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伤寒糖蛋白的生物制备方法及其应用

阅读：228发布：2020-05-16

专利汇可以提供伤寒糖蛋白的生物制备方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种伤寒糖蛋白的生物制备方法及其应用。本发明公开一种细菌多糖修饰的蛋白的制备方法，包括将脑膜炎奈瑟球菌O‑寡糖转移酶PglL的底物蛋白与脑膜炎奈瑟球菌O‑寡糖转移酶PglL在O‑ 抗原连接酶基因缺陷的细菌中共表达，得到细菌多糖修饰的蛋白。本发明在提高疫苗的均一性，提高疫苗的生产效率，降低成本，具有广泛的应用前景，可用于预防伤寒病原菌引起的疾病。，下面是伤寒糖蛋白的生物制备方法及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种细菌多糖修饰的蛋白的制备方法，包括将脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的底物蛋白与脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL在O-抗原连接酶基因缺陷的细菌中共表达，得到细菌多糖修饰的蛋白；
所述底物蛋白为重组融合蛋白或脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE；
所述重组融合蛋白含有N端信号肽、具有脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的糖基化位点的肽段和载体蛋白；
所述载体蛋白为细菌毒素蛋白的无毒突变体或细菌毒素蛋白的部分片段；
所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的糖基化位点为脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的自N端起第63位的丝氨酸；
所述具有脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的糖基化位点的肽段为含有脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的自N端起第 63位丝氨酸的脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的肽段，具体为SEQ ID No.15中第637位至第665位氨基酸所示的肽段；
所述O-抗原连接酶基因缺陷的细菌为O-抗原连接酶基因缺陷的伤寒沙门氏菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细菌毒素蛋白的无毒突变体为绿脓杆菌外毒素蛋白A无毒突变体；
所述细菌毒素蛋白的部分片段为霍乱毒素B亚单位或破伤风毒素C蛋白；
所述绿脓杆菌外毒素蛋白A无毒突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.15中第20位至第
631位所示；
所述霍乱毒素B亚单位的氨基酸序列如SEQ ID No.18中自N端起第20位至第122位所示；
所述破伤风毒素C蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.19中自N端起第20位至第455位所示；
所述信号肽为DsbA、PelB、DsbA、STⅡ、OmpA、PhoA、LamB、SpA或Enx信号肽；
所述DsbA信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.15中第1位至第19位所示；
所述PelB信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.20所示。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.15所示。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述重组融合蛋白是通过重组表达载体1导入所述细菌中进行表达的，所述重组表达载体1是将所述重组融合蛋白的编码基因替换pMMB66EH的多克隆位点间序列，pMMB66EH的其余序列保持不变得到的；
所述脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE是通过重组表达载体2导入所述细菌中进行表达的，所述重组表达载体2是将所述脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的编码基因替换pMMB66EH的多克隆位点间序列，pMMB66EH的其余序列保持不变得到的；
所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL是通过重组表达载体3导入所述细菌中进行表达的，所述重组表达载体3的序列如SEQ ID No.12所示。
5.由权利要求1-4任一所述的方法制备得到的细菌多糖修饰的蛋白。
6.一种制备重组菌的方法，包括如下步骤：将脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL底物蛋白的表达载体、脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的表达载体导入O-抗原连接酶基因缺陷的细菌中，得到所述重组菌；
所述底物蛋白为重组融合蛋白或脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE；
所述重组融合蛋白含有N端信号肽、具有脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的糖基化位点的肽段和载体蛋白；
所述载体蛋白为细菌毒素蛋白的无毒突变体或细菌毒素蛋白的部分片段；
所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的糖基化位点为脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的自N端起第63位的丝氨酸；
所述具有脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的糖基化位点的肽段为含有脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的自N端起第 63位丝氨酸的脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的肽段，具体为SEQ ID No.15中第637位至第665位氨基酸所示的肽段。
7.由权利要求6所述的方法制备得到的重组菌。
8.权利要求5所述的细菌多糖修饰的蛋白或权利要求7所述的重组菌在制备能引起动物体内产生抗O-多糖的特异性抗体的产品中的应用。
9.权利要求5所述的细菌多糖修饰的蛋白或权利要求7所述的重组菌在制备预防和/或治疗细菌引起的疾病的产品中的应用。

说明书全文

伤寒糖蛋白的生物制备方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种伤寒糖蛋白的生物制备方法及其应用，属于生物医药领域。

背景技术

[0002] 沙门氏菌(Salmonella spp.)是一种具有高度传染性的革兰氏阴性肠道致病菌，具有较强的内毒素及侵袭力，属胞内寄生菌，可通过侵袭小肠粘膜致病，引起肠热症、胃肠炎以及败血症等，严重者可导致肠出血或穿孔。沙门氏菌通过两个Ⅲ型分泌系统介导细菌最初的对肠黏膜的侵入和随后的全身性疾病。

