一种联合抗人巨细胞病毒的药物及其成分浓度的测定方法
专利汇可以提供一种联合抗人巨细胞病毒的药物及其成分浓度的测定方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了本发明提供了一种联合抗HCMV的药物，每份该药物由藻酸双酯钠、更昔洛韦和 溶剂 组成，所述的藻酸双酯钠和更昔洛韦为冻干灭菌粉末；所述的溶剂为0.9％ 氯化钠 注射液或5％ 葡萄糖 注射液或5％葡萄糖氯化钠注射液或生理盐 水 或注射用水，使用时用所述的溶剂将藻酸双酯钠和更昔洛韦进行溶解并制成1mL的注射用液；注射用液中所述的藻酸双酯钠浓度为312.50μg/mL-1000.00μg/mL，所述的更昔洛韦为12.50μg/mL-63.00μg/mL。本发明要解决的问题是确定一种在用药范围内使用最低剂量，尽可能降低药物毒性的主要成分是藻酸双酯钠作为抗HCMV感染肝脏的海洋药物及其最大无毒浓度和最小有效浓度的测定方法。，下面是一种联合抗人巨细胞病毒的药物及其成分浓度的测定方法专利的具体信息内容。
1.一种联合抗HCMV的药物，每份该药物由藻酸双酯钠、更昔洛韦和溶剂组成，所述的藻酸双酯钠和更昔洛韦为冻干灭菌粉末；所述的溶剂为0.9％氯化钠注射液或5％葡萄糖注射液或5％葡萄糖氯化钠注射液或生理盐水或注射用水，使用时用所述的溶剂将藻酸双酯钠和更昔洛韦进行溶解并制成1mL的注射用液；其特征在于：注射用液中所述的藻酸双酯钠浓度为312.50μg/mL-1000.00μg/mL，所述的更昔洛韦为12.50μg/mL-63.00μg/mL。
2.根据权利要求1所述的联合抗HCMV的药物，其特征在于：每份注射用液中所述的藻酸双酯钠浓度为935.0μg/mL，所述的更昔洛韦浓度为44μg/mL；或所述的藻酸双酯钠浓度为
567.0μg/mL，所述的更昔洛韦浓度为63μg/mL。
3.根据权利要求1所述的联合抗HCMV的药物，其特征在于：每份注射用液中所述的藻酸双酯钠浓度为625.00μg/mL，所述的更昔洛韦浓度为50.00μg/mL。
4.根据权利要求1至3所述的联合抗HCMV的药物，其特征在于：临床应用时，可根据临床需要将注射用液中的藻酸双酯钠和更昔洛韦的浓度增加1-10倍，此时如若使用0.9％氯化钠注射液作为溶剂无法充分溶解药物时，换用注射用水溶解。
5.一种联合抗HCMV的药物的最大无毒浓度和最小有效浓度的测定方法，具体步骤如下：
步骤(1)细胞的复苏及培养，将-150℃冻存的人胚肺成纤维细胞HFL1在37℃水浴1min内迅速融化，1000rpm离心5min，吸弃上清液，加入含10％新生胎牛血清的F12K培养液1mL，将下层沉淀细胞吹打混匀，转移到培养瓶内，补加含10％新生胎牛血清的F12K培养液至
4mL，在37℃、5％CO2恒温培养箱培养；3d后长成单层，用0.5mL0.25％胰酶消化，按1∶3传代，细胞长成单层人胚肺成纤维细胞HFL1时用于试验。
步骤(2)HCMV-AD169毒株扩增，观察步骤1最后培养成的单层人成纤维胚肺细胞HFL1的形态，待细胞汇合至70％～80％时，更换培养液；用含2％新生胎牛血清的F12培养液饥饿细胞两小时；将液氮中冻存的HCMV-AD169毒株室温流水融化后，用移液枪取200μL接种于已经长成的所述的步骤1中的单层人胚肺成纤维细胞HFL1上，继续培养吸附2h，期间每隔15min便晃动一下培养瓶，以便病毒可以完全吸附到细胞中；2h后吸去培养液，PBS清洗两遍，并继续加入5mL含有2％新生胎牛血清的F12K培养液置37℃、5％CO2病毒培养箱中培养，同步设立细胞对照组，其中细胞对照组采用相同操作仅需将上述HCMV-AD169毒株换成等量的含有
2％新生胎牛血清的F12K培养液；每天观察细胞形态变化并拍照保存；待细胞在HCMV-AD169毒株作用下出现80％以上的病变时，取出，反复冻融3次，1000rpm离心20min，取上清液加入胎牛血清至20％浓度作为病毒原液，定量分装于1.5mLEP管中，胶布封口，放于-80℃冰箱冻存备用。
