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使用RNA分子控制鞘翅目有害生物

阅读:769发布:2020-05-13

专利汇可以提供使用RNA分子控制鞘翅目有害生物专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本文披露了对鞘翅目昆虫具有毒性的双链RNA分子。具体地,本文提供了能够干扰 有害 生物 靶基因并对该靶 有害生物 具有毒性的干扰RNA分子。此外,本文披露了例如在转基因 植物 中制备并使用该干扰RNA或制备并使用该干扰RNA作为组合物中的活性成分以赋予免受昆虫损害的保护的方法。,下面是使用RNA分子控制鞘翅目有害生物专利的具体信息内容。

1.一种干扰核糖核酸(RNA)分子,其中该RNA包含至少一种dsRNA,其中该dsRNA是包含退火的互补链的双链RNA的区域,其中的一条链包含具有至少19个连续核苷酸的序列,该序列与在根萤叶甲属(Diabrotica spp)靶基因中的靶核苷酸序列是至少部分互补的,并且(i)至少与SEQ ID NO:130、134、140、160、164、170、190、194、或200,SEQ ID NO:274-276,SEQ ID NO:280-282,SEQ ID NO:304-324的19个连续核苷酸的片段,或其互补序列具有至少85%同一性;或者(ii)至少包含SEQ ID NO:130、134、140、160、164、170、190、194、或200,SEQ ID NO:274-276,SEQ ID NO:280-282,SEQ ID NO:304-324的19个连续核苷酸的片段,或其互补序列;(iii)至少包含编码由SEQ ID NO:130、134、140、160、164、170、190、194、或
200,SEQ ID NO:274-276,SEQ ID NO:280-282,SEQ ID NO:304-324编码的基酸序列的核苷酸序列的19个连续核苷酸的片段,或其互补序列;或者(iv)可以在严格条件下与选自下组的多核苷酸杂交,该组由以下组成:SEQ ID NO:130、134、140、160、164、170、190、194、或
200,SEQ ID NO:274-276,SEQ ID NO:280-282,SEQ ID NO:304-324,及其互补序列,其中该干扰RNA分子对鞘翅目植物有害生物具有杀昆虫活性。
2.如权利要求1所述的干扰RNA分子,其中所述鞘翅目植物有害生物是根萤叶甲属昆虫。
3.如权利要求1所述的干扰RNA分子,其中该RNA包含至少两种dsRNA,其中每种dsRNA包含如下核苷酸序列,该序列与该靶基因中的靶核苷酸序列是至少部分互补的。
4.如权利要求3所述的干扰RNA分子,其中所述dsRNA中的每种包含不同的核苷酸序列,该序列与该靶基因中的不同靶核苷酸序列是至少部分互补的。
5.如权利要求1所述的干扰RNA分子,其中该干扰RNA分子包含SEQ ID NO:130、134、
140、160、164、170、190、194、或200,SEQ ID NO:274-276,SEQ ID NO:280-282,SEQ ID NO:
304-324,或其互补序列。
6.如权利要求1所述的干扰RNA分子,其中该dsRNA是含有基本上互补的退火链的双链RNA的区域。
7.如权利要求1所述的干扰RNA分子,其中该dsRNA是含有完全互补的退火链的双链RNA的区域。
8.如权利要求1至7中任一项所述的干扰RNA分子,其中该根萤叶甲属昆虫选自下组,该组由以下组成:巴氏根萤叶甲(D.barberi)、西方玉米根萤叶甲(D.virgifera)、黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctata)、黄瓜条根萤叶甲(D.balteata)、黄瓜十一星叶甲
(D.undecimpunctata)、斯格尼根萤叶甲(D.significata)以及南美叶甲(D.speciosa)。
9.一种核酸构建体,其包含如权利要求1至8中任一项所述的干扰RNA分子。
10.一种核酸分子,其编码如权利要求1至8中任一项所述的干扰RNA分子。
11.一种核酸构建体,其包含编码如权利要求10所述的核酸分子的核苷酸序列。
12.如权利要求9或11中任一项所述的核酸构建体,其中该核酸构建体是表达载体。
13.一种重组载体,其包含可操作地连接至如下核苷酸序列的调节序列,该核苷酸序列编码如权利要求1至8中任一项所述的干扰RNA分子。
14.一种组合物,其包含如权利要求1至8中任一项所述的干扰RNA分子中的两种或更多种。
15.如权利要求14所述的组合物,其中该两种或更多种干扰RNA分子存在于相同的核酸构建体上、不同的核酸构建体上或其任何组合上。
16.如权利要求14或15中任一项所述的组合物,该组合物包含含有至少一种dsRNA的干扰RNA分子,其中该dsRNA是包含退火的互补链的双链RNA的区域,其中的一条链包含具有至少19个连续核苷酸的序列,该序列(i)至少与SEQ ID NO:130、134、140、160、164、170、190、
194、或200,SEQ ID NO:274-276,SEQ ID NO:280-282,SEQ ID NO:304-324的19个连续核苷酸的片段,或其互补序列具有至少85%同一性;或者(ii)至少包含SEQ ID NO:130、134、
140、160、164、170、190、194、或200,SEQ ID NO:274-276,SEQ ID NO:280-282,SEQ ID NO:
304-324的19个连续核苷酸的片段,或其互补序列。
17.一种组合物,其包含如权利要求9、11或12中任一项所述的核酸构建体中的两种或更多种,其中该两种或更多种核酸构建体各自包含不同的干扰RNA。
18.一种组合物,其包含如权利要求10所述的核酸分子中的两种或更多种,其中该两种或更多种核酸分子各自编码不同的干扰RNA分子。
19.一种用于抑制根萤叶甲属昆虫靶基因表达的杀昆虫组合物,该组合物包含如权利要求1至8中任一项所述的干扰RNA,以及农业上可接受的载体。
20.如权利要求19所述的杀昆虫组合物,其至少包含用于控制根萤叶甲属昆虫的第二杀昆虫剂。
21.如权利要求20所述的杀昆虫组合物,其中该第二杀昆虫剂是苏金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)杀昆虫蛋白。
22.如权利要求20所述的杀昆虫组合物,其中该第二杀昆虫剂不是苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白。
23.如权利要求20所述的杀昆虫组合物,其中该第二杀昆虫剂是铃薯糖蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、脲酶、α-淀粉酶抑制剂、成孔蛋白、凝集素、工程化抗体或抗体片段、或几丁质酶。
24.如权利要求22所述的杀昆虫组合物,其中该第二杀昆虫剂是或源自蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)杀昆虫蛋白、致病杆菌属(Xenorhabdus spp.)杀昆虫蛋白、光杆菌属(Photorhabdus spp.)杀昆虫蛋白、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporous)杀昆虫蛋白、球形赖氨酸芽胞杆菌(Lysinibacillus sphearicus)杀昆虫蛋白、色杆菌属(Chromobacterium spp.)杀昆虫蛋白、噬虫霉耶尔森菌(Yersinia entomophaga)杀昆虫蛋白、乳状芽孢杆菌(Paenibacillus popiliae)杀昆虫蛋白、或梭菌属(Clostridium spp.)杀昆虫蛋白。
25.一种转基因植物或其部分,包含如对应的前述权利要求中任一项所述的干扰RNA分子、核酸分子、核酸构建体和/或组合物,其中当与对照植物相比时,该转基因植物对根萤叶甲属昆虫具有增强的抗性。
26.如权利要求25所述的转基因植物或其部分,其中该转基因植物至少包含用于控制根萤叶甲属昆虫的第二杀昆虫剂。
27.如权利要求26所述的转基因植物或其部分,其中该第二杀昆虫剂是苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白。
28.如权利要求26所述的转基因植物或其部分,其中该第二杀昆虫剂不是苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白。
29.如权利要求26所述的转基因植物或其部分,其中该第二杀昆虫剂是马铃薯糖蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、脲酶、α-淀粉酶抑制剂、成孔蛋白、凝集素、工程化抗体或抗体片段、或几丁质酶。
30.如权利要求28所述的转基因植物或其部分,其中该第二杀昆虫剂是或源自蜡样芽孢杆菌杀昆虫蛋白、致病杆菌属杀昆虫蛋白、光杆菌属杀昆虫蛋白、侧孢短芽孢杆菌杀昆虫蛋白、球形赖氨酸芽胞杆菌杀昆虫蛋白、色杆菌属杀昆虫蛋白、噬虫霉耶尔森菌杀昆虫蛋白、乳状芽孢杆菌杀昆虫蛋白、或梭菌属杀昆虫蛋白。
31.如权利要求25至30中任一项所述的转基因植物或其部分,其中该转基因植物或其部分是玉蜀黍植物或其部分。
32.一种转基因种子,其是如权利要求25至31中任一项所述的转基因植物的转基因种子。
33.一种生物样品,其来自如权利要求25至31中任一项所述的转基因植物或其部分。
34.一种商品产品,其源自如权利要求25至31中任一项所述的转基因植物或其部分。