[0003] 对于沙门氏菌大多数血清型，半数感染量在105-108之间，但在暴发流行时，感染量3
一般都低于10 个菌体，有时甚至少于100个细菌。2012年我国卫生部公布的全年法定报告传染病疫情中，肠道传染病中的伤寒及副伤寒发病率有所上升，这是除霍乱外发病率唯一上升的肠道传染病。目前治疗伤寒及副伤寒的主要方式是抗生素，但随着耐药性尤其是多重耐药性的出现，常规的抗生素治疗遇到了巨大的挑战。在免疫预防方面，初期接种减毒或灭活菌疫苗，效果低且副反应大，而之后出现的伤寒Vi多糖疫苗属于非T细胞依赖抗原，对婴幼儿无法产生免疫保护，且对于较大年龄儿童及成年人保护持续时间较短，多糖-蛋白结合疫苗属于T细胞依赖抗原，能产生免疫效果的同时也恰好弥补了多糖疫苗对婴幼儿无法保护的缺陷。多糖-蛋白结合疫苗现多采用化学法制备，制备过程大规模培养病原菌的疫苗株存在一定安全风险，化学方法提取的多糖纯度较低、质控困难，多糖与载体蛋白的随机交联导致产物均一性差，纯化和质量控制困难且生产过程步骤多，得率低，成本高。因此，利用生物法开发针对细菌的多糖结合疫苗引起了人们的研究兴趣。

[0004] 近些年来，随着测序技术和生物信息学的发展，在多种细菌中发现了天然的蛋白质糖基化修饰系统，如空肠弯曲弧菌的N-糖基化修饰系统、奈瑟球菌和绿脓杆菌的O-糖基化修饰系统，这些糖基化修饰系统中，多糖的合成途径与细菌的脂多糖和荚膜多糖的合成途径十分相似，多糖结构取决于糖基合成基因簇，而其寡糖转移酶对其转移的多糖专一性较低。其中空肠弯曲弧菌N-糖基化修饰系统中的寡糖转移酶PglB对多糖底物的要求为多糖还原末端第一位糖基的C2位必须有乙酰氨基，且第二位糖基不能以β(1-4)糖苷键与其连接。而脑膜炎奈瑟球菌O-糖基化修饰系统中的寡糖转移酶PglL对多糖底物无类似的要求，PglL能将还原末端第一位糖基C2位无乙酰氨基的多糖转移至蛋白的糖基化位点上，因此具有更广泛的应用前景。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种伤寒糖蛋白的生物制备方法及其应用。

[0006] 本发明提供一种细菌多糖修饰的蛋白的制备方法，包括将脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的底物蛋白与脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL在O-抗原连接酶基因缺陷的细菌中共表达，得到细菌多糖修饰的蛋白；

[0007] 所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL将所述O-抗原连接酶基因缺陷的细菌自身合成的多糖连接到所述底物蛋白上，得到所述细菌多糖修饰的蛋白；

[0008] 所述底物蛋白含有脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的糖基化位点，具体含有脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的自N端起第63位的丝氨酸；

[0009] 所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的氨基酸序列如SEQ ID No.13所示；

[0010] 所述O-抗原连接酶基因缺陷使得O-多糖不能连接到类脂A-核心寡糖上，从而不能形成脂多糖；

[0011] 所述O-抗原连接酶基因缺陷的细菌可以是O-抗原连接酶基因天然缺陷的细菌，也可以是将细菌的O-抗原连接酶基因敲除后得到的O-抗原连接酶基因缺陷的细菌。

[0012] 上述方法中，所述底物蛋白为重组融合蛋白或脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE；

[0013] 所述重组融合蛋白含有N端信号肽、具有脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的糖基化位点的肽段和载体蛋白；

[0014] 所述载体蛋白为细菌毒素蛋白的无毒突变体或细菌毒素蛋白的部分片段；

[0015] 所述脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的氨基酸序列如SEQ ID No.17所示；

[0016] 所述信号肽可以是PelB、DsbA、STⅡ、OmpA、PhoA、LamB、SpA、Enx等信号肽。

[0017] 上述方法中，所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的糖基化位点为脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的自N端起第63位的丝氨酸；

[0018] 所述具有脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的糖基化位点的肽段为含有脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的自N端起第63位丝氨酸的脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的肽段，具体为SEQ ID No.15中第637位至第665位氨基酸所示的肽段。

