黑果枸杞花青素在制备用于诱导两种癌细胞凋亡的药物中的应用
阅读：873发布：2020-05-15
专利汇可以提供黑果枸杞花青素在制备用于诱导两种癌细胞凋亡的药物中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了黑果枸杞花青素在制备用于诱导两种癌细胞凋亡的药物中的应用，包括以下步骤：1）MCF-7、HepG2、Mac-T和RAW264.7四种细胞的培养；2）四种细胞分别改用花青素培养基和正常培养基培养继续培养30个小时；3）步骤2）中的细胞分别进行细胞流式凋亡实验、EDU 细胞增殖 、GeminiSEM 300蔡司场发射扫描电镜和 荧光 定量PCR，证明黑果枸杞花青素促进两种癌细胞凋亡，并对另外两种正常细胞无影响。本发明首次披露了黑果枸杞花青素在调控肝癌细胞和 乳腺癌 细胞凋亡中的作用。相比于 现有技术 ，不仅证明了黑果枸杞花青素能够诱导人乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG2凋亡，并且对 牛 乳腺上皮细胞Mac-T和小鼠巨噬细胞RAW264.7未见明显的毒性作用,因而可以有效地应用于抗癌制剂的研发中。，下面是黑果枸杞花青素在制备用于诱导两种癌细胞凋亡的药物中的应用专利的具体信息内容。
黑果枸杞花青素在制备用于诱导两种癌细胞凋亡的药物中的
应用
技术领域
背景技术
[0002] 黑果枸杞花青素是从黑果枸杞果实中提取出的一种紫红色素，它色泽鲜艳自然，无特殊气味，是一种珍稀的天然食用花色苷类色素，属于生物类黄酮物质，是一类广泛存在于植物中的水溶性色素。花青素是一种存在于植物性食物中具有生物活性的化合物，具有较强的抗氧化和抗癌等特性。花青素的抗肿瘤机制主要是通过抗突变、抗氧化、抗炎、诱导转化、调节信号转导通路来抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞周期阻滞、促进肿瘤细胞凋亡、诱导自噬、抗肿瘤侵袭及转移、逆转肿瘤细胞耐药性和增加对化疗的敏感性等实现的。武雪玲等对黑果枸杞花青素的毒理学安全性进行了评价，结果表明小鼠和SD大鼠均未见明显的中毒症状及死亡，且未呈现致突变作用。目前关于黑果枸杞花青素诱导乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG2凋亡作用尚未见报道。本发明就黑果枸杞花青素对人乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG2生长情况及其诱导细胞凋亡的作用进行探讨。
发明内容
[0003] 为了克服上述缺陷，本发明的目的是提供黑果枸杞花青素在制备用于诱导两种癌细胞凋亡的药物中的应用。本发明验证黑果枸杞花青素能够诱导乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG2凋亡，同时对牛乳腺上皮细胞Mac-T和小鼠巨噬细胞RAW264.7未见明显的毒性作用，以便确定黑果枸杞花青素可应用于抗癌制剂的研发。通过细胞凋亡实验、EDU细胞增殖、GeminiSEM300蔡司场发射扫描电镜和荧光定量PCR等方法检测黑果枸杞花青素对两种癌细胞凋亡的调控作用。
[0004] 为了实现以上目的，本发明采用的技术方案如下：花青素在制备用于诱导两种癌细胞凋亡的药物中的应用，其特征在于，所述的两种癌细胞为MCF-7(人乳腺癌细胞)、HepG2(人肝癌细胞)。
[0005] 所述的花青素为黑果枸杞花青素。花青素的使用浓度为10-30ug/mL，处理时间为25-35h，优选为20ug/mL、处理时间30h。所述的花青素对Mac-T(牛乳腺上皮细胞)和RAW264.7(小鼠巨噬细胞)无毒。
[0006] 本发明还提供黑果枸杞花青素在制备抑制或治疗乳腺癌或肝癌的药物中的应用。抑制癌症时，靶基因包括凋亡基因，其中一个靶基因为LATS2基因(即黑果枸杞花青素可以上调MCF-7、HepG2中LATS2基因的表达)。
[0007] 本发明验证了黑果枸杞花青素能诱导两种癌细胞凋亡，包括以下步骤：
[0008] 1)MCF-7、HepG2、Mac-T和RAW264.7四种细胞的分别培养(采用正常培养基)；
[0009] 2)四种细胞分别培养至50％时，四种细胞分别采用20ug/mL花青素培养基或正常培养基继续培养30个小时；
[0010] 3)对步骤2)得到的细胞分别进行流式细胞仪-细胞凋亡实验、EDU细胞增殖、GeminiSEM300蔡司场发射扫描电镜和荧光定量PCR，结果证明黑果枸杞花青素能够诱导人乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG2凋亡，并且对牛乳腺上皮细胞Mac-T和小鼠巨噬细胞RAW264.7未见明显的毒性作用。
