植物类胡萝卜素合成相关蛋白及其编码基因与应用
阅读：929发布：2020-05-13
专利汇可以提供植物类胡萝卜素合成相关蛋白及其编码基因与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 植物 类胡萝卜素合成相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供了一种 蛋白质 ，是如下(a1)或(a2)：(a1)由 序列表 中序列2所示的 氨 基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。本发明的 发明人 从蒺藜苜蓿中克隆出WF1基因，成功构建植物互补载体，采用农杆菌介导的叶盘法转化蒺藜苜蓿白花突变体，与对照相比，转入WF1基因的白花蒺藜苜蓿的花变成了黄色。本发明公开的内容可为研究该基因在植物中调控类胡萝卜素合成打下 基础 。，下面是植物类胡萝卜素合成相关蛋白及其编码基因与应用专利的具体信息内容。
1.如下任一所述在调控植物类胡萝卜素含量中的应用；
1）蛋白质，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2）编码1）所述蛋白质的基因；
3）含有2）所述基因的重组表达载体、表达盒或重组菌。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述基因为如下（b1）或（b2）：
（b1）编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；
（b2）序列表的序列5所示的DNA分子。
3.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中权利要求1或2所述基因的表达，得到类胡萝卜素含量降低的转基因植物。
4.一种降低植物类胡萝卜素含量的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中权利要求1中所述蛋白质的表达量，得到类胡萝卜素含量降低的转基因植物。
5.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将权利要求1或2所述基因导入目的植物，得到类胡萝卜素含量提高的转基因植物。
6.一种提高植物类胡萝卜素含量提高的方法，包括如下步骤：提高目的植物中权利要求1中所述蛋白质的表达量，得到类胡萝卜素含量提高的转基因植物。
7.权利要求3-6任一所述的方法在植物育种中的应用。
植物类胡萝卜素合成相关蛋白及其编码基因与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种植物类胡萝卜素合成相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
[0002] 豆科(Leguminosae)植物约有700属18000种，是仅次于菊科和兰科的第三大科，广泛分布于全世界，是人类食物和油料以及牧草、绿肥、药材和木材等的重要来源，具有重要的经济、生态学和生物学价值。但由于大部分豆科作物基因组较大，遗传转化体系尚不成熟等因素，限制了豆科植物功能基因组学的研究。蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)是一年生草本植物，放牧型牧草，因其生长周期短、倍性小、基因组小、自花受粉及固氮等特点，是豆科植物遗传学和基因组学研究的理想模式植物。
[0003] 类胡萝卜素是一类C40类萜化合物及其衍生物的总称，是所有光合生物的基本成分，在动物、植物、藻类、细菌和真菌中广泛存在，但动物自身不能合成类胡萝卜素，只能从外界摄取。类胡萝卜素是人体必需维生素A的前体物质，在体内起着抗氧化，清除自由基等功能，并与植物的花卉、果实中的黄色至红色等颜色相关。目前已经识别的类胡萝卜素按其结构不同分为烃类胡萝卜素，呈橙色、红色；醇类胡萝卜素，呈黄色；酮类和酸类胡萝卜素呈红色。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种植物类胡萝卜素合成相关蛋白及其编码基因与应用。
[0005] 本发明提供了一种蛋白质(命名为WF1蛋白)，获自蒺藜苜蓿，是如下(a1)或(a2)：
[0007] (a2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。