[0019] 上述任一所述的方法中，所述细菌毒素蛋白的无毒突变体为绿脓杆菌外毒素蛋白A无毒突变体；

[0020] 所述细菌毒素蛋白的部分片段为霍乱毒素B亚单位或破伤风毒素C蛋白；

[0021] 所述绿脓杆菌外毒素蛋白A无毒突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.15中第20位至第631位所示；

[0022] 所述霍乱毒素B亚单位的氨基酸序列如SEQ ID No.18中自N端起第20位至第122位所示；

[0023] 所述破伤风毒素C蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.19中自N端起第20位至第455位所示；

[0024] 所述信号肽为DsbA、PelB、DsbA、STⅡ、OmpA、PhoA、LamB、SpA或Enx信号肽；

[0025] 所述DsbA信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.15中第1位至第19位所示；

[0026] 所述PelB信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.20所示。

[0027] 上述任一所述的方法中，所述重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.15所示。

[0028] 上述任一所述的方法中，所述重组融合蛋白是通过重组表达载体1导入所述细菌中进行表达的，所述重组表达载体1是将所述重组融合蛋白的编码基因替换pMMB66EH的多克隆位点间序列，pMMB66EH的其余序列保持不变得到的；

[0029] 所述重组融合蛋白的编码基因序列具体如SEQ ID No.14所示；

[0030] 所述脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE是通过重组表达载体2导入所述细菌中进行表达的，所述重组表达载体2是将所述脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的编码基因替换pMMB66EH的多克隆位点间序列，pMMB66EH的其余序列保持不变得到的；

[0031] 所述脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的编码基因序列具体如SEQ ID No.16中第4位至第543位所示；

[0032] 所述重组表达载体2的序列具体如SEQ ID No.16所示；

[0033] 所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL是通过重组表达载体3导入所述细菌中进行表达的，所述重组表达载体3的序列如SEQ ID No.12所示；

[0034] 所述O-抗原连接酶基因缺陷的细菌为O-抗原连接酶基因缺陷的伤寒沙门氏菌。

[0035] 所述O-抗原连接酶基因为waaL基因；

[0036] 所述表达之后还有细菌裂解、离心收集上清、亲和层析、除盐和/或层析分离的步骤；

[0037] 所述层析分离为离子交换层析和/或凝胶过滤层析。

[0038] 由上述任一所述的方法制备得到的细菌多糖修饰的蛋白也属于本发明的保护范围。

[0039] 一种制备重组菌的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤：将脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL底物蛋白的表达载体、脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的表达载体导入O-抗原连接酶基因缺陷的细菌中，得到所述重组菌；

[0040] 所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL底物蛋白为上述任一所述的方法中所述的底物蛋白；

[0041] 所述O-抗原连接酶基因缺陷的细菌为上述任一所述的方法中所述的O-抗原连接酶基因缺陷的细菌；

[0042] 所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL底物蛋白的表达载体具体为如下(1)或(2)所示：

[0043] (1)将SEQ ID No.14所示的DNA分子替换pMMB66EH的多克隆位点间序列，pMMB66EH的其余序列保持不变得到的质粒；

[0044] (2)SEQ ID No.16所示的DNA分子；

[0045] 所述脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的表达载体的序列具体如SEQ ID No.12所示；

[0046] 所述重组菌可以产生上述细菌多糖修饰的蛋白。

[0047] 由所述的方法制备得到的重组菌也属于本发明的保护范围。

[0048] 上述任一所述的方法、上述细菌多糖修饰的蛋白或上述重组菌在制备能引起动物体内产生抗O-多糖的特异性抗体的产品中的应用也属于本发明的保护范围；

[0049] 或，

[0050] 上述任一所述的方法、上述细菌多糖修饰的蛋白或上述重组菌在制备预防和/或治疗细菌引起的疾病的产品中的应用也属于本发明的保护范围；

[0051] 所述产品具体为疫苗。

[0052] 所述细菌具体为伤寒沙门氏菌；

[0053] 所述疫苗具体还含有氢氧化铝佐剂。

[0054] 本发明在O-抗原连接酶基因缺陷的伤寒沙门氏菌中，共表达脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL、重组融合蛋白或脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE，获得了伤寒沙门氏菌O-多糖修饰的特定载体蛋白。用该O-多糖修饰的特定载体蛋白免疫小鼠，可获得抗伤寒沙门氏菌多糖的特异性抗体。用基因工程法制备这种细菌多糖修饰的特定载体蛋白用于伤寒多糖蛋白结合疫苗的制备，可以避免病原菌培养的诸多问题，提高疫苗的均一性，提高疫苗的生产效率，降低成本，具有广泛的应用前景，可用于预防伤寒病原菌引起的疾病。附图说明

