一种采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外
方法
技术领域
背景技术
[0002] 皮肤
覆盖于人体表面，是人体与
感知和
接触外界环境的最外屏障。皮肤在受到损伤后，早期出现
炎症反应，表现为红肿、渗液、形成结痂。随后
角质细胞和
成纤维细胞开始增生，肌成纤维细胞分化和伤口收缩，接着细胞和细胞外基质结构重塑，并可能形成肉芽组织或瘢痕。
[0003] 皮肤受损后，外界环境中的理化
生物因素直接接触人体组织，容易造成感染、慢性炎症、溃疡等。损伤后的皮肤虽然具有一定的自我修复功能，但是受到损伤面积和严重程度的影响，同时也受到自身修复能
力和环境因素的影响。
[0004] 皮肤受损后，通过人为干预，如添加辅料、药物生长因子等，可减少创面
水份
蒸发、保温、抗菌、消炎和促进
细胞增殖等功能不仅起到促进皮肤修复的目的，也可以减少疤痕和色素不均匀等起到美化皮肤的效果。
[0005] 目前广泛用于评价修复功能的模型大都采用实验动物进行，常用的有小鼠、大鼠、豚鼠、小型猪和兔子，制备急性、慢性和瘢痕性损伤模型。但是动物实验周期长、重现性差、且实验过程容易造成动物痛苦。而细胞模型广泛应用于药物筛查阶段，通过人为制造“伤口”，分析细胞增殖、标志物表达、炎性反应等指标，可以实现高通量快速筛查。但是与正常人体皮肤的三维构造仍具有一定的距离，细胞水平的测试缺乏空间结构，功能单一。
[0006] 体外重组三维皮肤模型的出现，填补了从细胞到动物间的差距。采用人源细胞，通过培养形成具有与正常皮肤相类似的三维结构和功能的皮肤模型，可形成稳定的屏障功能，并能表达多种人体皮肤特征蛋白和细胞外基质，还可根据需要构建不同类型的皮肤模型，如表皮模型、全层皮肤模型、含黑色素的皮肤模型等。目前3D皮肤模型已成为替代传统动物皮肤试验的理想替代实验系统。
[0007] 目前，以体外技术为核心的试验方法，逐渐被许多国家和地区的监管部
门所接收和认可。全球范围内多个地区和国家通过法规禁止或限
制动物试验的进行。但是目前的国际标准只针对样品安全性评估，并没有提出功能或功效的评价方法或标准。
[0008] 采用体外构建的三维皮肤组织进行皮肤修复功能评价，提出了一种新的试验系统，基于细胞培养形成的三维结构，一方面减少了
单层细胞水平试验的局限性，如溶解性、体系单一长等，另一方面提供了一种与正常人皮肤结构和功能相似的暴露方式。同时避免了使用过量的实验动物。
发明内容
[0009] 本发明的目的在于提供一种采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法，该方法具有通量高、可重复、与人相关性高、多指标评价等优点，可以对多种受试物进行快速评价。
[0010] 本发明中采用重组正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法，是利用体外重组正常人体的三维皮肤模型，采用SDS或机械方法对皮肤造成化学或机械损伤，通过分析损伤后组织的恢复情况或炎症反应的强弱，评价受试物质对损伤后皮肤的修复作用。
[0011] 本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：一种采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法，包括以下步骤：
[0012] (1)损伤模型的制备：选取重建正常人体三维皮肤模型，采用十二
烷基磺酸钠或机械损伤方法进行造模，制备损伤模型，同时设置对照组；
[0013] (2)修复：分别采用无血清培养基或生理盐水、阳性物和受试物对步骤(1)中的损伤模型进行修复，形成损伤组、阳性组和受试物组；
[0014] (3)评价指标的测量：测量各实验组的
电阻、常规
组织学或免疫组织学观察、细胞因子水平、蛋白表达水平和相关基因分析各评价指标中的一种或几种；
