青翅蚁形隐翅甲V-ATPase-A基因的dsRNA及其人工饲料和
应用
技术领域
背景技术
[0002] RNAi技术的发现为
生物的基因功能研究提供了新的思路，已经成为基因功能研究领域的一个极为重要的工具(Plasterk 1998)。在昆虫学领域，RNAi技术迅速成为昆虫的基因功能研究的主要方法。在多种农业
害虫中均可实现靶标基因的RNAi。因此，RNAi可以用于害虫防治。目前报道利用RNAi防治害虫的的方法包括：培育基于RNAi技术的转基因作物，防治田间害虫(Price and Gatehouse 2008)；合成dsRNA，作为新型
杀虫剂喷洒害虫(Baum et al 2007；Mao et al 2007；Tian et al 2009；Zhang et al 2015；Zhang et al 2010)。利用RNAi技术培育新型转基因作物是近年来非常具有应用潜
力的害虫防治新方法。目前，基于RNAi的抗虫转基因作物已经在鳞翅目、鞘翅目、半翅目等昆虫中获得成功。
[0003] 基于RNAi技术的转基因
植物具有巨大的潜在价值，但转基因植物的安全性备受人们的关注。很多研究已经证明基于RNAi的转基因植物作为一种害虫防治的新策略是可行的，但是这种转基因植物的安全性也引起了公众的广泛关注。如果要将基于RNAi的转基因植物商业化，必须要进行严格的安全性评价。
[0004] 现阶段dsRNA转基因植株培育正在如火如荼的进行中，但是相关的安全评价的研究报道却十分鲜见，并且被选择的非靶标
节肢动物的种类太少。另外，昆虫的种类繁多，但目前有基因组或转录组的昆虫还是很少的。而基于RNAi技术的转基因植株的杀虫机制的特异性在安全评价中尤其要研究非期望的基因沉默、脱靶效应、靶标害虫抗性、siRNA的环境持久性以及其它认知的不确定性。所以，评价RNAi生物技术作物安全性要比评价Bt作物安全性需要开展更多的工作。然而，当前RNAi生物技术的转基因植株的环境
风险评估工作还处于起步阶段。
[0005] 青翅蚁形隐翅甲在田间的数量和捕食害虫效能上位于捕食性天敌第3位(除蜘蛛外)，对稻田
生态系统具有重要意义(古德祥等1989)。在捕食的过程中，dsRNA可以通过猎物传递给青翅蚁形隐翅甲，因此必须要评价转基因
水稻表达的dsRNA对青翅蚁形隐翅甲安全性。同时，青翅蚁形隐翅甲易于饲养，有成熟的人工饲料，适合作为指示生物。
[0006] 基于RNAi技术的抗虫转基因作物是新一代转基因抗虫作物，已有的转Bt基因抗虫作物对非靶标生物的安全性评价技术体系并不适用于基于RNAi技术的抗虫转基因作物。
[0007] 目前，急需建立适应于基于RNAi技术的抗虫转基因作物的环境安全评价方法。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于克服
现有技术的不足，提供了一种青翅蚁形隐翅甲V-ATPase-A基因的dsRNA及其人工饲料和应用；本发明以稻田重要捕食性天敌青翅蚁形隐翅甲为对象，建立基于喂食法RNAi技术，为我们转基因抗虫水稻提供前瞻性安全评价技术体系。
[0009] 为实现上述目的，本发明所设计一种青翅蚁形隐翅甲V-ATPase-A基因的dsRNA，所述dsRNA来源于PfV-ATPase-A基因，其核苷酸序列由SEQ ID No.1所示。
[0010] 进一步地，它为
权利要求1所述PfV-ATPase-A基因中一段，命名为dsPfV-ATPase-A，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0011] 本发明还提供了一种喂养青翅蚁形隐翅甲的人工饲料，所述人工饲料中含有上述dsRNA。
[0012] 进一步地，所述人工饲料按重量份数比计由1份的蜂蜜、4～6份的猪肝粉和0.5～0.7份的dsRNA组成。