[0008] 为了使(a1)中的WF1蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0009] 表1标签的序列
[0010]标签 残基 序列
Poly--Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
Poly--Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
[0011] 上述(a2)中的WF1蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(a2)中的WF1蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0012] 编码所述WF1蛋白的基因(WF1基因)也属于本发明的保护范围。
[0013] 所述基因为如下(b1)-(b4)中任一所述的DNA分子：
[0014] (b1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；
[0015] (b2)序列表的序列5所示的DNA分子；
[0017] (b4)来源于蒺藜苜蓿并且与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
[0018] 上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
[0019] 含有所述WF1基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
[0020] 所述重组表达载体具体可为在pCAMBIA2300质粒的KpnI酶切位点中插入了序列表的序列3所示的DNA片段，并且在PstI酶切位点中插入序列表的序列4所示的DNA片段得到的重组质粒。
[0021] 所述重组表达载体具体可为含有序列表的序列5所示的双链DNA分子的表达载体。
[0022] 本发明还保护WF1蛋白或WF1基因在调控植物类胡萝卜素含量中的应用。
[0023] 本发明还保护一种培育转基因植物的方法(方法1)，包括如下步骤：抑制目的植物中WF1基因的表达，得到类胡萝卜素含量降低的转基因植物。
[0024] 本发明还保护一种降低植物类胡萝卜素含量的方法(方法2)，包括如下步骤：抑制目的植物中WF1蛋白的活性和/或表达量，得到类胡萝卜素含量降低的转基因植物。
[0025] 本发明还保护一种培育转基因植物的方法(方法3)，包括如下步骤：将WF1基因导入目的植物，得到类胡萝卜素含量提高的转基因植物。
[0026] 所述方法中，所述WF1基因可以通过重组表达载体导入目的植物。所述重组表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。
[0027] 所述重组表达载体具体可为在pCAMBIA2300质粒的KpnI酶切位点中插入了序列表的序列3所示的DNA片段，并且在PstI酶切位点中插入序列表的序列4所示的DNA片段得到的重组质粒。
[0028] 所述重组表达载体具体可为含有序列表的序列5所示的双链DNA分子的表达载体。
[0029] 本发明还保护一种提高植物类胡萝卜素含量提高的方法(方法4)，包括如下步骤：提高目的植物中WF1蛋白的活性和/或表达量，得到类胡萝卜素含量提高的转基因植物。
[0030] 本发明还保护WF1蛋白或WF1基因或以上任一所述的方法在植物育种中的应用。
[0031] 所述育种的目的是培育类胡萝卜素高的植物(方法3或方法4)或类胡萝卜素低的植物(方法1或方法2)。
[0032] 以上任一所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物为蔷薇目植物，所述蔷薇目植物为豆科植物。所述豆科植物为苜蓿属植物。所述苜蓿属植物为蒺藜苜蓿。方法1或方法2中，所述目的植物更具体可为蒺藜苜蓿R108。方法3或方法4中，所述目的植物更具体可为wf1突变体(The Nobel Foundation，编号：NF4496)。
[0033] 以上任一所述胡萝卜素具体可为叶黄素。
[0034] 以上任一所述植物为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物为蔷薇目植物，所述蔷薇目植物为豆科植物。所述豆科植物为苜蓿属植物。所述苜蓿属植物为蒺藜苜蓿，更具体可为蒺藜苜蓿R108。
