아미노산의제조방법
专利汇可以提供아미노산의제조방법专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且A Corynebacterium or Brevibacterium organism which includes a recombinant DNA encoding at least 3 of N-acetylglutamate kinase (I); N-acetylp-gamma-glutamyl phosphate reductase (II); arginosuccinase (III) and argininosuccinate synthetase (IV), derived from an Escherinchia organism. Also new are (2) bacteria contg. this recombinant DNA. DNA coding for (I), (II) and (III) will improve prodn. of all 3 amino acids; that also coding for (IV) will improve prodn. of L-arginine. Suitable hosts for the DNA are the C. glutamicum strains K61, K62 and K63 (FERM BP-1111, 1112 and 1113). Plasmid pEargI, contg. genes for (I), (II), (III) and AOD, is described in JA 66989/1985. It is cut with SalI, ligated and the reaction mixt. used to transform AOD-deficient E. coli EA-4. Transformants auxotpophic for arginine were isolated to produce plasmid pEarg2, which encodes (I), (II).，下面是아미노산의제조방법专利的具体信息内容。
아미노산의 제조방법
제 1 도는 pEarg2, pEarg3 및 pEarg4의.제한 효소 BamH I, BanIII, Pst I 및 Sal I 절단 지도 및 그의 형성 단계를 나타낸 것이다.
토리네박테리움 또는 브레비박테리움속의 코리네형 글루타메이트-생산 박테리아를 사용하여 발효시킴으써 L一아르기닌을 제조하는 데 있어서, L-아르기닌 생산능을 가지며, 이들 박테리아의 야생형으로부터 유도된 변이주가 이용되고 있다.
L-아르기닌-생산 변이주로는, 아미노산 유사체 또는 핵산 유사체에 내성인 변이주 또는 이들 유사체내성 균주에 핵산 염기에 대한 영양요구를 부여함으로써 수득된 변이주가 Agric.Bio1.Chem.,36,1675(1972), 일본국 특허 공개 제 37235/1979호, 일본국 특허 공개 제 150381/1982호 등에 공지되어 있다.DNA 재조합 기술에 의해 형성된 균주를 사용하여 L-아르기닌을 제조하는 방법이 공지되어 있다. 예를들면, 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하며, 에스케리키아콜리 K12로부터 분리된 DNA 단편을 함유하며, 아르기닌 생합성에 관한 유전정보, 그 중에서도 N-아세틸글루타메이트 키나아제(이후,AGK로약칭한다), N-아세틸-T-글루타밀 포스페이트 리덕타제(이후, AGPR로약칭한다), 아세틸오르틴데아세틸라제(이후, AOD로 약칭한다) 및 아르기니노숙시나제(이후, AS로 약칭한다)를 코오딩하는 유전자를 함유한 재조합 플라스미드 DNA(pEargl)을 운반하는 박테리아를 배양함으로써 L-아르기닌을 제조하는 방법이 공지되어 있다.
(일본국 특허 공개 제 66989/1985호).
더우기, 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 코러네형 글루타메이트-생산 박테리아를 사용하여 발효시킴으로써 L-오르니틴 또는 L-시트룰린을 제조하는 방법에 대해서는, 이들 박테리아의 야생 균주로부터 유도된 영양-요구성 변이주를 사용하는 방법이 공지이다. L-오르니틴-생산 변이주로는 시트룰린-또는 아르기닌-요구성 변이주가 공지되어 있다[J.Gen.App1.Microbio1.,4,272(1958)]. L-시트룰린 생산 변이주로는 L-아르기닌-요구성 변이주 등이 공지되어 있다[Amino Acid Nucleic Acid, 14, 6(1966)〕
최근 L-아르기닌, L-오르니틴 및 L-시트룰린에 대한 요구가 증가함에 따라 이들의 공업적으로 개량된 방법이 절실히 요구되어 있다.
본 발명자들은 DNA 재조합 기술에 의해 코리네박테리움 또는 브레비박테리움속에 속하며 L-아르기닌, L-시트룰린 또는 L-오르니틴의 향상된 생산성을 갖는 박테리아를 얻기 위해 광범위한 연구를 수행하였다. 그 결과, 신규의 재조합 플라스미드(pEarg2)를 운반하는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에속하는 박테리아를 사용할때, L-아르기닌의 생산성이 pEarg1-운반 박테리아를 사용하는 방법과 비교해 증가 될수 있다는 것을 발견하였다. pEarg2는 AOD를 코오딩하는 유전자가 없다는 점에서 AGK, AGPR,AOD 및 AS를 코오딩하는 에스케리키아콜리 K12로부터 유도된 유전자를 함유한 재조합 플라스미드 pEarg1과는 상이하다. 또한, pEarg2-운반 박테리아가 pEarg2-결핍 박테리아보다 L-오르니틴 또는 L-시트룰린의 생산성이 향상된다는 것, 및 아르기니노숙시네이트 합성효소(이후, ASS로 약칭한다)를 코오딩하는 유전자를 함유하는 에스케리키아콜리 K12로부터 유도된 DNA단편을 pEarg2로 삽입함으로써 형성된 재조합 플라스미드 DNA(pEarg4)를 운반하는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 박테리아를 사용할 때, 이들 박테리아는 pEarg2-운반 박테리아보다 높은 L-아르기닌 생산성을 갖는다는 것을 발견하였다.
