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一种球孢白僵菌油悬浮剂

阅读：962发布：2020-05-13

专利汇可以提供一种球孢白僵菌油悬浮剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种球孢白僵菌油悬浮剂，涉及微生物农药领域。该球孢白僵菌油悬浮剂，所述球孢白僵菌油悬浮剂是将球孢白僵菌孢子加入到表面活性剂和溶剂油的混合物中混合均匀后得到，孢子浓度为90‑110亿个/mL，所述球孢白僵菌油悬浮剂还含有5‑10g/L海藻糖、2‑8g/L的甘油和0.2‑1g/L的黄原胶。本发明球孢白僵菌油悬浮剂，显著提高了球孢白僵菌孢子的抗热能力，可用于球孢白僵菌制剂的制备、保藏及田间应用。，下面是一种球孢白僵菌油悬浮剂专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种球孢白僵菌油悬浮剂，其特征在于所述球孢白僵菌油悬浮剂是将球孢白僵菌孢子加入到表面活性剂和溶剂油的混合物中混合均匀后得到的，孢子浓度为90-110亿个/mL，所述球孢白僵菌油悬浮剂还含有5-10g/L海藻糖、2-8g/L的甘油和0.2-1g/L的黄原胶；所述球孢白僵菌为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)ZD-1株，保藏号为CGMCC NO：16500。
2.根据权利要求1所述球孢白僵菌油悬浮剂，其特征在于所述球孢白僵菌油悬浮剂还含有0.5-2g/L的二苯乙烯联苯二磺酸钠和0.5-2g/L的2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮。
3.根据权利要求2所述球孢白僵菌油悬浮剂，其特征在于所述表面活性剂为聚甘油蓖麻醇酯、脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、吐温中的一种或两种以上的混合物。
4.根据权利要求3所述球孢白僵菌油悬浮剂，其特征在于所述表面活性剂为聚甘油蓖麻醇酯。
5.根据权利要求4所述球孢白僵菌油悬浮剂，其特征在于所述溶剂油为大豆油、菜籽油、棉子油、棕榈油、芝麻油、玉米油和聚合亚麻油中的一种或两种以上的混合物。
6.根据权利要求5所述球孢白僵菌油悬浮剂，其特征在于所述溶剂油为聚合亚麻油。
7.根据权利要求6所述球孢白僵菌油悬浮剂，其特征在于表面活性剂和溶剂油的体积比为6：94。

说明书全文

一种球孢白僵菌油悬浮剂

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物农药领域，更具体地说是涉及一种球孢白僵菌油悬浮剂。

背景技术

[0002] 球孢白僵菌，属于子囊菌门、肉座菌目、虫草科、白僵菌属。球孢白僵菌是国内外广泛用于害虫生物防治的杀虫真菌之一，被认为是最具开发潜力的一种昆虫病原真菌。

[0003] 球孢白僵菌是广谱性杀虫真菌，国内外研究人员利用球孢白僵菌防治茶叶小绿叶蝉、玉米螟、松毛虫、小蔗螟、盲椿、谷象、柑桔红蜘蛛和蚜虫等农林害虫。特别是对茶叶小绿叶蝉、玉米螟、松毛虫的生物防治，在国内已作为常规手段连年使用。由于球孢白僵菌能有效地控制虫口数量，同时不伤害其他天敌昆虫和有益生物，完全符合有害生物综合治理的宗旨，同时由于其容易大量生产，防治成本较有竞争力，因而其具有广泛的应用前景。

[0004] 分生孢子(conidiospore)是真菌中常见的一类无性孢子，是生于细胞外的孢子，所以称为外生孢子。分生孢子着生于已分化的分生孢子梗(conidiophore) 或具有一定形状的小梗上，也有些真菌的分生孢子就着生在菌丝的顶端。

