 报道国内外均未见报道。
目前生产上蔬菜灰霉病主要依赖化学防治控制。用于防治蔬菜 灰霉病的杀菌剂主要有三类：苯并咪唑类、二甲酰胺类、N-苯氨基 甲酸酯类。自20世纪70年代以来，相继采用苯并咪唑类如多菌灵、 甲基托布津、苯来特等；二甲酰胺类如腐霉利、异菌脲、菌核净等； 氨基甲酸酯类如乙霉威等多种杀菌剂防治灰霉病。但由于频繁大剂 量使用这些杀菌剂，并且葡萄孢遗传变异大，适应性强，葡萄孢已 对常用的多种药剂产生了不同程度的抗性，导致防治效果下降。在 蔬菜作物上，除了抗药性的问题，化学杀菌剂的使用也引起了环境、 食品安全、残留、药害等多种问题。苯并咪唑类在许多国家和地区 已经限制使用，上世纪70年代以来人们开始关注利用有益微生物防 治蔬菜灰霉病。目前，用于防治蔬菜灰霉病的生防真菌近十多种， 研究和应用较广的主要是木霉和酵母等，如绿色木霉(Trichoderma viride)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、拟康木霉(Trichoderma pseudokoningii)、木素木霉(Trichoderma lignorum)、出芽梗短霉 (Aureobasidium pullulans)、浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)、 胶粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、粘帚霉(Gliocladium sp.)、链孢粘 帚霉(Gliocladium catenulatum)等；研究和应用于蔬菜灰霉病的生防 细菌有十多种，主要有芽孢杆菌(Bacillus sp.)、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、多粘芽杆菌(Bacillus polymyxa)、地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis Bacillus)、乳芽孢杆菌(Lactobacillus sp.)、短 体芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)等；放线菌链 霉菌科链霉菌属产生的武夷菌素(wuyiencin)、磷氮霉素 (phosphazomyzin)、白肽霉素(albopeptin)、变构霉素(tautomycin)、 变构菌素(tautomycein)和鱼时霉素(ezomycin S)等抗生素对灰霉病 均有较好的防治效果。但利用皱褶假单孢应用于蔬菜灰霉病防治的 报道国内外均未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种皱褶假单胞新菌株P94及其在植物 促生和病害生物防治中的应用。
本发明菌株P94是从北京远郊番茄温室大棚土壤中分离得到的 皱褶假单胞(Pseudomonas corrugata)新菌株。已于2006年12月 22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCC)，保藏号CGMCC NO.1895。
P94具体通过如下方法分离得到：从北京远郊番茄温室大棚采 集土样，取10g加入内装100ml无菌生理盐水的三角瓶中，28℃， 120rpm摇床震荡15min，静止10min后，取500μl加入4.5ml无 菌生理盐水中，再依次稀释10-2，10-3，10-4倍，分别取以上土壤悬 浮液100μl在NA培养基(牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，NaCl 5g/l，琼 脂15g/l)平板上均匀涂板，超静工作台内吹干，每个浓度重复3次， 28℃温箱内培养36h，用无菌牙签挑取细菌单菌落划线纯化后，以 灰霉病菌为靶标菌，利用平板对峙法进行拮抗菌的初步筛选；对获 得的拮抗菌摇瓶发酵后检测温室防病效果，最终筛选出性状优良的 生防菌株皱褶假单胞(Pseudomonas corrugata)P94。
综合皱褶假单胞(Pseudomonas corrugata)P94的形态学特征、 生理生化特性、16SrDNA序列和特异性引物分析的结果，将其鉴定 为皱褶假单胞菌基因II型。