[0055] 图1为敲除基因waaL的原理及流程示意图。

[0056] 图2为突变体检测引物位置示意图。

[0057] 图3为50096ΔwaaL基因缺失突变株PCR验证。

[0058] 图4为50096ΔwaaL和野生型菌株的银染图。

[0059] 图5为rEPA4573-OPSTyp50096的SDS-PAGE和western blot。

[0060] 图6为三次免疫后各组小鼠血清中抗伤寒O-多糖的IgG抗体滴度的测定。

[0061] 图7为pilE-OPS50096的SDS-PAGE和western blot。

具体实施方式

[0062] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0063] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0064] 伤寒沙门氏菌50096株(S.typhi CMCC50096)为中国医学细菌保藏管理中心产品，保藏编号为50096。

[0065] pKOBEG质粒在文献“A rapid method for efficient gene replacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans[J].Nucleic Acids Res.2000Nov15；28(22):E97”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得，该质粒为温度敏感型质粒，氯霉素抗性。

[0066] pCP20质粒在文献“Datsenko,K.A.and B.L.Wanner.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products[J].Proc.natl.Acad.Sci.U.S.A,2000,97(12):6640-6645”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得，该质粒为氯霉素抗性。

[0067] pMMB66EH为ATCC产品，编号为ATCC 37620。

[0068] G25层析填料为GE Healthcare产品。

[0069] ProteinPak DEAE8HR阳离子交换层析柱为Waters产品。

[0070] Superdex 75FPLC层析柱为GE Healthcare产品，产品目录号为17-1047-01。

[0071] Anti-His tag鼠单克隆抗体为Sigma产品，货号为A7058。

[0072] 雌性Balb/c小鼠为中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心产品。

[0073] 实施例1、一步生物交联法制备伤寒沙门氏菌O-多糖-重组EPA融合蛋白及其疫苗[0074] 一、O-抗原连接酶基因waaL缺陷的伤寒沙门氏菌的制备

[0075] (一)线性打靶DNA片段的制备

[0076] 1、PCR引物的设计

[0077] 依据NCBI上伤寒沙门氏菌全基因组序列(NC_004631.1)中所列O-抗原连接酶基因waaL(Genbank号为GI:29139723的第3925131-3926345位)及其上、下游序列，在waaL基因的上游(5’端)和下游(3’端)各设计一对引物，即96waaLu1/96waaLu2和96waaLd1/96waaLd2。为了方便操作，限制性酶切位点BamH Ⅰ和Sal Ⅰ将被添加到上游同源臂up的引物末端，限制性酶切位点HindⅢ和Xho Ⅰ被添加到下游同源臂down的引物末端。同时，为了验证突变体是否够构建成功，设计了基因组上waaL基因上下游同源臂以外的一对引物(96waaLw1/
96waaLw2)，内部检测引物(96waaLn1/96waaLn2)以及kan基因引物(Kan1/Kan2)进行PCR验证，同时进行测序验证。

[0078] 上述各引物如表1所示。

[0079] 表1引物列表

[0080]

[0081] 表1中的下划线所示的序列为酶切识别位点。

[0082] 2、线性打靶DNA片段的构建

[0083] (1)以伤寒沙门氏菌50096株(S.typhi CMCC50096)的基因组DNA为模板，分别以96waaLu1和96waaLu2、96waaLd1和96waaLd2为引物进行PCR扩增，PCR扩增产物分别为waaL基因的上游同源臂up和下游同源臂down。

[0084] (2)pETKan的构建

[0085] 将卡那霉素抗性基因(SEQ ID No.11中自5’末端起第479-1975位核苷酸)插入pET-22b质粒(为Novagen公司产品，产品目录号为69744)的Sal Ⅰ和Hind Ⅲ酶切识别位点间，pET-22b质粒其余序列保持不变，得到重组质粒pETKan。将pETKan送测序，结果正确，该质粒具有卡那霉素抗性。

[0086] (3)BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切上游同源臂up，得到基因片段1；BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切质粒pETKan，得到载体大片段1；将基因片段1与载体大片段1连接，得到中间载体1；

[0087] HindⅢ和Xho Ⅰ双酶切下游同源臂down,得到基因片段2；Hind Ⅲ和Xho Ⅰ双酶切中间载体1，得到载体大片段2；将基因片段2与载体大片段2连接，得到中间载体2。

[0088] (4)用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切中间载体2，得到目的打靶片段，如SEQ ID No.11所示。该打靶片段两侧为同源臂，中间含kan基因。

[0089] SEQ ID No.11中自5’末端起第7-472位核苷酸为up片段，第479-1975位核苷酸为kan基因，自5’末端第1982-2385位核苷酸为down片段。

[0090] (5)以SEQ ID No.11所示的DNA分子为模板，以96waaLu1和96waaLd2为引物，进行PCR扩增，即可获得浓度高达300ng/μL的线性打靶DNA片段。