[0011] 步骤3)中进行的流式细胞仪-细胞凋亡实验，细胞处理步骤为：收集细胞，用buffer调整细胞浓度1x106/100uL/test；加5uL Annexin V和10uL PI，室温避光20min；加400uL buffer上机检测。
[0012] 步骤3)中进行的EDU细胞增殖实验,细胞处理步骤为:EdU标记、细胞固定化、Apollo染色、DNA染色、图像获取及分析。
[0013] 步骤3)中进行的GeminiSEM 300蔡司场发射扫描电镜实验,细胞处理步骤为:细胞爬片制备、2.5％多聚甲醛前固定、PBS清洗、梯度浓度乙醇脱水、CDP-300型临界点干燥仪干燥、粘样、SCD 500型离子溅射仪内对样品表面喷镀黄金、上机观察。
[0014] 步骤3)中进行的荧光定量PCR实验,所使用LATS2基因的引物的核苷酸序列为：
[0015] 上游引物为：5’-CACCTCAGCCGCCACAGAAGT-3’；
[0016] 下游引物为：5’-GCTTGACGACCCGAACGATCT-3’
[0017] 且其在步骤3)中荧光定量PCR扩增程序为：
[0018] Stage1预变性：95℃5min；
[0019] Stage2循环反应：95℃10s,60℃30s,40个循环；
[0020] Stage3融解曲线：95℃15s,60℃60s,95℃15s。
[0021] 相对于现有技术，本发明达到了如下的有益效果：
[0022] 1)本发明首次证明了黑果枸杞花青素在诱导乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG2凋亡中的应用。相比于现有关于花青素提取工艺的研究，本发明从细胞层面证明了黑果枸杞花青素对两种癌细胞的调控作用，并且提高了细胞免疫因子的表达量，且凋亡基因LATS2表达量上调，细胞增殖量降低，因而具有更高的准确性和可信度。
[0023] 2)本发明证明了黑果枸杞花青素对牛乳腺上皮细胞Mac-T和小鼠巨噬细胞RAW264.7无明显的毒性作用，流式细胞仪检测细胞凋亡率无明显变化、凋亡基因LATS2表达量降低且免疫因子表达量增加，因而具有更高的安全性和可行性。附图说明
[0024] 图1是MCF-7、HepG2、Mac-T和RAW264.7四种细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡率结果；图1-A1、图1-B1、图1-C1、图1-D1分别是MCF-7、HepG2、Mac-T和RAW264.7四种细胞的阴性对照(培养基中始终不加花青素)的细胞凋亡率结果；图1-A2、图1-B2、图1-C2、图1-D2分别是MCF-7、HepG2、Mac-T和RAW264.7四种细胞用花青素处理后得到的细胞凋亡率结果；
[0025] 图2是HepG2细胞EDU细胞增殖结果；图2A为对照组(不加花青素)，图2B为黑果枸杞青花素处理组；
[0026] 图3是MCF-7、HepG2、Mac-T和RAW264.7四种细胞扫描电镜结果；图3-A1、图3-B1、图3-C1、图3-D1分别是MCF-7、HepG2、Mac-T和RAW264.7四种细胞的阴性对照(不加花青素)的细胞扫描电镜结果；图3-A2、图3-B2、图3-C2、图3-D2分别是MCF-7、HepG2、Mac-T和RAW264.7四种细胞用花青素处理后得到的细胞扫描电镜结果；
[0027] 图4是MCF-7、HepG2、Mac-T和RAW264.7四种细胞LATS2基因荧光定量PCR结果；
[0028] 图5是黑果枸杞花青素对MCF-7处理浓度和处理时间探索结果。
[0029] 图6是黑果枸杞花青素对HepG2处理时间探索结果。
具体实施方式
[0030] 为了阐明本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。
[0031] 实施例1：本实施例中，对黑果枸杞花青素浓度和处理时间进行探索。
[0032] (1)细胞培养：MCF-7使用DMEM/F12培养基，完全培养基成分比例为90％培养基和10％胎牛血清，37℃培养，CO2浓度为5％。
[0033] (2)细胞处理：MCF-7细胞分为5组，第1组为对照组，2-5组为处理组。六孔板培养细胞，待细胞培养至50％时，处理组2、3更换为黑果枸杞花青素浓度为20ug/mL的花青素培养基，分别继续培养20h和30h；处理组4、5更换为黑果枸杞花青素浓度为2mg/mL的花青素培养基,分别继续培养20h和30h。HepG2细胞分为3组，第1组为对照组，2、3组为处理组。六孔板培养细胞，待细胞培养至50％时，处理组2、3更换为黑果枸杞花青素浓度为20ug/mL的花青素培养基，分别继续培养20h和30h。