35.如权利要求34所述的商品产品,其中该商品产品选自下组,该组由以下组成:整个或经处理的种子、豆类、谷物、籽粒、壳、粉、粗碾去壳谷类、面粉、糖、糖、淀粉、蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、蜡、油、提取物、汁、浓缩物、液体、糖浆、饲料青贮饲料纤维、纸或者其他从植物生产的食物或产品。
36.一种控制根萤叶甲属昆虫的方法,该方法包括使该根萤叶甲属昆虫与作为如权利要求1-8所述的干扰RNA分子或能够产生如权利要求1-8所述的干扰RNA分子的核酸分子接触,该干扰RNA分子用于抑制靶基因在该根萤叶甲属昆虫中的表达,从而控制该根萤叶甲属昆虫。
37.如权利要求36所述的方法,其中该靶基因包含如下编码序列,该编码序列:
a)至少与SEQ ID NO:10、14、20、100、104、或110,SEQ ID NO:271-273,SEQ ID NO:277-
279,SEQ ID NO:283-303的19个核苷酸的连续片段,或其互补序列具有至少85%同一性;
b)至少包含SEQ ID NO:10、14、20、100、104、或110,SEQ ID NO:271-273,SEQ ID NO:
277-279,SEQ ID NO:283-303的19个核苷酸的连续片段,或其互补序列;或者
c)至少包含编码由SEQ ID NO:10、14、20、100、104、或110,SEQ ID NO:271-273,SEQ ID NO:277-279,或SEQ ID NO:283-303编码的氨基酸序列的核苷酸序列的19个核苷酸的连续片段。
38.如权利要求36所述的方法,其中该干扰RNA分子包含至少一种dsRNA,其中该dsRNA是包含退火的互补链的双链RNA的区域,其中的一条链包含具有至少19个连续核苷酸的序列,该序列(i)至少与SEQ ID NO:130、134、140、160、164、170、190、194、或200,SEQ ID NO:
274-276,SEQ ID NO:280-282,SEQ ID NO:304-324的19个连续核苷酸的片段,或其互补序列具有至少85%同一性;或者(ii)至少包含SEQ ID NO:130、134、140、160、164、170、190、
194、或200,SEQ ID NO:274-276,SEQ ID NO:280-282,SEQ ID NO:304-324的19个连续核苷酸的片段,或其互补序列;或者(iii)至少包含编码由SEQ ID NO:130、134、140、160、164、
170、190、194、200,SEQ ID NO:274-276,SEQ ID NO:280-282,SEQ ID NO:304-324编码的氨基酸序列的核苷酸序列的19个连续核苷酸的片段,或其互补序列。
39.如权利要求36至38中任一项所述的方法,其中该根萤叶甲属昆虫选自下组,该组由以下组成:巴氏根萤叶甲、西方玉米根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲、黄瓜条根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲、斯格尼根萤叶甲以及南美叶甲。
40.如权利要求39所述的方法,其中接触包括:
a)种植转基因种子,该转基因种子能够产生表达该核酸分子的转基因植物,其中该根萤叶甲属昆虫摄食该转基因植物或其部分;或者
b)将包含该核酸分子的组合物施用至种子或植物或其部分,其中该根萤叶甲属昆虫摄食该种子、该植物或其部分。
41.如权利要求39所述的方法,其中该转基因种子和转基因植物是玉米种子和玉米植物。
42.如权利要求39所述的方法,其中该种子或植物是玉米种子或玉米植物。
43.一种控制根萤叶甲属昆虫的方法,该方法包括使该根萤叶甲属昆虫与作为如权利要求1-8所述的干扰RNA分子或能够产生如权利要求1-8所述的干扰RNA分子的核酸分子接触,该干扰RNA分子用于抑制靶基因在该根萤叶甲属昆虫中的表达,并且使该根萤叶甲属昆虫至少与第二杀昆虫剂接触以控制根萤叶甲属。
44.一种控制根萤叶甲属昆虫的方法,该方法包括使该根萤叶甲属昆虫与作为如权利要求1-8所述的干扰RNA分子或能够产生如权利要求1-8所述的干扰RNA分子的核酸分子接触,该干扰RNA分子用于抑制靶基因在该根萤叶甲属昆虫中的表达,并且使该根萤叶甲属昆虫至少与第二杀昆虫剂接触以控制根萤叶甲属,从而控制该根萤叶甲属昆虫,其中所述第二杀昆虫剂包含苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白。
45.一种控制根萤叶甲属昆虫的方法,该方法包括使该根萤叶甲属昆虫与作为如权利要求1-8所述的干扰RNA分子或能够产生如权利要求1-8所述的干扰RNA分子的核酸分子接触,该干扰RNA分子用于抑制靶基因在该根萤叶甲属昆虫中的表达,并且使该根萤叶甲属昆虫至少与第二杀昆虫剂接触以控制根萤叶甲属,从而控制该根萤叶甲属昆虫,其中所述第二杀昆虫剂不包含苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白。
46.如权利要求43所述的方法,其中该第二杀昆虫剂包含马铃薯糖蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、脲酶、α-淀粉酶抑制剂、成孔蛋白、凝集素、工程化抗体或抗体片段、或几丁质酶。
47.如权利要求45所述的方法,其中该第二杀昆虫剂包含蜡样芽孢杆菌杀昆虫蛋白、致病杆菌属杀昆虫蛋白、光杆菌属杀昆虫蛋白、侧孢短芽孢杆菌杀昆虫蛋白、球形赖氨酸芽胞杆菌杀昆虫蛋白、色杆菌属杀昆虫蛋白、噬虫霉耶尔森菌杀昆虫蛋白、乳状芽孢杆菌杀昆虫蛋白、或梭菌属杀昆虫蛋白。
48.一种减少转基因植物上的成虫根萤叶甲属昆虫种群的方法,该转基因植物表达Cry蛋白、杂种Cry蛋白或修饰的Cry蛋白,该方法包括在该转基因植物中表达作为如权利要求1所述的干扰RNA分子或能够产生如权利要求1所述的干扰RNA分子的核酸分子,该干扰RNA分子抑制靶基因在成虫根萤叶甲属昆虫中的表达,从而减少该成虫根萤叶甲属昆虫种群。
49.一种减少对如权利要求1所述的干扰RNA分子的抗性在根萤叶甲属昆虫种群中的发展的方法,该方法包括在由该根萤叶甲属昆虫种群摄食的转基因植物中表达如权利要求1所述的干扰RNA分子,该干扰RNA分子抑制靶基因在幼虫和成虫根萤叶甲属昆虫中的表达,从而与暴露于能够抑制靶基因在幼虫或成虫根萤叶甲属昆虫中的表达的干扰RNA分子的根萤叶甲属昆虫种群相比,减少抗性在该根萤叶甲属昆虫种群中的发展。
50.一种降低从靶基因转录的靶RNA在根萤叶甲属昆虫中的平的方法,该方法包括使该根萤叶甲属昆虫与包含如权利要求1至8中任一项所述的干扰RNA分子的组合物接触,其中该干扰RNA分子降低该靶RNA在该根萤叶甲属昆虫的细胞中的水平。
51.如权利要求50所述的方法,其中该靶RNA编码的蛋白质的产生减少。
52.如权利要求51所述的方法,其中该蛋白质包含与SEQ ID NO:250、254、260具有至少
85%同一性的氨基酸序列。
53.如权利要求50所述的方法,其中该干扰RNA来自表达该干扰RNA的转基因生物体。
54.如权利要求53所述的方法,其中该转基因生物体是转基因植物、转基因微生物、转基因细菌或转基因内寄生菌。
55.如权利要求50所述的方法,其中该干扰RNA对于根萤叶甲属昆虫是致死的。
56.如权利要求55所述的方法,其中该根萤叶甲属昆虫选自下组,该组由以下组成:巴氏根萤叶甲、西方玉米根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲、黄瓜条根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲、斯格尼根萤叶甲以及南美叶甲。
57.一种赋予植物或其部分对根萤叶甲属昆虫耐受性的方法,该方法包括向该植物或其部分中引入如对应的前述权利要求中任一项所述的干扰RNA分子、核酸分子、核酸构建体、和/或组合物,从而赋予该植物或其部分对该根萤叶甲属昆虫的耐受性。
58.一种减少被根萤叶甲属昆虫摄食的植物的根损害的方法,该方法包括向该植物的细胞中引入如对应的前述权利要求中任一项所述的干扰RNA分子、核酸分子、核酸构建体、和/或组合物,从而减少对该植物的根损害。
59.一种产生对根萤叶甲属昆虫具有毒性的转基因植物细胞的方法,该方法包括向植物细胞中引入如对应的前述权利要求中任一项所述的干扰RNA、核酸分子、核酸构建体、和/或组合物,从而产生与对照植物细胞相比,对该根萤叶甲属昆虫具有毒性的转基因植物细胞。
60.多个转基因植物细胞,其由如权利要求59所述的方法产生。
61.如权利要求60所述的多个转基因植物细胞,其中使这些植物细胞在包括天然日光的条件下生长。
62.一种产生对根萤叶甲属昆虫摄食损害具有增强的耐受性的转基因植物的方法,该方法包括向植物中引入如对应的前述权利要求中任一项所述的干扰RNA分子、核酸分子、或核酸构建体,从而产生与对照植物相比,对根萤叶甲属昆虫摄食损害具有增强的耐受性的转基因植物。
63.如权利要求62所述的方法,其中通过转化植物细胞并且自该转化的植物细胞产生该转基因植物来进行该引入步骤。
64.如权利要求62所述的方法,其中通过共同培育两种植物来进行该引入步骤。
65.一种增强根萤叶甲属昆虫种群的控制的方法,该方法包括提供如权利要求25所述的转基因植物或植物部分并且向该植物或植物部分施用化学杀有害生物剂。
66.如权利要求65所述的方法,其中该化学杀有害生物剂是氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、有机磷酸酯、friprole、新烟、有机氯化物、沙蚕毒素或其组合。