이러한 사실을 기초로 본 발명자들은 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 에스케리키아 속에 속하는 균주로부터 분리된 AGK, AGPR 및 AS의 합성에 관한 유전정보를 갖는 DNA 단편 및 벡타 DNA의 재조합 DNA를 운반하는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 미생물을 회수 가능한 량의 L-아르기닌, L-시트룰린 또는 L-오르니틴이 배양 브로스에 축적될때까지 배지에서 배양하고, 그로부터 이들 아미노산을 회수함을 특징으로 하는 L-아르기닌, L-시트룰린 또는 L-오르니틴의 제조방법에 관한 것이다. 더우기, 본 발명은 에스케리키아 속에 속하는 균주로부터 분리된 AGK,AGPR, AS 및 ASS의 합성에 관한 유전정보를 갖는 DNA 단편 및 벡타 DNA의 재조합 DNA를 운반하는코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 미생물을 회수가능한 량의 L-아르기닌이 배양 브로스에 축적될때까지 배지에서 배양하고, 그로부터 L-아르기닌을 회수함을 특징으로 하는 L-아르기닌의 제조방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 생물 공업분야, 특히 약제 및 사료로 유용한 L-아르기닌, L-시트룰린 또는 L-오르니틴의 제조분야에 관한 것이다.
제 1 도는 pEarg2, pEarg3 및 pEarg4의 제한 효소 BamH I, BanIII, Pst Ⅰ및 Sal I 절단지도 및 그의 형성단계를 나타낸것이다. 도면에서, Bm, Bn, P 및 S는 각각 BamH I, , BanH III, Pst I 및 Sal I 을나타낸다. 플라스미드의 크기는 킬로 염기(Kb)로 표시한다. pEarg2, pEarg3 및 pEarg4의 굵은 실선 부분및 흰 공백이 있는 부분은 각각 pEarg1으로부터 유도된 아르기닌 생합성 유전자(argB, argC 및 argH 유전자)들을 함유한 DNA 단편 및 WA802 균주의 염색체 DNA로부터 클로닝된 argG 유전자를 함유한 DNA 단편을 나타낸 것이다.
본 발명의 숙주 미생물로 사용될 수 있는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 미생물로는 소위 코리네형 글루타메이트 생산 박테리아로 공지된 모든 미생물이 이용될 수 있다. 하기의 균주들은 형질전환에 적당한 예들이다.
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 31833
코리네박테리움 아세토아시도필룸 ATCC 13870
코리네박테리움 헤르쿨리스 ATCC 13868
코리네박테리움 릴리움 ATCC 15990
브레비박테리움 디바리카툼 ATCC 14020
브레비박테리움 플라붐 ATCC 14067
브레비박테리움 임마리오필룸 ATCC 14068
브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC 13869
브레비박테리움 티오게니탈리스 ATCC 19240
L-아르기닌을 제조하는 경우, L-아르기닌 생산성을 갖지 않는 박테리아가 숙주 미생물로 사용되나, L-아르기닌을 생산하는 박테리아가 바람직하게 사용될 수 있다, L-아르기닌 생산성을 갖는 박테리아로는 아미노산 유사체-내성 변이주 등과 같은 공지의 균주가 이용될 수 있다. L-오르니틴 또는 L-시트룰린을 제조하는 경우, L-오르니틴 또는 L-시트룰린 생산성을 갖는 아르기닌 요구 균주가 숙주 미생물로 사용될 수 있다.
AGK, AGPR, AS 및 ASS를 코오딩하는 유전자의 공급원으로는, 에스케리키아 속에 속하며, AGK, AGPR, AS 및 ASS의 활성을 갖는 미생물인 한 어떤 미생물도 사용될 수 있다. 특히, 바람직한 예로는, 에스케리키아콜리 K12 균주가 있다. 에스케리카아콜리 K12 균주에서, AGK, AGPR, AS 및 ASS는 각각 argB, argC, argH 및 argG 유전자에 코오딩된다. 〔Genetics, 51, 167(1965)〕.
이들 유전자의 공급원으로 사용된 염색체 DNA는, 미생물의 배양된 세포를 리소자임으로 처리하여 상층액을 세균 용혈시키고, 단백질을 제거한 후, DNA를 에탄올로 침전시키는 공지방법〔Biochim, Biophys, Acta, 72, 619 (1963)〕에 의해 AGK, AGPR, AS 및 ASS 활성을 갖는 미생물로부터 분리될 수 있다.
본 발명에 사용되는 벡타는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움속에 속하는 박테리아에서 자동적으로 복제할 수 있는 벡타에 제한된다. 특히 적당한 플라스미드는 pCG1(일본국 특허 공개 제 134500/1982호), pCG2(일본국 특허 공개 제 35197/1983호), pCG4 및 pCG11(일본국 특허 공개 제 183799/1982호), pCE51, pCE52 및 pCE53〔Mol, Gen, Genet., 196,175 (1984)〕, pCE54 및 pCB101(일본국 특허 공개 제 105999/1983호) 또는 이들 벡타 프라스미드로부터 유도된 플라스미드이다. 플라스미드는 일본국 특허 공개 제 134500/1982호 및 제 186489/1982호에 기재된 방법에 따라 플라스미드를 운반하는 균주의 배양세포로부터 분리 및 정제될 수 있다.
AGK, AGPR, AS 및 ASS를 코오딩하는 유전자를 함유한 공여 DNA 및 벡타 DNA의 제조합 DNA는 두 DNA를 시험관내에서 제한효소로 분해하고, DNA 리가아제로 결찰 반응시킨 후, 이 결찰 반응 생성물을 사용하여 코리네박테리움 또는 브레비박테리움속에 속하는 AGK-, AGPR-, AS- 및 ASS- 결핍 변이주를 형질 전환시키고, 결핍된 특성이 보완된 형질 전환체를 선택함으로써 수득될 수 있다. 이 공정은 일본국 특허 공개 제 186492/1982 및 186489/1982호에 기재된 방법에 따라 수행된다.
