本发明涉及通过将抗原施用于粘膜而引起血清和分泌抗体的特异刺激反应。

哺乳动物中的许多感染对它们相当有害，人们有理由为它们接种特异抗原以防止这些感染。因此，就制定了接种疫苗的方案，使哺乳动物受到一种抗原的刺激，从而产生免疫反应，并赋于动物免疫特性。

给哺乳动物施用抗原，可以通过许多常规的方法进行，包括肌肉注射（i.m.）、皮下注射（s.c.）、或通过口服给药（peros）。抗原的肌肉注射和皮下注射有一些不利之处，它需要比较专业化的技术、难于大规模进行、费用昂贵，而且无论对于免疫抗原还是对注射剂中的乳化剂都会发生若干付作用。疫苗的口服相比之下没有什么问题，但就目前为止用于口服的一些抗原来看，这种方法需要比较大的抗原量，因为实际吸收并且能刺激有效免疫反应的药量通常是很低的。因此，进行口服免疫所需的抗原量通常要远远超过体注射诱导免疫反应所需要的量。口服大量抗原以产生抗体反应还有一个主要的缺点，那就是服用大量的抗原常常导致产生身体的耐受性。（Tomasi，1980;Mowat，1985;Mowat和Parrot，1983;Ngan和Kind，1978;Hanson等人1979;Richman等人，1978;Rothberg等人，1973）

迄今为止的证据表明，总的来说，抗原在口服后被小肠吸收的机制，主要是借助于对肠腔内容物的非特异性选择进行的，这种选择是通过复盖在集合淋巴结（Peyer′s    Patches）和其他GALT （与肠结合的淋巴组织）的淋巴结上面的“M”细胞完成的。（Bland和Britton    1984）。局部淋巴细胞群落随后的致敏体作用导致产生局部IgA的免疫反应及IgG阻遏细胞的致敏，并因此抑制了血清IgG的反应（Tomasi，1980;Mowat，1985;Mowat和Parrot，1983;Ngan和Kind，1978;Hanson等人，1979;Richman等人，1978;Rothberg等人，1973）。

因此，很显然，抗原吸收的部位（不论它是通过集合淋巴结或是绒毛上皮）以及很可能抗原的服用量决定了口服抗原产生的免疫反应的形式。问题是除了霍乱毒素外是否还有任何其他的抗原，它们在口服后能够特异性地启动粘膜免疫系统和/或刺激体液的免疫反应，这些反应取决于所用剂量，而不诱发身体的耐受性以及不需要过多的抗原剂量。

考虑到这一点，我们决定研究某些粘连分子可能的潜力，它们与一些肠道病原的最初附着有关系，口服时能够刺激免疫反应。这些表面抗原使一些产肠毒的大肠杆菌菌株（ETEC）具有粘连性质，它们已被确定为是非鞭毛的丝状蛋白质附属物或纤毛（Gaastra和de    Graaf，1982）。其例子包括人类ETEC菌株的CFAI和CFAII以及动物ETEC菌株的K88，K99，F41和987P纤毛（Gibbons等人，1975;Evans和Evans，1978;Levine等人，1980;Morgan等人，1978;de    Graaf和Roorda    1982）。此外，我们还检查了其他一些蛋白质的能力，这些蛋白质在口服后对于免疫系统的启动没有明显的作用。这些抗原包括一些外源凝集素，S.typhimurium（i型鞭毛）的一种血清型抗原，没有活性的流感病毒和S.typhimurium内毒素（LPS）。 将口服引起的反应与完全肌肉注射（i.m.）产生的反应相比较。

因此，这些研究的目标是要提供一种方法，改进肠胃道粘膜对免疫原或抗原的吸收，以致于有可能通过免疫原的低剂量口服产生血清和分泌抗体，从而避免大量口服导致的耐受性。

因此，本发明描述了一组分子（粘膜免疫原），它们在服用后产生的抗这些蛋白的血清抗体，能与通过肌肉注射获得的抗体水平相比拟。而且，更大量地服用这些抗原时，还同时产生抗这些免疫分子的粘膜抗体。

本发明另一方面还描述了一种方法，依靠这种方法，对口服分子产生的抗体反应可以通过同时食用一些规定食物的分子而扩大或改变。

在本发明的另一方面，描述了一个可将半抗原或蛋白质粘连到粘膜免疫原上的方法，服用这种复合物时，会导致对这种半抗原或粘连蛋白质产生抗体。

缩写

1.Ab    抗体

2.BSA    牛血清清蛋白

3.ConA    伴刀豆球蛋白A

4.DNP    二硝基苯基

5.ELISA    酶连接免疫吸附剂测定法

6.ETEC    产肠毒素大肠杆菌

7.GALT    肠连结的淋巴组织

8.HA    羟磷灰石

9.i.m.    肌肉内

10.LHRH    促黄体释放激素

11.LPS    脂多糖

12.LT-B    产肠毒大肠杆菌的热不稳定毒素

13.O/N    隔夜

14.Per    oS    口服

15.PS    多糖

16.RT    室温

17.SC    皮下的

18.SDS-PAGE    SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

19.TCA    三氯乙酸

首先，本发明提供了一种复合物，它包括一个与一种载体分子相连的免疫原，这种载体分子能够与脊椎动物宿主的粘膜上皮发生特异的相互作用;在这种复合物中，基本上保留了免疫原的免疫活性和载体分子与脊椎动物宿主粘膜上皮发生特异的相互作用的能力，而且所说的复合物能够诱导该脊椎动物宿主的全身、细胞和/或粘膜的免疫反应。

符合本发明的较好的免疫原包括：一种激素、治疗药剂、抗原、或半抗原的全部、部份、其类似物、同系物、衍生物或它们的组合物。这些免疫原包括像LHRH（促黄体素释放激素）、FSH、HGH和抑制素等激素;还包括变应原如禾本植物（如大麦和匍匐冰草）的花粉、杂草花粉（例如三叶草、酸模草）、树的花粉（例如桉树、柏树），植物花粉（例如金雀花）、上皮（例如猫毛、狗毛、猪毛）和房间里的灰尘、麦壳和木棉等。

用作疫苗对抗剂的免疫原包括流行性感冒、麻疹、风疹、天花、黄热病、白喉、破伤风、霍乱、鼠疫、斑疹伤寒、卡介苗、流行性感 冒嗜血杆菌（haemophilus    influenzae），卡他奈瑟菌（Neisseria    catarrhalis），Kelbsiella    pneumonia，肺炎双球菌（pneumococci）和链球菌（streptococci）尤其是链球菌突变体（S.mutans）;以及由大肠杆菌、淋球菌、脑膜炎球菌、卡他、耶尔赞氏菌（Yersinia）、绿脓杆菌、假单胞菌（Pseudomonas）、牛摩拉克氏菌（Moraxella    bovis）、结状类细菌（Bacteroides    nodosus），葡萄球菌（Staphylococci）、链球菌（Streptococci）以及球杆菌（Bordetella）产生的纤毛。

较好的载体分子包括如987P、K99、CFAⅠ、CFAⅡ、K88或K41这样的细菌粘着物;从流行性感冒、麻疹、风疹、天花或黄热病病毒得到的血凝集素;像LTB、蓖麻毒素、相思子毒素、白喉毒素、modecin、破伤风毒素和具有类似结构的其他毒素或其结合亚基;以及从植物或其他来源得到的外源凝集素、外源凝集素包括如伴刀豆球蛋白A.Pokeweed促细胞分裂剂、或者由Lens    culinaris、Helix    pomatia、Glycine    max，Arachishypogea或Ulex    europeus或相思子毒素、天门冬属碗豆、宽豆、骆驼脚树、蓖麻籽、Fava豆、绿海藻、茸毛野碗豆、马吃的鹰咀豆（Horse    gram）、马靴酸苹果（Horse    shoe    crab）、Jack豆、Japanese    wisteria，Jequirity，Scotch    laburnum，Lima    bean，Limulin，Lotus，欧洲槲寄生（European    mistletoe）、Mung    bean、Osage橙、Pagoda树、花园碗豆（Garden    pea），马铃薯、红肾豆（Red    kidney    bean），红海藻（Red    marine    algea），西伯利亚碗豆村（Siberian    pea    tree），食用蜗牛（edible    snail）， 花园蜗牛（Garden    Snail）、欧卫矛（Spindle    tree），甜碗豆（Sweet    pea）、西红柿、小麦芽或有翼碗豆（Winged    pea）得到的外源凝集素。

在本发明的一个较好的实施方案中，提供了一个包括有促黄体释放激素及LTB的复合物。

在另一方面，本发明提供了一个生产上述复合物的方法，该方法包括：

（a）使免疫原与载体分子反应形成所述复合物;