研究表明，P94能产生与抗菌相关的HCN、蛋白酶及与植物促 生相关的磷酸脂酶和生长素(IAA)，对部分植物病原真菌和细菌具 有抑制作用，对灰霉病具有良好的防治作用，并且具有植物促生作 用，能够提高植物产量。
本发明还提供了P94的发酵培养方法，包括步骤：
1、菌种活化
使用KB培养基，培养基配方为：蛋白胨20g/l，甘油10ml/l， MgSO4·7H2O 1.5g/l，K2HPO4 1.5g/l，琼脂15g/l。将皱褶假单胞P94 接种于KB培养基斜面上，28℃培养48h。
2、种子液的培养
种子培养用AY培养基，AY培养基的组成：蔗糖8-10g/L，酵 母膏2-4g/L，NaCl 0.5-1g/L，KH2PO4 0.3-0.5g/L，MgSO4·7H2O 1-1.5 g/L，(NH4)2SO4 3-5g/L，pH值为7.0-7.2。将活化好的皱褶假单胞 P94用无菌生理盐水配制成108cfu/ml的菌悬液，以0.1％的接种量接 种于AY液体培养基中，28℃摇床震荡培养，转速为150-200rpm， 培养时间为44-48h。
3、发酵罐发酵
发酵培养基组成为：葡萄糖4-6g/L，淀粉5-8g/L，黄豆粉5-8 g/L，(NH4)2SO4 5-10g/L，KH2PO4 0.5-1g/L，MgSO4·7H2O 0.5-0.8g/L， CaCO3 1-1.5g/L，pH值为7.0-7.5。把培养好的种子液以2％的接种量 接入发酵罐中，28℃，搅拌速度为180rpm，通气量为1:0.6-0.8(发 酵液体积：每分钟通气量体积)、罐压1.5-2.0F/cm2。发酵48h菌量达 到5-10×108cfu/ml得到皱褶假单胞P94菌液。
本发明在发酵培养中，AY培养基是最适合本发明菌株生长的培 养基，发酵用培养基是考虑发酵成本菌量以及产生抗生物质量筛选出 的。
本发明还包括含有所述菌株的菌剂。
本发明菌株P94能产生与抗菌相关的HCN、蛋白酶及与植物促 生相关的磷酸脂酶和生长素(IAA)，对部分植物病原真菌和细菌具 有抑制作用，对灰霉病具有良好的防治作用，对番茄灰霉病和黄瓜灰 霉病的防效分别为86.3％和78.4％；并且具有良好的植物促生作用， 能够提高植物产量，能提高番茄和黄瓜产量22％～28％。
附图说明
图1是P94电镜照片(生长18hr；×20000)；
图2是用特异性引物PCR扩增P.corrugata P94基因组的结果。 1，Marker；2，阴性对照；3，以P.corrugata P94基因组为模板；
图3是P94蛋白酶活性检测；
图4是P94产HCN的检测，左为P94右为阴性对照；
图5是P94磷酸脂酶的活性检测。
本发明菌株P94是从北京远郊番茄温室大棚土壤中分离得到的 皱褶假单胞(Pseudomonas corrugata)新菌株。已于2006年12月 22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCC)，保藏号CGMCC NO.1895。
P94具体通过如下方法分离得到：从北京远郊番茄温室大棚采 集土样，取10g加入内装100ml无菌生理盐水的三角瓶中，28℃， 120rpm摇床震荡15min，静止10min后，取500μl加入4.5ml无 菌生理盐水中，再依次稀释10-2，10-3，10-4倍，分别取以上土壤悬 浮液100μl在NA培养基(牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，NaCl 5g/l，琼 脂15g/l)平板上均匀涂板，超静工作台内吹干，每个浓度重复3次， 28℃温箱内培养36h，用无菌牙签挑取细菌单菌落划线纯化后，以 灰霉病菌为靶标菌，利用平板对峙法进行拮抗菌的初步筛选；对获 得的拮抗菌摇瓶发酵后检测温室防病效果，最终筛选出性状优良的 生防菌株皱褶假单胞(Pseudomonas corrugata)P94。
综合皱褶假单胞(Pseudomonas corrugata)P94的形态学特征、 生理生化特性、16SrDNA序列和特异性引物分析的结果，将其鉴定 为皱褶假单胞菌基因II型。
研究表明，P94能产生与抗菌相关的HCN、蛋白酶及与植物促 生相关的磷酸脂酶和生长素(IAA)，对部分植物病原真菌和细菌具 有抑制作用，对灰霉病具有良好的防治作用，并且具有植物促生作 用，能够提高植物产量。
本发明还提供了P94的发酵培养方法，包括步骤：