코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 박테리아의 형질 전환체로부터 목적하는 재조합 DNA를 직접 수득하는 대신에, 유전자 재조합 DNA 기술이 설립된 에스케리키아콜리의 숙주-벡타계를 사용할 수도 있다. 즉, AGK, AGPR, AS 및 ASS를 코오딩하는 유전자를 갖는 공여 DNA 및 에스케리키아콜리의 벡타 DNA를 시험관내에서 제한효소로 분해하고, 두 DNA를 DNA 리가아제로 결찰시킨 후, 이 결찰 반응 생성물로 에스케리키아콜리의 AGK-, AGPR-, AS- 및 ASS- 결핍 변이주를 형질 전환시키고, 결핍 특성이 보완된 형질 전환체를 선택함으로써 목적하는 유전자를 클로닝할 수 있다. 목적하는 재조합 DNA는 상기에서 클로닝된 DNA 및 코리네박테리움 또는 브레비박테리움속에 속하는 박테리아의 벡타 DNA를 시험관내에서 제한효소로 분해하고, 이 두 DNA를 DNA 리가아제로 다시 결찰시킨 후, 이 결찰 반응 생성물로 에스케리키아콜리의 상술한 AGK-,AGPR-, AS- 또는 ASS- 결핍 변이주를 형질 전환시키고, 결핍 특성이 보완된 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 박테리아의 벡타 DNA의 선택마커를 갖는 형질 전환체를 선택함으로써 수득된다. 목적하는 재조합 DNA는 또한 결찰 반응 생성물로 에스케리키아콜리를 형질 전환시켜 에스케리키아콜리에서 클로닝 된 DNA 및 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 박테리아의 벡타 DNA의 재조합체를 선택하는 대신에, AGK, AGPR, AS 또는 ASS가 결핍된 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 박테리아의 변이주를 결찰 반응 생성물로 형질 전환시키고, 결핍 특성이 보완된 형질 전환체를 선택함으로써 수득될 수 있다.
더우기, AGK, AGPR 및 AS를 코딩하는 유전자를 갖는 공여 DNA 및 벡타 DNA의 재조합DAN는 상술한 바와 같은 방법에 의해 수득될 수 있다.
AGK, AGPR 및 AS를 코딩하는 유전자의 공급원으로 염색체 DNA를 사용하는 대신에, 이미 pEarg1에 클로닝된 AGK, AGPR 및 AS를 코딩하는 유전자를 함유한 DNA 단편을 사용할 수도 있다. 상술한바와 같이, pEarg1 은 AGK, AGPR 및 AS를 코오딩하는 유전자(argB,. argC 및 argH)와 더불어 AOD를 코오딩하는 유전자(argE)를 함유한다.
pEarg1은 일본국 특허 공개 제 66989/l985호에 기재되어 있으며,
에스케리키아콜리 K12 균주의 유전자뱅크 내의 플라스미드 pLC 20-10〔Cel1,9,9l(l976)] 및 플라스미드 pCE53[Mo1.Gen.Genet.,196,175(1984)]의 재조합체이다. 단지 argB, argC 및 argH 유전자만을 함유한 플라스미드는 예를 들면 실시예 1에서 설명된 argE 유전자에 상응하는 DNA 단편의 일부를 삭제함으로써 제조될 수 있다.
argG 유전자의 클로닝은 ASS 활성을 갖는 에스케리키아콜리 K12로부터 유도된 균주, 예를 들어 WA802 균주(FERM BP-718)의 염색체 DNA를 사용하여 상술한 방법에 의해 수행될 수 있다.
더우기, argB, argC, argH 및 argG 유전자를 모두 함유한 재조합 DNA는 예를 들면 argG 유전자를 함유한 DNA 단편 및 상술한 argB, argC 및 argH 유전자를 함유한 플라스미드를 결찰시킴으로써 수득될 수있다.、
상기에서 수득된 argB, argC 및 argH 유전자를 함유한 재조합 DNA 또는 argB, argC, argH 및 argG 유전자를 함유한 재조합 DNA는 일본국 특허 공개 제 186492/1982 및 186489/1982호에 나타낸 프로토 플라스트를 사용하는 방법에 의해 코리네박테리움 또는 브례비박테리움 속에 속하는 박테리아에 도입될 수 있다.
이들 재조합 DNA-운반 균주를 사용한 L-아르기닌, L-시트룰린 또는 L-오르니틴의 제법은 발효에 의한 이들 아미노산의 제법에 사용된 것과 같은 공지방법으로 수행될 수 있다.
즉, 형질 전환체를 온도, pH등을 조절하 호기성 조건하에 탄소원, 질소원, 무기화합물, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지에서 배양함으로써 L-아르기닌, L-시트룰린 또는 L-오르니틴을 배양브로스에 축적하고, 이 배양 브로스로부터 아미노산을 회수한다.
탄소원으로는, 글루코오즈, 글리세롤, 프럭토오즈 ,슈크로오즈, 말토오즈, 만노오즈, 녹말, 녹말 가수분해를, 몰라세등과 같은 탄수화물 : 폴리알콜 : 피루브산, 푸마르산, 락트산, 아세트산 등과 같은 각종유기산이 사용될 수 있다. 더우기, 박테리아의 동화에 따라 탄화수소, 알콜 등을 사용할 수 있다. 특히, 사탕수수 몰라세가 바람직하게 사용된다.
질소원으로는, 암모니아 또는 염화암모늄, 황산암모눔, 탄산암모늄, 초산암모늄 등과 같은 각종 무기 및 유기암모늄염 ; 우레아 및 기타 질소-함유 화합물, 펩톤, NZ-아민, 육 추출물, 이스트 추출물, 옥수수침지액, 카제인 가수분해물, 어류 및 또는 그의 분해 생성물, 탈지 대두찌꺼기 또는 그의 분해 생성물, 번데기 가수분해물 등이 사용될 수 있다.