67.如权利要求65所述的方法,其中该化学杀有害生物剂包含选自下组的活性成分,该组由以下组成:克百威、胺甲、灭多虫、联苯菊酯、七氟菊酯、氯菊酯、氟氯氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、毒死蜱、氯磷、乐果、灭线磷、马拉硫磷、甲基对硫磷、甲拌磷、特丁磷、叔丁嘧啶磷、氟虫腈、啶虫脒、吡虫啉、噻虫啉、噻虫嗪、硫丹、杀虫磺及其组合。
68.如权利要求67所述的方法,其中该活性成分在选自下组的产品中进行递送,该组由以下组成:
及其组合。
69.一种为玉米种植者提供控制玉米作物中的根萤叶甲属昆虫有害生物种群的手段的方法,该方法包括(a)向该种植者销售或为其提供包含本发明的干扰RNA分子、核酸分子、核酸构建体、和/或组合物的转基因玉米种子;并且(b)向该种植者做广告宣传该转基因玉米种子产生控制根萤叶甲属有害生物种群的转基因玉米植物。
70.一种鉴定直系同源靶基因用作控制植物有害生物的RNAi策略的方法,所述方法包括以下步骤:
a)产生将扩增选自下组的靶标的引物对,该组包含SEQ ID NO:49、50、57、58、69、70,或其互补序列,或由其组成,
b)扩增来自该植物有害生物的核酸样品的直系同源靶基因,
c)鉴定直系同源靶基因的序列,
d)产生干扰RNA分子,其中该RNA包含至少一种dsRNA,其中该dsRNA是包含退火的互补链的双链RNA的区域,其中的一条链包含具有至少19个连续核苷酸的序列,该序列与该靶基因中的直系同源靶核苷酸序列是至少部分互补的,以及
e)确定步骤(d)的干扰RNA分子是否对该植物有害生物具有杀昆虫活性;
其中如果该干扰RNA对该植物有害生物靶基因具有杀昆虫活性,则已鉴定出用于控制植物有害生物的直系同源靶基因。

说明书全文

使用RNA分子控制鞘翅目有害生物

[0001] 序列表
[0002] 提供ASCII文本格式的序列表作为纸质副本的替代,该序列表是根据37 C.F.R.§1.821提交的,名称为“81040_ST25.txt”,大小为467千字节,于2017年6月22日生成并经由EFS-Web提交。这个序列表特此通过引用以其披露内容并入本说明书中。

技术领域

[0003] 本发明总体上涉及由其摄食活动而引起对作物植物损害的有害生物的控制,并且更具体地涉及通过包含干扰RNA分子的组合物控制鞘翅目有害生物。本发明进一步涉及包
含干扰RNA分子的组合物并且涉及使用此类组合物的方法。

背景技术

[0004] 根萤叶甲属中的昆虫种类(玉米根虫和黄瓜叶甲)被认为是对作物植物最重要的有害生物中的一些。例如,玉米根虫的种类,包括西方玉米根萤叶甲(Diabrotica 
virgifera virgifera),西方玉米根虫(WCR),巴氏根萤叶甲(D.barberi),北方玉米根虫
(NCR),黄瓜十一星叶甲食根亚种(D.undecimpunctata howardi),南方玉米根虫(SCR)及墨西哥玉米根萤叶甲(D.virgifera zeae),墨西哥玉米根虫(MCR),是北美最具破坏性的玉米有害生物,每年导致估计超过十亿美元的损失。西方玉米根虫也已经入侵欧洲并且每年导
致估计五亿欧元损失。南美叶甲(除了别的之外,俗名包括叶甲、巴西小甲虫、葫芦甲虫及菊花甲虫)在南美是一种重要的玉米、大豆及花生有害生物。
[0005] 玉米损失的大部分由根虫幼虫摄食导致。刚孵出的根虫幼虫位于土壤中的玉米根部并且最初开始摄食细根毛并钻入玉米植物的根尖中。随着幼虫长大,它们摄食初生根并
挖隧道进入其中。当根虫数量巨大时,幼虫摄食和由根腐病病原体导致的受损根的劣变可
以导致根减少至茎的基部。严重的根损伤干扰根将和营养素运输进植物的能,减少植
物生长,并且导致谷物产量减少。严重的根损伤还可以导致玉米植物的倒伏,使得机械收获更困难或不可能。玉米根虫成虫主要摄食玉米须、花粉以及暴露的穗尖上的籽粒。如果玉米根虫成虫在玉米生殖组织存在之前开始出现,则成虫可以摄食叶组织,刮掉绿色的表面组
织并且留下窗玻璃外观。成虫摄食穗丝可以导致穗尖处的穗丝减少,通常称作穗丝修剪
(silk clipping)。在大田玉米中,甲虫种群在花粉散发过程中可以达到足以导致严重的穗丝修剪的程度,这可以干扰授粉并减少收率。因此,不像仅幼虫期导致损失的玉米的鳞翅目有害生物,玉米根虫的幼虫期和成虫期都能够对玉米导致经济损失。
[0006] 根萤叶甲属昆虫有害生物主要是通过密集应用化学杀有害生物剂来控制,这些化学杀有害生物剂通过抑制昆虫生长、预防昆虫摄食或繁殖或导致死亡而可以有效对抗幼虫
期和成虫期。由此可以达到良好的昆虫控制,但这些化学品有时也会影响其他益虫。另外的问题出现在使用高杀昆虫剂的区域中,在这些区域中玉米根虫甲虫种群对某些杀昆虫剂已
经变得有抗性。通过各种抗性管理实践已部分地缓和了这种状况,但对于可替代的有害生
物控制试剂存在着越来越多的需要。
[0007] 来自苏金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的若干天然Cry蛋白或工程化的Cry蛋白已经在转基因作物植物中表达并且在商业上被开发以控制某些鳞翅目和鞘翅目昆
虫有害生物。例如,起始于2003年,通过表达Cry3Bb1、Cry34Ab1/Cry35Ab1、或修饰的Cry3A(mCry3A)或Cry3Ab(eCry3.1Ab)蛋白而控制玉米根虫的转基因玉米杂交种在美国已经是可
商购的。
[0008] 种子产业、大学研究员以及美国环境保护局已经一起合作来制定管理计划,以帮助缓解昆虫对表达杀昆虫蛋白的转基因植物的抗性的发生。它们主要是基于高剂量以及避
护所策略。针对玉米的高剂量策略是使用表达甚至足够杀死部分抗性昆虫的高水平的杀昆
虫蛋白(例如Cry蛋白)的玉米杂交种。基础的假设是杀死部分抗性的昆虫并且大力防止它
们交配,从而延迟了抗性的产生。高剂量策略的成功部分取决于杀昆虫蛋白对具体昆虫种
类的特异性活性以及多少该杀昆虫蛋白可以被表达于转基因玉米植物中。杀昆虫蛋白对有
害生物的特异性活性越高,需要表达于转基因植物中以实现高剂量策略的杀昆虫蛋白的量
越少。例如,表达鳞翅目-有效Cry蛋白(Cry1Ab)的玉米杂交种被认为对抗主要靶有害生物
欧洲玉米螟(玉米螟)是高剂量的。由于Cry1Ab以LC50<10ng/cm2对于欧洲玉米螟幼虫很具
毒性(即,高特异性活性),在转基因植物中可实现的Cry1Ab表达水平很容易将这样的玉米
杂交种置于高剂量范畴中。然而,不像鳞翅目-有效产品,当前根虫产品不被认为是高剂量的。它们表达的蛋白不有效对抗成虫并且对晚龄幼虫具有有限活性。因此,当前转基因根虫产品允许一些根虫幼虫存活并成为成虫。
[0009] 因此,由玉米根虫成虫导致的穗丝修剪的经济水平仍可以甚至出现在种植为转基因玉米根虫杂交种的部分大田中。例如,西方玉米根虫成虫的密度可以在种植为转基因玉
米根虫杂交种的部分大田中超过经济水平,这归因于甲虫的迁入以及成虫从转基因根系的
直接羽化。已经有许多报道确认西方玉米根虫成虫羽化自某些玉米转基因根虫杂交种
(Crowder等人2005.J.Econ.Entomol.[经济昆虫学杂志]98:534-551)。另一个出版物表明,当在大田中遇到一些转基因玉米植物或非转基因玉米植物时,西方玉米根虫成虫将展现出
类似的摄食行为,并且表明转基因植物中的某些杀昆虫蛋白对可能影响抗性管理的成虫将
具有显著效果是不太可能的。
[0010] 因此,鉴定具有新作用模式的可替代的昆虫控制试剂将是有益的。特别有用的将可以是对靶昆虫有害生物的多个生活期具有毒性的新昆虫控制试剂。此类昆虫控制试剂可
以包括靶向遗传因子(例如对于靶昆虫有害生物的生长和存活必不可少的基因)的那些昆
虫控制试剂。
[0011] 当一种生物体识别双链RNA(dsRNA)分子并水解它们时,RNA干扰(RNAi)发生。所产生的水解产物是约19-24个核苷酸长度的小RNA片段,这些小RNA片段称作小干扰RNA
(siRNA)。然后这些siRNA扩散或被携带至整个生物体,包括越过细胞膜,在那里它们与mRNA(或其他的RNA)杂交并且导致RNA的水解。干扰RNA由RNA干扰沉默复合体(RISC)识别,RNA的效应链(或“引导链”)位于该复合体中。此引导链充当双链体序列的识别和破坏模板。每次siRNA与其互补RNA靶标杂交,该此过程都被重复,有效防止那些mRNA被翻译,并且因此“沉默”mRNA自其中转录的特异性基因的表达。大部分植物微小RNA(miRNA)对其靶mRNA显示出
广泛的配对,并引导其裂解(Jones-Rhoades等人(2006)Annu.Rev.Plant Biol.[植物
生物学年评]57,19-53;Llave等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]
97,13401-13406)。在其他例子中,干扰RNA可以结合至具有非完美互补性的靶RNA分子,导致在没有mRNA降解的情况下的翻译阻抑。到目前为止,多数研究的动物miRNA似乎以此方式发挥功能。
[0012] 已发现RNAi可用于某些昆虫有害生物的昆虫控制。RNAi策略典型地使用合成的、非天然存在的“干扰RNA”或“干扰RNA分子”,其典型地至少包含针对靶基因的RNA片段、间隔子序列和与第一RNA片段互补的第二RNA片段,从而可以形成双链RNA结构。这种非天然的双链RNA利用昆虫中的天然RNAi途径来触发可能导致摄食和/或生长停止和可能导致昆虫有
害生物的死亡的靶基因的下调。
[0013] 尽管在文献中已知聚焦于靶基因的RNAi策略可以在根萤叶甲属物种中产生杀昆虫效果,但还已知的是,不是每个靶序列都是成功的,并且不能预测杀昆虫效果。当用作