[0015] (4)结果分析：各评价指标采用单因素方差分析进行统计学分析，α＝0.05，其中两种以上的评价指标升高或降低有统计学差异时，并且两次独立测试获得一致结果时，认为该受试物在分析条件下具有修复功能。在上述采用重建正常人体三维皮肤模型评价修复功能的体外方法中：
[0016] 优选的，步骤(1)中的重建正常人体三维皮肤模型为商品化来源或实验室按照常规方法自制，其所用
种子细胞需来源于人，经特殊培养条件形成具有与正常人体皮肤相类似结构和功能的重组皮肤模型，所选模型需满足特定的质控指标，确保其具有特定的结构和功能。
[0017] 优选的，步骤(1)中损伤模型的制备中的
给药方式为将十二烷基磺酸钠直接涂抹在人源三维重组皮肤模型表面，或采用机械损伤方式对重建正常人体三维皮肤模型表面擦伤、刺伤或划伤制备损伤模型。
[0018] 具体是采用微针、
砂布或
胶带剥离的方法将重建正常人体三维皮肤模型表面擦伤、刺伤或划伤。
[0019] 优选的，步骤(1)中采用十二烷基磺酸钠进行造模，制备损伤模型时，十二烷基磺酸钠的
质量百分含量为0.1％-10％，暴露时间为5-60min，
温度条件为20-25℃，
相对湿度为40％-70％。
[0020] 优选的，步骤(1)中所述的对照组为无血清培养基或生理盐水。
[0021] 进一步的，步骤(1)中所述的对照组还包括受试物对照组，所述受试物对照组也为无血清培养基或生理盐水。
[0022] 优选的，步骤(2)中修复时的给药方式为将无血清培养基或生理盐水、阳性物或受试物直接涂抹在损伤模型表面，或采用培养液给药方式，具体是将损伤模型置于含有无血清培养基或生理盐水、阳性物或受试物培养液中进行给药。
[0023] 优选的，直接涂抹时，受试物浓度为10-50mg/μL，涂抹时间为10-60min，涂抹结束后清洗去除受试物，保持重组皮肤模型表面干燥，所述受试物能进行多次涂抹，涂抹时间间隔为6-24h；采用培养液给药时，所述受试物的质量体积浓度不超过100mg/mL，或所述受试物的质量百分含量不超过10％。
[0024] 优选的，步骤(2)中所述的阳性物为对皮肤具有明显促进修复的物质，所述的受试物为
植物提取物、动物提取物、中药提取物、
化妆品、化妆品原料或化学品。
[0025] 作为本发明的几种优选的实施方式，所述的阳性物为表皮生长因子(EGF)、胎
牛血清、细胞外基质、消炎物质或类固醇
激素等，所述的受试物为基底膜提取物、壳聚糖、维生素E、海藻糖、脱细胞基质、小分子肽、蛋白多糖和化学制剂等天然或合成的化合物或混合物中的一种或几种。
[0026] 优选的，步骤(2)中采用无血清培养基或生理盐水对步骤(1)中的对照组进行修复；步骤(2)中采用受试物对步骤(1)中的受试物对照组进行修复。
[0027] 优选的，步骤(3)中采用经皮肤电阻仪检测皮肤表面电阻值，采用MTT法或XTT检测组织活性，采用固定组织进行组织学观察分析，采用ELISA方法进行细胞因子水平分析，采用western blot法进行蛋白表达水平分析，采用PCR法进行相关基因分析。
[0028] 具体的，采用MTT法或XTT测量组织活性，包括以下步骤：将模型置于1mg/mL的MTT或XTT溶液中孵育3-4h，取下模型浸泡于异丙醇中提取甲瓒，在570nm
波长下测定吸光度。
[0029] 优选的，步骤(3)中可以将固定组织进行常规组织学或免疫组织学分析、用ELISA方法进行细胞因子水平分析、PCR技术进行基因分析或western blot进行蛋白分析中的一种或几种联合使用，其中细胞因子水平分析适用于连续监测，即在相同的时间间隔
采样后进行测量。
[0030] 具体的，常规组织学分析是采用4％多聚甲
醛固定、
石蜡包埋和制备组织学切片的方法，切片进行
乙醇脱水和二
甲苯透明，再进行HE
染色的方法，染色的组织学切片在普通生物学
显微镜下观察和分析；免疫组织化学方法是采用