[0005] 球孢白僵菌孢子制剂在制备、保藏和使用过程中，都会受到热损伤，这会加速农药中有效成分的降解、减慢药效发挥、降低药效或造成防治效果不稳定。热来自制备过程中的干燥、保藏过程中的环境，使用(田间应用)过程中的阳光照射或寄主行为。因此，提高球孢白僵菌孢子的抗热性，对提高其杀虫率和生物防治效果至关重要。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种球孢白僵菌油悬浮剂，显著提高了球孢白僵菌孢子的抗热能力，可用于球孢白僵菌制剂的制备、保藏及田间应用。

[0007] 本发明的目的采用如下技术方案实现。

[0008] 一种球孢白僵菌油悬浮剂，所述球孢白僵菌油悬浮剂是将球孢白僵菌孢子加入到表面活性剂和溶剂油的混合物中混合均匀后得到的，孢子浓度为90-110亿个/mL，所述球孢白僵菌油悬浮剂还含有5-10g/L海藻糖、2-8g/L的甘油和0.2-1g/L 的黄原胶。

[0009] 在本发明中，所述球孢白僵菌油悬浮剂还含有0.5-2g/L的二苯乙烯联苯二磺酸钠和0.5-2g/L的2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮。

[0010] 在本发明中，所述球孢白僵菌为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)ZD-1株，保藏号为CGMCC NO：16500。

[0011] 在本发明中，所述表面活性剂为聚甘油蓖麻醇酯、脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、吐温中的一种或两种以上。

[0012] 优选的技术方案中，所述表面活性剂为聚甘油蓖麻醇酯。

[0013] 在本发明中，所述溶剂油为大豆油、菜籽油、棉子油、棕榈油、芝麻油、玉米油和聚合亚麻油中的一种或两种以上的混合物。

[0014] 优选的技术方案中，所述溶剂油为聚合亚麻油。

[0015] 在本发明中，表面活性剂和溶剂油的体积比为6：94。

[0016] 本发明提供的球孢白僵菌油悬浮剂，由于添加了海藻糖、甘油和黄原胶，显著提高了球孢白僵菌孢子的抗热能力。在球孢白僵菌油悬浮剂中添加二苯乙烯联苯二磺酸钠和2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮后，显著提高了球孢白僵菌孢子的抗紫外线能力，有利于在田间使用时防止紫外线对球孢白僵菌的损伤。本发明油悬浮剂降低了孢子在制剂制备、保藏、田间使用过程中高温和紫外线对球孢白僵菌的不利影响，有利于提高球孢白僵菌孢子的存活率、延长货架期、提高产品的田间使用效果。球孢白僵菌油悬浮剂可用于防治茶叶小绿叶蝉。

具体实施方式

[0017] 本发明中培养基使用的溶剂为水。气液比是指每分钟通气量(m3)与发酵液体积3 3 3
(m)之比。换气量是指每分钟通气量(m)与固体发酵培养基体积(m) 之比。

[0018] 实施例1球孢白僵菌ZD-1孢子粉的获得

[0019] 本实施例介绍了球孢白僵菌ZD-1孢子粉的获得。

[0020] 1.球孢白僵菌菌株的筛选及鉴定

[0021] (1)球孢白僵菌菌株的筛选

[0022] 以茶叶小绿叶蝉为试验对象，本实施例介绍了球孢白僵菌ZD-1株的筛选。

[0023] 供试菌株：XY-201805株、YN-201803株、ZD-1株、KM-4株、ZA-7-3株、 B3株、B822株、PE-55株、PE-23株。

[0024] 供试虫源：2018年4月上旬至4月下旬，于云南省农业科学研究院茶叶基地采集小绿叶蝉。将采回的小绿叶蝉置于广口瓶内，以带嫩叶和幼芽的新鲜茶树枝条室内饲养。