[0091] (二)50096/pKOBEG菌株的构建

[0092] pKOBEG质粒含有编码λ-Red重组系统所需各种酶，将pKOBEG质粒电击转化至伤寒沙门氏菌50096株(S.typhi CMCC50096)感受态细胞中，涂于氯霉素抗性(pKOBEG质粒的抗性，氯霉素)的LB平板上，30℃培养过夜，得到的阳性克隆，将其命名为50096/pKOBEG菌株。

[0093] (三)线性打靶DNA片段电击转化50096/pKOBEG

[0094] 1、将上述得到的50096/pKOBEG于30℃培养过夜，以体积比1:100传代于低盐LB液体培养基(低盐LB液体培养基(500mL)配方：5g蛋白胨，2.5g 酵母粉，2.5g NaCl，余量为水，pH 7.0)，继续培养。

[0095] 2、在OD600值达到0.6前1h加入L-阿拉伯糖诱导Red重组系统的表达，L-阿拉伯糖终浓度为1mmol/L，待OD600值为0.6时，制备50096/pKOBEG感受态细胞。

[0096] 3、取步骤(二)制备的300ng/μL的线性打靶DNA片段5μL，电击转化至分装待用的50096/pKOBEG感受态细胞中。

[0097] 4、快速加入提前预冷的1mL低盐LB培养基，30℃复苏2.5h左右，然后涂布于含有50ug/mL卡那霉素的LB平板，放于30℃培养箱培养过夜。

[0098] 5、筛选出的阳性克隆即为带有卡那霉素抗性的waaL缺失突变株。

[0099] 6、将阳性克隆接种于液体LB培养基(有卡那霉素抗性，浓度为50μg/mL)中，42℃培养传代两次(每次培养12h时间)，即可除去pKOBEG质粒，最终获得含卡那霉素抗性的缺失O-抗原连接酶(waaL)基因的伤寒沙门氏菌50096株，将其命名为50096ΔwaaL::kan。

[0100] (四)卡那霉素抗性基因的去除

[0101] 1、将50096ΔwaaL::kan在30℃培养至OD600值达到0.6，离心收集菌体，用高压灭菌过的10％甘油洗涤四次，最后用400μL的10％的灭菌甘油重悬细菌，获得电击转化用50096ΔwaaL::kan感受态细胞。

[0102] 2、将编码FRT位点特异性重组酶的质粒pCP20电击转入50096ΔwaaL::kan感受态细胞中，在含氯霉素及不含卡那霉素的LB平板上30℃培养，筛选CmrKms的阳性克隆。

[0103] 3、将筛选到的阳性克隆转入液体LB中42℃培养12小时，即可获得不含卡那霉素和质粒pCP20的目的基因缺失突变株，将其命名为50096ΔwaaL，即为O-抗原连接酶基因waaL缺陷的伤寒沙门氏菌。

[0104] 由于WaaL的功能是将O-多糖(OPS)连接到类脂A-核心寡糖上形成脂多糖(LPS)，敲除了O-抗原连接酶基因waaL后，宿主菌表达的无论是自身多糖还是异源多糖均不能被宿主LPS合成途径利用，因此O-抗原连接酶基因缺陷使得O-多糖不能连接到类脂A-核心寡糖上，从而不能形成脂多糖，因此50096ΔwaaL也为脂多糖合成缺陷的伤寒沙门氏菌。

[0105] 敲除基因waaL的原理及流程如图1所示。

[0106] 二、脂多糖合成缺陷的伤寒沙门氏菌的分子与表型鉴定

[0107] (一)分子鉴定

[0108] 分别以伤寒沙门氏菌50096株、50096ΔwaaL的基因组DNA为模板，分别以一对内部引物(96waaLn1/96waaLn2)，一对外部引物(96waaLw1/96waaLw2)和kan引物(Kan1/Kan2)进行PCR验证。

[0109] 96waaLw1/96waaLw2和kan1/kan2的位置示意图如图2。

[0110] PCR验证结果如图3所示。

[0111] 图3中，1为以内部引物SEQ ID No.7和SEQ ID No.8为引物的PCR扩增结果；2为以外部引物SEQ ID No.5和SEQ ID No.6为引物的PCR扩增结果；3为以kan引物SEQ ID No.9和SEQ ID No.10为引物的PCR扩增结果。

[0112] 图3表明，在50096ΔwaaL中，以内部引物(96waaLn1/96waaLn2)为引物不能扩增出waaL内部目的片段，而野生株伤寒沙门氏菌50096中可扩增出内部目的片段；由于敲除了waaL基因，以外部引物(96waaLw1/96waaLw2)为引物，在50096ΔwaaL中扩增得到的目的条带比在野生株伤寒沙门氏菌50096中扩增得到的目的条带小；并且由于最终去除了Kan抗性基因，在50096ΔwaaL中没有kan目的条带。