더우기, 무기 화합물로는 인산 2수소칼륨, 인산수소 2칼륨, 황산암모늄, 염화암모늄, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산 제1철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 미생물의 성장을 위해 필요한 비타민, 아미노산 등을 상술한 다른 배지 성분에 의해 공급한다면, 이들 특정 영양 물질을 배지에 따로 가할 필요는없다.
배양은 진탕 배양, 통기-교반 배양 등에 의해 호기적 조건하에 수행된다. 바람직한 배양 온도는 20∼40℃이다.
배양동안 배지의 pH는 중성 근처에서 유지하는 것이 바람직하다. 이러한 조건하에 1∼5일 동안 배양한후, 회수 가능한 량의 L-아르기닌, L-시트룰린 또는 L-오르니틴이 배양 브로스에 축적된다.
배양 완결 후, 배양 브로스로부터 세포를 제거하고, 활성탄처리, 이온 교환수지처리 등과 같은 공지 방법에 의해 상층액으로부터 L-아르기닌, L-시트룰린 또는 L-오르니틴을 회수한다.
상술한 argB, argC 및 argH 유전자를 모두 함유한 재조합 DNA를 운반하는 코러네박테리움 또는 브레비박테리움속에 속하는 박테리아를 사용하면 재조합 DNA를 운반하지 않는 균주를 사용할때 보다 L-아르기닌, L-시트룰린 또는 L-오르니틴이 고수율로 생산될 수 있으며 : 더우기 argB, argC, argH 및 argG유전자를 모두 함유한 재조합 DNA를 운반하는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 박테리아를 사용하면, 재조합 DNA를 운반하지 않는 균주를 사용할때보다 L-아르기닌이 고수율로 생산될 수 있다. 특히, 아르기닌 생산성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 K62(FERM BP-1112) 및 아르기닌 생산성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 K63(FERM BP-1113)은 이런 재조합 DNA들을 운반하며, 시트룰린생산 균주인 코리네박테리움 글루다미쿰 K6l(FERM BP-1111)과 함께 1986년 7월24일자로 일본국 통상산업성 공업기술원 미생물 공업 기술 연구소에 기탁되어 있다. 또한 이들 코리네박테리움 글루타미쿰 K61,K62 및 K63은 한국과학기술원에 각각 KCTC 8340P, KCTC 8341P 및 KCTC 8342P의 수탁번호로 1988년 2월11일에 기탁되었다.
이후, 본 발명은 하기 실시예를 참고로 설명한다.
〔실시예 1〕
(1) 에스케리키아콜리의 아르기닌-요구성 변이주의 생산 : 아르기닌 생합성 유전자를 클로닝하고, 클로닝된 유전자를 확인하기 위해, 아르기닌 생합성 유전자가 결핍된 에스케리키아콜리 균주를 다음과 같이 수득한다.
에스케리키아콜리 K12로부터 유도된 데티오닌-요구성 에스케리키아콜리 WA802(FERM BP-718)을 400 Υ/ml N-데틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG)로 통상적인 변이 처리한다. 페니실린을 사용한 영양 요구 균주의 농축방법〔Experiment in Molecular Genetics, p.230, Cold Spring Harbour Laboratory(1972)〕에 따라, 아르기닌 요구 균주를 선택한다. 수득된 아르기닌-요구 균주의 변이 유전자의 확인은 각 아르기닌 생합성 효소의 활성을 측정함으로써 수행한다.
효소분석은 AGK, AOD 및 AS에 대해서는 J.Gen.Micorbiol.,69,365(1971) ; AGPR에 대해서는 Biochem, Biophys, Acta, 108,306(1965) ; 및 ASS에 대해서는 J.Biochem., 85,1309(1979)에 설명된 바와 같이 수행한다.
그 결과, EA-21, EA-35, EA-4, EA-51 및 EA-77이 각각 AGK-결핍 변이주(argB), AGPR-결핍 변이주(argC), AOD-결핍 변이주(argE), ASS-결핍 변이주(argG) 및 AS- 결핍 변이주(argH)로 수득된다.
(2)에스케리키아콜리의 argB, argC 및 argH 유전자를 함유하며, argG 유전자를 함유하지 않는 플라스미드 DNA의 생산 : 일본국 특허 공개 제 66989/l985호에 나타낸 바와같이 PLC 20-l0 및 pCE53을 결찰시킴으로써 에스케리키아콜리의 argB, argc, argH 및 argE 유전자 군을 함유한 재조합 DNA pEarg1을 수득한다. pLC20-l0이 상술한 유전자 군을 함유한다는 것은 공지이다[Cel1,9,91(1976)].
pLC 20-10은 에스케리키아콜리 K12 균주의 유전자 뱅크로부터 수득된다. pCE53은 Mol.Gen.Genet.,196,175(1984)에 설명된 플라스미드이며, 선택마커로 카나마이신 내성 유전자를 갖고 있으며, 에스케리키아 콜리 및 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하는 코리네형 글루타메이트 생산 박테리아에서 자동적으로 복제할 수 있다. pEarg1은 제 1도에 나타낸 바와같이 각종 제한효소의 절단부위를 가지며, Sal I 의두 절단 부위는 모두 argE 유전자에 존재한다[Gene,5,207(1979)].