步骤(3)病毒的滴定，观察单层人胚肺成纤维细胞HFL1形态，待细胞汇合至70％-80％左右时，消化并重悬细胞，计数细胞后，向96孔板中接种细胞，每孔100μL含5000个细胞；待
96孔细胞铺成单层细胞时，约80％左右接种病毒；将所述的步骤2中最终得到的病毒原液进行梯度稀释，准备8个EP管，用含2％新生胎牛血清的F12K培养液将病毒原液以1:10作倍比稀释并充分混匀，各EP管病毒稀释最终浓度依次为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8
；将稀释后的病毒原液分别接种于96孔板，每孔0.1mL，同步设立对照组，对照组加等体积的含10％新生胎牛血清的F12K培养液，每孔0.1mL；将96孔板置于培养箱中继续培养2h；每隔30min轻混匀培养板；2h后吸去培养液，PBS清洗两遍，并改用含2％新生胎牛血清的F12K培养液培养该细胞，对照组只将含10％新生胎牛血清的F12K培养液换为含2％新生胎牛血清的F12K培养液；每天使用显微镜观察细胞形态变化并拍照保存；用Reed－Muench两氏法计算TCID50，即公式(1)、(2)，计算病毒的半数细胞感染量TCID50(50％tissue culture infective dose):
公式(1):pd＝(p1-50％)/(p1－p2)，
公式(2):TCID50＝Antilog(logC+pd×logCm)；
其中:pd＝细胞比距，p1＝高于50％病变百分数，p2＝低于50％病变百分数，C＝高于
50％病变率的稀释度，Cm＝倍比稀释系数。
步骤(4)RT-PCR检测病毒基因HCMV IE1，IE2，UL138mRNA确立HCMV感染成功，应用Trizol法提取被HCMV感染的人胚肺成纤维细胞HFL1总RNA，所提的RNA(2μl)用cDNA合成试剂盒和PCR仪进行RT反转录提取和PCR扩增，选用D2000 Maker做GAPDH参照孔，PCR扩增出的DNA为实验孔，用1.8％琼脂糖凝胶进行电泳，用Image J进行灰度值分析。
步骤(5)检测药物的最大无毒浓度，将人胚肺成纤维细胞HFL1接种96孔板,待细胞长成单层人胚肺成纤维细胞HFL1后,分别用含10％新生胎牛血清的F12K培养液将藻酸双酯钠按倍比稀释20000，10000，5000，2500，1250，625，312.5，156.25μg·mL-1共8个浓度；同样稀释-1
更昔洛韦3000，1500，750，375，187.5，93.75，46.875μg·mL 共8个浓度；每个浓度设4孔为实验孔，另设正常细胞对照2孔，培养72h，每天观察记录单层人胚肺成纤维细胞HFL1的形态变化和生长情况；分析藻酸双酯钠和更昔洛韦对单层人胚肺成纤维细胞HFL1的最大无毒浓度，即与正常对照比较,半数以上实验孔细胞无毒性的最大药物浓度(TC0)。
步骤5中分析藻酸双酯钠和更昔洛韦对单层人胚肺成纤维细胞HFL1的最大无毒浓度的方法可以为MTT法，培养72h后,每孔加入MTT溶液20μL,继续孵育4h,终止培养,倾去孔内液体,每孔加入100μL DMSO,振荡10min,使结晶充分溶解；选择490nm波长,用酶标仪检测各孔吸光度测出OD值计算细胞存活率，
细胞存活率(CSR％)＝实验孔OD值/对照孔OD值×100％，计算两种药物对HFL1细胞的半数中毒浓度TC50浓度，并推算出TC0(最大无毒浓度)
细胞存活率>50％的药物浓度即为最大无毒浓度(TC0)。
步骤(6)检测药物的最小有效浓度，将人胚肺成纤维细胞HFL1接种于96孔板中，待细胞长成单层人胚肺成纤维细胞HFL1后，根据病毒，细胞，药物之间的关系，设计3种给药方式，模式1:用100倍TCID50的所述的步骤2中的病毒原液攻击量接种细胞,病毒吸附2h后，换液加入药物；模式2：将藻酸双酯钠与更昔洛韦分别于细胞混合后，再用100倍TCID50的所述的步骤2中的病毒原液攻击量接种细胞；模式3：将100倍TCID50的所述的步骤2中的病毒原液分别加入两种药物中，放入37℃培养箱2h后加入细胞中；用含有2％新生胎牛血清的F12K培养液将更昔洛韦与藻酸双酯钠自TD0开始按10倍梯度稀释6个浓度，每个浓度设4个孔，另设正常细胞对照组和病毒对照组各4个孔，培养7-10天。