[0113] 上述结果证明50096ΔwaaL为waaL基因缺失、无抗生素基因的伤寒沙门氏菌50096突变株。

[0114] (二)表型鉴定

[0115] 取1mL50096ΔwaaL的过夜培养物，离心收集菌体，用PBS洗一次，加入100μL裂解缓冲液(10％SDS 2mL，2-巯基乙醇0.4mL，100％甘油1mL，2M Tris-HCL pH6.85mL，10％溴酚蓝20μL，ddH2O 1.6mL)充分混匀，沸水煮10分钟，加4μL20mg/mL的蛋白酶K，60℃反应1至2小时，取15μL上样，进行SDS-PAGE，分离胶为15％，浓缩胶为4％，待溴酚蓝出胶后30分钟终止电泳。将上述的聚丙烯酰胺凝胶先于固定液中作用30分钟，然后置于增敏液作用30分钟，用去离子水洗3次，每次15分钟，再于硝酸银溶液作用20分钟，用去离子水洗2次，每次1分钟，接下来置于显影液进行显色，最后终止反应，用去离子水洗。同时以野生株伤寒沙门氏菌
50096为对照，进行上述实验。

[0116] 结果如图4所示。

[0117] 图4表明，野生株伤寒沙门氏菌50096有ladder形式的条带，而50096ΔwaaL因敲除了O-抗原连接酶基因waaL，WaaL蛋白的功能是将O-多糖(OPS)连接到类脂A-核心寡糖上形成LPS，所以没有ladder形式的条带。

[0118] 三、一步生物交联法制备伤寒沙门氏菌O-多糖-重组EPA融合蛋白结合物[0119] (一)糖基工程伤寒沙门氏菌的构建

[0120] 先后将载体pMMB66EH-rEPA4573和pETtac28-pglL电击转化宿主菌50096ΔwaaL，涂布含有终浓度为50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素的双抗LB平板，长出的阳性克隆即伤寒糖基化工程菌，将其命名为50096ΔwaaL/pMMB66EH-rEPA4573/pETtac28-pglL。

[0121] 其中pETtac28-pglL的序列如SEQ ID No.12所示。SEQ ID No.12中自5’末端起第180位至第1994位为脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的编码基因序列。脑膜炎奈瑟球菌O-寡糖转移酶PglL的蛋白序列如SEQ ID No.13所示。

[0122] 其中pMMB66EH-rEPA4573的构建方法如下：

[0123] 根据脑膜炎奈瑟球菌菌毛蛋白PilE的三级结构，通过截取包含PilE第63位丝氨酸(S63)在内的多肽，以绿脓杆菌外毒素蛋白A无毒突变体(rEPA)为载体蛋白，将多肽融合至rEPA的C端，得到重组蛋白rEPA4573。

[0124] rEPA4573的编码基因序列如SEQ ID No.14所示，其中自5’末端起第64位至第1899位为rEPA编码基因序列，1915至2001位为PilE的第45至73位氨基酸编码基因序列，第7位至第63位为DsbA信号肽编码基因序列。

[0125] rEPA4573蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.15所示，自N端起第20至第631位为rEPA氨基酸序列，第632至第636位为柔性linker，第637至第665位为PilE的第45至73位氨基酸，第666至第674位为柔性linker和his标签，第1位至第19位为DsbA信号肽序列。

[0126] 用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切SEQ ID No.14所示的DNA分子，得到基因片段；用EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切pMMB66EH，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pMMB66EH-rEPA4573，将重组质粒pMMB66EH-rEPA4573送测序，结果正确，表明pMMB66EH-rEPA4573是将pMMB66EH的EcoR Ⅰ和HindⅢ识别位点间的DNA序列替换为SEQ ID No.14所示的DNA分子，保持pMMB66EH其它序列不变得到的重组质粒。pMMB66EH-rEPA4573可表达SEQ ID No.15所示的rEPA4573蛋白。

[0127] (二)重组EPA融合蛋白的糖基化修饰与检测

[0128] 1、挑取糖基工程菌50096ΔwaaL/pMMB66EH-rEPA4573/pETtac28-pglL单克隆，接种于含有终浓度为100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃培养至OD600约为0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，并降温至16℃诱导20h。

[0129] 2、样品预处理

[0130] 取步骤1中16℃诱导20h的菌体10g，加入100mL纯水，超声破菌(超声3s暂停5s，累计超声时间30min)，用12000g的离心力离心，收集上清，向其中加入终浓度为20mM pH7.5Tris-HCl、0.2M NaCl、10mM咪唑，充分搅拌，再次用12000g的离心力离心，收集上清，此上清为含有被伤寒沙门氏菌OPS修饰的重组EPA融合蛋白(rEPA4573-OPSTyp50096)的粗提液。