1、菌种活化
使用KB培养基，培养基配方为：蛋白胨20g/l，甘油10ml/l， MgSO4·7H2O 1.5g/l，K2HPO4 1.5g/l，琼脂15g/l。将皱褶假单胞P94 接种于KB培养基斜面上，28℃培养48h。
2、种子液的培养
种子培养用AY培养基，AY培养基的组成：蔗糖8-10g/L，酵 母膏2-4g/L，NaCl 0.5-1g/L，KH2PO4 0.3-0.5g/L，MgSO4·7H2O 1-1.5 g/L，(NH4)2SO4 3-5g/L，pH值为7.0-7.2。将活化好的皱褶假单胞 P94用无菌生理盐水配制成108cfu/ml的菌悬液，以0.1％的接种量接 种于AY液体培养基中，28℃摇床震荡培养，转速为150-200rpm， 培养时间为44-48h。
3、发酵罐发酵
发酵培养基组成为：葡萄糖4-6g/L，淀粉5-8g/L，黄豆粉5-8 g/L，(NH4)2SO4 5-10g/L，KH2PO4 0.5-1g/L，MgSO4·7H2O 0.5-0.8g/L， CaCO3 1-1.5g/L，pH值为7.0-7.5。把培养好的种子液以2％的接种量 接入发酵罐中，28℃，搅拌速度为180rpm，通气量为1:0.6-0.8(发 酵液体积：每分钟通气量体积)、罐压1.5-2.0F/cm2。发酵48h菌量达 到5-10×108cfu/ml得到皱褶假单胞P94菌液。
本发明在发酵培养中，AY培养基是最适合本发明菌株生长的培 养基，发酵用培养基是考虑发酵成本菌量以及产生抗生物质量筛选出 的。
本发明还包括含有所述菌株的菌剂。
本发明菌株P94能产生与抗菌相关的HCN、蛋白酶及与植物促 生相关的磷酸脂酶和生长素(IAA)，对部分植物病原真菌和细菌具 有抑制作用，对灰霉病具有良好的防治作用，对番茄灰霉病和黄瓜灰 霉病的防效分别为86.3％和78.4％；并且具有良好的植物促生作用， 能够提高植物产量，能提高番茄和黄瓜产量22％～28％。
附图说明
图1是P94电镜照片(生长18hr；×20000)；
图2是用特异性引物PCR扩增P.corrugata P94基因组的结果。 1，Marker；2，阴性对照；3，以P.corrugata P94基因组为模板；
图3是P94蛋白酶活性检测；
图4是P94产HCN的检测，左为P94右为阴性对照；
图5是P94磷酸脂酶的活性检测。
具体实施方式
下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的 范围。
实施例1 P94的鉴定
综合皱褶假单胞(Pseudomonas corrugata)P94 CGMCC NO.1895 的形态学特征、生理生化特性、16SrDNA序列和特异性引物分析的 结果，将其鉴定为皱褶假单胞菌基因II型。具体鉴定结果如下：
1、菌体的形态特征
革兰氏染色阴性，在PDA培养基上产生黄绿色可溶性非荧光色 素，菌落兰绿色；在KB培养基上色素产生较少，菌落淡黄绿色。 电子显微镜观察，菌体长椭圆形，大小0.7×1.8μm，不少于两根极生 鞭毛(见图1)。
2、生理生化特性
皱褶假单胞P94生理生化特性如表1所示。
表1.P94生理生化特性
注：+，阳性反应；-，阴性反应；w，反应较弱。
3、16SrDNA序列分析
方法是：提取P94的基因组，用16S扩增通用引物63F 5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’ 和 1494R 5’-GGYTACCTTGT TACGACTT-3’。在如下PCR体系中扩增：50μl扩增体系，10pmol 引物，0.2mM dNTP，1.5mM MgCl2，2.5U Taq DNA聚合酶 (TaKaRa)，1×PCR buffer(TaKaRa)，25ng基因组DNA作模板。 PCR反应条件为：94℃ 5min预变性，94℃变性30s，56℃退火 30s，72℃延伸1min，30个循环后72℃充分延伸5min。PCR扩增 产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分析，用OMEGA公司的纯化试剂盒 Gel Extraction Kit纯化回收后连接TaKaRa公司的T载体 pMD18-T。在Invitrogen公司用ABI 3730 DNA测序仪进行测序，核 苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，基因序列已经提交GenBank， 基因收录号为：EF153018。用BLAST程序在GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)相应序列比对的结果表明P94的 16SrDNA序列与目前发表的皱褶假单胞相关菌株相比相似性最高， 达到99％。