（b）对该免疫原进行化学修饰，使得它至少具有一个可以形成化学键的功能团，使该免疫原与载体分子反应形成所说的复合物。

（c）对该载体分子进行化学修饰，使得它至少具有一个可以形成化学键的功能团，使该免疫原与载体分子反应形成所说的复合物。

（d）对免疫原和载体分子进行化学修饰，使得它们具有可以形成化学键的功能团，使该免疫原与载体分子反应形成所说的复合物。

（e）使该免疫原与至少一种键合剂反应，使该免疫原与载体分子反应形成所说的复合物。

（f）使该载体分子与至少一种键合剂反应，使该免疫原与该载体分子反应形成所说的复合物。

（g）使该免疫原和载体分子与至少一种键合剂反应，并使该免疫原与载体分子反应形成所说的复合物。

（h）任何一种上述方法中各步骤的组合。

在另一方面，本发明提供这样一个方法，该方法包括：

提供一个DNA重组分子，该分子包括一个在表达时为免疫原氨基酸序列编码的第一DNA序列，一个在表达时为载体分子氨基酸序 列编码的第二DNA序列以及载体DNA;用所说的DNA重组分子转化一个宿主，使所说的宿主能够表达一个含有所述复合物的杂化蛋白质产品;培养所说的宿主来实现所说的表达并收集所说的杂化蛋白质产品。

另一方面，本发明还提供了另一种生产复合物的方法，该方法包括：

（a）化学合成免疫原和/或载体分子，并通过化学反应形成复合物;或

（b）合成一个含有免疫原和载体分子氨基酸序列的杂化肽，肽最好是由固相合成、酶合成或人工合成制备的。

在本发明的一个较好的方案中，人工合成的免疫原或载体分子虽然束缚在固相肽合成装置的树脂上，但也分别被偶联到载体分子或免疫原上。

在本发明的另外一个方案中，提供了一个用DNA重组分子转化的转化株宿主，该DNA重组分子包括一个表达时为免疫原的全部、部份、它们的类似物、同系物、衍生物或其组合物的氨基酸序列编码的第一DNA序列;一个表达时为该载体分子的全部、部份、它们的类似物、同系物、衍生物或它们的组合物的氨基酸序列编码的第二DNA序列，及载体DNA。

在本发明的一个较好的方案中，这种转化宿主是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌、酵母、霉菌或一种较高级的真核细胞。在本发明的一个较好的方案中，所说的宿主是大肠杆菌。属于本发明范围之内的一种转化微生物培养物已寄存在美国典型培养物收集中心（ATCC）其编号为：

在另一个方案中，本发明提供了一个DNA重组分子，它包括一个在表达时为免疫原氨基酸序列编码的第一DNA序列;一个在表达时为载体分子氨基酸序列编码的第二DNA序列和载体DNA。

在本发明这种方案的较好的实施例中，载体DNA是质粒DNA，但是其他一些载体也被视为在本发明范围之内，它们包括：病毒、噬菌体和柯氏质粒（Cosmids）。在本发明的一个较好的方案中，提供了质粒pBTAK66，用它转化一个宿主细胞时，可以产生包含落在本发明范围之内的多肽的蛋白质产品。

在本发明的另一个方案中，提供了一个多核苷酸序列，该序列包括为一种融合产品编码的第一杂交多核苷酸序列，该融合产品包含了与载体氨基酸序列融合的免疫原的氨基酸序列;包括一个与所述第一杂交多核苷酸序列充份相关以至能与所述杂交多核苷酸序列杂交的一个多核苷酸序列;一个由于突变、包括单个或多个碱基的置换、缺失、插入和倒位，而与所述第一杂交多核苷酸序列相关的多核苷酸序列，或者一个在表达时为一种多肽编码的多核苷酸序列，这种多肽具有与所述融合产品相似的生物学或免疫学活性。

这种多核苷酸序列最好是这样一种序列，其中的第一杂交多核苷酸序列是LHRH的全部、部份、它们的类似物、同系物、衍生物或其组合物的氨基酸序列的编码序列，该LHRH与载体分子的氨基酸列序相融合，而载体分子最好是LTB。

在本发明的另一个方案中，提供了一种药物，它包含一个本发明的复合物以及药学上可允许的载体或稀释剂，药学上可允许的载体或稀释剂包括像片剂、水溶液、碳酸氢钠溶液这样的典型载体和稀释剂以及类似的、中和胃酸的或具有类似缓冲能力的稀释剂、乙二醇、油、 水包油型或油包水型乳化剂、并包括乳剂、凝胶体、膏剂和粘性胶体悬浮液形式的药物，这些药物可以制成胶囊、片剂、缓慢释放或酏剂的形式，或者制成凝胶或膏剂，或也可以制成鼻用喷雾剂，这种形式的药物中含有气溶胶。而且该药物还可以做成牲口的饲料或适于人类消耗的食品。

发明人还发现，一些特定食物的分子与本发明的复合物共同服用，可选择性地调节对该复合物的免疫原产生的免疫反应的强弱和/或类型。

因此，本发明还提供了这样一种药物，它包括本发明的复合物以及一种能够选择性地调节该复合物的免疫原产生的免疫反应的强弱和类型的特定食物分子。

本发明所设想的特定食物分子包括碱性的、中性的和酸性的氨基酸，如：精氨酸、组氨酸、赖氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、门冬氨酸、谷氨酸;水溶性和非水溶性的维生素如硫胺素、核黄素、吡哆醛、氰钴胺（维生素B12）、抗坏血酸（维生素C）、维生素D2、麦角甾醇、维生素E、维生素A、维生素K等;糖，包括单糖如半乳糖、甘露糖、甘露糖醇、山梨醇、葡萄糖、木糖、阿洛糖、阿卓糖、阿拉伯糖、毛地黄毒素糖、赤藓糖、果糖、来苏糖、胞壁酸、丙酮酸、核糖、塔格糖、塔罗糖以及酰胺化的和N-乙酰化的衍生物;低聚糖例如：乳糖、麦芽糖、蜜二糖、蔗糖、纤维二糖、N，N联乙酰壳二糖、龙胆二糖、异麦芽糖、乳糖酸、海藻糖、土冉糖;以及食用无机盐和辅助因子例如锰、镁、锌、钙和铁。

本发明还提供了一个本发明复合物的施用方法，此方法包括将本发明的复合物与特定食物分子一道施用于粘膜，该食物分子能够调节免疫原引起的免疫反应的强弱和类型。

本发明还给出了本发明药物的口服用药法，以便使宿主的活性分子产生反应。这样一种反应在活性分子是抗原或半抗原时可以是身体的免疫反应和/或粘膜的免疫反应。在活性分子是LHRH或其衍生物、类似物、同系物、部份或其组合物时，这种反应将是对于宿主性腺功能的抑制。如果口服药物中包含有符合本发明的一种特定食物分子，本发明则还提供了一种增强宿主对活性分子的反应的方法，该方法包括将这种口服药物施用于宿主。

图1显示了987P纤毛素亚单位的N-末端氨基酸序列，与其他纤毛蛋白的N-末端氨基酸序列的对照。

材料：

外源凝集素是从Sigma化学公司购买的，失活的流感疫苗是从联邦血清实验室（澳大利亚）购买的。糖和维生素由以下来源获得：乳糖（AR级）-澳大利亚悉尼的Ajax化学公司;果糖D（-），甘露糖D（+），山梨醇和木糖D（+）（所有的都是AR级）-英格兰、普尔的B.D.H化学有限公司;蜜二糖D（+）-密西西比州、聖路易斯Sigma公司;视黄醛（维生素A醛）-瑞士Fabrik Buchs，Fluka AG化学公司;盐酸硫胺素（维生素B1），核黄素（维生素B2），吡哆醛（维生素B6），氰钴铵（维生素B12），L-抗坏血酸（维生素C），麦角甾醇（前维生素D）以及dl-a-生育酚（维生素E）-密西西比州聖路易斯Sigma化学公司。

细菌菌种和培养基

实验中所用的大肠杆菌K99，987P和LTB菌种例于表1中，它们是由SuSan    Clark博士（澳大利亚生物工程研究所分子生物学实验室）慷慨赠送的。培养物是在37℃（除非特别指出）如所指出的那样（表1），在具有或不具有1mM异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的卢丽亚肉汤培养基（LB）中摇晃下生长的。沙门氏杆菌（Salmonella    Typhimurium）是在37℃在加入了0.2%甘油的LB培养基中摇晃下生长的。