[0025] 将各供试菌株分别接种于萨氏培养基SDAY上(萨氏培养基SDAY配方： 4％葡萄糖、1％蛋白胨、1％酵母粉、2％琼脂)，在25±1℃条件下，培养8天，得到各菌株的孢子。用含有
0.05％Tween 80的无菌水洗下孢子，配制成1.0×107个/mL的孢子悬浮液，备用。

[0026] 选取个体大小一致的小绿叶蝉，考察上述各菌株的孢子悬浮液对小绿叶蝉的致病力。具体方法如下：将小绿叶蝉在孢子悬浮液中浸10s后取出，置于滤纸上吸去多余水分，转入人工饲养盒中。每种孢子悬浮液处理50头试虫，重复3 次。以浸含有0.05％Tween 80的无菌水作为对照，同样条件下正常饲养。饲养过程中，及时将死虫转入无菌培养皿内培养。分别在小绿叶蝉处理后第6天、第9 天、第12天统计死亡数，以虫尸上长出可见的菌丝或孢子粉为有效致死。具体结果见表1。

[0027] 表1不同球孢白僵菌菌株处理后小绿叶蝉的累计死亡率

[0028]

[0029] 由表1数据可知，各球孢白僵菌孢子对小绿叶蝉均有不同程度的致病力。但ZD-1株的杀虫效果最好，在第12天，其累计死亡率可达95.33％。

[0030] (2)鉴定

[0031] ZD-1株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上生长较慢，28℃黑暗条件下培养 14天，菌落直径为58～61mm，初期为白色，后逐渐变为浅黄色，绒状到絮状，具同心环纹及放射状纹路；菌落背面米色到浅黄褐色，无水溶性色素。

[0032] ZD-1株营养菌丝薄壁，透明、光滑，常见分枝，宽0.7～2.0μm，分生孢子梗直接着生在营养菌丝上，分生孢子簇生于分生孢子梗上，近球形到椭圆形，单孢、薄壁、透明、光滑，23.5～43.2×2.2～4.3μm。

[0033] ZD-1株rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示，通过序列比对，发现ZD-1 株为球孢白僵菌，命名为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)ZD-1株，缩写为球孢白僵菌ZD-1株。

[0034] 球孢白僵菌(Beauveria bassiana)ZD-1株，已经保藏。

[0035] 分类命名为：球孢白僵菌

[0036] Beauveria bassiana。

[0037] 参椐的生物材料(株)：ZD-1。

[0038] 保藏日期为2018年11月19日。

[0039] 保藏单位全称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称 CGMCC。

[0040] 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

[0041] 保藏编号为：CGMCC NO.16500。

[0042] 2.球孢白僵菌ZD-1株的培养

[0043] (1)球孢白僵菌ZD-1株孢子活化

[0044] 将球孢白僵菌ZD-1株斜面种子接种于萨氏培养基SDAY(4％葡萄糖、1％蛋白胨、1％酵母粉、2％琼脂)上，在25±1℃培养8天，得到活化后的球孢白僵菌ZD-1株孢子。

[0045] (2)制备球孢白僵菌ZD-1株一级种子液

[0046] 在250mL三角烧瓶中，液体萨氏培养基SDAY的装液量50mL，接入上述活化后的球孢白僵菌ZD-1株孢子，使孢子浓度为3×106个/mL。在25±1℃、150rpm 条件下，振荡培养36h后，得到孢子含量为30×108个/mL的一级种子液。

[0047] 其中液体萨氏培养基SDAY含有40g/L葡萄糖、10g/L蛋白胨和10g/L酵母粉。

[0048] (3)制备球孢白僵菌ZD-1株二级种子液

[0049] 在100L 发酵罐中，配制含有如下成分的培养基：淀粉10g/L、葡萄糖15g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉10g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、硫酸镁0.25g/L。溶剂为水。在121℃下灭菌30min，冷却至室温后，按照2.5％的接种量接种本实施例标题2中所得一级种子液，在25±1℃、
200rpm、气液比1:1的条件下培养36h，得到二级种子液，孢子含量为1.3×109个/mL。