4、特异性引物分析
用特异性引物PC 1/1(5’-GGATATGAGCCAGGTCTTCG-3’) 和PC 1/2(5’-CGCTCAAGCGCGACTTCAG-3’)，PC 5/1 5’- CCACAGGACAACATGTCCAC-3’)和PC 5/2(5’- CAGGCGCTTTCTGGAACATG-3’)，可以将皱褶假单胞 Pseudomonas corrugata分为两个基因群(group I or group II)，扩增 条带为1100bp是group I，扩增条带为600bp为group II。PCR反 应体系为：25μl反应体系，20ng基因组DNA，1×PCR buffer (TaKaRa)，1.5mM MgCl2，20mM of dNTP(TaKaRa)，四条特异性引 物(每条引物浓度为10pmol)and 2.5U Taq DNA聚合酶(TaKaRa)。 PCR反应条件为：94℃ 5min预变性，94℃变性30s，62℃退火1 min，72℃延伸90s，30个循环后72℃充分延伸5min。PCR扩增 产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分析，条带大小为600bp(如图2)。结 果表明皱褶假单胞P94属于皱褶假单胞基因群II。
实施例2 抑菌谱分析
对病原真菌的平板抑制检测方法：用打空器打取5mm直径的 靶标病原真菌接种于PDA平板中央，P94与靶标菌成180°接种于 靶标病原真菌两测2.5cm处，25℃培养4到6天后测量病原真菌菌 落直径。以接种靶标真菌而不接种P94的平板为对照。抑制生长率 按照如下公式计算：
抑制生长率＝(C-T)/C×100％
C：对照真菌生长直径
T：接种P94后真菌生长直径
对病原细菌平板抑制检测方法：用双层培养法检测皱褶假单胞 P94对病原细菌的抑制情况。用KB培养基活化P94后用生理盐水配 成108cfu/ml的菌悬液，用移液枪吸取5μl接种于KB平板中央，培 养48h后用3ml的氯仿以其蒸汽杀死菌体。将活化好的靶标细菌配 成108cfu/ml的菌悬液，吸取50μl菌悬液加入到加入3ml融化后冷 却到50℃的水琼脂(0.7％琼脂，pH7.0)中，迅速混匀，立即倒入 三氯甲烷杀死P94菌体的培养基上，铺成均匀的薄层，28℃培养36 小时，观察抑菌圈的情况。
P94对病原真菌平板抑制结果如表2所示。
表2.P94对病原真菌平板抑制
注：a表示标准差；b-表示没有抑制作用
P94对病原细菌平板抑制结果如表3所示。
表3.P94对病原细菌平板抑制
注：a表示标准差。
实施例3 生防相关性状检测
蛋白酶检测：用脱脂牛奶平板(胰蛋白胨5g，酵母抽提物2.5g， 葡萄糖1g，7％的脱脂牛奶250ml，琼脂15g，用水补足至1000ml) 检测蛋白酶。将P94接种到平板中央，28℃培养72h，菌落周围有 透明圈出现表示蛋白酶阳性(见图3)。
HCN检测：HCN检测试纸准备，10mg copper(II)ethyl acetoacetate和10mg 4，4’-methylenebis-(N，N-dimethylaniline)溶于 4ml的氯仿中，剪切Whatman滤纸条，浸泡于配制好的溶液中，氯 仿挥发完全后就制备成了HCN检测试纸。在含有1ml KB培养基的 离心管中穿刺接种P94，HCN检测试纸悬于离心管中，28℃培养36 h，HCN检测试纸显示蓝色，表明P94产生HCN(见图4)。
IAA检测：P94接种于NA培养基(蛋白胨5g/l，酵母抽提物 1.5g/l，牛肉膏1.5g/l，NaCl5g/l)和添加0.5g/l色氨酸NA培养基中 28℃摇培4d后，取样5ml，12000rpm离心10min，取2ml上清， 加入100μl的10mM正磷酸，4ml检测液(1ml的0.5M FeCl3 溶于50ml of 35％ HClO4)室温反应25min后用分光光度计测530 nm处光吸收。用纯品IAA配制溶液测量标准吸收曲线，并计算P94 产生IAA的量。结果：P94在含有色氨酸的NA培养基中产生IAA 的浓度为15.97μg/ml，在不含有色氨酸的NA培养基中产生IAA 的浓度为6.97μg/ml。