[0013] 再进一步地，所述人工饲料按重量份数比计由1份的蜂蜜、5份的猪肝粉和0.6份的dsRNA组成。
[0014] 上述喂养青翅蚁形隐翅甲的人工饲料的制备方法，包括以下步骤：
[0015] 1)按重量份数比称取1份的蜂蜜、4～6份的猪肝粉和0.5～0.7份的dsPfV-ATPase-A或含有转V-ATPase-A基因dsRNA的植物；
[0016] 2)首先将蜂蜜和猪肝粉混匀，然后加入dsPfV-ATPase-A或含有转V-ATPase-A基因dsRNA的植物，得到混合物；
[0017] 3)混合物加入水中，混合均得到悬浊液混合饲料，放入液氮中快速冻结成
冰，然后
冷冻干燥8h至干粉，即得到人工饲料。
[0018] 本发明还提供了一种上述喂养青翅蚁形隐翅甲的人工饲料在转基因植物环境安全评价上的应用。
[0019] 利用上述人工饲料建立鉴定含有V-ATPase-A基因dsRNA的植物的安全性评价方法，包括以下步骤：
[0020] 1)将重铬酸
钾混入人工饲料中，得到混合饲料；
[0021] 2)将混合饲料喂养青翅蚁形隐翅甲幼虫，并记录青翅蚁形隐翅甲幼虫的存活情况，统计10天内幼虫的死亡率，利用多元方差分析检验不同处理的差异显著性，并利用LSD法进行均值比较；饲喂后第3、6天取样，检测干扰效率，利用单因素方差分析检验不同处理间的差异显著性，
[0022] 若显著时，利用LSD法进行均值比较，含dsPfV-ATPase-A处理组的存活率显著低于dsGFP的对照组(p<0.05)，并且第3、6天取样，处理组显著降低了PfV-ATPase-A表达量(p<0.05)；
[0023] 或，若不显著时，利用LSD法进行均值比较，含dsPfV-ATPase-A处理组与dsGFP的对照组之间无显著差异(p>0.05)，并且第3、6天取样，处理组PfV-ATPase-A表达量无显著影响(p>0.05)。
[0024] 作为优选方案，所述步骤2)中，饲养条件是
温度为28±1℃，
相对湿度为65～80％，光照比为L12h:D12h。
[0025] 本发明的有益效果：
[0026] 本发明利用青翅蚁形隐翅甲V-ATPase-A基因的dsRNA建立了一套系统、科学的评价方法，作为一种理论、
基础研究，为未来基于RNAi的转基因水稻安全评价技术体系还是对青翅蚁形隐翅甲RNAi的研究都提供了有意义的参考价值和必要的基础数据，为未来转基因抗虫水稻提供前瞻性安全评价技术体系。
[0027] 本发明的评价方法中，10天内饲喂含dsPfV-ATPase-A的处理组幼虫死亡率显著高于对照组,并且饲喂后第3、6天取样，处理组的PfV-ATPase-A表达量显著降低，说明本方法中饲喂青翅蚁形隐翅甲dsRNA的方法可行，为以后通过本方法评价相关转基因水稻提供理论基础。
附图说明
[0028] 图1为dsPfV-ATPase-A和dsGFP的合成纯化结果；
[0029] 图2为人工饲料中dsRNA的
稳定性；
[0030] 图2A中，不接青翅蚁形隐翅甲幼虫24h内，人工饲料中dsPfV-ATPase-A稳定性和相对灰度值；图2B中，接入青翅隐翅甲幼虫24h内，人工饲料中dsPfV-ATPase-A稳定性和相对灰度值；
[0031] 图3为注射不同来源700ng的dsRNA后，青翅蚁形隐翅甲成虫的存活率曲线；
[0032] 图4为注射不同来源700ng的dsRNA后，青翅蚁形隐翅甲成虫靶标基因Pf V-ATPase-A相对表达量；
[0033] 图5为dsPfV-ATPase-A混入人工饲料，饲喂的青翅蚁形隐翅甲幼虫存活率曲线；
[0034] 图6为dsPfV-ATPase-A混入人工饲料，饲喂的青翅蚁形隐翅甲幼虫靶标基因PfV-ATPase-A表达量。
具体实施方式
[0035] 下面结合具体
实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