argB, argC 및 argH 유전자를 함유하고 있으나 argE 유전자를 함유하지 않는 플라스미드 DNA는 pEargl으로부터 다음과 같이 제조된다. 앤 등의 방법 [J.Bacterio1.,140,400(1979)]에 따라 pEarg1을 운반하는 에스케리키아콜리 K12로부터 유도된 에스케리키아콜리 WA802의 배양 세포로부터 pEargl 플라스미드 DNA를 분리한다.2μg의 pEarg1 플라스이드 DNA를 함유한 제한 효소 SalI용 반응완충용액[10mM--트리스(히도록시메틸) 아미노메탄(이후 트리스로 약칭함),150mM NaC1 및 7mM MgC1 2 , pH 8.0〕l00μ1에 5단위의 Sal I (다까라슈조사제품, 8단위/μ1)를 가하고,37℃에서 1시간동안 반응시킨다. 65℃에서 1시간동안 가열한후,10배 농도의 12μ1의 T4 리가아제 반응 완충액(660mM 트리스,66mM MgC1 2 및 100mM 디티오트레이톨, pH 7.6),3μ1의 ATP(100mM) 및 1μ1의 T4 리가아제(다까라슈조사제품, 350만위/μ1)를상기 분해 생성물에 가하고, 4℃에서 24시간동안 반응시킨다. 이 리가아제 반응혼합물을 형질 전환에 사용한다. 수용체로는,(1)에서 수득된 에스케리키아콜리 K12로부터 유도된 AOD-결핍 에스케리키아콜리 EA-4(아르기닌 및 메티오닌 요구성)를 사용한다. EA-4의 적격 세포는 다케트등의 방법[Gene,6,23(1979)]에 의해 제조된다.
즉, EA-4 균주를 50ml의 L배지(물 1ℓ에 l0g의 박토트립톤,5g의 이스트 추출물,lg의 글루코오즈 및5g의 NaC1을 함유하며, pH 7.2로 조절된 배지)에 접종시키고, 도꾜코덴색열량계로 측정한 660nm에서의 흡광도(OD)가 0.5(흡광도는 특별한 지시가 없는 한 660nm에서 측정한다)가 될때까지 37℃에서 배양한다. 배양 브로스를 얼음으로 l0분동안 냉각시키고, 원심분리한다. 세포를 20m1의 0.lM CaC1 2 에 재현탁시키고,현탁액을 0℃에서 20분간 방치한다. 세포를 다시 원심분리하고,0.5ml의 0.lM CaC1 2 에 현탁시키고, 현탁액을 0℃에서 18시간 동안 방치한다. CaC1 2 로 처리된 세포 현탁액 50μ1에 상술한 리가아제 반응 혼합물 50μ1를 가한다. 혼합물을 0℃에서 l0분동안 방치하고,37℃에서 5분동안 가열한다. 이어서,2m1의 L배지를 가하고,37℃에서 2시간동안 진탕 배양한다. 원심분리에 의해 생리식염수로 2번 세척하고, 세척된 세포를 25μg/m1의 카나마이신이 보충된 L한천 배지(1ℓ의L 배지에 16g의 한천을 함유한 배지)를 넓게 펴고,37℃에서 1일동안 배양한다. 나타난 형질 전환체를 30μg/m1 메티오닌이 보충된 데이비스 최소 한천 배지[1ℓ의 물에 2g의 글루코오즈, lg의 (NH 4 ) 2 SO 4 ,7g의 K 2 HPO 4 , 2g의 KH 2 PO 4 , 0.lg의 MgSO 4 ·7H 2 O, 0.5g의 트리소듐 시트레이트,4mg의 티아민 히드로클로라이드 및 16g의 한천을 함유한다. pH 7.2〕 및 각각 30μg/m1의 메티오닌 및 아르기닌이 보충된 데이비스 최소 한천 배지에 펴고, 아르기닌 영양 요구성을 시험한다. 상술한 pEarg1의 분리와 유사한 방법으로 아르기닌 영양 요구성을 나타내는 형질 전환체의 배양세포로부터 플라스미드 DNA를 분리한다. 이 플라스미드 DNA를 제한 효소분해 및 아가로즈겔전기 영동에 의해 분석한다. 그 결과, 이 플라스미드는 제 1 도에 나타낸 바와 같이 pEarg1의 Sal I의 2절단부위 사이에 위치한 0.5kb의 DNA 단편이 삭제된 구조를 갖는다는 것을 알수 있다. 이 플라스미드를 pEarg2라고 명명 한다.
EA-4 균주를 상기와같은 방법으로 이 플라스미드 DNA로 재형질 전환시킨다 : 그결과, 수득된 카나마이신-내성형질 전환체가 모두 아르기닌 요구성이라는 것을 알 수 있다.
그러나, 에스케리키아콜리 K12로부터 유도된 AGK-결핍 EA-21, AGPR-결핍 EA-35 및 AS-결핍 EA-77(이들 모두 아르기닌- 및 메티오닌 요구성을 갖는다)를 pEarg2로 형질 전환시키면 아르기닌 요구성이 없는 카나마이신 내성 형질 전환체가 수득된다. 이러한 사실로부터, pEarg2가 argB, argC 및 argH유전자를 모두 함유하나 argE 유전자를 함유하지 않는 플라스미드라는 것을 알수 있다(제 1 도 참고).