[0050] (4)球孢白僵菌ZD-1株三级液体发酵培养

[0051] 将球孢白僵菌ZD-1株的二级种子液，按照接种量为1％(V/V)分别接入 3000L发酵罐中进行培养，得到三级种子液。发酵罐使用的培养基及培养条件分别如下。

[0052] 培养基含有如下成分：大米粉20g/L、葡萄糖10g/L、蔗糖5g/L，黄豆饼粉 5g/L、蚕蛹粉5g/L、酵母粉7.5g/L、磷酸二氢钾0.25g/L、硫酸镁0.2g/L、氯化钙0.3g/L、pH7.0。溶剂为水。

[0053] 培养条件：发酵罐搅拌转速150rpm，培养过程中通气量和温度控制如下： 0h～8h：气液比为0.5:1、温度28℃；8h～24h：气液比为0.8:1、温度25℃；24h～ 48h：气液比为1:1、温度25℃。培养44h，三级种子液的孢子含量达到885×108个/mL。

[0054] (5)固体发酵培养。

[0055] 固体培养基加水混合均匀后，高温高压灭菌，洁净室浅盘平铺，固体培养基厚7cm，冷却至室温。将球孢白僵菌ZD-1株的三级种子液，均匀接种到浅盘中进行进一步的发酵培养。

[0056] 培养基：按照质量份称取大米30份、玉米粉10份、葡萄糖1份、谷壳27 份、麦麸18份、蚕蛹粉8.5份、豆饼粉5.5份、水150份，混合均匀。

[0057] 培养条件：接种量为15％，接种后培养条件控制如下：0～2天：换气量为 0.3:1、温度27.5℃～28.5℃、湿度为65％；3～7天：换气量为0.5:1、温度24.5℃～ 25.5℃、湿度为60％；8～9天：换气量为0.5:1、温度28℃～29℃、湿度为45％。

[0058] 发酵时间为216h时，孢子含量达到1150×108个/g，孢子萌发率不低于90％。将发酵培养物干燥处理后，采用旋风分离集孢器进行孢子抽提，得到球孢白僵菌孢子粉。

[0059] 实施例2球孢白僵菌孢子的热保护剂

[0060] 1、抗热能力测定

[0061] 将实施例1制备的球孢白僵菌孢子粉，采用生理盐水配制成含量为5×108个 /mL的孢子悬浮液，作为对照。

[0062] 将对照按照如下方法分别进行处理，考察各物质对球孢白僵菌孢子抗热性能的影响。

[0063] 处理1：在5×108个/mL的孢子悬浮液中添加海藻糖，使海藻糖的终浓度为 8g/L。

[0064] 处理2：在5×108个/mL的孢子悬浮液中添加甘油，使甘油的终浓度为5g/L。

[0065] 处理3：在5×108个/mL的孢子悬浮液中添加黄原胶，使黄原胶的终浓度为 0.5g/L。

[0066] 处理4：在5×108个/mL的孢子悬浮液中添加海藻糖、甘油，使海藻糖的终浓度为8g/L、甘油的终浓度为5g/L。

[0067] 处理5：在5×108个/mL的孢子悬浮液中添加黄原胶、甘油，使黄原胶的终浓度为0.5g/L、甘油的终浓度为5g/L。

[0068] 处理6：在5×108个/mL的孢子悬浮液中添加黄原胶、海藻糖，使黄原胶的终浓度为0.5g/L、海藻糖的终浓度为8g/L。

[0069] 处理7：在5×108个/mL的孢子悬浮液中添加海藻糖、甘油、黄原胶，使海藻糖的终浓度为8g/L、甘油的终浓度为5g/L、黄原胶的终浓度为0.5g/L。

[0070] 从对照、处理1、处理2和处理3中分别取样，测定其孢子萌发率。将各样品采用萨氏培养基SDAY，在25±1℃培养24h后测定萌发率，当芽管长度不小于孢子直径时，该孢子视为已萌发。每个样品三次重复，其结果见如下表1。