磷酸酯酶活性测定：用Pikovskaya’s平板检测磷酸酯酶活性。 Pikovskaya’s平板配制方法为：酵母抽提物0.5g/l，葡萄糖10g/l，磷 酸钙5g/l，硫酸铵0.5g/l，氯化钾0.2g/l，氯化镁0.1g/l，硫酸锰 0.0001g/l，硫酸亚铁0.0001g/l，琼脂15g/l。把P94接种于 Pikovskaya’s平板中央，28℃培养7d，在菌落周围出现透明圈，这 表明P94具有磷酸酯酶活性(见图5)。
实施例4 发酵生产
1、菌种活化
使用KB培养基，培养基配方为：蛋白胨20g/l，甘油10ml/l， MgSO4·7H2O 1.5g/l，K2HPO4 1.5g/l，琼脂15g/l。将P94接种于KB 培养基斜面上，28℃培养48h。
2、种子液的培养
种子培养用AY培养基，AY培养基的组成：蔗糖9g/L，酵母 膏3g/L，NaCl 0.8g/L，KH2PO4 0.4g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，(NH4)2 SO4 3-5g/L，pH值为7.1。将活化好的皱褶假单胞P94用无菌生理 盐水配制成108cfu/ml的菌悬液，以0.1％的接种量接种于AY液体培 养基中，28℃摇床震荡培养，转速为150-200rpm，培养时间为44-48h。
3、发酵罐发酵
发酵培养基组成为：葡萄糖5g/l，淀粉6.5g/l，黄豆粉7g/l， (NH4)2SO4 7g/L，KH2PO4 0.8g/L，MgSO4·7H2O 0.65g/L，CaCO3 1.3g/L，pH值为7.2。把培养好的种子液以2％的接种量接入发酵罐 中，28℃，搅拌速度为180rpm，通气量为1:0.6-0.8(发酵液体积: 每分钟通气量体积)、罐压0.05MPa。发酵48h菌量达到 5-10×108cfu/ml得到皱褶假单胞P94菌液。
实施例5 防效与促生
以温室番茄和温室黄瓜为植物材料检测P94对番茄灰霉病和黄 瓜灰霉病的防治效果。番茄灰霉病菌和黄瓜灰霉病菌在PDA平板上 28℃培养7d，黑光灯诱导7d产孢，用无菌生理盐水洗脱孢子，用 血球计数板调整孢子浓度到107个孢子每毫升。试验设计5个处理。 将发酵好的P94发酵液稀释两倍喷施于番茄和黄瓜上，等叶面干燥 后喷施灰霉病孢子，塑料薄膜保湿，湿度控制80％以上，环境温度 控制为21℃～23℃。于接种后7天调查结果。试验结果表明P94对 番茄灰霉病和黄瓜灰霉病防治效果分别达到86.3％和78.4％。喷施 皱褶假单胞P94菌剂的番茄和黄瓜生长明显优于对照植株，称量番 茄和黄瓜的鲜重，发现喷施P94的番茄和黄瓜生长量提高22％～28％。 P94对瓜果腐霉、辣椒疫霉、茄科青枯等蔬菜病害有潜在的生防作 用。
序列表
<110>中国农业大学
<120>皱褶假单胞菌P94及其应用
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1462
<212>DNA
<213>Pseudomonas corrugata P94
<400>1
实施例1 P94的鉴定
综合皱褶假单胞(Pseudomonas corrugata)P94 CGMCC NO.1895 的形态学特征、生理生化特性、16SrDNA序列和特异性引物分析的 结果，将其鉴定为皱褶假单胞菌基因II型。具体鉴定结果如下：
1、菌体的形态特征
革兰氏染色阴性，在PDA培养基上产生黄绿色可溶性非荧光色 素，菌落兰绿色；在KB培养基上色素产生较少，菌落淡黄绿色。 电子显微镜观察，菌体长椭圆形，大小0.7×1.8μm，不少于两根极生 鞭毛(见图1)。
2、生理生化特性
皱褶假单胞P94生理生化特性如表1所示。
表1.P94生理生化特性
注：+，阳性反应；-，阴性反应；w，反应较弱。
3、16SrDNA序列分析
