耐高温藤黄单孢菌及其应用
阅读：582发布：2020-05-14
专利汇可以提供耐高温藤黄单孢菌及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 发现了一个新的 微 生物 菌种，经鉴定确认该菌属于藤黄单孢菌属，被命名为耐高温藤黄单孢菌W20，Luteimonas thermotoleransW20。经实验验证，该菌具有较强耐 热能 力 。，下面是耐高温藤黄单孢菌及其应用专利的具体信息内容。
耐高温藤黄单孢菌及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 适宜的温度是植物良好生长的前提。近年来全球气候变暖，世界各地温度广泛上升，高温胁迫对植物生长的影响日益显著。因此，筛选具有耐热能力的菌株，鉴定其耐热基因，进而将该基因转化植物，有助于培育耐高温植物，以适应不断升高的气候环境，具有重要的现实意义。
[0003] 目前，研究较多的耐热微生物主要为栖热菌属(Thermus)的革兰氏阳性菌，例如嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)，该属菌株的最适生长温度为45℃以上。此外，耐辐射异常球菌作为“世界上最顽强的细菌”之一，也具有较强的耐热能力。
[0004] 但是，Luteimonas属的革兰氏阴性菌却少有报道具有耐热能力的菌株。
发明内容
[0005] 本发明的目的是分离出具有耐热能力的新种微生物。
[0006] 本发明从新疆阿勒泰地区白桦林间的土壤中分离培养出一个新的微生物菌种，发现该菌具有耐热的功能。
[0007] 经鉴定确认该菌属于藤黄单孢菌属，被命名为耐高温藤黄单孢菌W20， Luteimonas thermotolerans W20【ther.mo.to′le.rans.Gr.n.thermê heat；
L.part.adj.】。
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[0009] 本发明的耐高温藤黄单孢菌W20具有下述性质：
[0010] 1.形态特征
[0012] 2.在各种培养基上的特征：
[0013] 在ZBA琼脂培养基上，菌落呈现柠檬黄色、凸起状，表面湿润，边缘整齐，无胞外分泌物(图2)。
[0014] 3.生理生化特征
[0018] 5.其它性质
[0019] 最适生长温度30℃。细胞壁脂肪酸含有Summed Feature 9(C17:1iso w9c and/or C16:0 10-methyl),C15:0iso,C16:0iso和C11:0iso等，其中以Summed Feature 9(C17:1iso w9cand/or C16:0 10-methyl), C15:0iso和C16:0iso为主。
[0020] 6.耐高温藤黄单孢菌W20的培养条件为：
[0022] (2)pH7.6±0.2；
[0023] (3)培养温度：30℃。
[0024] 7.耐高温藤黄单孢菌W20的16S rDNA与同属的其它种的16S rDNA相比，具有显著性差异(相似度≤97％)：
[0025] 与Luteimonasterricola BZ92r的相似度为97.06％；
[0026] 与Luteimonasarsenica 26-35的相似度为97.06％；
[0027] 与Luteimonasaestuarii B9的相似度为96.76％；
[0028] 与Luteimonascomposti CC-YY255的相似度为96.62％；
[0029] 与Luteimonashuabeiensis HB2的相似度为95.81％；
[0030] 与Luteimonas marina FR1330的相似度为95.66％；
[0031] 与Luteimonasabyssi XH031的相似度为95.66％；
[0032] 与Luteimonaslutimaris G3的相似度为95.45％；
[0033] 与Luteimonas mephitis B1953/27.1的相似度为94.35％等等。
[0034] 构建的系统发育树如图3所示。
[0035] 8.与同属不同近缘标准菌株的微生物学特性比较
[0036] 与藤黄单胞菌属标准菌株——Luteimonas mephitis DSM 12574T的对比实验显示，本发明发现的耐高温藤黄单孢菌W20与标准菌株的微生物学特性有显著差异。
[0037] 见表1：
[0038] 表1耐高温藤黄单孢菌W20与同属不同近缘菌株的微生物学特性比较
[0039]
[0040] 注：“+”表示阳性，“-”表示阴性，“w”表示弱阳性，“ND”表示无该数据。
[0041] 9.耐高温藤黄单孢菌W20的耐热性实验
[0042] 与耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans R1)菌株在同等条件下进行对比。
[0043] 结果表明，本发明耐高温藤黄单孢菌W20在48℃热击4h后仍然可以正常生长，而对照菌株R1在48℃热击4h后，其生长情况较热击3h滞后一个数量级，见图4。