dsRNA或siRNA时,绝大多数与玉米根虫DNA互补的序列在玉米根虫物种中不是致命的。例
如,Baum等人((2007)Nature Biotechnology[自然生物技术]25:1322-1326)描述了通过
RNAi抑制若干种WCR基因靶标的效果。这些作者报道,即使在超过520ng/cm2的非常高的
iRNA(例如,dsRNA)浓度下,他们测试的26种靶基因中也有8种不能提供实验上显著的鞘翅
目有害生物死亡率。另外,已知针对靶基因的dsRNA分子在一种昆虫物种中产生强RNAi效
果,这样的靶基因可能不是针对不同昆虫物种的良好靶标。Whyard等人((2009)Insect 
Biochemistry and Molecular Biology[昆虫生物化学与分子生物学]39:824-832)报道了
在四种不同昆虫物种中测试针对V-ATP酶基因的同种dsRNA分子时功效上有近100倍差异。
[0014] 对于含有杀昆虫活性成分的组合物,以及对于使用此类组合物的方法,例如用于作物保护或昆虫介导的疾病的控制存在不断的需要。需要新颖的组合物来克服对现有杀昆
虫剂的抗性问题和/或帮助缓解对现有转基因植物方法的抗性的发展。理想地,此类组合物具有高毒性并且当被靶有害生物口服摄取时是有效的并且对于使用对抗有害生物昆虫的
幼虫期和成虫期两者而言具有适用性。因此,提供了其中这些特性中的任一种被增强的组
合物的任何发明将代表本领域的进步。

发明内容

[0015] 以上所列出的需要是通过本发明来满足的,在多个实施例中,本发明提供了控制经济上重要的昆虫有害生物的新方法。本发明部分地包含抑制一种或多种靶基因和蛋白质
在鞘翅目昆虫有害生物中表达的方法。具体而言,本发明包含调节一种或多种靶基因在根
萤叶甲属物种中的表达的方法,如西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)、墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米
根虫)、南美叶甲(Diabrotica speciosa)(菊花甲虫)以及相关物种,该方法导致摄食、生
长、发育及繁殖的中止,并且最终导致昆虫的死亡。该方法包括将包含双链RNA(dsRNA)的干扰RNA分子或其修饰形式(如小干扰RNA(siRNA)序列)引入进有害生物昆虫体内的细胞或进
入细胞外环境(如中肠)中,其中该dsRNA或siRNA进入这些细胞中,并且抑制至少一种或多
种靶基因的表达,并且其中该一种或多种靶基因的抑制在该有害生物昆虫上发挥有害作
用。该干扰RNA分子是非天然存在的。明确考虑的是,通过在该有害生物的饲料中提供一种或多种包含含有dsRNA或siRNA分子的干扰RNA分子的组合物,本发明的这些方法和组合物
将在限制或消除任何植物中或其上的有害生物昆虫侵染方面是有用的。本发明还提供了干
扰RNA分子,当递送至昆虫有害生物时,该干扰RNA分子通过毒性作用抑制该昆虫有害生物
存活、生长、摄食和/或繁殖的能力,或限制有害生物相关的损害或作物植物的损失。这样的递送可以是通过在转基因植物(例如玉米)中产生干扰RNA,或通过将包含干扰RNA的组合物
局部施用至植物或植物种子(如玉米植物或玉米种子)。递送可以进一步通过使昆虫与干扰
RNA接触进行,如当昆虫摄食包含干扰RNA的植物材料时,因为该植物材料通过转基因方法
正在表达干扰RNA,或者因为该植物材料涂覆有包含干扰RNA的组合物。该干扰RNA也可以以人工昆虫饲料提供,该昆虫然后通过摄食与其接触。该干扰RNA分子包含如下核苷酸序列,该核苷酸序列与可从该有害生物昆虫的靶基因转录的mRNA的核苷酸序列或可从该有害生
物昆虫的靶基因转录的mRNA的核苷酸序列的一部分互补并且因此抑制该靶基因的表达,导
致摄食、生长、发育、繁殖的中止,并且最终导致该有害生物昆虫的死亡。本发明进一步涉及包含或编码本发明的干扰RNA分子的一条链的至少一个片段的核酸构建体、核酸分子和重
组载体。本发明还提供了如下嵌合核酸分子,这些嵌合核酸分子包含该干扰RNA的dsRNA的
一条反义链,该反义链可操作地与植物微小RNA前体分子相关。本发明还提供了人工植物微小RNA前体,这些前体包含本发明的干扰RNA的dsRNA的一条反义链。
[0016] 本发明进一步提供了如下干扰核糖核酸(RNA)分子,其中该RNA包含至少一种dsRNA,其中该dsRNA是包含退火的互补链的双链RNA的区域,其中的一条链包含具有至少19个连续核苷酸的序列,该序列与在根萤叶甲属靶基因中的靶核苷酸序列是至少部分互补
的,并且(i)至少与SEQ ID NO:121-210、SEQ ID NO:274-276、SEQ ID NO:280-282、SEQ ID NO:304-324的19个连续核苷酸的片段,或其互补序列具有至少85%同一性;或(ii)至少包
含SEQ ID NO:121-210或SEQ ID NO:274-276、SEQ ID NO:280-282、SEQ ID NO:304-324的
19个连续核苷酸的片段,或其互补序列;或(iii)至少包含编码由SEQ ID NO:121-210、SEQ ID NO:274-276、SEQ ID NO:280-282、SEQ ID NO:304-324编码的基酸序列的核苷酸序列的19个连续核苷酸的片段,或其互补序列,其中该干扰RNA分子对鞘翅目植物有害生物具有杀昆虫活性。在一些实施例中,该干扰分子可以包含至少两种dsRNA,其中每种dsRNA包含如下核苷酸序列,该序列与该靶基因内的靶核苷酸序列是至少部分互补的。在进一步的实施
例中,每种dsRNA可以包含不同的核苷酸序列,该序列与该靶基因中的不同靶核苷酸序列是互补的。
[0017] 本发明进一步提供了如下组合物,这些组合物包含本发明的一种或多种干扰RNA分子,这些干扰RNA分子包含两种或更多种dsRNA分子,其中这两种或更多种RNA分子各自包含不同的反义链,或包含两种或更多种核酸构建体或核酸分子或人工植物微小RNA前体。
[0018] 本发明进一步提供了用于抑制鞘翅目昆虫基因表达的杀昆虫组合物,该组合物包含本发明的dsRNA,以及农业上可接受的载体。在一个实施例中,在此描述的根萤叶甲属基因表达的抑制引起摄食和生长的中止,并且最终导致该根萤叶甲属昆虫的死亡。
[0019] 本发明进一步涉及转基因植物,这些转基因植物产生一种或多种本发明的干扰RNA分子,这些干扰RNA分子自我保护免受昆虫摄食损害,并且涉及单独使用或与其他昆虫
控制策略组合使用这些植物以赋予最大昆虫控制能力的方法。产生一种或多种本发明的干
扰RNA分子或用包含一种或多种本发明的干扰RNA分子的组合物处理的植物和/或植物部分
对昆虫有害生物侵染是高度抗性的。例如,经济上重要的鞘翅目有害生物可以通过一种产
生本发明的干扰RNA分子的植物或通过用一种包含本发明的干扰RNA分子的组合物处理的
植物或植物种子加以控制。
[0020] 本发明还提供了一种控制鞘翅目昆虫植物有害生物的方法,该方法包括使该鞘翅目昆虫与一种作为本发明的干扰RNA或能够产生本发明的干扰RNA的核酸分子接触,该干扰
RNA用于抑制基因在该鞘翅目昆虫中的表达,从而控制该鞘翅目昆虫。
[0021] 在其他方面中,本发明提供了一种减少转基因植物上的根萤叶甲属昆虫种群的方法,该转基因植物表达第二杀昆虫剂,例如杀昆虫蛋白(除了一种能够抑制靶基因在根萤叶甲属昆虫中表达的本发明的干扰RNA之外),从而减少该根萤叶甲属昆虫种群。该第二杀昆
虫剂可以源自苏云金芽孢杆菌的杀昆虫蛋白。苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白可以是许多杀昆
虫蛋白中的任何一种,包括但不限于Cry1蛋白、Cry3蛋白、Cry7蛋白、Cry8蛋白、Cry11蛋白、Cry22蛋白、Cry23蛋白、Cry36蛋白、Cry37蛋白、Cry34蛋白连同Cry35蛋白、二元杀昆虫蛋白CryET33和CryET34、二元杀昆虫蛋白TIC100和TIC101、二元杀昆虫蛋白PS149B1、VIP、
TIC900或相关蛋白、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、修饰的Cry3A蛋白、或杂合蛋白或由任何前述杀昆虫蛋白制成的嵌合体。在其他实施例中,该苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白选自
下组,该组由以下组成:Cry3Bb1、Cry34Ab1连同Cry35Ab1、mCry3A以及eCry3.1Ab。
[0022] 在其他实施例中,该第二杀昆虫剂可以源自除苏云金芽孢杆菌外的来源。该第二杀昆虫剂可以是选自下组的试剂,该组包含:铃薯糖蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、脲酶、α-淀粉酶抑制剂、成孔蛋白、几丁质酶、凝集素、工程化抗体或抗体片段、蜡样芽孢杆菌杀昆虫蛋白、致病杆菌属(如嗜线虫致病杆菌或伯氏致病杆菌)杀昆虫蛋白、光杆菌属(如发光杆菌或非共生光杆菌)杀昆虫蛋白、侧孢短芽孢杆菌杀昆虫蛋白、球形赖氨酸芽胞杆菌杀昆虫蛋白、色杆菌属杀昆虫蛋白、噬虫霉耶尔森菌杀昆虫蛋白、乳状芽孢杆菌杀昆虫蛋白、梭菌属(如双酶梭菌)杀昆虫蛋白、和木质素。在其他实施例中,该第二试剂可以是至少一种源自来自发光杆菌、致病杆菌、沙雷氏菌或耶尔森氏菌的杀昆虫毒素复合物(Tc)的杀昆虫蛋白。
在其他实施例中,该杀昆虫蛋白可以是源自杀昆虫细菌(如光杆菌属)的ADP-核糖基转移
酶。在其他实施例中,该杀昆虫蛋白可以是VIP蛋白,如来自蜡样芽孢杆菌的VIP1或VIP2。在仍其他实施例中,该杀昆虫蛋白可以是源自杀昆虫细菌的二元毒素,如来自侧孢芽孢杆菌