[0035] 本发明的发明人从蒺藜苜蓿中克隆出WF1基因，成功构建植物互补载体，采用农杆菌介导的叶盘法转化蒺藜苜蓿白花突变体，与对照相比，转入WF1基因的白花蒺藜苜蓿的花变成了黄色。本发明公开的内容可为研究该基因在植物中调控类胡萝卜素合成打下基础。附图说明
[0036] 图1为蒺藜苜蓿R108野生型花和蒺藜苜蓿wf1白花突变体花表型图。
[0037] 图2为R108花和wf1花中类胡萝卜素含量及成分测定。
[0038] 图3为WF1与白花表型连锁关系分析。
[0039] 图4为wf1突变体互补转基因植株花色表型分析和wf1突变体互补转基因植株分子检测。
[0040] 图5为wf1突变体互补转基因植株类胡萝卜素合成相关基因的表达量分析。
具体实施方式
[0041] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0042] 蒺藜苜蓿R108(野生型)：The Nobel Foundation。
[0043] wf1突变体：The Nobel Foundation，编号：NF4496。
[0044] wf1-2突变体：The Nobel Foundation，编号：NF10625。
[0045] wf1-3突变体：The Nobel Foundation，编号：NF10301。
[0046] pCAMBIA2300质粒：武汉中利源生物科技有限公司，货号：P0283。
[0047] 农杆菌AGL1：Biomed，货号：BC302-01。
[0049] YEP液体培养基：蛋白胨10g、酵母提取物10g、氯化钠5g，蒸馏水定容至1L。
[0050] 愈伤诱导液体培养基(PH 5.8)：大量元素母液100mL、微量元素母液1mL、有机元素母液1mL、铁盐母液140mg、肌醇100mg、蔗糖30g、生长素4mg、细胞分裂素0.5mg、头孢200mg、特美汀250mg、草胺磷2mg，定容至1L。
[0051] 愈伤诱导固体培养基(PH 5.8)：大量元素母液100mL、微量元素母液1mL、有机元素母液1mL、铁盐母液140mg、肌醇100mg、蔗糖30g、生长素4mg、细胞分裂素0.5mg、头孢200mg、特美汀250mg、草胺磷2mg、Phytagel 3.2g，定容至1L。
[0052] 分化培养基(PH 5.8)：大量元素母液100mL、微量元素母液1mL、有机元素母液1mL、铁盐母液140mg、肌醇100mg、蔗糖20g、头孢200mg、特美汀250mg、草胺磷2mg、Phytagel 3.2g，定容至1L。
[0053] 生根培养基(PH 5.8)：Murashige&Skoog Basal Medium with Vitamins 2.215g/L(公司：PhytoTechnology Laboratories，货号：16B0519138A)
[0057] 有机元素母液：烟酸500mg、盐酸硫胺素500mg、盐酸吡哆醇500mg，蒸馏水定容至1L。
[0058] 实施例1、WF1及其编码基因WF1的发现
[0059] 一、突变体获得及表型分析
[0060] 通过筛选蒺藜苜蓿Tnt1插入突变体库，获得了一个花色由野生型的黄色变成白色的极端异常突变体，命名为white flower1(wf1)。
[0061] wf1突变体和蒺藜苜蓿R108(野生型)的花表型观察结果见图1。图1中，A：野生型R108花正面；B：野生型R108花旗瓣；C：野生型R108花融合的翼瓣和龙骨瓣；D：野生型R108花二体雄蕊；E：wf1花正面；F：wf1花旗瓣；G：wf1花融合的翼瓣和龙骨瓣；H：wf1花二体雄蕊。野生型R108的花正面、花旗瓣、花融合的翼瓣合龙骨瓣均为黄色；wf1花正面、花旗瓣、花融合的翼瓣和龙骨瓣均为白色。
[0062] 二、花色素成分测定
[0063] 待测植株：蒺藜苜蓿R108(野生型)和wf1突变体。
[0064] 分析待测植株花中的色素成分，步骤如下：
[0065] 1、将研钵及药勺洗净，倒入适量无水乙醇并点燃灼烧，室温冷却1h，放入样品前用液氮冻2-3遍。
[0066] 2、取生长状态一致，完全开放的待测植株花瓣约20mg(约8-9朵，去除叶柄、萼片与雄蕊)，准确称量重量后迅速放入液氮中冷冻。