[0044] 本发明的耐高温藤黄单孢菌W20，可以直接作为耐热转基因生物的基因供体，将其优良的耐热基因转入其它生物体中，使其可以获得优良的抗逆性状；同时，它也可能作为新的基因工程菌株，通过接受外来其它优良基因从而获得更多的优良性状；此外，通过传统的诱变育种手段进行性状的改良，还可以获得更多优良性状的菌株。附图说明
[0045] 图1耐高温藤黄单孢菌W20的透射电镜图片；
[0046] 图2耐高温藤黄单孢菌W20的菌落形态；
[0047] 图3耐高温藤黄单孢菌W20与其它藤黄单胞菌属成员之间的进化分析(基于16S rDNA序列分析)；
[0048] 图4耐高温藤黄单孢菌W20与对照菌株耐辐射异常球菌(D.radiodurans R1)的耐热能力对比。
[0049] 左图为耐高温藤黄单孢菌W20在48℃高温冲击下，不同时间处理后的生长情况，右图为对照菌株耐辐射异常球菌R1在48℃高温冲击下，不同时间处理后的生长情况。
[0050] 生物材料保藏信息：
[0051] 名称：耐高温藤黄单孢菌W20(Luteimonas thermotoleransW20)
[0052] 保藏编号：GDMCC No:60237
[0053] 保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心保藏单位地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼
[0054] 保藏时间：2017年9月15日。
[0055] 序列信息
[0056] SEQ ID NO:1：耐高温藤黄单孢菌W20的16S rDNA核苷酸序列。
具体实施方式
[0057] 实施例1耐高温藤黄单孢菌W20的获得
[0058] 于新疆阿勒泰地区某草地采集土壤样品，称取1g土样，加入20mL TGY培养基中于 30℃、200rpm下富集培养112h，取富集培养物100μL，按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6依次梯度稀释，分别取200μL涂布于R2A琼脂培养基平板上，倒置于30℃培养箱中培养几天，委托广东省微生物菌种保藏中心对分离到的菌进行鉴定，确认该菌属于藤黄单孢菌属，被命名为耐高温藤黄单孢菌W20。
[0059] 所述R2A琼脂培养基成分：酪蛋白水解物0.5g/L；酵母提取物0.5g/L；胰蛋白胨0.5 g/L；葡萄糖0.5g/L；可溶性淀粉0.5g/L；磷酸氢二钾0.3g/L；无水硫酸镁0.024g/L；丙酮酸钠0.3g/L；氯化钠10g/L；琼脂15g/L。pH7.2±0.2。
[0060] 培养温度为30℃。
[0061] 实施例2耐高温藤黄单孢菌W20的耐热能力试验
[0062] 1、试验方法
[0063] 将本发明所述的耐高温藤黄单孢菌W20菌株接种于ZBA液体培养基中，30℃摇床培养至OD600＝1.3，后转移至48℃摇床进行培养；
[0064] 分别在转移培养0h、1h、2h、3h、4h取样100μL，并依次稀释为10-1、10-2、10-3、 10-4和10-5。每个浓度梯度取8μL菌液点在ZBA琼脂培养基上，30℃倒置培养，观察结果。
[0065] 同时以OD600＝2的耐辐射异常球菌(D.radiodurans R1)菌株为对照，在TGY培养基上进行点板。
[0066] 试验菌和对照菌各进行3次平行实验。
[0067] 2、结果
[0068] 本发明耐高温藤黄单孢菌W20在48℃热击4h后，仍然可以正常生长，而对照菌株R1 在48℃热击4h后，其生长情况较正常生长滞后一个数量级(图4)。
[0069] 实施例3耐高温藤黄单孢菌W20中16S rDNA的提取
[0070] 本发明还提供了耐高温藤黄单孢菌W20的基因组提取、16S rDNA的扩增及测序方法，具体按照下述操作进行：
[0071] 1.基因组提取方法
[0073] 2.PCR扩增方法
[0074] 本发明所述的耐高温藤黄单孢菌W20的16S rDNA的PCR扩增所用的通用引物序列的设计参照William G.Weisburg(1991)的文章，引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。扩增所用的试剂盒购买于南京诺唯赞生物科技有限公司。
[0075] 正向引物27F(5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’)
[0076] 反向引物1492R(5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)
[0077] 表2 PCR扩增体系
[0078]
[0079] PCR反应程序：
[0080]
[0081] 将扩增得到的16S rDNA序列，连接于 公司的pJET 1.2/blunt载体上，委托北京六合华大基因科技有限公司对于插入序列进行测序。
[0082] 测序得到的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
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