的ISP1A和ISP2A或来自球形赖氨酸芽胞杆菌的BinA和BinB。在仍其他实施例中,该杀昆虫
蛋白可以是工程化的或可以是任何前述杀昆虫蛋白的杂合体或嵌合体。
[0023] 在其他方面中,本发明提供了一种减少对本发明的干扰RNA的抗性在根萤叶甲属昆虫种群中的发展的方法,该方法包括在由该根萤叶甲属昆虫种群摄食的转基因植物中表
达一种本发明的干扰RNA,该干扰RNA能够抑制靶基因在幼虫和成虫根萤叶甲属昆虫中的表
达,从而与暴露于仅能够抑制在此描述的根萤叶甲属基因在根萤叶甲属昆虫的幼虫期或成
虫期的表达的干扰RNA的根萤叶甲属昆虫种群相比,减少抗性在该根萤叶甲属昆虫种群中
的发展。
[0024] 在其他方面中,本发明提供了一种降低可从在此描述的根萤叶甲属基因转录的靶RNA在根萤叶甲属昆虫中的水平的方法,该方法包括使该根萤叶甲属昆虫与包含本发明的
干扰RNA分子的组合物接触,其中该干扰RNA分子降低该靶RNA在根萤叶甲属昆虫的细胞中
的水平。
[0025] 在仍其他方面中,本发明提供了一种赋予植物或其部分对根萤叶甲属昆虫耐受性或鞘翅目植物有害生物耐受性的方法,该方法包括向该植物或其部分中引入本发明的干扰
RNA分子、dsRNA分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子和/或组合物,从而赋予该植物或其部分对该根萤叶甲属昆虫或鞘翅目植物有害生物的耐受性。
[0026] 在另外的方面中,本发明通过了一种减少被根萤叶甲属昆虫摄食的植物的根损害的方法,该方法包括向该植物的细胞中引入本发明的干扰RNA分子、dsRNA、核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子和/或组合物,从而减少被根萤叶甲属昆虫摄食的植物的根损害。
[0027] 在其他方面中,本发明提供了一种产生对鞘翅目昆虫具有毒性的转基因植物细胞的方法,该方法包括向植物细胞中引入本发明的干扰RNA分子、dsRNA、核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子和/或组合物,从而产生与对照植物细胞相
比,对该鞘翅目昆虫具有毒性的转基因植物细胞。
[0028] 在另外的方面中,本发明提供了一种产生对鞘翅目昆虫摄食损害具有增强的耐受性的转基因植物的方法,该方法包括向植物中引入本发明的干扰RNA分子、dsRNA、核酸分
子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子和/或组合物,从而产生与对照植物相比,对鞘翅目昆虫摄食损害具有增强的耐受性的转基因植物。
[0029] 在其他方面中,本发明提供了一种增强鞘翅目昆虫种群的控制的方法,该方法包括提供一种本发明的转基因植物或转基因种子并且向该转基因植物或该转基因种子施用
一种对鞘翅目昆虫而言具有杀虫性的化学杀有害生物剂,从而增强该鞘翅目昆虫种群的控
制。
[0030] 在其他方面中,本发明提供了为玉米种植者提供将玉米作物中的鞘翅目昆虫有害生物种群控制在低于经济阈值之下的手段的方法,该方法包括(a)向该种植者销售或为其
提供包含本发明的dsRNA、核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子和/或组合物的转基因玉米种子;并且(b)向该种植者做广告宣传该转基因玉米种子产生
能够控制鞘翅目昆虫有害生物种群的转基因玉米植物。
[0031] 在另一方面,本发明提供了一种鉴定直系同源靶基因用作控制植物有害生物的RNAi策略的方法,所述方法包括以下步骤:a)产生将扩增选自下组的靶标的引物对,该组包含SEQ ID NO:31-90或其互补序列,或由其组成;b)扩增来自该植物有害生物的核酸样品的直系同源靶基因;c)鉴定直系同源靶基因的序列;d)产生干扰RNA分子,其中该RNA包含至少一种dsRNA,其中该dsRNA是包含退火的互补链的双链RNA的区域,其中的一条链包含具有至少19个连续核苷酸的序列,该序列与该靶基因中的直系同源靶核苷酸序列是至少部分互补
的;以及e)确定步骤(d)的干扰RNA分子是否对该植物有害生物具有杀昆虫活性。如果该干
扰RNA对植物有害生物靶基因具有杀昆虫活性,则已鉴定出用于控制植物有害生物的直系
同源靶基因。
[0032] 在下文本发明的描述中更详细地阐述本发明的这些方面和其他方面。
[0033] 序列表中的序列简述
[0034] SEQ ID NO:1-30是用于合成干扰RNA分子以测试杀昆虫活性的DNA编码序列的片段。
[0035] SEQ ID NO:31-90是用于鉴定来自根萤叶甲属的靶基因的引物的核酸序列,使用RNAi策略将这些靶基因用于测试杀昆虫活性。
[0036] SEQ ID NO:91-120是在基于RNAi的杀昆虫活性筛选中鉴定的30种靶基因的完整DNA编码序列。
[0037] SEQ ID NO:121-150是用于合成干扰RNA分子以测试杀昆虫活性的DNA编码序列的片段的RNA序列。
[0038] SEQ ID NO:151-180是在基于RNAi的杀昆虫活性筛选中鉴定的30种靶基因的完整DNA编码序列的RNA序列。
[0039] SEQ ID NO:181-210是在基于RNAi的杀昆虫活性筛选中鉴定的30种靶基因的完整mRNA序列,包括5’和3’UTR。
[0040] SEQ ID NO:211-240是在基于RNAi的杀昆虫活性筛选中鉴定的30种靶基因的完整DNA编码序列的反义RNA序列。
[0041] SEQ ID NO:241-270是由在基于RNAi的杀昆虫活性筛选中鉴定的30种靶基因编码的蛋白质的氨基酸序列。
[0042] SEQ ID NO:271-273是在基于RNAi的杀昆虫活性筛选中鉴定的三种选择的WCR靶基因(BPA_2526、BPA_46378、和BPA_10976)的NCR直系同源物的DNA编码序列。
[0043] SEQ ID NO:274-276是在基于RNAi的杀昆虫活性筛选中鉴定的三种选择的WCR靶基因(BPA_2526、BPA_46378、和BPA_10976)的NCR直系同源物的DNA编码序列的RNA序列。
[0044] SEQ ID NO:277-279是在基于RNAi的杀昆虫活性筛选中鉴定的三种选择的WCR靶基因(BPA_2526、BPA_46378、和BPA_10976)的SCR直系同源物的DNA编码序列。
[0045] SEQ ID NO:280-282是在基于RNAi的杀昆虫活性筛选中鉴定的三种选择的WCR靶基因(BPA_2526、BPA_46378、和BPA_10976)的SCR直系同源物的DNA编码序列的RNA序列。
[0046] SEQ ID NO:283-289是BPA_2526靶基因片段的DNA序列。
[0047] SEQ ID NO:290-297是BPA_46378靶基因片段的DNA序列。
[0048] SEQ ID NO:298-303是BPA_10976靶基因片段的DNA序列。
[0049] SEQ ID NO:304-310是BPA_2526靶基因mRNA片段的RNA序列。
[0050] SEQ ID NO:311-318是BPA_46378靶基因mRNA片段的RNA序列。
[0051] SEQ ID NO:319-324是BPA_10976靶基因mRNA片段的RNA序列。
[0052] SEQ ID NO:325-326是各自编码靶基因的发夹RNA结构的DNA序列。

具体实施方式

[0053] 下面提供了本发明的详细说明,以协助本领域的普通技术人员实践本发明。本说明不旨在是可以实施本发明的所有不同方式,或可以添加到本发明中的所有特征的详细目
录。例如,关于一个实施例所说明的特征可以并入其他实施例中,并且关于一个具体实施例所说明的特征可以从那个实施例删除。另外,鉴于本披露内容,对本发明的不同实施例的众多变体以及附加对于本领域技术人员是明显的,这不脱离本发明。因此,以下说明旨在阐述本发明的一些具体实施例,并且并没有穷尽地叙述其所有排列、组合和变化。本领域的普通技术人员将意识到,在在此描述的这些实施例中可以做出修饰和变化而不偏离本发明的精
神或范围。
[0054] 除非另外定义,在此所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在此本发明的说明中使用的术语是仅出于描述具体
实施例的目的,且并不旨在限制本发明。在此提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用以其全文结合在此。
[0055] 为了清晰起见,定义了在本说明书中所使用的某些术语并且将其呈现如下:
[0056] 如在此使用的,“一个(a)”、“一个(an)”或“该(the)”可以意指一个或多于一个。例如,细胞可以意指单个细胞或多个细胞。
[0057] 如在此使用的,“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关的列出项的任何及全部可能组合,连同当以可替代性(或)解释时组合的缺少。
[0058] 另外,当指可计量值(例如化合物或试剂、剂量、时间、温度等等的量)时,如在此使用的,术语“约(about)”意图包括所指值的±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%、或甚至±0.1%的变化。
[0059] 如在此使用的,过渡短语“基本上由……组成”是指一项权利要求的范围将被解释为包括该权利要求中所提到的指定材料或步骤以及不实质上影响要求保护的发明的一个或多个基本特征和新特征的那些材料或步骤。因此,当用于本发明的权利要求中时,术语