表1

菌株    遗传标记    菌株起源    表型

BTA 595 p BTA 193 RB 791 LTB＊

BTA    604    P    BTA    201    MC    1061    987P

BTA    262    P    BTA    106    EO    8654    K99

＊包括了 1mM IPTG

抗原的纯化

纤毛的制备

用放射性标记的抗血清检测到的表达被克隆的纤毛的大肠杆菌，在对数生长期时进行收集。把培养物加热到60℃保持三十分钟，在这之后，生物体通过离心（3，000xg，30min，4℃）进行沉淀。利用改进的Laemmli的方法（Laemmli，1970，Salit等人1980），用12.5%的SDS-PAGE（十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）检查上清液中的纤毛含量。

K99的提纯：培养物上清液用10N的氢氧化钠调整PH值到9.7，并在室温下搅拌十分钟，用离心法（3，000xg，30min， 4℃）回收含有纤毛的沉淀，并再次悬浮在PH7.2的100毫升蒸馏水（dH2O）中，将该步骤重复两次。

987P的纯化：除了使纤毛通过用冰醋酸将pH调节到3.9而进行沉淀外，所采取的步骤与上面具体描述的相同。

羟磷灰石色谱法

使羟磷灰石（HA）（DNA级，Bio-Gel    HTP，Bio-Rad）慢慢地在过量的蒸馏水中溶胀，在短时间后（小于2分钟）轻轻倒出漂浮的微粒。再重新加入蒸馏水，使凝胶慢慢地悬浮，并再次倾倒出漂浮微粒。这样的过程重复好几次。用近似30%的HA悬浮液装柱（30×5厘米），并通过重力作用使之沉淀。用蒸馏水以16毫升/小时的流速通过该柱，从而使柱体压紧，直到胶床表面稳定为止。将K99或987P（100毫升）的样品以不超过每小时30毫升的流速上柱，然后用蒸馏水洗柱直到过柱液在280nm下检测不到蛋白质为止。用pH为7.5的15到250mM的磷酸钠的线性梯度以30毫升/小时的流速洗脱纤毛，收集各组份并用SDS-PAGE检查，回收纤毛峰，并将各峰组分合并。

离子交换色谱法

将从HA色谱法收集的K99和987P纤毛合并组份分别用NaOH（pH9.7）或冰醋酸（pH3.9）再沉淀，在离心后（3000xg，10分钟），把含有纤毛的沉淀重新悬浮在pH5.5，50mM的柠檬酸缓冲液（K99）和pH8.5，50mMTris-HCl（987P）中，然后加到已用同样的缓冲液平衡过的离子交换柱上，K99和987P以100毫升/小时的流速分别加到羧甲基纤维素（CM）和二乙胺基乙基（DEAE）柱上，用二倍体积的上柱缓冲液洗柱， 并用含有10mM到0.5M的NaCl线性梯度的平衡缓冲液洗脱纤毛，按照Tsai和Frasch（1982年）的方法用SDS-PAGE检查组份的蛋白质含量和LPS污染。

LTB的纯化

3升的LTB上清液用蒸馏水稀释至6升，用冰醋酸把pH值调至6.5，并以1.2升/小时的流速加到用pH为6.5的10mM磷酸盐缓冲液平衡的快速流动的羧甲基-琼脂糖胶柱（5×30cm）上，然后用400毫升pH为6.5的10mM磷酸盐缓冲液洗柱，并用含有10-500mM    NaCl的线性梯度的pH为6.5、10mM磷酸盐洗脱结合的蛋白质。收集洗脱组份并用SDS-PAGE进行分析，合并LTB峰。

鞭毛的分离

用离心法（3000xg，15min，4℃）使指数后期生长的细菌培养物沉淀。将这些细胞重新悬浮在盐水中，并加热到60℃保持30分钟，接着进行离心分离（3000xg，10min，4℃），在上清液中加入100%的三氯醋酸（W/V），使其最终浓度为10%（W/V）而产生沉淀，在1500xg4℃下离心10分钟，把沉淀物重新悬浮在少量的pH为8.8的1M    Tris中，用超声波处理直到成为溶液。加入最终浓度为80%（V/V）的乙醇，并在4℃下以2000xg，10分钟离心沉淀鞭毛。把沉淀物悬浮在丙酮中，用超声波处理使其成为悬浮液，由离心分离（5000xg）再次沉淀。最后，使沉淀物在10%SDS，50mMEDTA，10mM    Tris-HCl，pH8.0中沸腾使之溶解，然后上Sephacyl    S-200的层析柱。

鞭毛的纯化

在沸腾15分钟后，在Beckman半敞开小室微形分离器中离心分离5分钟，除去不溶物质以净化鞭毛，把上清液加到用pH为8.8的20mM    Tris、0，1%SDS和10mM    EDTA平衡过的Sephacryl-S200柱（2.5×80cm）上（Pharmacia，Fine    Chemicals），并用同样的缓冲液洗脱。收集组份并用SDS-PAGE进行分析。最后合并鞭毛峰组份，并用10%（最终浓度）TCA进行沉淀。离心，再如前所述的那样，用乙醇和丙酮洗涤，把最终的沉淀物重新悬浮在蒸馏水中。

脂多糖（LPS）的纯化

S.typhimurium的过夜培养物用溶解在20%（V/V）乙醇中的0.5M CaCl2萃取（30分钟，在室温下），该乙醇中含有pH3.0的100mM柠檬酸盐和5%的Zwittergent3.12（W/V）（Calbiochem）。用离心法（3000xg，10min，4℃）沉淀细菌，把沉淀物重新悬浮在pH8.0的50mM EDTA中，室温下强烈搅动该悬浮液30分钟。离心除去细菌后，在上清液中加入乙醇至最终浓度为75%，沉淀蛋白质物质并继续加入乙醇，使其上清液含90%乙醇。用丙酮洗涤形成的沉淀颗粒，再沉淀最后重新悬浮在蒸馏水中。用蒽酮试剂（Herbert等人，1985）测定糖含量。并用SDS-PAGE检查是否有杂蛋白的存在。市售的大肠杆菌LPS（Sigma公司）在二个检测中都可以作为标准，按照Tsai和Frasch（1982）的方法，用银染色法对凝胶中的LPS进行染色。

多糖（PS）的制备

将S.typhimurium    LPS制剂与1M冰醋酸一起加热至100℃保持2-5小时，从而从LPS上分解下来A类脂。然后在4℃以3000xg离心10分钟除去A类脂。

纯化抗原的说明

对纯化的K99和987P纤毛制品进行SDS-PAGE分析表明，在还原条件下，分别有一个泳动至17500和20，000分子量处的单带（图1）。这与Isaacson及其他人（Isaacson和Richter，1980;Morris等人1980;de    Graaf等人，1981;Fusco等人1978）发表的数据一致。这些蛋白质在pH9.7和3.9（分别对于K99和987P来说）容易沉淀，表明这两种蛋白质的pI值是在这些值域附近（见Isaacson和Richter    1981;de    Graaf等人，1981）。这些制剂的银染色显示他们很少含有（小于1微克/100微克蛋白质）或没有LPS杂质。确定987P氨基末端的序列。

氨基末端的小型序列分析是由南澳大利亚Adelaide，S.A.Pty有限公司的生物工程研究所为我们进行的。对100毫微摩尔如上所述纯化的987P样品进行测定，将987P的氨基末端序列与发表的K99序列进行比较，表明这二个分子之间没有同源区的存在（图1）（Gaastra和Graaf，1982）。

并发现纯化的LTB和S.typhimurium鞭毛没有杂质LPS，在还原条件下用SDS-PAGE检查时，分别以表观分子量为12500和52000的单带泳动。

对纯化的LPS的SDS-PAGE凝胶进行银染色，没有检测到蛋白质杂质。由蒽酮反应测定的复合物糖含量是2毫克/毫升。没 有多糖的A类脂也发现含有2毫克/毫升的多糖。它在SDS-PAGE中不能泳动（用银染色法进行检测）表明它没有杂质类脂。