方法是：提取P94的基因组，用16S扩增通用引物63F 5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’ 和 1494R 5’-GGYTACCTTGT TACGACTT-3’。在如下PCR体系中扩增：50μl扩增体系，10pmol 引物，0.2mM dNTP，1.5mM MgCl2，2.5U Taq DNA聚合酶 (TaKaRa)，1×PCR buffer(TaKaRa)，25ng基因组DNA作模板。 PCR反应条件为：94℃ 5min预变性，94℃变性30s，56℃退火 30s，72℃延伸1min，30个循环后72℃充分延伸5min。PCR扩增 产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分析，用OMEGA公司的纯化试剂盒 Gel Extraction Kit纯化回收后连接TaKaRa公司的T载体 pMD18-T。在Invitrogen公司用ABI 3730 DNA测序仪进行测序，核 苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，基因序列已经提交GenBank， 基因收录号为：EF153018。用BLAST程序在GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)相应序列比对的结果表明P94的 16SrDNA序列与目前发表的皱褶假单胞相关菌株相比相似性最高， 达到99％。
4、特异性引物分析
用特异性引物PC 1/1(5’-GGATATGAGCCAGGTCTTCG-3’) 和PC 1/2(5’-CGCTCAAGCGCGACTTCAG-3’)，PC 5/1 5’- CCACAGGACAACATGTCCAC-3’)和PC 5/2(5’- CAGGCGCTTTCTGGAACATG-3’)，可以将皱褶假单胞 Pseudomonas corrugata分为两个基因群(group I or group II)，扩增 条带为1100bp是group I，扩增条带为600bp为group II。PCR反 应体系为：25μl反应体系，20ng基因组DNA，1×PCR buffer (TaKaRa)，1.5mM MgCl2，20mM of dNTP(TaKaRa)，四条特异性引 物(每条引物浓度为10pmol)and 2.5U Taq DNA聚合酶(TaKaRa)。 PCR反应条件为：94℃ 5min预变性，94℃变性30s，62℃退火1 min，72℃延伸90s，30个循环后72℃充分延伸5min。PCR扩增 产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分析，条带大小为600bp(如图2)。结 果表明皱褶假单胞P94属于皱褶假单胞基因群II。
实施例2 抑菌谱分析
对病原真菌的平板抑制检测方法：用打空器打取5mm直径的 靶标病原真菌接种于PDA平板中央，P94与靶标菌成180°接种于 靶标病原真菌两测2.5cm处，25℃培养4到6天后测量病原真菌菌 落直径。以接种靶标真菌而不接种P94的平板为对照。抑制生长率 按照如下公式计算：
抑制生长率＝(C-T)/C×100％
C：对照真菌生长直径
T：接种P94后真菌生长直径
对病原细菌平板抑制检测方法：用双层培养法检测皱褶假单胞 P94对病原细菌的抑制情况。用KB培养基活化P94后用生理盐水配 成108cfu/ml的菌悬液，用移液枪吸取5μl接种于KB平板中央，培 养48h后用3ml的氯仿以其蒸汽杀死菌体。将活化好的靶标细菌配 成108cfu/ml的菌悬液，吸取50μl菌悬液加入到加入3ml融化后冷 却到50℃的水琼脂(0.7％琼脂，pH7.0)中，迅速混匀，立即倒入 三氯甲烷杀死P94菌体的培养基上，铺成均匀的薄层，28℃培养36 小时，观察抑菌圈的情况。
P94对病原真菌平板抑制结果如表2所示。
表2.P94对病原真菌平板抑制
注：a表示标准差；b-表示没有抑制作用
P94对病原细菌平板抑制结果如表3所示。
表3.P94对病原细菌平板抑制
注：a表示标准差。
实施例3 生防相关性状检测
蛋白酶检测：用脱脂牛奶平板(胰蛋白胨5g，酵母抽提物2.5g， 葡萄糖1g，7％的脱脂牛奶250ml，琼脂15g，用水补足至1000ml) 检测蛋白酶。将P94接种到平板中央，28℃培养72h，菌落周围有 透明圈出现表示蛋白酶阳性(见图3)。