抗体与对应的皮肤修复相关的特征性标志物进行原位结合反应，通过抗体带有的
荧光物质在荧光显微境下观察和分析的一种方法。
[0031] 具体的，与皮肤修复相关的基因包括但不局限于：角蛋白K10、角蛋白K14、套膜蛋白(Involucrin,IVL)、Ki-67、谷胺酰转
氨酶1(Transglutaminase,TGM1)、兜甲蛋白(Loricrin,LOR)、丝聚蛋白(Filaggrin,FLG)、后胶封蛋白3E(Late cornified envelope 3E,LCE3E)、人β防御素2(human beta defensin-2,hBD-2)，管家基因为酸性核糖体磷蛋白P0(human acidic ribosomal phosphoprotein P0,RPLP0)。
[0032] 具体的，与皮肤修复相关的炎症因子包括但不限于：TNF-a,IL-8,IL-1b,EGF-2等。
[0033] 具体的，与皮肤修复相关的细胞外基质包括但不限于：III型
胶原蛋白、V型胶原蛋白、弹性蛋白、原纤维蛋白(Fibrillin)、细胞粘合素C(Tenascin)、蛋白聚糖(Versican)、透明质酸等。
[0034] 本发明具有如下有益效果：
[0035] (1)本发明方法使用的用于体外重建正常人体三维皮肤模型来源于正常人体皮肤，其重建的皮肤模型具有与正常人皮肤相似的结构和功能，相关性高；
[0036] (2)本发明方法通过化学方法和机械方法诱导皮肤损伤，用于评估损伤后皮肤修复水平，两种给药的方法均符合实际情况；
[0037] (3)本发明采用多方面指标评价，增加结果可信度，同时也可用于受试物作用机制的研究；
[0038] (4)本发明建立的方法可以直接用于评价药物、各种提取物、产品原料等的功能评价。
附图说明
[0039] 图1是
实施例1中IL-1α含量对比；
[0040] 图2是实施例2中皮肤模型组织学图片；
[0041] 图3是实施例3中细胞因子IL-1α检测结果；
[0042] 图4是实施例3中细胞因子TNFα检测结果。
具体实施方式
[0043] 以下实施例中采用的各原料，如无特殊说明，均为市售产品。
[0044] 实施例1基于三维皮肤组织的壳聚糖修复功效评价
[0045] 1、实验的准备
[0046] 1.1重组人表皮模型
试剂盒：商品化购置(购自上海斯安肤诺生物科技有限公司，EpiskinTM检测试剂盒)，配有专用维持培养液。
[0047] 1.2样品制备：壳聚糖，原样。
[0048] 1.3其他试剂：SDS、PBS、MTT、EGF、异丙醇、ELISA试剂盒。
[0049] 1.4孵育条件：温度37±1℃，5％CO2浓度，饱和相对湿度。
[0050] 1.5暴露条件：室温，温度20-25℃，相对湿度40-70％。
[0051] 2试验过程：
[0052] 2.1重组人皮肤模型准备。
[0053] 2.1.1检查模型，弃去任何肉眼可见损伤或异常。
[0054] 2.1.2将模型转移至含2mL维持培养液的培养板中，孵育过夜。
[0055] 2.2试验分组及操作
[0056] 预处理(损伤模型制备)：直接将刺激物SDS(十二烷基磺酸钠)/对照品(生理盐水)10μL，涂抹于模型表面，暴露15min后冲洗至无残留，制得下表1中的预处理各实验组。
[0057] 加样(修复)：直接将受试物(或生理盐水、阳性物EGF)10μL，涂抹于模型表面，暴露30min后冲洗至无残留，24h后重复1次，制得下表1中的加样各实验组。
[0058] 表1损伤和修复时制备的各实验组
[0059]分组 预处理 加样(24h重复1次)
对照组 生理盐水 生理盐水
样品对照组 生理盐水 壳聚糖
损伤组 2％SDS 生理盐水
阳性组 2％SDS EGF
样品组 2％SDS 壳聚糖
[0060] 2.3末次加样42h后，将皮肤模型转移至含2mL MTT(0.5mg/mL)的12孔板中，孵育3h。同时收集培养基，-80℃保存。