抗原的二硝基苯基化

按照Little和Eisen（1967）的方法，对K99、LTB和外源凝集素进行二硝基苯基化，简单地说，使载体（在pH9.5的0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中）与0.1M的DNFB溶液（在丙酮中）于室温下反应过夜。蛋白质然后在偶联缓冲液中进行充份渗析。我们以前的研究表明，987P并没有曝露的可偶联的游离氨基基团，所以双氨基的间隔基团首先如下述键合到蛋白质的游离羧基部份上。10毫克提纯的987P加入冰醋酸在pH3.9下沉淀。纤毛通过在4℃以3000xg离心10分钟除去，把沉淀物重新悬浮在蒸馏水中，并用1N的NaOH使pH上升至6.5，然后使纤毛溶液与1-乙基-3-（3-二甲基氨苯基）碳化二亚胺-HCl（EDAC，Bio    Rad实验室，加里福尼亚州Richmond）在有20mM1，2-二氨乙烷（BDH化学公司，英格兰Poole）存在下反应到0.5mM的最终浓度，在室温下（20-23℃）过夜。将氨基取代了的987P更换两次pH值为9.5，0.1M的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液渗析24小时，再在下列各有关步骤中使用。外源凝集素结合部位在它们与DNFB反应时通过加入外源凝集素特异糖而被保护起来。因此把50mM的D-葡萄糖、D-甘露糖、N-乙酰基-D-半乳糖胺、D-半乳糖、N-乙酰基-D-半乳糖胺、D-半乳糖（1-3）-D-半乳糖N-Ac，和L-岩藻糖的溶液分别加到如下的外源凝集素中：伴刀豆球蛋白A、Pokeweed促细胞分裂剂、Lens    Culinaris、Helix    Pomatia、Phaseolus Vulgaris、Glycino    max、Arachis    hypogea和Ulex    eruopeus。

抗原的施用

雌性C57BL/6J小鼠（18至22克）是从动物资源中心（西澳大利亚Perth）得到的，所有的小鼠在口服或肌肉注射（i.m.）抗原之前均经受3-4小时的饥饿，用一个专门制作的饲喂针将在pH9.5的0.5毫升的0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中具有适当浓度的抗原喂给小鼠。将同样剂量的，在灭菌生理盐水中的抗原通过肌肉注射到左后腿上。口服或肌肉注射接受抗原的5只小鼠的小组，在第0天和第14天给于两次同样的抗原剂量。在第14天和第21天从眼巢后丛抽取血样（约0.5毫升），然后用颈部脱位法处死小鼠，并以下述方法清洗小肠：小心地取出小肠，并用一个钝头的饲喂针将小量的清洗缓冲液（1.0ml，30mM    Tris-HCl、PH8.8;0.9%NaCl、50mM    EDTA加1.0%吐温20）加到肠腔中，轻轻地搓揉肠子后，用食指和大拇指挤出内容物，立刻离心这样得到的肠洗液以除去碎屑，并贮藏在-20℃以用于分析。在除去血样中的血清并在-20℃下贮存之前允许血样在4℃下凝结。

酶连接的免疫吸附剂测定（ELISA）

用于确定抗体效价的ELISA，如前所述，用Russell-Jones等人（1984）的方法进行。

实例1

粘膜免疫原活性分子的鉴别

检查了一些在口服后能附着于小肠粘膜并能刺激产生免疫反应的分子的可能的潜力，将由这些分子产生的反应与相似地喂给没有粘膜 附着功能的其它分子后看到的反应进行比较。

从表1，1中可看出，在这些实验中，检测到三大类的蛋白质：一引起血清和肠的反应的小蛋白质，K99，987P，LTB，流感疫苗和各种外源凝集素（第一类）（这些在以后将称为粘膜免疫原），仅仅引起血清反应的那些蛋白质（LPS）（第二类），以及在试验剂量下既没有血清反应又没有肠反应的蛋白质（鞭毛，BSA和PS）（第三类）。在第一类抗原中，987P与LTB（12.2±4.4）或K99（3.2±4.9）相比，是IgA抗体（ab）（48.5±1.8）的极为有效的刺激剂。此外987P也比K99（3.0±5.3）或LTB（1.0）在更大的程度上刺激肠胃的IgG（10.8±1.76），而且只有987P能够刺激血清IgA的形成（10.8±8.8）。所有四种第一类抗原以相似的程度刺激血清IgG（表1.1）。第二类抗原，LPS激发小量的血清IgG反应（12.1±1.0）而没有IgA或肠胃的刺激活性。最后，BSA，鞭毛和LPS的多糖部份-第三类抗原-既不诱发血清的、也不诱发肠的IgG或IgA形成。所有三类有代表性的样品，K99，987P，LTB，LPS和鞭毛以肌肉注射方式给药，并检测是否同时有血清的反应和肠的反应（表1，2）。第一类和第二类抗原产生相似的血清IgG反应，但没有产生血清IgA反应或肠的IgG/IgA反应。用肌肉注射免疫原时，只有抗-LPS的血清IgG反应得到很大的改善。在口服和肌肉给药后进一步研究987P，K99和LTB对于剂量的反应。从表1，3和1，4中可以看出，不管给药的方式如何，987P无论是比K99或是比LTB总是产生更高的效价。很有意义的是，第一类抗原-LTB-显示出一个钟型 的剂量反应关系，在10与50微克之间具有一个平稳的最大值，没有其他的第一类抗原所产生这样的效果，LTB在肌肉给药时也没有这种效果。口服所有的第一类抗原（Ag）都在很宽的试验剂量范围上引起更高水平的肠IgA抗体的形成（S-IgA）。

这两种给药方式之间的比较表明，虽然肌肉注射始终产生较高的效价，但对粘膜免疫原进行口服施用所产生的抗体水平，可与肌肉注射第一类和第二类抗原10至100微克所产生的抗体水平相比拟。

表1.1

口服抗原的免疫反应

用于免疫的抗原 免疫反应＊第21天

血清的    肠的

（20微克的剂量）    IgG    IgA    IgG    IgA

K99    968±120    ＜4    3.0±5.2    3.2±4.9

987P    776±64    10.8±8.8    10.9±1.7    48.5±1.88

LTB    1351±211    ＜4    ＜4    12.2±4.4

流感疫苗    179±34    ＜4    ＜4    ＜4

鞭毛    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4

LPS    12.1±1.0    ＜4    ＜4    ＜4

pS    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4

BSA    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4

ConA＊＊666±84 ＜4 未测 未测

FW-mitogen＊＊641±119 ＜4 未测 未测

L.culinaris＊＊954±48 ＜4 未测 未测

H.pomatia＊＊591±127 ＜4 未测 未测

p.vulgaris＊＊1378±110 4.8±2.3 未测 未测

G.max＊＊1529±65 3.1±6.9 未测 未测

A.hypogea＊＊1276±242 ＜4 未测 未测

U.europeus＊＊1583±94 ＜4 未测 未测

＊在37℃45分钟后给出ELISA读数0.5的抗血清稀释液的倒数。每个数值代表了由5只小鼠获得的平均值±1个标准误差。

＊＊每种外源凝集素，其ELISA效价代表了抗DNP的反应，是通过与DNP-BSA反应而测得的，它们是用4个DNP分子/摩尔的外源凝集素取代的。

表1.2

肌肉注射抗原的免疫反应

用于免疫的抗原 免疫反应＊第21天

（20μg的剂量）    血清的    肠的

IgG    IgA    IgG    IgA

K99    1024±94    ＜4    ＜4    ＜4

987P    1552±112    ＜4    ＜4    ＜4

LTB    1782±100    ＜4    ＜4    ＜4

鞭毛    1595±227    ＜4    ＜4    ＜4

LPS    388±58    ＜4    ＜4    ＜4

＊见表1.1

表1.3

口服抗原的剂量反应

抗原 免疫反应＊，第21天，每种剂量（μg）

0.1    1.0    10    50    100    1000

血清IgG

K99    1.0    4.0    28    675    1351    4096

987P    4.0    14    84    588    1024    3104

LTB    9.0    194    1351    1331    891    891

血清IgA

K99    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4

987P    ＜4    ＜4    ＜4    9.6    18.3    32

LTB    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4

肠IgG

K99    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4

987P    ＜4    ＜4    ＜4    4.0    4.0    8.0

LTB    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4

肠IgA

K99    ＜4    ＜4    ＜4    4.0    16.7    87

987P    ＜4    ＜4    9.1    54    84    147

LTB    ＜4    ＜4    ＜4    4.0    4.0    8.0

＊见表1.1

表1.4

肌肉注射抗原的剂量反应

抗原 免疫反应＊，第21天时，每种剂量（μg）

0.1    1.0    10    50    100    1，000

血清IgG

K99    256    445    776    1351    1776    5104

987P    256    891    1024    3104    4096    18820

LTB    64    588    1176    2702    4096    8192

血清IgA

TK99    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4

987P    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4

LTB    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4

小肠IgG

K99    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4

987P    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4

LTB    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    7.0    16

小肠IgA

K99    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    4.6

987P    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    4.0    6.0

LTB    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    16.0    11.1

＊见表1.1

实例    2

特定食物分子对口服粘膜免疫原后的免疫反应的效应。

我们实验室用异系交配的瑞士雄鼠所做的最初的研究表明，在口服抗原时同时饲喂某些特定食物分子，有可能改变免疫反应。因此，将粘膜免疫原K99，987P和LTB等与一些食物糖类和维生素一起饲喂给小鼠。我们推测，由于已知多种不同的抗原能附着于小肠上皮表面的不同分子上，并由于已知整个肠腔中的糖蛋白和糖脂的分布以及吸收细胞的分布有变化，因此，将抗原与这些细胞经常吸收的特定食物分子一同施用，则有可能促进这些细胞对附着分子的吸收。从此论点进一步推测下去，我们还认为对于不同的抗原来说，刺激分子可能有不同的结构。