(3) pEarg2-운반 균주에 의한 L-아르기닌, L-시트룰린 및 L-오르니틴의 제조.코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 3l833, 코리네박테리움 헤르쿨리스 ATCC 13868, 브레비박테리움 플라붐 ATCC 14067, L-오르니틴-생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13232, 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 아르기닌 요구 균주로서 분리된 시트룰린-생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 K61(FERM BP-llll, KCTC 8340P)을 pEarg2로 형질전환시킨다. 코리네박테리움 글루타미쿰ATCC 31833, 코리네박테리움 헤르쿨리스 ATCC 13868, 브레비박테리움 플라붐 ATCC 14067, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13232 및 코리네박테리움 글루타미쿰 K61(FERM BP-1111, KCTC 8340P)을 NB배지(20g의 육즙 분말 및 5g의 이스트 추출물을 함유하며 pH7.2로 조절된 배지)에서 30℃로 밤새 진탕배양하고,0.lm1의 각종 배양액을 10ml의 SSM배지[1ℓ의 증류수에 10g의 글루코오즈,4g의 NH 4 Cl,2g의 우레아,lg의 이스트 추출물,lg의 KH 2 PO 4 ,3g의 K 2 HPO 4 ,0.4g의 MgCl 2 ·6H 2 O,10mg의 FeSO 4 ·7H 2 O,0.2mg의 MnSO 4 ·4-6H 2 O,0.9mg의 ZnSO 4 : 7H 2 O,0.4mg의 CuSO 4 ·5H 2 O,0.09mg의 Na 2 B 4 O 7 ·10H 2 O,0.04mg의 (NH 4 ) 6 MO 7 O 24 4H 2 O,30μg의 비오틴 및 1mg의 티아민 히드로클로라이드를 함유하며, pH7.2로 조절된 배지], 또는 200μg/m1의 아르기닌으로 보충된 10ml의 SSM배지를 함유한 L-시험관에 접종� �키고,30℃에서 진탕 배양한다.OD가 0.l5에 도달했을때, 페닐실린 G를 0.5단위/ml의 최종 농도로 가한다. 배양을 계속하고,OD가 약 0.6이 되었을때, 세포를 수거한다.
이 세포를 1mg/ml 리소자임(pH7.6)이 보충된 2.5ml의 RCGP배지[1ℓ의 물에 5g의 글루코오즈, 5g의카스아미노산,2.5g의 이스트 추출물,3.5g의 K 2 HPO 4 ,1.5g의 KH 2 PO 4 ,0.41g의 MgCl 2 ·6H 2 O,10mg의 FeSO 4 ·7H 2 O, 2mg의 MnSO 4 ·4-6H 2 O,0.9mg의 FeSO 4 ·7H 2 O, 0.04mg의 (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 ·4H 2 O, 30μg의 비오틴,2mg의 티아민 히드로클로라이드,135g의 디소듐 숙시네이트 및 분자량이 10,000인 30g의 폴리비닐 피롤리돈을 함유한 배지]에 약 10 9 세포/ml농도로 현탁시킨다. 현탁액을 L-시험관에 옮기고,30℃에서 15시간 동안 서서히 진탕 배양하여 프로트플라스트를 유도한다.0.5ml의 프로토플라스트 현탁액을 작은 시험관에 넣고,2,500×g로 5분간 원심 분리한후,1ml의 TSMC완충용액[10mM MgC1 2 ,30mM CaC1 2 ,50mM 트리스 및 400mM 슈크로오즈 : pH7.5〕에 현탁시킨다.
이 현탁액을 원심 분리에 의해 세척하고, 세척된 세포를 0.lm1의 TSMC완충용액에 재현탁시킨다. 세포현탁액에 2배 농도의 TSMC완충용액 1 : 1혼합물 100μl를 가하고, pEarg2 플라스미드 DNA용액을 세포 현탁액에 가한다. 그리고 TSMC완충용액에 용해시킨 20% 폴리에틸렌글리콜(PEG) 6,000(나까라이케미칼 제품)의 용액 1.0ml를 가한다. 3분후, 혼합물을 2,500×g로 5분간 원심분리하여 상층액을 제거한다. 침전된 플로트플라스트를 1ml의 RCGP배티(pH7.4)에 현탁시키고, 현탁액을 30℃에서 2시간동안 서서히 진탕한다. 0.3ml의 플로토플라스트 현탁액을 l.6% 한천 및 400μg/ml카나마이신을 함유한 RCGP배지(pH7.4)에 펴고, 30℃에서 8일간 배양한다.
나타난 카나마이신-내성 형질 전환체를 400ml의 SSM배지에서 진탕 배양하고,OD가 0.15가 되었을때, 페니실린 G를 0.5단위/ml의 최종 농도 가한다. OD가 0.65가 될 때까지 배양을 계속한다. 배양브로스로부터 세포를 수거한다. TES완층 용액(0.03M 트리스,0.005M EDTA 및 0.05M NaC1 : pH8.0)으로 세척한 후, 세포를 10ml의 리소자임 용액(25% 슈크로오즈,0.lM NaC1,0.05M 트리스 및 0.8mg/ml리소자임 : pH8.0)에 현탁시키고, 37℃에서 4시간 동안 반응시킨다. 반응 혼합물에 2.4ml의 5M NaC1,0.6m1의 0.5M EDTA(pH8.0) 및 4% 라우릴설페이트 및 0.7M NaC1로 구성된 용액 4.4ml를 순서대로 가한다. 혼합물을 서서히 혼합한 후, 혼합물을 빙수에 15시간 동안 방치한다. 세균분해 생성물 총량을 원심 분리 튜브에 옮기고, 4℃에서 69,400×g로 60분간 원심 분리하여 상층액을 회수한다. 10중량％에 상응하는 량의PEG 6,000(나까라이 캐미칼 제품)을 상층액에 가하고, 혼합물을 서서히 교반하여 용해시키고, 얼음속에방치한다.10시간 후, 혼합물을 1,500×g로 10분 동안 원심 분리하여 펠릿을 회수한다. 펠릿을 용해시키기위해 5ml의 TES완충용액을 서서히 가한다. 이 용액에 2.0ml의 1.5mg/m1 에티듐 브로마이드를 가한다. 염화세슘을 가하여 용액의 밀도를 1.580으로 조절한다. 이 용액을 18℃에서 105,000×g로 48시간 동안 초원심 분리한다. 이 밀도 경사원심 분리에 의해, 공유 결합으로 닫혀진 고리형 DNA는 자외선 조사로 검출된 원심분리 튜브의 아래쪽 위치에서 고밀도를 갖는 밴드로 발견된다. 이 밴드를 주사기를 사용하여 원심 분리튜브의 옆으로부터 제거함으로써, 플라스미드를 분리한다. 분리된 용액을 등 부피의 이소프로필 알콜 용액[90부피％의 이소프로필알콜 및 10부피%의 TES완충용액(이 혼합물에서 포화량의 염화세슘 함유)]으로 5번 처리하여 추출에 의해 에티듐 브로마이드를 제거한 후, 혼합물을 TES완층용액으로 투석하여 최종 플라스미드 DNA제제를 수득한다.