[0068] 4、完成步骤3后，加入100μl Tris-HCl buffer(50mM，pH7.5，含1M NaCl)，上下颠倒8-10次，充分混匀后冰上放置10min。
[0069] 5、完成步骤4后，加入400μL氯仿，上下颠倒混匀后冰上放置10min。
[0070] 6、完成步骤5后，4℃、3000g离心5min，取下层液体。
[0071] 7、对上层剩余液体再次按照步骤5、6进行萃取，将2次获得的下层液体混合，氮气吹干后用100μL乙酸乙酯溶解，通过HPLC检测色素成分。
[0072] 标准品：叶黄素Lutein(Carotenature，NO.0133)；
[0073] 色谱柱：YMC公司5μm C30柱(250×4.6mm)串联20×4.6mmC30柱；
[0074] 进样量：10μL；
[0075] 流速：1.0mL·min-1；
[0076] 柱温：25℃；
[0077] 检测波长：450nm；
[0078] 流动相：A：甲醇；B：水/甲醇(体积比1/4，含0.2％醋酸铵)；C：叔甲基丁基醚[0079] 梯度洗脱：95％A、5％B等度洗脱12分钟，80％A、5％B、15％C洗脱12分钟，随后30％A、5％B、65％C洗脱30分钟。
[0080] 结果如图2所示。结果表明，蒺藜苜蓿R108(野生型)花中主要色素是叶黄素(Lutein)，wf1突变体花中的叶黄素含量远低于野生型。
[0081] 三、WF1与白花表型连锁关系的确认及其编码基因WF1的获得
[0082] 1、根据蒺藜苜蓿突变体数据库(https：//medicago-mutant.noble.org/mutant/)提供的Tnt1逆转座子插入位点的侧翼序列，设计相应的引物WF1-Insertion-6-F和WF1-Insertion-6-R分别与Tnt1的引物(LTR6或LTR31)进行组合，筛选与wf1突变体表型共分离的Tnt1插入位点，初步锁定目的基因。
[0083] LRT31-F(5’-3’)：CTCCTCTCGGGGTCGTGGTT
[0084] LTR6-R(5’-3’)：GCTACCAACCAAACCAAGTCAA
[0085] WF1-Insertion-6-F(5’-3’)：GGTGTTGCATGGACAGAA
[0086] WF1-Insertion-6-R(5’-3’)：GCCCATGCCTAGTTGTTA
[0087] 2、提取蒺藜苜蓿R108(野生型)完全开放的黄花的总RNA，反转录成cDNA作为模板，采用引物对WF1-F/WF1-R进行扩增，得到PCR扩增产物。进行测序，得到目标基因的编码区序列，如序列表中序列1所示，编码序列表的序列2所示的蛋白质。将序列表的序列2所示的蛋白质命名为WF1，由230个氨基酸残基组成。将WF1的编码基因命名为WF1基因。
[0088] 3、进一步反向筛选蒺藜苜蓿Tnt1逆转座子插入突变体库，又获得了其他两个WF1 Tnt1插入突变体wf1-2和wf1-3。随后对蒺藜苜蓿R108(野生型)、wf1突变体、wf1-2和wf1-3突变体进行基因组和转录水平分析，并对完全开放花的表型进行深入分析。
[0089] 4、提取蒺藜苜蓿R108(野生型)及三个突变体的基因组DNA为模板，根据蒺藜苜蓿突变体数据库(https：//medicago-mutant.noble.org/mutant/)提供的Tnt1逆转座子插入位点序列设计引物，分别分析wf1-1、wf1-2和wf1-3中Tnt1逆转座子的插入情况，结果显示，wf1-1和wf1-2中Tnt1分别插入到第二个外显子和第三个外显子上，导致花色由野生型的黄色变成白色，而wf1-3突变体中Tnt1插入到其基因组的3′UTR区，导致花色由野生型的黄色变为浅黄色(图3A)。转录水平上进一步分析三个突变体中WF1基因表达量情况，分别提取野生型R108和三个突变体的总RNA，反转录成的cDNA为模板，以WF1 CDS扩增引物WF1-F/WF1-R组成的引物对扩增WF1基因，并以引物MtActin-F/MtActin-R组成的引物对扩增蒺藜苜蓿内参基因MtActin，进行RT-PCR，扩增产物结果显示，与野生型相比wf1-1中WF1基因的目的片段变小，该片段测序结果显示其第二个外显子缺失，导致WF1基因130bp碱基缺失，从而使该基因产生移码突变导致功能缺失(图3B)。经测序，wf1-1突变体中WF1基因错误拼接(图C)。分别提取野生型R108和三个突变体的总RNA，反转录成的cDNA为模板，以WF1特异引物qWF1-F/qWF1-R组成的引物对扩增WF1基因，并以引物qMtActin-F/qMtActin-R组成的引物对扩增蒺藜苜蓿内参基因MtActin，进行Real-time PCR，显示三个突变体中WF1基因的表达水平均明显低于野生型(图3D)，进一步验证了WF1基因的缺失导致蒺藜苜蓿花色由黄色变成了白色，说明WF1在蒺藜苜蓿花色调控中起到重要的作用。图3E：野生型R108花正面；图3F：wf1花正面；图3G：wf1-2花正面；图3H：wf1-3花正面。野生型R108的花正面为黄色；wf1花正面和wf1-2花正面均为白色，wf1-3花正面为浅黄色。