[0036] 实施例1青翅蚁形隐翅甲V-ATPase-A基因的dsRNA筛选：
[0037] 选取青翅蚁形隐翅甲2龄幼虫和
羽化10-15D的成虫，所取样品包含组织撕取40个成虫中肠(雌雄比1:1)和40个幼虫中肠分别用于total RNA提取，对青翅蚁形隐翅甲成虫mRNA文库进行高通量测序，采用RNA转录组无参分析流程进行序列分析和注释。
[0038] 分析测序结果，从52个转录本比对分析得到青翅蚁形隐翅甲V-ATPase-A cDNA序列长为2442bp，编码区长1839bp，由SEQ ID No.1所示。
[0039] 在编码区设计的PfV-ATPase-A的dsRNA长度为475bp，其核苷酸序列由SEQ ID No.2所示。
[0040] 并根据目的基因PfV-ATPase-A和对照的基因GFP的
片段用Primer Premier 5.0设计引物(表1)，PCR扩增目的片段。
[0041] 表1供试引物序列
[0042]
[0043] 注：T7为T7启动子序列，如：TAATACGACTCACTATAGG
[0044] 通过连接转化等操作，以纯化后的质粒PCR产物为合成模板，参照RNAi Kit
试剂盒提供的试剂和步骤进行合成dsGFP和dsPfV-ATPase-A(图1)。
[0045] 实施例2
[0046] 人工饲料的制备方法，包括以下步骤：
[0047] 1)按重量份数比计称取1份的蜂蜜、5份的猪肝粉和0.6份的dsPfV-ATPase-A；
[0048] 2)首先将蜂蜜和猪肝粉混匀，然后加入dsPfV-ATPase-A，得到混合物；
[0049] 3)混合物加入水中，混合均得到悬浊液混合饲料，放入液氮中快速冻结成冰，然后冷冻干燥8h至干粉，即得到人工饲料。
[0050] 实施例3
[0051] 检测上述人工饲料中的dsPfV-ATPase-A稳定性和生物活性：
[0052] 利用凝胶
电泳和显微注射法分别确定在接幼虫的条件下，24h内人工饲料中的dsPfV-ATPase-A稳定性和生物活性：
[0053] 凝胶电泳检测：在接入青翅蚁形隐翅甲幼虫和不接幼虫两种情况下，每12h取一次饲料样品，即0、12、24h检测饲料样品，用酚氯仿抽提，分别抽提出接虫和不接虫两种情况下的人工饲料样品中的dsRNA。1.5％琼脂糖凝胶电泳检验人工饲料中dsRNA的片段完整性以及稳定性；用凝胶成像仪的相对灰度法比较电泳胶图上的dsRNA的
亮度，计算人工饲料中dsPfV-ATPase-A降解程度(图2)；
[0054] 显微注射法检测：将混入饲料中的dsPfV-ATPase-A用酚氯仿抽提法抽提出来，采用紫外分光光度计测定浓度，然后将dsRNA浓度稀释到7μg/μl，分别标记为dsPfV-ATPase-A-24h和dsGFP-24h。取新合成的dsPfV-ATPase-A和dsGFP(7μg/μl)，分别标记为dsPfV-ATPase-A和dsGFP作为对照组。再通过中胸
腹板节间膜显微注射到隐翅甲成虫体内，注射体积为100nl，注射剂量为0.7μg/头，每个处理4个重复，一个重复30头。注射后第3、6天取样，每个处理3个重复，每个重复4头成虫，检测PfV-ATPase-A相对表达量，同时统计成虫死亡率。
[0055] 结果表明：通过琼脂糖凝胶电泳中dsRNA条带的亮度、条带的清晰度及条带的相对灰度，比较各个时间点dsPfV-ATPase-A的稳定性及完整性(图2)。在不接青翅蚁形隐翅甲幼虫的条件下，dsPfV-ATPase-A混入饲料12、24h之后，没有明显降解的现象(图2A)。在接入青翅蚁形隐翅甲幼虫的条件下，dsPfV-ATPase-A混入饲料12、24h之后，也没有明显降解的现象(图2B)。因此，将dsPfV-ATPase-A直接混合到人工饲料中，加入DEPC水快速混合，用液氮急速冷冻之后，再冷冻干燥成粉状供隐翅甲取食，不仅可以将dsPfV-ATPase-A均匀混合到饲料中，而且还能够保持dsPfV-ATPase-A的稳定性及完整性。