이 플라스미드를 각종 제한효소분해 및 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석한다. 그 결과, 이 플라스미드는 각종 제한효소에 의해 절단 패턴으로 특징되는 pEarg2와 같은 구조를 갖는다는 것이 확인된다.
그럼으로써, 형질전환체, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 31833/pEarg2, 코리네박테리움 헤르쿨리스 ATCC 13868/pEarg2, 브레비박테리움 플라붐 ATCC 14067/pEarg2, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC l3232/pEarg2 및 코리네박테리움 글루타미쿰 K6l/pEarg2를 수득한다. 이들 중에서, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 31833/pEarg2는 코리네박테리움 글루타미쿰 K62(FERM BP-1112)로 일본국 통상 산업성공업 기술원 미생물 공업 기술 연구소에 기탁되어 있다. 또한 이 형질전환체는 1988년 2월 11일자로 한국과학기술원에 KCTC 8341P의 수탁번호로 기탁되어 있다.
더우기, pEarg1을 유사한 방법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 31833,
코리네박테리움 헤르쿨리스 ATCC 13868, 브레비박테리움 플라붐 ATCC 14067, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13232, 및 코리네박테리움 글루타미쿰 K61에 도입하여 각각의 형질 전환체를 수득한다.
이렇게 수득된 pEarg1 또는 pEarg2-운반 형질 전환체에 대해, 다음과 같이 L-아르기닌, L-시트룰린또는 L-오르니틴의 생산 시험을 수행한다.
NB배지에서 30℃로 16시간 동안 진탕 배양함으로써 수득된 종 배양액 0.5ml를 시험관에 충전된 5ml의생산배지[1ℓ의 물에 80g의 사탕수수 몰라세(글루코오즈로 계산),40g의 (NH 4 ) 2 SO 4 ,0.5g의 KH 2 PO 4 ,0.5g의 K 2 HPO 4 및 20g의 CaCO 3 를 함유하며 pH7.0으로 조절된 배지]에 접종시키고,30℃에서 72시간 동안 진탕 배양한다.
L-시트룰린 또는 L-오르니틴을 제조하는 데는 100μg/ml L-아르기닌을 5ml의 생산 배지에 보충한다.배양후, 배양 여과액을 종이 크로마토그래피하고, 닌히드린으로 발생시킨 후, 칼러리메타를 수색하여 생성된 L-아르기닌, L-시트룰린 및 L-오르니틴의 양을 결정한다.
결과는 표 1,2 및 3에 나타낸다.
[표 1]
[표 2]
[표 3]
상기의 결과로부터, pEargl(argB, argC, argH 및 argE 유전자 함유)로 부터 pEargE 유전자를 제거함으로써 수득된 플라스미드 pEarg2를 운반하는 균주를 사용하면 pEarg1-운반 균주에 비해 아르기닌, 시트룰린 또는 오르니틴의 생산성이 향상될 수 있다는 것을 알 수 있다.
[실시예 2]
(1) 에스케리키아 콜리의 argG 유전자를 함유한 플라스미드 DNA의 제조 :
상술한 에스케리키아 콜리 WA802(FERM BP-718)로부터 공지방법[Biochim. Biophys. Acta,72,619(1963)]에 의해 argG 유전자를 함유한 염색체 DNA를 분리한다.
벡타로 사용된 pBR 322(암피실린-내성 및 테트라시클린 내성)는 다까라 슈조사의 시판품이다. 16단위의 BanIII(도요보사제품)을 1μg의 pBR 322플라스미드 DNA 및 3μg의 상술한 염색체 DNA를 함유한 제한효소 BanIII용 반응용액(10mM 트리스,50mM NaC1 및 7mM MgCl 2 , pH7.5) l00μl에 가한다.37℃에서 60분간 배양한 후, 반응 혼합물을 65℃에서 40분간 가열하여 반응을 중단시킨다. 분해된 반응 생성물에 10배 농도의 12μl의 T4리가아제 완충용액,3μl의 10mM ATP 및 350단위의 T4리가아제(다까라 슈조제품)를 가하고,12℃에서 l6시간동안 반응시킨다. 이 리가아제 반응 혼합물을 실시예 l(1)에서 수득된 아르기닌 및 메티오닌 요구성 에스케리키아 콜리 EA-51의 형질 전환에 사용한다. EA-51균주의 적합 세포를 실시예1(2)와 같은 방법으로 제조한다. 선택 배지로,30μg/ml 메티오닌 및 50μg/ml 암피실린이 보충된 데이비스 최소 한천 배지를 사용한다. 나타난 형질 전환체의 배양 세포로부터, 상술한 앤 등의 방법에 의해 플라스미드 DNA를 분리한다. 형질 전환체로부터 수득된 플라스미드 pEarg3를 각종 제한 효소 분해 및 아가로즈겔 전기 영동에 의해 분석한다. 그 결과, 이 플라스미드는 7킬로 염기의 BanIII DNA단편이 pBR 322의 BanIII 단일 절단 부위(절단인지 부위는 ClaI과 동일하다)에 삽입된 구조를 갖는다는 것을 발견하였다.