[0090] WF1-F(5’-3’)：CAAAAAAGCAGGCTTCATGGGTGGTGTTGCATGGAC
[0091] WF1-R(5’-3’)：CAAGAAAGCTGGGTCCTAAGAAAAACCATTATATAGATCC
[0092] MtActin-F：TCTTACTCTCAAGTACCCCATTGAGC
[0093] MtActin-R：GTGGGAGTGCATAACCCTCATAGATT
[0094] 实施例2、WF1基因的功能验证
[0095] 为了进一步验证WF1在类胡萝卜素合成调控中的作用，通过在wf1突变体中进行WF1基因组互补实验进行功能验证。
[0096] 一、互补表达载体的构建
[0097] 在pCAMBIA2300质粒的KpnI酶切位点中插入了序列表的序列3所示的DNA片段，并且在PstI酶切位点中插入序列表的序列4所示的DNA片段，得到重组质粒pWF1pro：：WF1 gDNA-1.5KASC(已经测序验证)。
[0098] 序列表的序列3为WF1基因上游3K启动子区段和WF1基因gDNA区段，序列表的序列4为WF1基因下游1.5K终止区区段。序列表的序列5为WF1基因上游3K启动子区段-WF1基因gDNA区段-载体中间片段-WF1基因下游1.5K终止区区段的完整序列。
[0099] 二、互补突变体植株的获得
[0100] 1、将步骤一制备的重组质粒pWF1pro：：WF1 gDNA-1.5KASC转化农杆菌AGL1，得到重组菌AGL1/pWF1pro：：WF1 gDNA-1.5KASC。
[0101] 2、将步骤1得到的重组菌AGL1/pWF1pro：：WF1 gDNA-1.5KASC接种于含有50mg/mL的利福平抗生素和50mg/mL的卡那抗生素的YEP固体培养基上，28℃培养至长出单菌落，挑取单菌落至YEP液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养过夜。
[0102] 3、完成步骤2后，取500μL菌液接种于5mLYEP液体培养基中，再加入5μL 100mg/mL的乙酰丁香酮，28℃、200rpm振荡培养至OD600nm＝0.8，3800rpm离心菌液15min收集菌体。
[0103] 4、采用含有100mg/L的乙酰丁香酮的SH3a液体培养基重悬步骤3得到的菌体，调菌液OD600nm＝0.2，得到侵染液。
[0105] 6、完成步骤5后，将侵染后的叶片转移到SH3a固体培养基上，培养四周至出现白色胚性愈伤组织(两周更换一次培养基)。
[0106] 7、完成步骤6后，将白色胚性愈伤组织转移到分化培养基上，培养四周至分化出绿色胚状体(两周更换一次培养基)。
[0107] 8、完成步骤7后，将绿色胚状体转移到生根培养基上，两周更换一次培养基，生根长叶后移至蛭石中，直至成苗，得到T0代互补突变体植株。
[0108] T0代自交得到T1代，T1代自交得到T2代。
[0109] 9、采用pCAMBIA2300质粒替代重组质粒pWF1pro：：WF1 gDNA-1.5KASC，按照步骤1-8进行操作，得到转空载体植株(pCAMBIA2300-GFP-HA/wf1)。
[0110] 三、互补突变体植株的表型
[0111] 待测植株：蒺藜苜蓿R108(野生型)、wf1突变体、互补突变体植株(F2代)(pWF1：WF1 gDNA-GFP-HA/wf1)、转空载体植株(pCAMBIA2300-GFP-HA/wf1)。
[0112] 观察待测植株完全开放的花表型。结果如图4A-图4D所示。结果表明，互补突变体植株的花色由wf1突变体的白色变成类似野生型的黄色。对照载体植株的花色为与wf1突变体相同的白色。转空载体植株花色依然为白色，排除载体对花色影响。
[0113] 四、互补突变体植株类胡萝卜素合成基因表达量分析