步骤6中的检测药物最小有效浓度的方法为MTT法，培养72h后,每孔加入MTT溶液20μL,继续孵育4h,终止培养,倾去孔内液体,每孔加入100μLDMSO,振荡混匀10min,使结晶充分溶解；按Reed-Muench法计算细胞病变抑制率，
病毒抑制率(％)＝(实验组平均OD值-病毒对照组OD值)/(正常细胞对照组平均OD值-病毒对照组平均OD值)×100％；
与病毒组对照比较，半数以上实验孔细胞病变抑制率>50％的药物浓度即为该药物对HCMV的半数抑制浓度(IC50),及其治疗指数TI(半数毒性浓度TC50/半数抑制浓度IC50)。
6.根据权利要求5所述的联合抗HCMV的药物的最大无毒浓度和最小有效浓度的测定方法，其特征在于：步骤5中分析藻酸双酯钠和更昔洛韦对人胚肺成纤维细胞HFL1的最大无毒浓度的方法也可以为细胞病变法(CPE)，每日观察记录细胞生长情况及形态变化，确定更昔洛韦与藻酸双酯钠对HepG2的最大无毒浓度(TD0)；判断标准：加药后，出现细胞皱缩、细胞间隙变大、胞质粗糙、不透明、部分细胞脱落，细胞内有较多颗粒等形态改变记录为(+)，表示细胞出现药物毒性反应；细胞形态正常记录为(-)，表示细胞无药物毒性反应；未出现细胞形态改变的最大药物浓度即为TD0。
一种联合抗人巨细胞病毒的药物及其成分浓度的测定方法
技术领域
背景技术
发明内容
1mL，将下层沉淀细胞吹打混匀，转移到培养瓶内，补加含10％新生胎牛血清的F12K培养液至4mL，在37℃、5％CO2恒温培养箱培养；3d后长成单层，用0.5mL0.25％胰酶消化，按1∶3传代，细胞长成单层人胚肺成纤维细胞HFL1时用于试验。
80℃冰箱冻存备用。
10-7、10-8；将稀释后的病毒原液分别接种于96孔板，每孔0.1mL，同步设立对照组，对照组加等体积的含10％新生胎牛血清的F12K培养液，每孔0.1mL；将96孔板置于培养箱中继续培养
2h；每隔30min轻混匀培养板；2h后吸去培养液，PBS清洗两遍，并改用含2％新生胎牛血清的F12K培养液培养该细胞，对照组只将含10％新生胎牛血清的F12K培养液换为含2％新生胎牛血清的F12K培养液；每天使用显微镜观察细胞形态变化并拍照保存；用Reed－Muench两氏法计算TCID50，即公式(1)、(2)，计算病毒的半数细胞感染量TCID50(50％tissue culture infective dose):
具体实施方式
5d；4是HCMV感染内皮细胞，7d。
1mL，将下层沉淀细胞吹打混匀，转移到培养瓶内，补加含10％新生胎牛血清的F12K培养液至4mL，在37℃、5％CO2恒温培养箱培养；3d后长成单层，用0.5mL0.25％胰酶消化，按1∶3传代，细胞长成单层人胚肺成纤维细胞HFL1时用于试验；人胚肺成纤维细胞HFL1正常生理状态照片如图1所示。
80℃冰箱冻存备用。
6、10-7、10-8；将稀释后的病毒原液分别接种于96孔板，每孔0.1mL，同步设立对照组，对照组加等体积的含10％新生胎牛血清的F12K培养液，每孔0.1mL；将96孔板置于培养箱中继续培养2h；每隔30min轻混匀培养板；2h后吸去培养液，PBS清洗两遍，并改用含2％新生胎牛血清的F12K培养液培养该细胞，对照组只将含10％新生胎牛血清的F12K培养液换为含2％新生胎牛血清的F12K培养液；每天使用显微镜观察细胞形态变化并拍照保存；用Reed－Muench两氏法计算TCID50，即公式(1)、(2)，计算病毒的半数细胞感染量TCID50(50％tissue culture infective dose):
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