[0131] 3、用Chelating亲和层析柱纯化样品用

[0132] Chelating亲和层析柱(GE Healthcare，产品目录号为17-5203-06)(Φ1.6cm*15cm)初步纯化样品。

[0133] 首先用0.5M的NaOH水溶液冲洗柱床至少3个柱床体积，然后用去离子水平衡至pH中性，然后用0.5M的NiSO4水溶液平衡至少3个柱床体积，再用B1液(含有0.5MNaCl、500mM咪唑的20mM pH7.5Tris-HCl)平衡至少一个柱床体积，最后用A1液(含有0.5M NaCl、10mM咪唑的20mM pH7.5Tris-HCl)平衡至少3个柱床体积，以上流速均为4mL/min。从A管道将步骤2得到的rEPA4573-OPSTyp50096的粗提液上样，再用A1液(含有0.5M NaCl、10mM咪唑的20mM pH7.5Tris-HCl)洗去未结合蛋白，冲洗至紫外吸收(280nM)接近于0mAU，最后用100％B1(含有0.5M NaCl、500mM咪唑的20mM pH7.5Tris-HCl)洗脱，收集洗脱液30mL，得到初步纯化的样品。

[0134] 4、样品除盐

[0135] 用G25fine层析柱(Φ1.6cm*30cm)将Chelating亲和层析柱初步纯化的样品除盐，流动相为A2液(20mM pH5.4HAc-NaAc)。首先用0.5M的NaOH水溶液冲洗柱床3个柱床体积，然后用去离子水平衡至pH中性，最后用A2液平衡3个柱床体积，从A管道上样，A2液(20mM pH5.4HAc-NaAc)洗脱，并收集样品60mL，以上流速均为4mL/min。

[0136] 5、用ProteinPak DEAE8HR阴离子交换层析柱进一步纯化rEPA4573-OPSTyp50096[0137] 将步骤4除盐后的样品用ProteinPak DEAE8HR阴离子交换层析柱(waters)进一步纯化。

[0138] 首先用0.5M的NaOH水溶液冲洗柱床至少3个柱床体积，然后用去离子水平衡至pH中性，然后用A3液(20mM pH7.5Tris-HCl)平衡至少3个柱床体积，将样品从A管道上样，用A3液洗去未结合糖蛋白，然后体积百分含量0～50％的B3液(A管道进A3液，B管道进B3液(含有1M NaCl的20mM pH7.5Tris-HCl，纯化仪自动混合)30min内线性洗脱，并收集洗脱液，以上流速均为1mL/min。糖蛋白rEPA4573-OPSTyp50096的出峰位置在电导为约8～18mS/cm处，得到蛋白rEPA4573-OPSTyp50096粗提液。

[0139] 6、用Superdex 75层析柱精纯化rEPA4573-OPSTyp50096

[0140] 将ProteinPak DEAE8HR阴离子交换层析柱纯化的样品用Superdex 75FPLC(Φ1cm*30cm，GE公司)进一步精纯化。

[0141] 首先用0.5M的NaOH水溶液冲洗柱床至少3个柱床体积，然后用去离子水平衡至pH中性，然后用A4液(含有0.9g/100ml NaCl的20mM pH7.5PB)平衡至少3个柱床体积，通过上样环上样步骤5得到的蛋白rEPA4573-OPSTyp50096粗提液1mL，用A4液(含有0.9g/100ml NaCl的20mM pH7.5PB)洗脱，收集8-11mL流出的样品，以上流速均为1mL/min。此样品即精纯化的rEPA4573-OPSTyp50096，即目的蛋白rEPA4573-OPSTyp50096。

[0142] 将样品用8％SDS-PAGE和western blot分析，同时以步骤2得到的粗提液做对照。

[0143] 结果如图5所示。

[0144] 图5中，从左至右第1泳道代表对照，第2泳道和第3泳道代表步骤6精纯化得到的目的蛋白rEPA4573-OPSTyp50096；His-WB代表用Anti-His tag鼠单克隆抗体的WB图。

[0145] 四、rEPA4573-OPSTyp50096多糖蛋白结合疫苗的的制备及动物实验评价[0146] (一)rEPA4573-OPSTyp50096多糖蛋白结合疫苗的制备

[0147] 将Superdex 75层析柱精纯化的rEPA4573-OPSTyp50096过滤除菌，按一定比例经生理盐水稀释后与氢氧化铝佐剂(Rehydragel LV，General Chemical)按15:1(v/v)的比例混合，得到rEPA4573-OPSTyp50096皮下注射样品。