[0071] 表1各样品的萌发率(％)

[0072] 对照处理1 处理2 处理3
重复1 93.4 92.5 93.3 92.6
重复2 94.1 93.1 92.9 93.5
重复3 93.8 92.8 93.7 92.1
平均萌发率 93.77 92.80 93.30 92.73

[0073] 表1的数据结果表明：海藻糖、甘油、黄原胶对球孢白僵菌孢子的萌发并没有明显的促进的作用。

[0074] 从对照、处理1-7中，分别取样5mL于无菌的试管中，将样品置于50℃恒温水浴锅中处理30min(同时震荡)后，立即取出，置于冰水混合物中冰浴冷却至室温；将冷却后的混合液转移到250mL三角瓶中，再加入45mL液体萨氏培养基SDAY，混匀后，在25±1℃培养24h后测定萌发率，结果如表2所示。

[0075] 表2水浴处理后样品的萌发率(％)

[0076] 对照处理1 处理2 处理3 处理4 处理5 处理6 处理7
重复1 3.5 23.5 24.5 26.8 36.8 38.8 39.5 79.5
重复2 3.7 22.9 25.2 27.3 36.2 38.2 39.1 79.8
重复3 4.2 23.1 24.8 27.1 37.5 37.9 38.8 80.3
平均萌发率 3.8 23.17 24.83 27.07 36.83 38.30 39.13 79.87 [0077] 表2的数据结果表明：处理7的萌发率为对照的21.02倍，海藻糖、甘油、黄原胶共同存在时，显著提高了热处理后孢子的萌发率，热保护作用明显。

[0078] (2)海藻糖、甘油和黄原胶浓度对球孢白僵菌孢子抗热能力的影响

[0079] 利用实施例1制备的球孢白僵菌孢子粉，采用生理盐水配制浓度为5×108个 /mL的孢子悬浮液。

[0080] 对照：5×108个/mL的孢子悬浮液。

[0081] 处理7：5×108个/mL的孢子悬浮液中添加海藻糖、甘油、黄原胶，使海藻糖终浓度为8g/L、甘油终浓度为5g/L、黄原胶终浓度为0.5g/L。

[0082] 处理8：5×108个/mL的孢子悬浮液中添加海藻糖、甘油、黄原胶，使海藻糖终浓度为5g/L、甘油终浓度为2g/L、黄原胶终浓度为0.2g/L。

[0083] 处理9：5×108个/mL的孢子悬浮液中添加海藻糖、甘油、黄原胶，使海藻糖终浓度为10g/L、甘油终浓度为8g/L、黄原胶终浓度为1g/L。

[0084] 将对照、处理7-9分别取样5mL于无菌的试管中，将样品置于50℃恒温水浴锅中，水浴30min(同时震荡)后，立即取出，置于冰水混合物中冰浴冷却至室温；将冷却后的混合液转移到250mL三角瓶中，再加入45mL液体萨氏培养基 SDAY，混匀后，在25±1℃培养24h后测定萌发率，结果如表3所示。

[0085] 表3水浴处理后的样品萌发率测定(％)

[0086] 对照处理7 处理8 处理9
重复1 3.6 78.3 70.4 72.4
重复2 3.5 78.2 69.8 71.9
重复3 4.0 77.8 69.1 72.2
平均萌发率 3.7 78.1 69.8 72.2

[0087] 表3的数据结果表明：海藻糖浓度为5-10g/L、甘油浓度为2-8g/L、黄原胶浓度为0.2-1g/L，显著提高了热处理后孢子的萌发率。处理7的保护效果最好，孢子萌发率为对照的21.11倍。