表2.1、2.2和2.3给出的结果证明，尽管大多数维生素和糖类在调节K99、987P和LTB的免疫反应中都有些影响，但某些特定食物分子对于它所能够影响的粘膜免疫原来说仍然具有选择性，而且，对于究竟是首先诱导分泌或是血清反应也具有选择性。因此，与维生素B12或蜜二糖一起施用时，K99所诱导的血清抗体反应得到显著增加（P＜0.05），与维生素B2、维生素D、维生素E、果糖或甘露糖一起施用时没有什么变化，而与维生素A、维生素B1、维生素B6、维生素C、乳糖、山梨醇和木糖等一起施用时则有不同程度的降低（表2.1）。

与此不同，将987P与维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素E、果糖或甘露糖等一起施用时，血清抗体反应得到提高（表2.2），与维生素A，维生素B1、维生素B2、乳糖、蜜二糖、山梨醇和木糖等一起施用时没有什么变化，有维生素D存在时则降低。 另一方面，在共同饲喂的特定食物分子对血清抗体水平的影响中，LTB表现出独特的性质。表2.3的结果清楚地表明，有维生素A，维生素B2、维生素D、果糖、甘露糖和木糖存在时，LBT抗血清的效价增大。使用维生素B1、维生素B12、维生素C或密二糖则很少或没有变化，而用维生素B6、维生素E、乳糖、蜜二糖和山梨醇时则几乎完全抑制了反应。使用维生素B6、乳糖、蜜二糖和山梨醇时观察到的这种免疫反应的抑制是可以预料的，因为这些化合物与半乳糖的结构相似，而半乳糖被认为是能够结合LTB的GM1神经节苷脂上的特异性糖决定子。从这些结果可以大致认为，K99、987P和LTB能够和微绒毛上皮的分散细胞结合并被其吸收。

剂量反应实验（表2.4、2.5和2.6）表明，只要在口服粘膜免疫原中简单地加入特定食物分子，就有可能促进免疫系统的分泌臂，而并不同时刺激血清抗体，或者与此相反，加强血清反应而不影响分泌抗体的水平。这样，K99与大剂量的维生素B12或蜜二糖的共同饲喂，导致血清抗体分别上升两倍到八倍，而很少同时导致分泌抗体的上升。相反，增加维生素D的共同饲喂剂量，导致血清抗体的下降和分泌抗体的上升。另一方面，某些特定食物分子也能同时促进分泌抗体和血清抗体的效价，如所表明的那样，共同饲喂维生素C和987P可使血清抗体上升八倍，使血清IgA上升1000倍。

用粘膜免疫原和维生素或糖类一起作肌肉注射的实验表明，这种注射对免疫反应很少有-如果有一点的话-什么效应，这证明与粘膜免疫原一起饲喂这些分子而导致的反应变化一定是在这些分子的吸收部位或其附近发生的，而不是直接作用于免疫系统（表2.7）。