[0056] 将混入饲料中的dsPfV-ATPase-A重新抽提出来，再注射到隐翅甲成虫体内，检测dsPfV-ATPase-A对靶标基因的干扰活性。注射dsPf V-ATPase-A、dsPf V-ATPase-A-24h的青翅蚁形隐翅甲成虫的存活率随着时间的推移逐渐降低，第5天起与注射dsGFP、dsGFP-24h的成虫相比，存活率分别显著下降至69％和75％(P<0.05)(图3)。第3和6天，注射dsPf V-ATPase-A、dsPfV-ATPase-A-24h的成虫，与注射dsGFP、dsGFP-24h的成虫相比，体内的Pf V-ATPase-A的表达量显著下降98.2％、95.6％和95.6％、96.7％(P<0.05)(图4)。从死亡率和干扰效率的结果可知，注射dsPfV-ATPase-A和dsPfV-ATPase-A-24h两处理间，在存活率和PfV-ATPase-A的表达量上趋势一致，两者之间无显著差异(图3，图4)，这说明：隐翅甲幼虫取食24h后，人工饲料中的dsPfV-ATPase-A的与新合成的dsPfV-ATPase-A在生物活性无显著差异，混入人工饲料中dsPfV-ATPase-A在24h内一直保持自身的生物活性。
[0057] 实施例3
[0058] 利用上述人工饲料建立鉴定含有V-ATPase-A基因dsRNA的植物的安全性评价方法，包括以下步骤：
[0059] 1)在上述实验的基础上，喂食实验设置以下4种处理：
[0060] (1)青翅蚁形隐翅甲幼虫的人工饲料中不加任何其他化合物，本处理作为阴性对照；
[0061] (2)青翅蚁形隐翅甲幼虫的人工饲料中混入dsPfV-ATPase-A，饲料中dsPfV-ATPase-A浓度为100mg/g；
[0062] (3)青翅蚁形隐翅甲幼虫的人工饲料中混入dsGFP。饲料中dsGFP的浓度与处理组中dsPf V-ATPase-A的浓度一致，饲料中dsGFP浓度为100mg/g；
[0063] (4)青翅蚁形隐翅甲幼虫的人工饲料中混入重铬酸钾，饲料中重铬酸钾浓度为1.5mg/g，本处理作为阳性对照；
[0064] 每个处理设4个重复，每个重复32头，每日更换饲料并记录青翅蚁形隐翅甲幼虫的存活情况，统计死亡率。饲喂后第3、6天取样，每个样品6头幼虫。抽提幼虫Total RNA，反转录成cDNA，以青翅蚁形隐翅甲的RPS3基因作为
荧光定量的内参基因，检测干扰效率。2)统计10天内幼虫的死亡率，利用多元方差分析检验不同处理的差异显著性，并利用LSD法进行均值比较；饲喂后第3、6天取样，检测干扰效率，利用单因素方差分析检验不同处理间的差异显著性。
[0065] 结果显示：取食含有1.5mg/g重铬酸钾人工饲料的青翅蚁形隐翅甲幼虫存活率显著下降，第8天幼虫全部死亡。说明添加到饲料中的杀虫物质可以通过饲料传递到隐翅甲中肠中。与阴性对照组dsGFP相比，含有100mg/g dsPfV-ATPase-A的人工饲料喂食隐翅甲幼虫后，从第4天起，幼虫的存活率显著下降，到第10天，幼虫的存活率显著下降86.11％(P<0.05)(图5)。含100mg/g dsPfV-ATPase-A的人工饲料喂食隐翅甲幼虫后，与纯人工饲料及含dsGFP的人工饲料相比，第3、6天青翅蚁形隐翅甲幼虫体内PfV-ATPase-A表达量分别显著下调75.8％、72.5％(P<0.05)(图6)。说明表明本饲喂体系能够高效沉默青翅蚁形隐翅甲幼虫靶标基因的表达和沉默后幼虫表型显著。
[0066] 说明本方法中饲喂青翅蚁形隐翅甲dsRNA的方法可行，为以后通过本方法评价相关转基因水稻提供理论基础。
[0067] 其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