[0061] 2.4取下皮肤模型，置于异丙醇中，室温下避光放置过夜。
[0062] 2.5在570nm波长下测定吸光度。
[0063] 2.6采用人白介素1α(IL-1α)ELISA试剂盒，测量培养基中的IL-1α含量，具体操作如下：
[0064] 1)取出试剂盒和标本，室温下放置30min。
[0065] 2)配制标准品，各孔加入100μL标准品或标本，孵育2h。
[0066] 3)弃上清，加入Biotin antibody 100μL，孵育1h。
[0067] 4)洗板2min×3次，加入HRP-avidin 100μL，孵育1h。
[0068] 5)洗板2min×5次，加入显色底物90μL，孵育15-30min。
[0069] 6)加入终止液50μL，5min内在在450nm波长下测定吸光度。
[0070] 3数据分析
[0071] 3.1组织活性：以对照组组织活性为100％，计算各组相对组织活性(％)。
[0072] 3.2IL-1α相对含量：根据标准曲线，计算各组IL-1α含量，以损伤组IL-1α含量为100％，计算各组相对含量(％)，如图1所示。
[0073] 3.3各组间差异采用单因素方差分析进行统计学分析，α＝0.05。
[0074] 4结果
[0075] 表2组织活性结果
[0076]
[0077] 空白孔是扣除背景值。
[0078] 表3组织活性
[0079]
[0080] 表4 IL-1α结果
[0081]
[0082]
[0083] *与损伤组对比，差异具有统计学意义(p<0.05)
[0084] 4结果分析：从上述结果可以看出，样品在所测浓度下可以增加损伤后皮肤模型的组织活性，组织活性增加了(25.18％)，同时减少了损伤后的炎症反应(IL-1α含量下降了45.6％)，推测该样品对损伤后的皮肤具有一定的修复作用。
[0085] 实施例2一种基底膜提取物的皮肤修复功能的体外评价
[0086] 1、实验的准备
[0087] 1.1重组人表皮模型试剂盒：商品化购置(购自上海斯安肤诺生物科技有限公司，EpiskinTM检测试剂盒)，配有专用维持培养液。
[0088] 1.2样品制备：基底膜提取物
[0089] 1.3其他试剂：PBS、MTT、EGF、异丙醇、组织固定液、苏木素-伊红染液。
[0090] 1.4孵育条件：温度37±1℃，5％CO2浓度，饱和相对湿度。
[0091] 1.5暴露条件：室温，温度20-25℃，相对湿度40-70％。
[0092] 2试验过程
[0093] 2.1重组人皮肤模型准备
[0094] 2.1.1检查模型，符合模型质量要求，检测皮肤电阻为60-80Ω，表明皮肤无破损，屏障功能正常。
[0095] 2.1.2将模型转移至含2mL维持培养液的培养板中，孵育过夜。
[0096] 2.2试验分组及操作
[0097] 预处理：直接用细砂布(1200目-1600目)擦伤皮肤表面，制得下表6中的各实验组。
[0098] 加样：直接将受试物(包括对照品)加入下方培养液中(终浓度为5％)，制得下表6中的各实验组。
[0099] 表6损伤和修复时制备的各实验组
[0100]
[0101]
[0102] 2.3加样完成24h后，将皮肤模型转移至含2mL新鲜维持培养液的12孔板中，继续孵育42h。
[0103] 2.4孵育结束，将皮肤模型转移至含2mL MTT(0.5mg/mL)的12孔板中，孵育3h。随后取下皮肤模型，置于异丙醇中，室温下避光放置过夜。在570nm波长下测定吸光度。
[0104] 2.5孵育结束同时将一部分皮肤模型取下，置于组织固定液中，室温固定至少24h。
[0105] 2.6常规石蜡包埋、切片、染色，镜下分析。
[0106] 3数据分析
[0107] 3.1组织活性：以对照组组织活性为100％，计算各组相对组织活性(％)。
[0108] 3.2表皮组织学：显微镜下观察，并采集图像，测量表皮厚度。