表2.1

特定食物分子对口服K99（20μg）＊后的免疫反应的影响。

抗体反应

特定食    剂量    血清    小肠

物分子    IgG    IgA    IgG    IgA

对照    -    968±120    ＜4    3.0±5.2    3.2±4.9

VitA    20μg    278±184    3.4±4.7    1.5±1.1    5.4±3.0

VitB1″ 117±107 1.5±2.0 2.7±1.0 2.1±0.9

VitB2″ 604±216 ＜4 2.3±1.7 2.0±0.6

VitB6″ 14±50 ＜4 2.0±1.5 3.5±8.2

VitB＊＊12″ 3377±1266 4.0±3.0 ＜4 ＜4

VitC＊＊″ 318±255 2.0±2.8 32±1.1 98±70

VitD＊＊″ 1921±640 ＜4 ＜4 6.3±2.7

VitE    ″    512±128    ＜4    ＜4    4.4±2.1

果糖    50mM    1782±966    8.4±3.7    2.9±1.6    34.7±14.2

乳糖    ″    84±204    ＜4    ＜4    22.9±6.7

甘露糖    ″    1176±411    2.6±3.4    10.2±3.4    21.1±40.3

蜜二糖    ″    1840±208    1.2±1.4    3.2±2.0    4.4±3.7

山梨醇    ″    77±179    ＜4    1.3±0.4    20.5±3.4

木糖    ″    328±217    ＜4    1.9±1.1    2.8±1.3

＊在免疫后21天，在37℃保温45分钟后，ELISA的读数为0.5的稀释抗体血清的倒数。每个数值是5只小鼠的平均值±1个标准差。

＊＊每个数值是15只小鼠的平均值±1个标准差。在剂量反应实 验中也做了这些分子的实验。

表2.2

特定食物分子对口服987P（20μg）＊后的免疫反应的影响。

特定食    剂量    血清    抗体反应    小肠

物分子    IgG    IgA    IgG    IgA

对照    -    776±64    10.8±8.8    10.9±1.7    48.5±1.8

VitA＊＊20μg 648±40 29.0±20 8.4±3.1 20.5±24.6

VitB1″ 891±127 12.1±3.6 9.4±1.5 14.7±5.5

BitB2″ 1082±271 31.1±11.9 17.8±7.6 21.1±11.9

VitB6″ 1782±509 23.6±8.7 32.8±9.3 39.9±7.1

VitB12″ 3983±1307 48.5±16.0 35.7±3.4 91.7±31.9

VitC＊＊″ 4521±1046 54.2±19.2 10.8±6.9 84.1±14.3

VitD＊＊″ 398±89 18.8±11.0 13.1±4.9 34.7±8.1

VitE    ″    3468±776    9.18±2.6    11.1±4.2    19.9±3.9

果糖    50    2048±894    10.8±3.6    15.1±4.7    23.5±3.2

乳糖    ″    1128±662    15.3±2.9    19.6±2.5    21.7±6.1

甘露糖    ″    4970±2270    24.9±11.7    14.3±1.9    16.9±26.4

蜜二糖＊＊″ 1243±474 30.3±7.7 91.7±10.9 124.5±22.6

山梨醇    ″    1389±307    38.8±19.1    22.9±4.6    91.7±18.6

木糖    ″    1024±941    6.2±1.9    19.6±7.1    21.4±5.4

＊见表2.1

＊＊见表2.1

表2.3

特定食物分子对口服LTB（20μg）＊后的免疫反应的影响。

抗体反应

特定食    剂量    血清    小肠

物分子    IgG    IgA    IgG    IgA

对照    -    1351±211    ＜4    ＜4    12.2±4.4

VitA    20μg    4705±676    ＜4    ＜4    21.1±7.6

VitB1″ 1782±309 ＜4 ＜4 16.0±2.1

VitB2″ 3565±908 ＜4 ＜4 16.0±3.7

VitB＊＊6″ 9.18±1.1 ＜4 ＜4 ＜4

VitB12″ 1024±116 ＜4 ＜4 24.2±11.9

VitC    ″    337±206    ＜4    ＜4    16.1±5.0

VitD    ″    4097±74    ＜4    ＜4    13.9±2.2

VitE    ″    194±64    ＜4    ＜4    18.4±3.6

果糖    50mM    6208±1192    ＜4    ＜4    10.5±3.3

乳糖＊＊″ 5.0±1.0 ＜4 ＜4 ＜4

甘露糖    ″    4096±658    ＜4    ＜4    24.2±8.1

蜜二糖    ″    512±76    ＜4    ＜4    8.0±4.0

山梨醇    ″    8.0±1.2    ＜4    ＜4    ＜4

木糖    ″    5404±2211    ＜4    ＜4    21.1±9.2

＊见表2.1

＊＊见表2.1

表2.4

口服施用特定食物分子对口服抗原（K99）＊的免疫反应的影响：

特定食

物分子    第21天的免疫反应，每种剂量（μg～，mM+）

0.1    1.0    10    50    100    500    1000

血清IgG

VitB12256 675 1176 1552 2352 未测 2352

VicC    512    891    588    675    1024    未测    891

VitD    588    588    776    891    1782    未测    891

蜜二糖    128    256    675    4096    9410    256    未测

血清IgA

VitB12＜4 ＜4 4.0 5.2 ＜4 未测 ＜4

VitC    ＜4    ＜4    4.0    16.0    16.0    未测    16.0

VitD    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    未测    ＜4

蜜二糖    ＜4    ＜4    ＜4    4.0    4.0    4.0    未测

小肠IgG

VitB12＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 未测 ＜4

VitC    ＜4    4.0    16.2    32.0    36.1    未测    38.0

VitD    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    未测    ＜4

蜜二糖    ＜4    ＜4    ＜4    4.0    4.0    4.5    未测

小肠IgA

VitB12＜4 ＜4 ＜4 ＜4 5.2 未测 13.9

VitC    ＜4    ＜4    4.0    16.0    36.7    未测    73.5

VitD    ＜4    ＜4    4.0    8.0    13.9    未测    24.2

蜜二糖    5.2    40    4.0    4.0    9.2    4.0    未测

～.维生素的剂量单位为μg;+，糖类的剂量单位为mM

＊见表2.1

表2.5

口服施用特定食物分子对口服抗原（987P）的免疫反应的影响。

每种剂量（μg～，mM+），第21天的免疫反应

特定食

物分子    0.1    1.0    10    50    100    500    1000

血清IgG

VitA    512    675    388    891    675    未测    588

VitC    891    1351    4096    8192    8192    未测    9410

VitD    2352    2048    256    73    147    未测    1351

蜜二糖    512    481    463    1250    1006    1292    未测

山梨醇    873    1133    1024    1400    2123    85    未测

血清IgA

VitA    ＜4    ＜4    16.0    30.0    36.0    未测    64.0

VitC    4.0    4.0    32.0    66.0    73.1    未测    86.7

VitD    64    16.0    16.0    16.0    28.0    未测    38.1

蜜二糖    未测    未测    未测    未测    未测    未测    未测

山梨醇    未测    未测    未测    未测    未测    未测    未测

小肠IgG

VitA    ＜4    ＜4    4.6    17.2    16.1    未测    16.0

VitC    ＜4    ＜4    16.0    6.0    5.2    未测    16.0

VitD    ＜4    ＜4    ＜4    12.2    14.6    未测    14.0

蜜二糖    5.0    27    75    76    38.3    4.3    未测

山梨醇    50    74    64    93    294    257    未测

小肠IgA

VitA    ＜4    ＜4    4.0    26.9    32.1    未测    16.0

VitC    ＜4    4.6    55    337    1024    未测    776

VitD    ＜4    ＜4    16.0    147    25.2    未测    36.7

蜜二糖    7.6    39    65    159    58.0    16.0    未测

山梨醇    52    51    67    111    178    180    未测

～    维生素剂量单位为μg;+，糖类剂量单位为mM

＊见表2.1

表2.6

口服施用特定食物分子对口服抗原（LTB）＊的免疫反应的影响。

每种剂量（μg～，mM+），第21天的免疫反应

特定食

物分子    0.1    1.0    10    50    100    500    1000

血清IgG

VitB62352 5048 55.7 10.5 4.6 未测 4.0

乳糖    1782    1782    73.5    6.9    4.0    4.0    未测

山梨醇    1024    256    18.3    13.9    4.0    4.0    未测

血清IgA

VitB6＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 未测 ＜4

乳糖    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    未测

山梨醇    ＜4    1.4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    未测

小肠IgG

VitB6＜4 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 未测 ＜4

乳糖    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    未测

山梨醇    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    未测

小肠IgA

VitB65.6 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4 未测 ＜4

乳糖    4.0    4.0    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    未测

山梨醇    4.0    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4    未测

～维生素剂量单位为μg;+，糖类剂量单位为mM

＊见表2.1

表2.7

共同施用不同剂量的特定食物分子对肌肉注射抗原K99，987P＊后的免疫反应的影响

所用抗原    特定食    第21天的免疫反应

物分子

血清IgG    （μg）    0.1    1.0    10    50    100    1000

K99 VitB121121 1468 1572 2328 4766 2109

K99    VitD    1024    1272    1168    1372    1489    1315

987P    VitC    1687    1529    1707    1700    1662    1891

血清IgG    （mM）0.1    1.0    10    50    100    500

K99    蜜二糖    1024    1176    1057    1392    1262    989

987P    蜜二糖    1583    1622    1701    1519    1666    1621

987P    山梨醇    1670    1577    1548    1632    1711    1651

+.没有测定血清IgA，小肠IgG或小肠IgA

＊.见表2.1

实例    3

前面的两个实施例表明，小剂量口服粘膜免疫原能够显著诱导血清IgG效价，而同时有或没有IgA分泌抗体水平的平行上升。而且已经表明，共同施用特定食物分子能够控制免疫反应。用于最初研究的外源凝集素具有启动抗DNP反应的载体的功能，这一发现提示我们，至少某些粘膜免疫原具有作为其它抗原的载体的潜力，因而能够提高大多数较难吸收的抗原穿越小肠上皮的能力。

下述研究是为了探明是否存在这样一种载体潜力，并确定它的一些参数，以至于能够成功地利用它作为构成新的和更有效的口服疫苗和/或口服药物的手段。

材料和方法

抗原与粘膜免疫原的结合

载体的二硝基苯基化

使DNFB与外源凝集素的载体如上述进行反应。

脂多糖（LPS）和多糖（PS）的结合

如前述（见有关实施例）纯化S.typhimurium的LPS和PS。用过碘酸盐法（Avrameus和Ternynck，1971）使LPS和pS偶联到MI上。

戊二醛的偶联

利用Avrameus等人（1978）的戊二醛两步法，将促黄体释放激素（LHRH）、牛血清清蛋白（BSA）（来自Sigma化学公司，密西西比州，圣路易斯）和S.typhimurium鞭毛分别单独偶联到MI上。简而言之，使所需要的蛋白与0.2%的戊二醛在室温下反应两小时。让蛋白质在ph9.5的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中透析过夜，然后根据需要加入不同摩尔比率的MI，抗原：MI为5、10、20和40∶1，并在室温下反应24小时。最后，加入最终浓度为0.1M的乙醇胺（Sigma公司产品）（1小时，在室温下），然后，在pH9.5的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中于4℃下透析过夜。

与过氧化物酶结合的外源凝集素

与外源凝集素Glycine    max.Ara.chis    hypogea    Tetragonolobus    purpureas和伴刀豆球蛋白A结合的过氧化物酶制剂是从Sigma公司购买的。

LHRH结合物的化学合成

利用上面概述的戊二醛法使LHRH与LTB相结合。以LHRH∶LTB为20∶1的比例，向LTB中加入戊二醛活化的LHRH，并使其在室温下过夜结合。在使用之前，使所得到的结合物在ph9.5、0.1M的碳酸盐/碳酸氢盐冲洗中充分透析。对照由用戊二醛单独 处理的LHRH或LTB组成。