[0088] 实施例3球孢白僵菌孢子的抗紫外能力测定

[0089] (1)各物质对球孢白僵菌孢子抗紫外能力的影响

[0090] 将实施例1制备的球孢白僵菌孢子粉，采用生理盐水配制成浓度为5×108个/mL的孢子悬浮液。

[0091] 对照：5×108个/mL的孢子悬浮液。

[0092] 处理10：在5×108个/mL的孢子悬浮液中添加二苯乙烯联苯二磺酸钠(荧光增白剂)，使荧光增白剂终浓度为1g/L。

[0093] 处理11：在5×108个/mL的孢子悬浮液中添加2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮，使2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮终浓度为1g/L。

[0094] 处理12：在5×108个/mL的孢子悬浮液中添加二苯乙烯联苯二磺酸钠(荧光增白剂)和2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮，使二苯乙烯联苯二磺酸钠和2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮的终浓度皆为1g/L。

[0095] 从对照和处理10-12中取样，采用萨氏培养基SDAY，在25±1℃培养24h 后测定萌发率，每个样品重复三次，其结果如表4。

[0096] 表4各样品的萌发率(％)

[0097] 对照处理10 处理11 处理12重复1 93.5 92.9 94.2 93.6
重复2 93.8 93 93.7 93.1
重复3 93.1 92.1 94.5 92.8
平均萌发率 93.5 92.7 94.1 93.2

[0098] 表4的数据表明：二苯乙烯联苯二磺酸钠和2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮对球孢白僵菌孢子的萌发并没有明显的促进的作用。

[0099] 分别从对照、处理10-12中取10mL样品置于直径为9cm的无菌培养皿内，充分混匀备用。超净台内两端上方各有一紫外线灯(一体化TB超量光荧光灯， 15W，功率因素0.65，频率50～60Hz)。打开紫外线灯管5min，待其稳定后将装有上述样品的培养皿敞开至于超净台内，紫外灯下35cm处照射5min后，关紫外灯。将处理后的液体混匀，取5mL于250mL三角瓶中，再加入45mL液体萨氏培养基SDAY，混匀后，在25±1℃培养24h后测定萌发率，结果如表5所示。

[0100] 表5紫外光处理后各样品的萌发率(％)

[0101] 对照处理10 处理11 处理12重复1 2.1 45.6 46.4 65.4
重复2 2.7 44.8 46.1 64.9
重复3 2.3 45.1 45.9 65.1
平均萌发率 2.4 45.2 46.1 65.1

[0102] 表5中的数据结果表明：二苯乙烯联苯二磺酸钠、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮及其混合物对球孢白僵菌孢子具有紫外保护作用，处理12的萌发率为对照的27.13倍，紫外保护作用明显。

[0103] (2)二苯乙烯联苯二磺酸钠(荧光增白剂)和2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮浓度对球孢白僵菌孢子抗紫外能力的影响

[0104] 将实施例1制备的球孢白僵菌孢子粉，采用生理盐水制备成浓度为5×108个 /mL的孢子悬浮液。

[0105] 对照：5×108个/mL的孢子悬浮液。

[0106] 处理12：在5×108个/mL的孢子悬浮液中添加二苯乙烯联苯二磺酸钠(荧光增白剂)和2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮，使其终浓度皆为1g/L。

[0107] 处理13：5×108个/mL的孢子悬浮液中添加二苯乙烯联苯二磺酸钠(荧光增白剂)和2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮，使其终浓度皆为0.5g/L。

[0108] 处理14：5×108个/mL的孢子悬浮液中添加二苯乙烯联苯二磺酸钠(荧光增白剂)和2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮，使其终浓度皆为2g/L。

[0109] 分别从对照、处理12-14中取10mL样品置于直径为9cm的无菌培养皿内，充分混匀。超净台内两端上方各有一紫外线灯(一体化TB超量光荧光灯，15W，功率因素0.65，频率50～60Hz)。打开紫外线灯管5min，待其稳定后将装有上述样品的培养皿敞开至于超净台内，紫外灯下35cm处照射5min后，关紫外灯。