[0109] 3.3各组间差异采用单因素方差分析进行统计学分析，α＝0.05。
[0110] 4结果
[0111] 表7组织活性结果
[0112]
[0113] 表8组织活性
[0114]
[0115] 表9表皮厚度测量结果
[0116]
[0117] *与损伤组对比，差异具有统计学意义(p<0.05)
[0118] 4结果分析：从上述结果可以看出，样品在所测浓度下可以增加损伤后皮肤模型的组织活性(提高了9.26％)，同时对增加了损伤后表皮的厚度，推测该样品对损伤后的皮肤具有一定的修复作用。
[0119] 实施例3基于三维皮肤组织的海藻糖和维生素E皮肤修复功效研究[0120] 1、实验的准备
[0121] 1.1重组人表皮模型试剂盒：商品化购置(购自上海斯安肤诺生物科技有限公司，EpiskinTM检测试剂盒)，配有专用培养液。
[0122] 1.2样品制备：海藻糖和维生素E
[0123] 1.3其他试剂：PBS、MTT、胎牛血清、异丙醇、IL-1α和TNFαELISA试剂盒。
[0124] 1.4孵育条件：温度37±1℃，5％CO2浓度，饱和相对湿度。
[0125] 1.5暴露条件：室温，温度20-25℃，相对湿度40-70％。
[0126] 2试验过程
[0127] 2.1重组人皮肤模型准备
[0128] 2.1.1检查模型，弃去任何肉眼可见损伤或异常。
[0129] 2.1.2将模型转移至含1mL维持培养液的6孔培养板中，孵育过夜。
[0130] 2.2试验分组及操作
[0131] 预处理：直接将刺激物SDS或生理盐水)20μL，涂抹于模型表面，暴露40min后冲洗至无残留，制得的各实验组如下表10中预处理所示。
[0132] 加样：直接将受试物(包括对照品)加入下方培养液中，制得的各实验组如下表10中的加样所示。
[0133] 表10损伤和修复时制备的各实验组
[0134]
[0135]
[0136] 2.3加样完成24h后，将皮肤模型转移至含2mL新鲜维持培养液的12孔板中，继续孵育。
[0137] 2.4每隔24h，收集100μL培养液，-80℃保存备用，同时补充100μL新鲜培养液。
[0138] 2.5至96h后，将皮肤模型转移至含2mL MTT(0.5mg/mL)的12孔板中，孵育3h。取下皮肤模型，置于异丙醇中，室温下避光放置过夜。在570nm波长下测定吸光度。
[0139] 2.6将收集的培养液进行如下检测：人白介素1α(IL-1α)和
肿瘤坏死因子α(TNFα)人白介素1α(细胞因子IL-1α)检测结果如图3所示，细胞因子TNFα检测结果如图4所示。
[0140] 3数据分析
[0141] 3.1组织活性：以对照组组织活性为100％，计算各组相对组织活性(％)。
[0142] 3.2各组间差异采用单因素方差分析进行统计学分析，α＝0.05。
[0143] 4结果
[0144] 表11组织活性结果
[0145]
[0146] 表12组织活性
[0147]
[0148] 表13细胞因子连续监测结果
[0149]
[0150] *与损伤组对比，差异具有统计学意义(p<0.05)
[0151] 4结果分析：从上述表12-13的结果可以看出，损伤组在刺激后，组织活性明显下降IL-1α和TNFα显著升高，单独采用维生素E和海藻糖，可以提高损伤后皮肤的组织活性，同时降低IL-1α和TNFα的水平，而联合海藻糖和维生素E后，组织活性高于单独使用的时候，同时IL-1α和TNFα也明显降低，推测维生素E和海藻糖对损伤后的皮肤具有一定的修复作用，同时采用海藻糖和维生素E的修复效果优于单独使用的时候。
[0152] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。本发明虽然仅列举了部分壳聚糖、基底膜提取物、海藻糖和维生素E等原料。但本发明中提到的其他受试物，也可以用本发明所述方法进行修复作用的体外评价。此处不再一一列举。