表3.1

DNP修筛的粘膜免疫原的抗体反应

免疫原 剂量 免疫反应＊

（μg）    抗-DNP    抗-载体

血清IgG    小肠IgA    血清IgG    小肠IgA

K99    20    ＜4    ＜4    875±62    3.9±5.1

K99    100    ＜4    ＜4    1351±128    16.7±2.3

DNP6.K99    20    21±10.5    ＜4    64±7.2    ＜4

DNP18.K99    500    1024±77    42±9.6    128±27.4    76±12.9

DNP1.8.K99    500    1176±164    28±14.4    3565±192    88±21.0

987P    20    ＜4    ＜4    891±76    27.8±13.6

987P    100    ＜4    ＜4    1024±89    84±22.4

DNP6.987P    20    24±3.1    ＜4    147±12.2    ＜4

DNP25.987P    500    1024±244    14±3.1    111±34.1    68±19.2

DNP2.5.987P    500    1351±196    7±1.4    2048±166    128±38.4

LTB    20    ＜4    ＜4    1351±211    12.2±4.4

DNP2.3.LTB    20    24.3±5.6    ＜4    445±35    ＜4

LTB    100    ＜4    ＜4    891±56    4.0

DNP6BSA    20    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4

DNP6BSA    100    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4

伴刀豆球蛋白A＊＊20 666±84 ＜4 未测 未测

PW-mitogen＊＊20 641±119 ＜4 未测 未测

L.culinaris＊＊20 954±48 ＜4 未测 未测

H.pomatia＊＊20 591±127 ＜4 未测 未测

p.vulgaris＊＊20 1378±110 4.8±2.3 未测 未测

G.max＊＊20 1529±65 3.1±6.9 未测 未测

A.hypogea＊＊20 1276±242 ＜4 未测 未测

U.europeus＊＊20 1583±94 ＜4 未测 未测

＊在37℃保温45分钟后ELISA的读数为0.5的抗血清稀释液的倒数。每个数值为5只小鼠的平均值±1个标准差。

＊＊每个外源凝集素用4个DPN基团取代。

表3.2

K99作为多种抗原的载体的能力

克分子    免疫反应

免疫原    比率    剂量    抗原    载体

（μg）    血清IgG    小肠IgA    血清IgG    小肠IgA

K99    -    20    ＜4    ＜4    875±62    3.9±5.1

K99    -    100    ＜4    ＜4    1351±94    16.7±2.8

BSA-K99    1∶4    20    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4

BSA-K99    1∶5    500    ＜4    ＜4    73.5±11.2    ＜4

BSA-K99    1∶10    500    ＜4    ＜4    147±48.2    ＜4

BSA-K99    1∶20    500    222±47    126±29.2    3809±226    84±16.6

BSA-K99    1∶40    500    73±19.6    44±7.5    3176±391    64±11.9

Flag-K99    1∶5    20    ＜4    ＜4    ＜4    ＜4

LPS-K99 1∶1＊＊20 ＜4 ＜4 ＜4 ＜4

PS-K99 1∶1＊＊20 ＜4 ＜4 299±101 5.2±2.6

BSA    -    20    ＜4    ＜4    -    -

鞭毛    -    20    ＜4    ＜4    -    -

IPS    -    20    12.1±2.7    4    -    -

PS    -    20    ＜4    4.2±0.4    -    -

＊见表3.1

＊＊重量比率

表3.3

987P作为各种抗原的载体的能力

免疫反应

克分子    剂量    抗原    载体

免疫原    比率    （μg）血清IgG    小肠IgA    血清IgG    小肠IgA

987P    -    20    ＜4    ＜4    891±76    27.8±13.6

987P    -    100    ＜4    ＜4    1024±83    84±26.7

BSA-987P    1∶4    20    ＜4    ＜4    84±2.6    ＜4

BSA-987P    1∶5    500    ＜4    ＜4    256±49    ＜4

BSA-987P    1∶10    500    29.8±7.4    4.6±2.2    675±110    ＜4

BSA-987P    1∶20    500    306±88    122±47.6    4263±408    194±38.6

BSA-987P    1∶40    500    124±47    110±38.4    4705±521    156±55

Flag-987P    1∶5    20    1552±361    ＜4    -    -

LPS-987P 1∶1＊＊20 ＜4 ＜4 194±28.6 ＜4

PS-987P 1∶1＊＊20 ＜4 ＜4 337±96 5.2±6.8

BSA    -    20    ＜4    ＜4    -    -

鞭毛    -    20    ＜4    ＜4    -    -

LPS    -    20    12.1±2.7    ＜4    -    -

PS    -    20    ＜4    4.2    0.4    -    -

＊见表3.1

＊＊重量比率

表3.4

取代载体的剂量改变对免疫反应的影响

剂量 免疫反应（血清IgG）＊

抗原    （μg）    抗-BSA    抗-载体

BSA0.03.K99    70    13.9±4.4    776±148

BSA0.03.K99    140    36.7±14.6    1782±174

BSA0.03.K99    280    73.5±22.1    1989±215

BSA0.05.987P    70    36±2.6    891±109

BSA0.05.987P    140    168±23.7    1552±176

BSA0.05.987P    280    337±43.7    2042±180

＊见表2.1

表3.5

化学键结合的LHRH-LTB对雌鼠生殖器的影响

用药    剂量    卵巢    占体重

结合物    偶联方式    途径    （μg）编号    体重    +子宫    的%

LHRH-LTB    足量    OS/OS    20    5    21.19    0.03    0.17%

LHRH-LTB    足量    OS/OS    50    5    21.16    0.04    0.23%

LHRH    足量    OS/OS    50    6    20.13    0.11    0.62%

LTB    足量    OS/OS    50    3    18.18    0.14    0.76%

LHRH-LTB    足量    im/im    50    6    20.16    0.16    0.97%

LHRH，LTB    混合    OS/OS    50    7    27.32    0.15    0.55%

LHRH，LTB    混合    im/im    50    7    30.07    0.26    0.73%

LTB    -    OS/OS    50    7    28.26    0.24    0.87%

-    -    OS/OS    -    5    19.19    0.16    0.82%

＊动物在0和14天接受抗原，第28天将鼠处死，将其生殖器称重。

OS：口服;im：肌肉注射

表3.6

遗传建成的LHRH结合物对雌鼠生殖器的影响

占体重的%

剂量    卵巢

卵巢+子宫

结合物    给药途径（μg）    体重    +子宫

/总体重＊

B-gal-（LHRH）3.5    im/im    20    19.47    0.10    0.49

B-gal-（LHRH）3.5    im/im    20    18.44    0.10    0.56

B-gal-（LHRH）3.5    im/im    50    19.39    0.10    0.54

LTB-（LHRH）3.5    OS/OS    20    19.35    0.08    0.39

LHRH    OS/OS    20    19.34    0.10    0.44

LHRH    im/im    20    19.39    0.15    0.76

-    im/im    -    17.74    0.08    0.46

-    OS/OS    -    18.63    0.11    0.60

用于肌肉注射的所有抗原都是在Montanide中使用的，而Im/im的对照则注射Montanide/盐水的混合物。

＊动物在0和14天接受抗原，在第28天将鼠处死，将它们的生殖器称重。

LHRH与β-半乳糖苷酶和LTB的遗传融合

一种质粒载体的建成

一种融合的LTB/LHRH杂交多肽的表达

1、含有LTB编码序列的DNA片段

从含有克隆的LTB基因的pBR322质粒中（Leong等人，1985），从修饰过的大肠杆菌RC411菌株的NP307质粒中（Dallus等人，1979），得到了Hind Ⅲ片段，该片段是在标准条件下，利用LTB的终止密码附近的SpeⅠ位点，然后用绿豆核酸酶降解得到的。（除非加以特别说明，用于DNA重组技术的标准条件和限制性核酸酶如《分子克隆-实验手册》中所述，Maniatis、Fritsch和Sambrook编，Cold Spring Harbour Laboratory，1982）。这样就去掉了通常位于LTB中 第123氨基酸之后的终止密码子，去掉了DNA的9个碱基对，并偶然产生了一个如下所示的Hind    Ⅲ位点：

Hind    Ⅲ部位

Hind    Ⅲ部位    Ile    Ser    Met    Lys

LBT编码序列    ATC    AGT    ATG    AAA    GCTT

121    122

大小＝573碱基对

在标准条件下，对pUC13载体质粒进行HindⅢ降解的磷酯酶处理，然后使此片段与该载体相连接（Messing，1983）。这样做是为了pUC13中剩下的聚合连接物区位于含有LTB序列的DNA插段的下游，该聚合连接物区中包括PstⅠ、SalⅠ、XbaⅠ、BamHⅠ、SmaⅠ、SstⅠ和EcoRⅠ等的位点。

2、编码LHRH的合成的寡聚核苷酸的产生

设计两个长度为30碱基对寡聚核苷酸，具有下面所示的A和B的序列，它们如C所示形成重迭的杂交双螺旋，这样形成的双螺旋编码激素LHRH肽段的10个氨基酸的完全线性重复（Schally和Coy，1983，《肽和蛋白质在生殖控制中的作用》，MaCann和Dhindsa主编，Elsevier    Science    Publishing公司，89-110页）。在此序列中，谷氨酸替换了通常位于N-端的焦谷氨酸。

A.5′  GAG    CAC    TGG    TCC    TAC    GGC    CTT    CGA    CCC    GGG    3′

使寡聚核苷酸在40℃下，在50mM    NaCl    10mM    Tris    pH7.5中一起退火一小时，用Klenow进行末端填充，然后，利用常规方法，使混和物与M13、mp18的SmaⅠ切口相连接。分离含有DNA插段的M13噬菌体，用双脱氧法确定插段的DNA序列。一个被定名为P29的重组体，被选来用作融合产物的生成。下面给出了插段中SmaⅠ位点区域的DNA序列，以及它所编码的氨基酸序列。