“基本上由……组成”并不意在被解释为等同于“包含(comprising)”。“编码序列”是转录成RNA(如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、正义RNA或反义RNA)的核酸序列。优选地,RNA进而在生物中被翻译以产生蛋白质。
[0060] 术语核苷酸或氨基酸序列的“序列相似性”或“序列同一性”意指两个或更多个序列的同一性或相似性程度,并且可以常规地通过使用已知软件计算机程序(如Best-Fit或Gap成对比较程序(GCG威斯康星州软件包(Wisconsin Package),遗传学计算机集团公司
(Genetics Computer Group),科学先驱路575号(575 Science Drive),麦迪逊,威斯康星州,53711))确定。BestFit使用Smith和Waterman,Advances in Applied Mathematics[应
用数学进展]2:482-489(1981)的局部同源性算法以找到两个序列之间最佳的同一性或相
似性片段。通常通过在比较窗口上比较这两个序列的部分来进行两个或更多个多核苷酸或
多肽之间的序列比较,以鉴定并比较序列相似性的局部区域。比较窗口通常是从约20至200个连续核苷酸。Gap使用Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453
(1970)的方法执行所有一个序列与所有另一个相似的序列的全局比对。当使用序列比对程
序(如BestFit)来确定DNA序列同源性、相似性或同一性的程度时,可以使用默认设置,或者可以选择适当的评分矩阵以优化同一性、相似性或同源性评分。类似地,当使用程序(如
BestFit)来确定两个不同氨基酸序列之间的序列同一性、相似性或同源性时,可以使用默
认设置,或者可以选择适当的评分矩阵(如blosum45或blosum80)以优化同一性、相似性或
同源性评分。
[0061] 在两个核酸或两个氨基酸序列的上下文中,短语“基本上同一的”是指当针对最大对应性进行比较和比对时具有至少约50%核苷酸或氨基酸残基同一性的两个或更多个序列或子序列,如使用以下序列比较算法之一或通过目测检查所测量的。在某些实施例中,基本上同一的序列具有至少约60%、或至少约70%、或至少约80%、或甚至至少约90%或95%核苷酸或氨基酸残基同一性。在某些实施例中,基本上的同一性存在于这些序列的整个长
度为至少约50个残基的区域中,或在整个至少约100个残基的区域中,或这些序列在至少约
150个残基中是基本上同一的。在另外的实施例中,当这些序列在编码区的整个长度上时,这些序列是基本上同一的。
[0062] 在本发明的上下文中,术语“同源性”是指在两个核酸或氨基酸序列之间就核苷酸和氨基酸同一性或相似性而言的相似性水平(序列相似性或同一性)。同源性、同源物、以及同源的也是指不同核酸或蛋白质之间相似功能特性的概念。同源物包括直系同源物和旁系同源物的基因。可以通过使用在此公开的编码序列或在适当的数据库中找到的同源物(例
如在NCBI或其他数据库中),以一种或多种以下方式确定同源物。对于氨基酸序列,应使用算法比较序列(例如参见“同一性”和“基本上的同一性”部分)。对于核苷酸序列,可以用几乎相同的方式将一个DNA分子的序列与已知或推定的同源物的序列进行比较。跨越分子的
任何实质区域(DNA、RNA、或蛋白质分子)上,同源物是至少20%同一性、或至少30%同一性、或至少40%同一性、或至少50%同一性、或至少60%同一性、或至少70%同一性、或至少
80%同一性、或至少88%同一性、或至少90%同一性、或至少92%同一性、或至少95%同一性。
[0063] 用于比较的序列的最佳比对可以按照以下方式进行,例如通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman和
Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443(1970)的同源比对算法、通过Pearson和
Lipman,Proc.Nat'l.Acad Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444(1988)的相似性方法的
搜索,通过这些算法的计算机化实施(威斯康星州遗传学分析软件包中的GAP、BESTFIT、
FASTA和TFASTA,遗传学计算机集团公司(Genetics Computer Group),科学先驱路575号
(575Science Dr.),麦迪逊,威斯康星州),或通过目测检查(总体上参见Ausubel等人,下文)。
[0064] 适合于确定序列同一性百分比以及序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法,它描述于以下文献中:Altschul等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410(1990)。
执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for 
Biotechnology Information)公开地获得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。这种算法涉
及首先通过鉴定查询序列中具有长度W的短字码而鉴定得分高的序列对(HSP),这些得分高
的序列对当与数据库序列中具有相同长度的字码(word)进行比对时匹配或满足一些正值
阈值的得分T。T被称为邻近字码得分阈值(Altschul等人,1990)。这些初始的邻近字码命中充当种子用于起始搜索以发现包含它们的较长的HSP。然后,将这些字码命中在两个方向上沿着每个序列延伸直到累积的比对得分可以增加。对于核苷酸序列,使用参数M(对于一对
匹配残基的奖赏得分;总是>0)和N(对于错配残基的罚分;总是<0)来计算累积的得分。对于氨基酸序列,使用得分矩阵来计算累积得分。当累积的比对得分从它的最大达到值降低了
数量X;由于累积一个或多个负得分的残基比对使累积得分趋于零或零以下;或者到达任一序列的末端时,停止这些字码命中在每个方向上的延伸。BLAST算法的参数W、T、以及X决定了比对的灵敏度与速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、截止值(cutoff)为100、M=5、N=-4、以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列,
BLASTP程序使用字长(W)为3、期望值(E)为10、以及BLOSUM62评分矩阵作为默认值(参见
Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915(1989))。
[0065] 除了计算序列同一-性百分数之外,BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计分析(参见,例如Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:
5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似性的一种量度是最小概率总和(P(N)),它提供了在两个核苷酸或氨基酸序列之间会偶然发生匹配的概率的指示。例如,若在测试核酸序
列与参考核酸序列的比较中最小概率总和小于约0.1、更优选地小于约0.01、并且最优选地小于约0.001,则该测试核酸序列被认为是与该参考序列相类似的。
[0066] 用于进行序列比对的另一种被广泛使用和接受的计算机程序是CLUSTALW v1.6(Thompson等人Nuc.Acids Res.[核酸研究]22:4673-4680,1994)。将匹配的碱基或氨基酸
的数目除以碱基或氨基酸的总数目并乘以100,获得百分比同一性。例如,如果两个580个碱基对序列具有145个匹配的碱基,则它们会是25%同一的。如果两个进行比较的序列具有不同的长度,则将匹配的数目除以这两个长度中较短的一个。例如,如果在200个氨基酸的蛋白质与400个氨基酸的蛋白质之间存在100个匹配的氨基酸,则相对于较短的序列这两个蛋
白质是50%同一的。如果该较短的序列在长度上小于150个碱基或50个氨基酸,则将匹配的数目除以150(对于核酸碱基而言)或50(对于氨基酸而言)并乘以100,获得百分比同一性。
[0067] 当两个核苷酸序列在严格条件下彼此杂交时,这两个核苷酸序列也可以被认为是基本上同一的。在代表性实施例中,被认为基本上同一的两个核苷酸序列在高严格条件下
彼此杂交。
[0068] 术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指多核苷酸与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如,至少2倍于背景)的条件。严格条件是序列依赖性的并且在不同的情形下将会不同。通过控制该杂交和/或洗涤条件的严格度,能够鉴定与该探针(同源探测)100%互补的靶多核苷酸。可替代地,可调整严格条件以允许序列中的一些错配,这样使得检测到较低程度的相似性(异源探测)。典型地,严格条件将是这些:其中盐浓度小于约1.5M Na离子、典型地为约0.01至1.0M Na离子(或其他盐),pH为7.0至8.3,并且对于短探针(例如,10至50个核苷酸)温度为至少30℃而对于长探针(例如,大于50个核苷酸)至少约60℃。还可以通过添加去稳定剂(如甲酰胺)来达到严格条件。示例性低严格条件包括在37℃下使用30%至35%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS(w/v;十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液进行杂交,并且在50℃至55℃下在1×至2×SSC(20×SSC=3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。中等严格条件检测共享至少80%序列同一性的序列。示例性中等严格条件包括在