[0034] (3)试验检测：通过流式细胞仪对MCF-7和HepG2两种种细胞进行细胞凋亡检测(百分比为凋亡率)，结果如图5、6所示，综合考虑花青素不同处理浓度和处理时间对MCF-7和HepG2凋亡率的影响，黑果枸杞花青素对MCF-7和HepG2最佳处理浓度和时间为20ug/mL、30h。采用较低的花青素处理浓度,是为了在保证MCF-7和HepG2凋亡率的前提下，尽可能降低对Mac-T和RAW264.7的不利影响。
[0035] 实施例2：本实施例中，用流式细胞仪对四种细胞进行细胞凋亡检测。
[0036] (1)细胞培养：MCF-7和Mac-T使用DMEM/F12培养基、HepG2使用MEM培养基、RAW264.7使用DMEM培养基，完全培养基成分比例为90％培养基和10％胎牛血清，37℃培养，CO2浓度为5％。，待细胞培养至50％时，实验组更换为黑果枸杞花青素浓度为20ug/mL的花青素培养基继续培养30个小时。
[0037] (2)样品制备：30h后，弃去培养基，并用PBS缓冲液洗涤2次，经胰蛋白酶消化后低速离心，收集细胞。用buffer调整细胞浓度1x106/100uL/test；加5uL Annexin V和5uL PI，室温避光20min；加500uL buffer上机检测。
[0038] (3)图像分析：Annexin V-FITC和PI是细胞凋亡检测最常用的试剂，这两种荧光素都能被488nm激光器激发，信号接收通道分别为第一通道(FITC)和第三通道(ECD)，因此凋亡检测方案第一张图为FSC/SSC，将细胞群体全部圈中，第2张图为第一通道和第三通道的散点图，即可分析细胞群体中各凋亡时期所占的比例，结果如图1所示，黑果枸杞花青素处理后的乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG2早期凋亡率(Q1-LR)和晚期凋亡率(Q1-UR)增加，而牛乳腺上皮细胞Mac-T和小鼠巨噬细胞RAW264.7早期凋亡率和晚期凋亡率均有所降低。说明黑果枸杞花青素能够促进乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG2凋亡，且降低了正常细胞的凋亡率。
[0040] (1)细胞培养：同实施例2(1)。
[0041] (2)样品制备：1)用细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μM EdU培养基；每孔加入100μL 50μM EdU培养基孵育2小时，弃培养基；PBS清洗细胞1-2次，每次5分钟。2)每孔加入50μL细胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟，弃固定液；每孔加入50μL 2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；每孔加入100μL PBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS；每孔加入100μL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10分钟；PBS清洗1次，5分钟。3)每孔加入100μL的 染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；加入100μL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗2-3次，每次10分钟，弃渗透剂。4)用去离子水按100：1的比例稀释试剂F，制备适量1X Hoechst33342反应液，避光保存；每孔加入100μL 1X Hoechst 33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；每孔每次加入100μL PBS清洗1-3次。
[0042] (3)图像观察：议染色完成后立即进行观测；如果条件限制，请避光4℃湿润保存待测，但不应超过3天。调试仪器时，请将曝光时间调整为30ms左右，尽量不要>1s。结果如图2所示，浓度为20ug/mL黑果枸杞花青素处理后的肝癌细胞HepG2增殖量明显降低，说明黑果枸杞花青素能够抑制肝癌细胞HepG2增殖。
[0043] 实施例4：本实施例中，利用GeminiSEM 300蔡司场发射扫描电镜观察花青素处理后四种细胞的形貌变化。
[0044] (1)细胞培养：同实施例2(1)。
[0045] (2)细胞爬片制备：胰酶消化细胞后计数并重悬细胞于完全培养基中。根据爬片大小选择合适的细胞密度种入爬片。待细胞贴壁后，实验组去除多余完全培养基，更换为花青素浓度为20ug/mL的花青素培养基继续培养30个小时。滴加2.5％戊二醛前至完全没过爬片，4℃过夜进行前固定。