β-半乳糖苷酶的N末端，α片段

Met  Thr  Met  Ile  Thr  Asn    Ser    Ser    Ser    Val    Pro    Leu    Arg

ATG  ACC  ATG  ATT    ACG    AAT    TCG    AGC    TCG    GTA    CCC    CTT    CGA

EcoRⅠ

Pro    Gly    Glu    His    Trp    Ser    Tyr    Gly    Leu    Arg    Pro    Gly

CCC    GGG    GAG    CAC    TGG    TCC    TAC    GGC    CTT    CGA    CCC    GGG

←1→

Clu  His  Trp  Ser    Tyr    Gly    Leu    Arg    Pro    Gly    Glu    His  Trp

GAG  CAC  TGG  TCC    TAC    GGC    CTT    CGA    CCC    GGG    GAG    CAC  TGG

←2→←

Ser  Tyr  Gly  Leu  Arg  Pro  Gly  Gly    Asp    Pro    Leu    Glu  Ser  Thr

TCC  TAC  GGC  CTT  CGA  CCC  GGG  GGG    GAT    CCT    CTA    GAG  TCG  ACC

-3→    HincⅡ

上面的DNA序列证实，来自合成的寡聚核苷酸的DNA插段在编码系统中插入了大约3.5个重复的LHRH编码序列（34个氨 基酸）。LHRH的完整编码区已用箭头标出。

用EcoRⅠ和HincⅡ降解P29的复制DNA（它在上面的DNA序列中标出了降解位点），利用标准条件进行末端填充。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离140碱基对的小片段。

3、LTB/LHRH融合载体的构建

将含有插入Hind Ⅲ部位的LTB编码序列的pUC13质粒（见上述第1部分），在标准条件下用SalⅠ进行降解、填充末端并用磷酯酶进行水解。然后，再把载体DNA连接到来自p29，已填充末端的EcoRⅠ/HincⅡ片段上（见上述第2部分）。该融合体有下列氨基酸序列。

氨基酸1-122（lys）-ala-trp-ala-ala-gly-arg-asn-ser-ser-ser-val-pro-

LTB编码序列

leu-arg-pro-gly-〔glu-his-trp-ser-tyr-gly-leu-arg-pro-gly〕3-

LHRH

gly-asp-pro-leu-glu-ser-arg-leu

在位于LHRH序列24碱基的上部有一个终止密码子，它限定一个具有122个氨基酸的LTB，34个氨基酸的LHRH重复序列和接邻区域的20个氨基酸的总长为176个氨基酸多肽的表达。

通过用EcoRⅠ降解少量DNA制品和寻找带有较大的EcoRⅠ 片段的质粒，筛选出正确的建成质粒。为了表达由pUC13的乳糖启动子驱动所产生的多肽，进一步筛选假定正确的质粒。将细菌抽提物用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，然后转移到硝化纤维素薄膜上，用抗LTB和LHRH接合物的兔抗血清进行Western印迹法测试。两种抗血清都可检测到所需大小的肽。

4、表达质粒K66和表达菌株BTA1185的构建

通过琼脂糖凝胶层析，分离3中所述的带有LTB-LHRH融合序列的pUC13质粒中的573碱基对的EcoRⅠ片段，此片段含有完整的LTB-LHRH融合产物的编码区域，并把它接到用磷酯酶水解过的表达颗粒pKK223-3（pharmacia公司产品）的Eco RⅠ切口上。所得到的表达质粒PBTA K66使融合蛋白的表达置于tac启动子的控制下，此处的表达是由IPTG所诱导的。将质粒转化到大肠杆菌宿主菌株JM101中（SupE，thi，（lac-proAB）IF′traD36，pro AB lacIqZM15），从而得到宿主-载体表达系统BTA1185。

5、用于动物试验的LTB/LHRH融合蛋白的生产和纯化

按前述方法培养LTB（LHRH）3.5生产菌株，用IPTG诱导2小时后，通过离心（3000xg，10分钟，4℃）使细菌沉淀。然后，把细菌再悬浮在蒸馏水中，在French    Press中溶菌。通过离心（18，000xg，10分钟，4℃）除去细菌碎片后，把上清液加到agthio-半乳糖柱（Sigma）中。再用0.5M半乳糖溶液洗脱融合蛋白，并用pH9.5的0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液进行透析。

抗原的施用以及免疫反应的测定

所有的口服方法，抗体的收集以及ELISA的测定都如前述。

结果

粘膜免疫原载体潜力之论证

所有测试过的粘膜免疫原都显示出具有有效地运载共价结合的半抗原DNP通过肠粘膜的能力，并且在饲喂二硝基苯基化的粘膜免疫原后，引起血清的抗-DNP抗体的反应。然而，在测试的浓度下，DNP修饰的BSA完全不能产生抗-DNP或抗-BSA反应（表3.1）。初期试验时，将K99和987P与比DNP大得多的分子复合后，不能产生对粘膜免疫原或对与它连接的分子的免疫反应（表3.2和3.2），这可能是由于纤毛与粘膜上皮的结合受到了立体干扰。因此，便决定改变抗原与粘膜免疫原（MI）的比例。在进行BSA∶纤毛的不同比例试验中，发现当饲喂的BSA∶纤毛的比例大于1∶20时，即使剂量为500ug，也不可能产生抗-BSA或抗-纤毛的反应，这就说明复合物不可能有效地与粘膜上皮结合，进而产生免疫反应。但是，当使用的比例为1∶20或1∶40时，则可以观察到产生了对BSA和纤毛的有效反应（表3.2和3.3）。免疫反应的强弱很容易随着所饲喂的复合物的剂量而改变（表3.4）。

口服结合了LTB的LHRH，不论是服用20或50ug    LHRH-LTB，都会使雌鼠子宫和卵巢的总重量显著减少（P＜0.05）（表3.5，3.6）。单独服用LHRH或LTB或两者一起服用，或肌肉注射LHRH-β-半乳糖苷酶，LHRH-LTB或游离LHRH，都看不到重量的减少。在发育过程中，当卵巢中的成熟卵泡完全没有了时，也看到了重量减少的效果，这就意味着，这些动物 被有效地“阉割”了。当老鼠服用遗传构建的LTB-（LHRH）融合蛋白时，生殖器官的重量只有少量减少（表3.6），而在本试验中，在试用的剂量下，这种减少是微不足道的。

实例4

口服抗原后细胞中介免疫性的诱导

通过测定血清和肠内抗体的产生，表明服用粘膜免疫原，能有效地产生粘膜反应。然而，尚不得知是否同时刺激了对粘膜免疫原的细胞中介的免疫（CMI）反应。

下面所设计的试验就是把通过口服粘膜免疫原与通过经典的皮下（S.C.）注射弗氏完全佐剂（Complete    Freund′s    adjuvant）（CFA）中的抗原所产生的CMI作个比较。

方法

通过饲喂在pH为9.65，0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中的20ug抗原和皮下注射在CFA中的20ug抗原对雄性C57Bl/6J鼠进行免疫。对照只接受缓冲液和佐剂。免疫七天后，给左后爪垫注射在20ul生理盐水中的10ug抗原，同时给右后爪垫只注射20ul生理盐水。24小时后，用测微计测定左后和右后爪垫厚度的不同。

结果

表4.1所显示的结果说明，口服987P或LTB粘膜免疫原后产生了有效的细胞免疫反应。实际上，这种反应的强度是令人惊异的，因为它只比用CFA皮下注射抗原有轻微的减少。

表4.1

口服粘膜免疫原所产生的细胞中介的免疫反应

免疫方法

抗原    对照    口服    皮下注射

987P    11±2    31±6.6    38±5

LTB    5±4.5    14±3.7    26±5.8

＊结果说明了用抗原免疫后爪垫厚度的增加。结果是5个鼠的平均值±标准误差。

工业上的应用

本发明的工业应用包括施用给脊椎动物宿主之口服药物的制备。

可能作为口服疫苗的疫苗

变应原：各种草类花粉：大麦，茅草

杂草花粉：车轴草，去毛尾

树木花粉：梣树，Cyprus

植物花粉：金雀花

上皮：猫毛，狗毛，猪毛

其他：室内尘埃，麦糠，木棉

激素：LHRH，FSH，HGH，抑制素

疫苗：血球凝集素来自

流行性感冒，麻疹，风疹，天花，黄热病，白喉，破

伤风，霍乱，鼠疫，斑疹伤寒，卡介菌，流感嗜血杆

菌，粘膜炎奈瑟氏菌，肺炎杆菌，肺炎球菌，链球菌

特别是链球菌变种。

纤毛来自：大肠杆菌，淋病奈瑟氏球菌，N.meningitis，

粘膜灰奈    氏菌，耶尔森氏菌种，绿脓假单胞菌，假

单胞菌种，牛摩拉克氏菌，Bacteroides    nodosus，葡萄球菌种，链球菌种，博代氏杆菌种。

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