[0110] 将处理后的液体混匀，取5mL于250mL三角瓶中，再加入45mL液体萨氏培养基SDAY，混匀后，在25±1℃培养24h后测定萌发率，结果如表6所示。

[0111] 表6紫外光处理后各样品的萌发率(％)

[0112] 对照处理12 处理13 处理14重复1 3.1 65.9 58.7 64.8
重复2 2.7 65.2 58.1 64.2
重复3 2.5 66 57.9 63.8
平均萌发率 2.8 65.7 58.2 64.3

[0113] 表6的数据结果表明：改变二苯乙烯联苯二磺酸钠(荧光增白剂)和2-羟基 -4-甲氧基二苯甲酮的浓度，均对球孢白僵菌孢子具有紫外保护作用。处理12的紫外保护作用更为明显，孢子萌发率为对照的23.46倍。

[0114] 实施例4球孢白僵菌油悬浮剂抗热、抗紫外能力测定

[0115] (1)恒温水浴和紫外灯照射下的抗热和抗紫外能力测定

[0116] 设置如下几个样品及处理：

[0117] 对照药剂：将实施例1制备的球孢白僵菌孢子粉，直接加入聚甘油蓖麻醇酯(表面活性剂)和聚合亚麻油(溶剂油)的混合物中，混合均匀后得到球孢白僵菌油悬浮剂，孢子浓度为100亿个/mL。其中聚甘油蓖麻醇酯和聚合亚麻油的体积比为6：94。

[0118] 处理药剂：将聚甘油蓖麻醇酯和聚合亚麻油按照体积比为6：94混合均匀，添加终浓度为100亿个/mL的孢子，同时添加以下保护剂：海藻糖8g/L、甘油 5g/L、黄原胶0.5g/L、二苯乙烯联苯二磺酸钠(荧光增白剂)1g/L、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮1g/L，此处的浓度均为终浓度。

[0119] 分别对对照药剂和处理药剂进行热处理、紫外线处理以及热处理后再紫外线处理，检测处理后样品的萌发率。

[0120] 热处理及萌发率测定：从各样品中分别取样5mL置于无菌的试管中，将样品置于50℃恒温水浴锅中，水浴30min(同时震荡)后，立即取出，置于冰水混合物中冰浴冷却至室温；将冷却后的混合液转移到250mL三角瓶中，再加入45mL 液体萨氏培养基SDAY，混匀后，在25±1℃培养24h后测定萌发率。

[0121] 紫外线处理及萌发率测定：从各样品中分别取样品10mL置于直径为9cm的无菌培养皿内，充分混匀。紫外灯照射5min后关紫外灯。将处理后的液体混匀，取5mL于250mL三角瓶中，再加入45mL液体萨氏培养基SDAY，混匀后，在 25±1℃培养24h后测定萌发率。

[0122] 热处理后再紫外处理及萌发率测定：从各样品中分别取样10mL置于无菌的试管中，将样品置于50℃恒温水浴锅中，水浴30min(同时震荡)后，立即取出，置于冰水混合物中冰浴冷却至室温；将冷却后的混合液转移置于直径为9cm的无菌培养皿内，充分混匀。紫外灯照射5min后关紫外灯。将处理后的液体混匀，取5mL于250mL三角瓶中，再加入45mL液体萨氏培养基SDAY，混匀后，在 25±1℃培养24h后测定萌发率。

[0123] 具体结果见表7。

[0124] 表7不同药剂不同处理下的萌发率

[0125]

[0126]

[0127] 由表7数据可知，单独热处理时，添加了保护剂的处理药剂孢子萌发率是对照药剂的24.19倍；单紫外线处理时，添加了保护剂的处理药剂孢子萌发率为对照药剂的23.54倍；热处理后再紫外线处理，添加了保护剂的处理药剂孢子萌发率为对照药剂的32.84倍。由此可知，添加了海藻糖、甘油、黄原胶、二苯乙烯联苯二磺酸钠和2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮显著提高了孢子的抗热和抗紫外能力。