[0148] (二)rEPA4573-OPSTyp50096的动物免疫及效果评价

[0149] 1、O抗原(OPSTyp50096)的制备

[0150] 先用热酚法提取伤寒沙门氏菌50096株的LPS(参考文献“孙洋,冯书章,祝令伟,等.肠出血性大肠杆菌O157LPS单克隆抗体的制备与鉴定[J].中国人兽共患病学报,2007,23(10):971-973.”)，-20℃保存。再用乙酸脱去脂质A制备OPS，取溶解后的LPS按终浓度1％(v/v)加入冰醋酸，沸水浴90分钟后冷却至室温，调节pH至7.0。经40000×g离心30min后收集上清，用去离子水彻底透析后，得到O抗原(OPSTyp50096)，过滤除菌，经生理盐水稀释后与氢氧化铝佐剂(Rehydragel LV，General Chemical)按照体积比15:1的比例混合，得到OPSTyp50096皮下注射样品。

[0151] 2、小鼠实验

[0152] 取30只6周龄大(体重相近)的雌性Balb/c小鼠，随机分为3组(每组10只)：氢氧化铝组、OPS组和rEPA4573-OPSTyp50096组，其中氢氧化铝组为阴性对照，每只小鼠注射含1/15(v/v)氢氧化铝佐剂的生理盐水(由氢氧化铝佐剂和生理盐水组成)90μl。OPS组每只小鼠分别注射由氢氧化铝佐剂1/15(v/v)、2.5μg的OPS Typ50096和生理盐水组成的O抗原·佐剂混合液90μl。rEPA4573-OPSTyp50096组每只小鼠分别注射由氢氧化铝佐剂1/15(v/v)、含糖量为2.5μg的Superdex 75层析柱精纯化的rEPA4573-OPSTyp50096和生理盐水组成的糖蛋白·佐剂混合液90μl。各组分别在第1、21、42天经背部皮下免疫，三免后14天尾静脉取血。

[0153] 用间接ELISA法测各组小鼠血清中抗伤寒沙门氏菌O-多糖的抗体滴度。用提取的伤寒沙门氏菌50096株LPS包被酶联板，每孔包被10μg的LPS，其他操作步骤参见精编分子生物学实验指南[M].科学出版社,2008.。

[0154] 结果如图6所示。

[0155] 图6中，A1组为氢氧化铝组；OPS代表OPS组；rEPA-OPS组代表rEPA4573-OPSTyp50096组。

[0156] 图6表明，与OPSTyp50096相比，rEPA4573-OPSTyp50096诱导小鼠产生抗伤寒沙门氏菌OPS(O-多糖)的特异性抗体能力有显著提高。

[0157] 实施例2、一步生物交联法制备伤寒沙门氏菌O-多糖-PilE蛋白

[0158] 一、O-抗原连接酶基因waaL缺陷的伤寒沙门氏菌的制备

[0159] 步骤同实施例1中的步骤一。

[0160] 二、脂多糖合成缺陷的伤寒沙门氏菌的分子与表型鉴定

[0161] 步骤同实施例1中的步骤二。

[0162] 三、一步生物交联法制备伤寒沙门氏菌O-多糖-PilE蛋白

[0163] (一)糖基工程伤寒沙门氏菌的构建

[0164] 先后将载体pMMB66EH-pilE和pETtac28-pglL电击转化宿主菌50096ΔwaaL，涂布含有终浓度为50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素的双抗LB平板，长出的克隆即伤寒糖基化工程菌50096ΔwaaL/pMMB66EH-pilE/pETtac28-pglL。

[0165] pMMB66EH-pilE的序列如SEQ ID No.16所示，其中自5’末端起第4位至第543位为PilE蛋白的编码基因序列。

[0166] PilE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.17所示。

[0167] (二)PilE蛋白在糖基工程伤寒沙门氏菌中的糖基化修饰与检测

[0168] 挑取糖基工程菌50096ΔwaaL/pMMB66EH-pi lE/pETtac28-pglL单克隆，接种于含有终浓度为100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃培养至OD600约为0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，并降温至16℃诱导20h。收集诱导20h后的菌，WB制样后用
12％SDS-PAGE和western blot分析。同时以不转pETtac28-pglL只转pMMB66EH-pilE得到的
50096ΔwaaL/pMMB66EH-pilE进行上述实验，作为对照。

[0169] 结果如图7所示。

[0170] 图7中，Anti-His代表用Anti-His tag鼠单克隆抗体的WB图。

[0171] 图7表明，糖基工程菌50096ΔwaaL/pMMB66EH-pilE/pETtac28-pglL能产生O-多糖修饰的pilE蛋白。

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