37℃下在40%至45%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS中杂交,并且在55℃至60℃下在0.5×至1×
SSC中洗涤。高严格条件检测共享至少90%序列同一性的序列。示例性高严格条件包括在37℃下在50%甲酰胺、1M NaCl、1%SDS中杂交,并且在60℃至65℃下在0.1×SSC中洗涤。特异性通常取决于杂交后的洗涤,关键因素是最终洗涤溶液的离子强度以及温度。对于DNA-DNA杂交体,可从Meinkoth以及Wahl(Anal.Biochem.[分析生物化学],138:267-284,1984)的方
程粗略估计Tm:Tm=81.5℃+16.6(log M)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L;其中M是一价阳离子的摩尔浓度,%GC是DNA中的苷以及胞嘧啶核苷酸的百分比,%form是杂交溶液中甲酰胺的百分比,并且L是杂交体的长度(单位为碱基对)。Tm是50%的互补靶序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在限定的离子强度及pH下)。对于每1%错配,Tm降低约1℃;因此,可调整Tm、杂交和/或洗涤条件以便杂交至所希望的同一性的序列。例如,如果寻找具有大约90%同一性的序列,则可将Tm降低10℃。一般来说,将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在限定的离子强度以及pH下的热熔点(Tm)低约5℃。然而,极严格条件可利用低于热熔点(Tm)1℃、2℃、3℃或4℃的杂交和/或洗涤;中等严格条件可利用低于热熔点(Tm)6℃、7℃、8℃、9℃或10℃的杂交和/或洗涤;低严格条件可利用低于热熔点(Tm)11℃、12℃、13℃、
14℃、15℃或20℃的杂交和/或洗涤。使用该方程、杂交和洗涤组成以及所希望的Tm,本领域普通技术人员应了解,杂交和/或洗涤溶液严格性的变化固有地得到了描述。如果所希望的错配程度导致Tm小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液),则优选增加SSC浓度以使得可使
用较高温度。有关核酸杂交的详尽指南见于以下文献:Tijssen,Laboratory Techniques 
in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes
[生物化学与分子生物学实验室技术-与核酸探针杂交],第I部分,第2章“Overview of 
principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays[杂
交原理概述和核酸探针测定策略]”,Elsevier(爱思唯尔),纽约(1993);以及Current 
Protocols in Molecular Biology[现代分子生物学实验技术],第2章,Ausubel等人编著,
Greene Publishing与Wiley-Interscience,纽约(1995)。严格杂交的方法是本领域已知
的,这些条件可以通过本领域已知的方法计算。这披露于Sambrook等人,Molecular 
Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆:实验室手册],第二版,Cold Spring Harbor 
Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],1989,Cold Spring Harbor[冷泉港],纽约以及
Current Protocols in Molecular Biology[现代分子生物学实验技术],Ausebel等人
(编),约翰·威利父子公司(John Wiley and Sons,Inc.),2000中。确定序列同一性百分比
的方法是本领域已知的,其实例是GCG计算机序列分析软件(GCG公司,麦迪逊,威斯康星
州)。
[0069] 如果在严格条件下彼此不杂交的核酸所编码的蛋白质是基本上同一的,则它们仍然是基本上同一的(例如,由于遗传密码的简并性)。
[0070] 两个核酸序列或蛋白质基本上同一的另一个指示是由第一核酸编码的蛋白质与由第二核酸编码的蛋白质进行免疫性交联反应。因此,蛋白质典型地是与第二蛋白质基本
上同一的,例如其中这两种蛋白质仅区别于保守性置换。
[0071] 当核酸序列编码了多肽(该多肽与由参考核酸序列所编码的多肽具有相同的氨基酸序列)时,这种核苷酸序列与这种参考核酸序列“同类编码”。
[0072] 如在此使用的,“互补”多核苷酸是能够根据标准Watson-Crick互补性规则发生碱基配的那些。具体而言,嘌呤将与嘧啶进行碱基配对,以便形成鸟嘌呤与胞嘧啶配对(G:C)和在DNA情况下腺嘌呤与胸腺嘧啶配对(A:T)或在RNA情况下腺嘌呤与尿嘧啶配对(A:U)的组合。例如,序列“A-G-T”结合至互补序列“T-C-A”。应当理解两种多核苷酸可以相互杂交,甚至它们彼此并不完全互补,其条件是每种多核苷酸具有至少一个与另一种多核苷酸基本
上互补的区域。
[0073] 术语“互补的(complementary)”或“互补性(complementarity)”是指多核苷酸在容许性盐条件和温度条件下通过碱基配对发生天然结合。两单链分子之间的互补性可以是“部分的(partial)”,其中这些核苷酸中仅一些结合,或者当这些单链分子之间存在完全互补性时,这种互补性可以是完全的。核酸链之间的互补性程度对于核酸链之间杂交的效率
和强度具有显著影响。
[0074] 如在此使用的,术语“基本上互补”或“部分互补的”意指两个核酸序列在其至少约50%、60%、70%、80%或90%的核苷酸处是互补的。在一些实施例中,这两个核酸序列可以至少在其85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的核苷酸处是互补的。术语“基本上互补的”和“部分互补的”也可以意指两个核酸序列可以在高严格性条件下杂交并且这类条件是本领域熟知的。
[0075] 如在此使用的,“dsRNA”或“RNAi”是指由单个自身互补RNA链或至少由两条互补RNA链形成的多核糖核苷酸结构。互补程度(换言之,%同一性)不需要必须是100%。而是,它必须足够允许在所采用的条件下形成双链结构。如在此使用的,术语“完全地互补”意指dsRNA的核苷酸序列的所有碱基都与靶核苷酸序列的碱基互补或‘匹配’。术语“至少部分地互补”意指dsRNA的碱基与靶核苷酸序列的碱基之间存在小于100%的匹配。本领域的技术人员将理解,为了介导靶基因表达的下调,dsRNA仅需要与靶核苷酸序列至少部分地互补。
本领域已知,相对于靶序列而具有插入、缺失以及错配的RNA序列在RNAi方面仍然可以有
效。根据本发明,优选地是,dsRNA和靶基因的靶核苷酸序列共有至少80%或85%的序列同一性,优选至少90%或95%序列同一性,或更优选至少97%或98%序列同一性,并且再更优选至少99%序列同一性。可替代地,在24个部分互补的核苷酸的每个长度上,如与靶核苷酸序列相比,dsRNA可以包含1、2、或3个错配。本领域的普通技术人员将了解,dsRNA与靶核苷酸序列之间共有的互补性程度可以取决于有待下调的靶基因或者取决于基因表达有待控
制的昆虫有害生物物种而改变。
[0076] 应了解的是,dsRNA可以包含双链RNA的区域,该双链RNA包含退火的互补链,其中的一条链,即正义链,包含与靶基因内的靶核苷酸序列至少部分互补的核苷酸序列。
[0077] 靶核苷酸序列可以选自靶基因或其RNA转录物的任何合适区域或核苷酸序列。举例来说,靶核苷酸序列可以位于靶基因或RNA转录物的5'UTR或3'UTR内,或者基因的外显子或内含子区域内。本领域的技术人员熟知在全长靶基因背景下鉴定最合适的靶核苷酸序列
的方法。例如,可以合成和测试靶向靶基因的不同区域的多种dsRNA。可替代地,用如RNAse H等酶消化RNA转录物可以被用来确定RNA上构象对基因沉默敏感的位点。靶位点也可以使
用计算机模拟(in silico)方法,例如使用被设计成基于靶向全长基因内的不同位点来预
测基因沉默效力的计算机算法进行鉴定。
[0078] 优选地,通过GAP(Needleman和Wunsch,1970)分析(GCG程序),使用默认设置确定多核糖核苷酸的%同一性,其中查询序列是至少约21至约23个核苷酸长度,并且GAP分析经至少约21个核苷酸的区域比对这两个序列。在另一个实施例中,查询序列至少150个核苷酸长度,并且GAP分析经至少150个核苷酸的区域比对这两个序列。在另外的实施例中,查询序列至少300个核苷酸长度并且GAP分析经至少300个核苷酸的区域比对这两个序列。在又另
一个实施例中,查询序列对应于全长靶RNA(例如mRNA),并且GAP分析经全长靶RNA比对这两个序列。
[0079] 便利地,该dsRNA可以在重组宿主细胞中产生自单个开放阅读框,其中正义和反义序列的侧翼是不相关序列,该不相关序列使得正义和反义序列可以杂交以与该不相关序列