[0114] 待测植株：蒺藜苜蓿R108(野生型)、wf1突变体、空载体转化植株(F2代)(pCAMBIA2300/wf1-7)、互补突变体植株(F2代)(pWF1：WF1 gDNA-GFP-HA/wf1-1)。
[0115] 1、提取待测植株完全开放的花总RNA，并反转为cDNA。
[0116] 2、以步骤1得到的cDNA为模板，利用qRT-PCR检测野生型R108、wf1突变体、wf1-2和wf1-3突变体花中类胡萝卜素合成相关基因的表达，检测的基因及其检测引物如下(MtActin为内参基因)：
[0117] qMtActin-F(5’-3’)：TCAATGTGCCTGCCATGTATGT
[0118] qMtActin-R(5’-3’)：ACTCACACCGTCACCAGAATCC
[0119] qMtWF1-F(5’-3’)：CTAGAAGCTGATCAAGATAGGTCAC
[0120] qMtWF1-R(5’-3’)：CTTGGCTCCTTCTCTTCACTG
[0121] qMtPSY-F(5’-3’)：ATGACTCCTGAAAGGCGAAG
[0122] qMtPSY-R(5’-3’)：TGATTCCCACCTATCCATTGC
[0123] qMtPDS-F(5’-3’)：TTCTACCTTTCGTGCTTCTCC
[0124] qMtPDS-R(5’-3’)：TTTCCACCTAGAACGTCTCTTG
[0125] qMtZDS-F(5’-3’)：CCTCCCGTTTTACTAAGACTCG
[0126] qMtZDS-R(5’-3’)：CTCGATAATGTTCAGGCTCCG
[0127] qMtCRTISO-F(5’-3’)：CTCTCCCTTTCTAACCACACC
[0128] qMtCRTISO-R(5’-3’)：TTTCACCGCCACCCTTTT
[0129] qMtLYCE-F(5’-3’)：AGCATGTTTGGAAGGATACCG
[0130] qMtLYCE-R(5’-3’)：GAGCCAAGATATGAGACACCTG
[0131] qMtLYCB-F(5’-3’)：TGTGGATCTTGTCGTTGTCG
[0132] qMtLYCB-R(5’-3’)：CCTCAAATTCATCCACCCAAAC
[0133] qMtECH-F(5’-3’)：GGCTGTTCAAATTGGTGCTG
[0134] qMtECH-R(5’-3’)：TCCACAGCTCCATTACCTTTC
[0135] qMtBCHa-F(5’-3’)：TTTGCTCTATCAGTGGGTGC
[0136] qMtBCHa-R(5’-3’)：CACAAGGAAGCATGCCAAAG
[0137] qMtBCHb-F(5’-3’)：TCACTTACCTAGTTGCAGCTG
[0138] qMtBCHb-R(5’-3’)：GCCAAACATTTCAGACCAAGG
[0139] qMtVDE-F(5’-3’)：ACCAGAGCCTTCCATTGTG
[0140] qMtVDE-R(5’-3’)：CCTTCTCCAAATCCTTCTCCAC
[0141] qMtZEP-F(5’-3’)：AGTGGTCTTGGATAATGGTCAG
[0142] qMtZEP-R(5’-3’)：CCCGAGTATGTAGCTTCTGTTG
[0143] qMtNXS-F(5’-3’)：ACCAAACTTCTCTTTACTGTTCTGT
[0144] qMtNXS-R(5’-3’)：AGATTGAAGGAGAAATGATTGTGTG
[0145] 每个株系检测3株。
[0146] 检测结果如图5所示(每个基因的检测结果中，从左至右依次为蒺藜苜蓿R108、wf1突变体、pCAMBIA2300/wf1-1和pWF1：WF1 gDNA-GFP-HA/wf1-1)。wf1突变体互补转基因植株花中类胡萝卜素合成相关基因的表达量相对wf1突变体升高，且表达量明显超过野生型R108中类胡萝卜素合成相关基因的表达量，对照载体植株的检测结果与wf1突变体相同，证明WF1基因能有效提高类胡萝卜素合成相关基因的表达，从而提高类胡萝卜素产量。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
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