[0128] (2)室温下保藏一年的孢子悬浮液抗热和抗紫外能力测定

[0129] 设置如下2个样品及处理：

[0130] 对照药剂：将聚甘油蓖麻醇酯和聚合亚麻油按照体积比为6：94混合均匀，添加终浓度为100亿个/mL的球孢白僵菌孢子。

[0131] 处理药剂：将聚甘油蓖麻醇酯和聚合亚麻油按照体积比为6：94混合均匀，添加终浓度为100亿个/mL的球孢白僵菌孢子，同时添加以下保护剂：海藻糖 8g/L、甘油5g/L、黄原胶0.5g/L、二苯乙烯联苯二磺酸钠1g/L、2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮1g/L，此处的浓度均为终浓度。

[0132] 对照药剂和处理药剂在干燥环境中，室温放置(窗户朝南，无窗帘遮阳)1 年，分别于放置开始时(起始样品)，放置3个月、6个月、12个月取样测定其孢子萌发率。结果见表8。

[0133] 表8室温保藏一年期间各样品的萌发率

[0134]

[0135]

[0136] 注：表8中“对照”为对照药剂，“处理”为处理药剂。

[0137] 由表8数据可知，100亿个/mL的球孢白僵菌油悬浮剂，室温放置一年时间，添加了保护剂的处理药剂孢子萌发率是对照药剂的2.03倍，由此可见，添加了海藻糖、甘油、黄原胶、二苯乙烯联苯二磺酸钠和2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮显著提高了球孢白僵菌孢子的抗热和抗紫外能力。

[0138] 实施例5球孢白僵菌油悬浮剂在田间对茶叶小绿叶蝉的防治

[0139] 在田间考察了球孢白僵菌油悬浮剂对茶叶小绿叶蝉的防治效果。试验地点：云南省农科院茶叶研究所茶园试验地。该园单行种植，种植密度3500株/亩。

[0140] 试验处理设计：空白对照；对照1是本发明实施例4中制备的对照药剂(无抗热和抗紫外线保护剂添加)；对照2是本发明实施例4中制备的处理药剂(添加有抗热和抗紫外线保护剂)。

[0141] 使用量：设置3个处理(空白对照、对照1和对照2)，每个处理3次重复，共9个小区，每小区20平方米左右，随机区组安排，各小区四周的茶树为保护行。于2018年6月5日施药一次，对照1和对照2的施用量均为100mL/亩，空白对照中以清水替代药剂。

[0142] 施药方式：手动喷雾器均匀喷雾，用药主要部位为茶树蓬面及两侧叶的正反面，使药液充分接触小绿叶蝉虫体。

[0143] 试验进行3次调查，分别为药后1天、7天、14天，每小区调查100片芽叶，记载茶叶小绿叶蝉的存活数。调查结果见下表9。

[0144] 表9茶叶小绿叶蝉田间药效试验结果

[0145]

[0146] 由表9可知，无论是否添加保护剂，球孢白僵菌油悬浮剂在田间对茶叶小绿叶蝉具有明显的防治效果。添加了保护剂的处理药剂的防治效果，明显高于没有添加保护剂的对照药剂。

[0147] 100亿个孢子/mL的球孢白僵菌油悬浮剂是一种安全、无毒、无残留的新型微生物农药。抗热和抗紫外保护剂的添加，可以明显提高球孢白僵菌的抗热性和抗紫外性，降低了孢子在制剂制备、保藏、田间使用过程中高温、紫外线对球孢白僵菌的不利影响，有利于提高球孢白僵菌孢子的存活率、延长货架期、提高产品的田间使用效果。

[0148] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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一种球孢白僵菌油悬浮剂

一种球孢白僵菌油悬浮剂

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