HCN检测：HCN检测试纸准备，10mg copper(II)ethyl acetoacetate和10mg 4，4’-methylenebis-(N，N-dimethylaniline)溶于 4ml的氯仿中，剪切Whatman滤纸条，浸泡于配制好的溶液中，氯 仿挥发完全后就制备成了HCN检测试纸。在含有1ml KB培养基的 离心管中穿刺接种P94，HCN检测试纸悬于离心管中，28℃培养36 h，HCN检测试纸显示蓝色，表明P94产生HCN(见图4)。
IAA检测：P94接种于NA培养基(蛋白胨5g/l，酵母抽提物 1.5g/l，牛肉膏1.5g/l，NaCl5g/l)和添加0.5g/l色氨酸NA培养基中 28℃摇培4d后，取样5ml，12000rpm离心10min，取2ml上清， 加入100μl的10mM正磷酸，4ml检测液(1ml的0.5M FeCl3 溶于50ml of 35％ HClO4)室温反应25min后用分光光度计测530 nm处光吸收。用纯品IAA配制溶液测量标准吸收曲线，并计算P94 产生IAA的量。结果：P94在含有色氨酸的NA培养基中产生IAA 的浓度为15.97μg/ml，在不含有色氨酸的NA培养基中产生IAA 的浓度为6.97μg/ml。
磷酸酯酶活性测定：用Pikovskaya’s平板检测磷酸酯酶活性。 Pikovskaya’s平板配制方法为：酵母抽提物0.5g/l，葡萄糖10g/l，磷 酸钙5g/l，硫酸铵0.5g/l，氯化钾0.2g/l，氯化镁0.1g/l，硫酸锰 0.0001g/l，硫酸亚铁0.0001g/l，琼脂15g/l。把P94接种于 Pikovskaya’s平板中央，28℃培养7d，在菌落周围出现透明圈，这 表明P94具有磷酸酯酶活性(见图5)。
实施例4 发酵生产
1、菌种活化
使用KB培养基，培养基配方为：蛋白胨20g/l，甘油10ml/l， MgSO4·7H2O 1.5g/l，K2HPO4 1.5g/l，琼脂15g/l。将P94接种于KB 培养基斜面上，28℃培养48h。
2、种子液的培养
种子培养用AY培养基，AY培养基的组成：蔗糖9g/L，酵母 膏3g/L，NaCl 0.8g/L，KH2PO4 0.4g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，(NH4)2 SO4 3-5g/L，pH值为7.1。将活化好的皱褶假单胞P94用无菌生理 盐水配制成108cfu/ml的菌悬液，以0.1％的接种量接种于AY液体培 养基中，28℃摇床震荡培养，转速为150-200rpm，培养时间为44-48h。
3、发酵罐发酵
发酵培养基组成为：葡萄糖5g/l，淀粉6.5g/l，黄豆粉7g/l， (NH4)2SO4 7g/L，KH2PO4 0.8g/L，MgSO4·7H2O 0.65g/L，CaCO3 1.3g/L，pH值为7.2。把培养好的种子液以2％的接种量接入发酵罐 中，28℃，搅拌速度为180rpm，通气量为1:0.6-0.8(发酵液体积: 每分钟通气量体积)、罐压0.05MPa。发酵48h菌量达到 5-10×108cfu/ml得到皱褶假单胞P94菌液。
实施例5 防效与促生
以温室番茄和温室黄瓜为植物材料检测P94对番茄灰霉病和黄 瓜灰霉病的防治效果。番茄灰霉病菌和黄瓜灰霉病菌在PDA平板上 28℃培养7d，黑光灯诱导7d产孢，用无菌生理盐水洗脱孢子，用 血球计数板调整孢子浓度到107个孢子每毫升。试验设计5个处理。 将发酵好的P94发酵液稀释两倍喷施于番茄和黄瓜上，等叶面干燥 后喷施灰霉病孢子，塑料薄膜保湿，湿度控制80％以上，环境温度 控制为21℃～23℃。于接种后7天调查结果。试验结果表明P94对 番茄灰霉病和黄瓜灰霉病防治效果分别达到86.3％和78.4％。喷施 皱褶假单胞P94菌剂的番茄和黄瓜生长明显优于对照植株，称量番 茄和黄瓜的鲜重，发现喷施P94的番茄和黄瓜生长量提高22％～28％。 P94对瓜果腐霉、辣椒疫霉、茄科青枯等蔬菜病害有潜在的生防作 用。
序列表
<110>中国农业大学
<120>皱褶假单胞菌P94及其应用
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1462
<212>DNA
<213>Pseudomonas corrugata P94
<400>1
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