EA-51균주를 상술한 바와같은 방법에 의해 pEarg3으로 재형질 전환시킨다. 암피실린 내성에 의해 선택된 모든 형질 전환체는 아르기닌 요구성을 나타내지 않는다. 이러한 사실로부터, 에스케리키아 콜리 K12로부터 분리된 argG 유전자가 클로닝 된다는 것이 확인된다. pEarg3의 형성단계를 제 1 도에 나타낸다
(2) 에스케리키아 콜리의 argG 유전자와 pEarg2의 재조합 플라스미도의 제조
실시예 l,(2)에서 제조된 pEarg2 및 실시예 2,(1)에서 클로닝된 argG 유전자를 재조합하여 argB,argC, argH 및 argG 유전자를 모두 함유한 플라스미드 pEarg4를 제조한다.
2μg의 pEarg2 DNA를 함유한 제한효소 Ban III용 반응 용액 100μl에 0.3단위의 BanⅢ을 가한다. 37℃에서 60분간 반응시킨 후, 반응 혼합물을 65℃에서 40분간 가열하여 반응을 중단한다. 한편, 2μg의 pEarg3 DNA를 함유한 제한효소 BanⅢ용 반응 용액 100μl에 가한다. 37℃에서 60분간 반응시킨 후, 반응 혼합물을 65℃에서 40분간 가열하여 반응을 중단한다. 두 분해 반응 생성물을 혼합한 후,10배 농도의 23μl의 T4리가아제 반응 완충 용액,5μ1의 100mM ATP 및 350단위의 T4리가아제를 혼합물에 가하고, 12℃에서 16시간 동안 반응시킨다. 이 리가아제 반응 혼합물을 EA-51균주의 형질전환에 사용한다. 선택 배지로는,30μg/ml 메티오닌 및 25μg/ml 카나마이신으로 보충된 네이비스 최소 한천 배지가 사용된다. 나타난 형질 전환체의 배양 세포로부터 수득된 플라스미드 pEarg4를 각종 제한 효소 분해 및 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석한다. 그 결과, 이 플라스미드는 pEarg3로부터 유래된 7킬로베이스의 BanIIl DNA단편이 BanIII-절단부위를 갖는 카나마이신 내성 pEarg2에 포함된 유전자의 바깥쪽 BanIII-절단 부위 바깥쪽에 삽입된구조를 갖는다는 것이 발견된다. 실시예 1(1)에 수득된 EA-21, EA-35, EA-77 및 EA-51을 pEarg4로형질전환시킨다. 카나마이신 내성에 의해 선택된 모든 형질 전환체는 아르기닌-요구성을 나타내지 않는다.이러한 사실로부터, pEarg4는 argB, argC, argH 및 argG 유전자를 함유한다는 것을 알 수 있다.
또 pEarg4를 사용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 LA-A36(아르기닌 요구성)를 형질 전환시킨다. 이균주는 ATCC 31833으로부터 유도된 리소자임-민감성 변이주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 3l834로부터 공지의 변이 처리에 의해 유도된 아르기닌 요구성 균주이다. 아르기닌 생합성용 중간체로서의 시트룰린은 성장에 필요한 물질인 아르기닌으로 변화될 수 없으며, 아르기닌 요구성은 pEarg2의 도입에도 불구하고 보충될 수 없기 때문에, LA-A36에서의 변이는 ASS(에스케리키아 콜리 K12의 argG 유전자 생성물에 상응)의 결핍으로부터 이루어진다는 것이 확인된다.
코리네박테리움 글루타미쿰 LA-A36의 종 배양액 0.1ml를 10ml의 NB배지에 접종시킨다.OD가 0.6에 도달할때, 세포를 수거하고, 실시예 1,(3)과 같은 방법을 수행하여 pEarg4에 의해 LA-A36 균주를 형질 전환시킨다. 선택 배지로 400μg/ml 카나마이신을 함유한 RCGP한천 배지를 이용한다. 이렇게 수득된 카나마이신-내성 형질 전환체에 대해, 아르기닌-요구성을검사한다. 그 결과, 모든 형질 전환체는 아르기닌 요구성을 나타내지 않는다. 따라서, argG 유전자가 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 박테리아에 형질 발현된다는 것을 알 수 있다. pEarg4의 형성 단계는 제 1도에 나타낸다.
(3) pEarg4-운반 균주에 의한 L-아르기닌의 제조 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 31833, 코리네박테리움 헤르쿨리스 ATCC 13868 및 브레비박테리움 플라붐 ATCC 14067를 실시예 1(3)과 같은 방법으로 제조하고, pEarg4를 도입한다.
실시예 1,(3)과 같은 방법으로 이들 형질 전환체로부터 플라스미드를 분리하고, 각종 제한 효소 분해 및 아가로즈겔 전기 영동에 의해 분석한다. 그 결과, 이 플라스미드가 pEarg4와 같은 구조를 갖는다는 것이 발견된다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 31833/pEarg4는 일본국 통상 산업성 공업 기술원 미생물 공업 기술 연구소에 코리네박테리움 글루타미쿰 K63(FERM BP-1113)으로 기탁되어 있다. 또한 이 형질 전환체는 1988년 2월 11일자로 한국과학기술원에 KCTC 8342P의 수탁 번호로 기탁되어 있다.
pEarg4-운반 균주, pEarg2-운반 균주 및 플라스미드를 운반하지 않은 균주로 실시예 1,(3)과 같은 방법으로 L-아르기닌의 생산 시험을 수행한다.
결과는 표4에 나타낸다.
[표 4]
상기의 결과로부터, pEarg2(argB, argC 및 argH 유전자 함유) 및 argG 유전자를 함유한 DNA 단편의 재조합에 의해 수득된 플라스미드 pEarg4를 운반하는 균주를 사용하면 pEarg2-운반 균주를 사용하는 것에 비해 L-아르기닌의 생산성이 향상될 수 있음을 알 수 있다.
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