[0046] (3)样品漂洗：0.1M PBS或双蒸水清洗3-4次。用1％OSO4进行后固定，再用0.1M PBS或双蒸水清洗3-4次。每次清洗10-15min，4℃进行。
[0047] (4)样品脱水：梯度浓度乙醇脱水(30％→50％→70％→80％→90％→95％→100％→100％无水硫酸钠)，更换液体时不能触及样品，每步骤停留10-15min，70％乙醇脱水剂可停留过夜，子80％乙醇脱水后，室温下进行。
[0048] (5)样品导电与形貌观察：样品经CDP-300型临界点干燥仪干燥后，将样品待观察面朝上，粘贴到样品台上，用SCD 500型离子溅射仪内对样品表面喷镀黄金，并在一天内利用GeminiSEM 300蔡司场发射扫描电镜进行细胞形貌观察。结果如图3所示，黑果枸杞花青素处理后的乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG2形态发生明显变化，细胞凋亡裂解。对于牛乳腺上皮细胞Mac-T未发生明显的形态结构变化。对于小鼠巨噬细胞RAW264.7，与对照组相比，黑果枸杞花青素处理后的细胞表面吞噬体活性未受到损伤。
[0049] 实施例5：本实施例中，通过荧光定量PCR检测黑果枸杞花青素处理后的四种细胞LATS2基因表达量变化。
[0050] (1)细胞培养：同实施例2(1)。
[0051] (2)RNA提取：30h后，弃去培养基，并用PBS缓冲液洗涤2次，每个孔加入1mLTRNzol,充分吹打后收集与冻存管中。将裂解的细胞转移到新的EP管中，每管加入200uL氯仿(每1mLTRNzol加入0.2mL氯仿)，剧烈摇晃15s，室温静置3-5min，于4℃、12000r离心15min。轻轻取出，吸取上清液并转移到新的EP管中，加入500mL异丙醇(约等于上清体积)，轻轻上下颠倒混匀，于4℃、12000r离心10min。缓慢弃去上清，管底会有白色沉淀生成。每管加入
1mL75％乙醇洗涤，于4℃、7500r离心5min，弃去上清，并重复上步操作。室温晾干5-10min，加入30-50uL去离子水，反复吹打，充分溶解RNA。利用分光光度计检测RNA浓度和OD值(OD值范围在1.9-2.0最佳)。
1mL75％乙醇洗涤，于4℃、7500r离心5min，弃去上清，并重复上步操作。室温晾干5-10min，加入30-50uL去离子水，反复吹打，充分溶解RNA。利用分光光度计检测RNA浓度和OD值(OD值范围在1.9-2.0最佳)。
[0052] (3)引物设计：使用LATS2基因引物的核苷酸序列如下：
[0053] 上游引物为：5’-CACCTCAGCCGCCACAGAAGT-3’(SEQ ID NO.1)；
[0054] 下游引物为：5’-GCTTGACGACCCGAACGATCT-3’(SEQ ID NO.2)
[0055] (4)反转录：
[0056] 1)基因组DNA去除，加入4×gDNA wiper Mix 4uL，加入模板RNA 1uL，加入RNase free ddH2O至16uL。用移液器轻轻吹打混匀，42℃2min。
[0057] 2)配制逆转录反应体系，在1)反应管中直接加入5×No RT Control Mix 4uL，用移液器轻轻吹打混匀，50℃15min，85℃2min，完成逆转录。
[0058] (5)qRCR：配制如下混合液：2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10.0uL，Primer1(10uM)0.4uL，Primer2(10uM)0.4uL，50×ROX Rererence Dye2 0.4uL，cDNA 0.2uL，ddH2O 8.8uL。扩增程序为：预变性：95℃5min；循环反应：95℃10s,60℃30s,40个循环；融解曲线：95℃15s,60℃60s,95℃15s。结果如图4所示，黑果枸杞花青素处理后的乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG2凋亡基因LATS2表达量显著上调，分别为2.17和1.95倍，牛乳腺上皮细胞Mac-T和牛乳腺上皮细胞Mac-T凋亡基因LATS2表达下调，分别为0.56和0.82倍。
[0059] 本发明利用的四种细胞分别为乳腺癌细胞MCF-7、肝癌细胞HepG2、牛乳腺上皮细胞Mac-T和小鼠巨噬细胞RAW264.7，后两种细胞用于对黑果枸杞花青素的毒理学安全性验证。为此，课题组根据研究需要，进行流式细胞仪-细胞凋亡实验、EDU细胞增殖、GeminiSEM 300蔡司场发射扫描电镜和荧光定量PCR等多项实验，最终证明黑果枸杞花青素能够诱导人乳腺癌细胞MCF-7和肝癌细胞HepG2凋亡，并且对牛乳腺上皮细胞Mac-T和小鼠巨噬细胞RAW264.7未见明显的毒性作用。
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