形成该dsRNA分子,从而形成环结构。可替代地,正义链和反义链可以在不具有开放阅读框的情况下产生,以保证在转基因宿主细胞中将不制造蛋白质。这两条链还可以被分别表达
为两种转录物,一种编码正义链并且一种编码反义链。
[0080] 可以在细胞内部或外部启动RNA双链体形成。该dsRNA可以是部分或完全双链的。RNA可以在体外或在体内酶促地或化学地合成。
[0081] 该dsRNA相对于初级转录产物或完全加工的RNA不需要是全长的。在本领域熟知的是,长度为约19-23bp的小dsRNA可用于触发靶基因的基因沉默。通常,可以使用较高的同一性来补偿较短的序列的使用。此外,该dsRNA还可以包含单链区域,例如该dsRNA可以是部分或完全双链的。该dsRNA的双链区域可以具有至少约19至约23个碱基对的长度,任选是约19至约50个碱基对的序列,任选是约50至约100个碱基对的序列,任选是约100至约200个碱基对的序列,任选是约200至约500个碱基对的序列,并且任选是约500至约1000个或更多个碱基对的序列,直到对于其全长是双链的分子,大小对应于全长靶RNA分子。Bolognesi等人
(2012,PLOS One[公共科学图书馆·综合],7(10):e47534,通过引用并入本文)教导了在具
有南方玉米根虫(SCR;黄瓜十一星叶甲食根亚种)的人工饲料生物测定中生物活性需要大
于或等于约60bp的dsRNA。
[0082] Mao等人(2007,Nature Biotechnology[自然生物技术],35(11):1307-1313)教导了表达针对昆虫有害生物(螟蛉,棉铃虫)的靶基因(CYP6AE14)的dsRNA构建体的转基因
植物。摄食转基因植物的昆虫在其中肠中具有约19-23bp大小的靶基因的小RNA,相应地减
少了CYP6AE14转录物和蛋白质。这表明了小RNA在减少昆虫有害生物中靶基因的表达方面
是有效的。因此,约19bp、约20bp、约21bp、约22bp、约23bp、约24bp、约25bp、约26bp、约27bp、约28bp、约29bp、或约30bp的小RNA可有效减少昆虫有害生物中靶基因的表达。
[0083] 可替代地,dsRNA可以包含具有至少19个碱基对的靶dsRNA,并且靶dsRNA可以在dsRNA“载体”或“填充物”序列内。例如,Bolognesi等人(2012)显示包含靶dsRNA的240bp dsRNA(其包含与靶序列具有100%同一性的21bp连续序列)在具有南方玉米根虫的生物测
定中具有生物活性。本申请例示了在具有西方玉米根虫的生物测定中的类似方法。该靶
dsRNA可以具有至少19至约25个碱基对的长度,任选是约19至约50个碱基对的序列,任选是约50至约100个碱基对的序列,任选是约100至约200个碱基对的序列,任选是约200至约500个碱基对的序列,以及任选是约500至约1000或更多个碱基对的序列。与载体dsRNA序列组
合,靶序列的dsRNA和载体dsRNA可具有至少约50至约100个碱基对的总长度,任选地约100
至约200个碱基对的序列,任选地约200至约500个的序列,和任选地约500至约1000个或更
多个碱基对的序列。
[0084] 该dsRNA可以包含已知的核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接物,其是合成的、天然存在的及非天然存在的。此类类似物的实例包括但不限于,硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酯以及2-O-甲基核糖核苷酸。
[0085] 如在此使用的,术语“特异性减少靶RNA的水平和/或由该RNA编码的靶蛋白的产生”及其变体是指该dsRNA的一条链的一部分与该靶RNA足够同一,这样使得在细胞中存在
的该dsRNA减少稳态水平和/或所述RNA的产生。在许多情况下,该靶RNA将是mRNA,并且在产生该mRNA的细胞中存在该dsRNA将导致所述蛋白的产生的减少。优选地,当与野生型细胞相比时,这一积累或产生被减少至少10%,更优选至少50%,甚至更优选至少75%,仍甚至更优选至少95%并且最优选100%。
[0086] 抑制的后果可以通过检测该细胞或生物体的外表特性或通过生化技术加以确认,这些生化技术是例如但不限于,Northern杂交、逆转录、用微阵列监测基因表达、抗体结合、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹法、放射免疫测定(RIA)以及其他免疫测定。
[0087] 本发明的干扰RNA可以包含一种dsRNA或多种dsRNA,其中每种dsRNA包含与在靶基因中的靶核苷酸序列至少部分互补的核苷酸序列或由其组成,并且在被昆虫有害生物摄入
后起到下调所述靶基因的表达的作用。通过引用结合在此的WO 2006/046148中描述了这种
类型的多联体RNA构建体。在本发明的上下文中,术语‘多个’意指至少两个,至少三个,至少四个等并且直到至少10、15、20个或至少30个。在一个实施例中,该干扰RNA包含单个dsRNA的多个拷贝,即结合至特定靶基因内的特定靶核苷酸序列的dsRNA的重复。在另一个实施例中,干扰RNA内的dsRNA包含与不同的靶核苷酸序列互补的不同核苷酸序列或由其组成。应
该清楚的是,与结合于不同靶核苷酸序列的dsRNA组合的相同dsRNA的多个拷贝的组合是在
本发明的范围内。
[0088] 这些dsRNA可以安排为干扰RNA的一个连续区域或者可以通过接头序列的存在加以隔开。接头序列可以包含不与任何靶核苷酸序列或靶基因互补的短的随机核苷酸序列。
在一个实施例中,该接头是条件性自切割RNA序列,优选是pH敏感性接头或疏水敏感性接
头。在一个实施例中,该接头包含与内含子序列等效的核苷酸序列。本发明的接头序列的长度可以在从约1个碱基对到约10000个碱基对的范围内,其条件是该接头不会削弱干扰RNA
下调靶基因的表达的能力。
[0089] 除了这样的一种或多种dsRNA和任何接头序列,本发明的干扰RNA可以包含至少一种另外的多核苷酸序列。在本发明的不同实施例中,该另外的序列选自(i)能够保护干扰
RNA免于RNA加工的序列,(ii)影响干扰RNA的稳定性的序列,(iii)允许蛋白质结合以例如
促进干扰RNA被昆虫有害生物物种的细胞摄入的序列,(iv)促进大规模产生干扰RNA的序
列,(v)作为结合于受体或结合于昆虫有害生物细胞表面上的分子以促进摄入的适体的序
列,或(v)催化昆虫有害生物细胞中干扰RNA的加工并由此增强干扰RNA的效力的序列。用于增强RNA分子的稳定性的结构在本领域中是众所周知的并且进一步描述在WO 2006/046148
中,该案通过引用结合在此。
[0090] 该干扰RNA可以包含DNA碱基、非天然碱基或者糖-磷酸骨架的非天然骨架连接或修饰,例如以增强储存期间的稳定性或增强对核酸酶降解的抗性。此外,该干扰RNA可以由本领域的普通技术人员通过手动或自动反应化学地或酶促地产生。可替代地,该干扰RNA可以由编码其的多核苷酸转录。因此,在此提供了编码本发明的干扰RNA中的任一个的分离的多核苷酸。
[0091] 微小RNA(miRNA)是不编码蛋白质的RNA,通常在约18至约25个核苷酸长度之间(植物中常见地是约20-24个核苷酸长度)。这些miRNA指导靶转录物的反式切割,负向调节参与各种调节及发育途径的基因的表达(Bartel,Cell[细胞],116:281-297(2004);Zhang等人
Dev.Biol.[发育生物学]289:3-16(2006))。照此,已经显示miRNA参与植物生长和发育的不同方面以及参与信号转导和蛋白质降解。此外,内源性小mRNA(包括miRNA)也可以参与生物胁迫反应,例如病原体攻击。自第一个miRNA在植物中发现以来(Reinhart等人Genes Dev
[基因与发育]16:1616-1626(2002),Park等人Curr.Biol[当代生物学]12:1484-1495
(2002)),已经鉴定了数百种miRNA。另外,已经示出许多植物miRNA是跨非常趋异性分类单元而高度保守的。(Floyd等人Nature[自然]428:485-486(2004);Zhang等人Plant J[植物
杂志]46:243-259(2006))。许多微RNA基因(MIR基因)已经被鉴定并且是在数据库
(“miRBase”,通过万维网可获得)中公开可获得的。美国专利公开2005/0120415和2005/
144669A1中也描述了miRNA,该专利的全部内容通过引用结合在此。
[0092] 编码miRNA的基因产生长度70bp至300bp的初级miRNA(称作“pri-miRNA”),其可以形成不完美的茎环结构。单个初级miRNA可以含有从1个至若干个miRNA前体。在动物中,初级miRNA在细胞核中由RNA酶III Drosha及其辅因子DGCR8/Pasha加工成约65nt的更短发夹RNA(前miRNA)。这种前miRNA随后输出至细胞质,在那里,它由另一种RNA酶III-切丁酶
(Dicer)进一步加工,释放出大小约22nt的miRNA/miRNA*双链体。与动物相反,在植物中,初级miRNA加工为成熟miRNA完全在细胞核内利用单一RNA酶III-DCL1(切丁酶样1)进行。(Zhu Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]105:9851-9852(2008))。关于微小RNA生物起
源和功能的许多综述是可获得的,例如,参见,Bartel Cell[细胞]116:281-297(2004);
Murchison等人Curr.Opin.Cell Biol[细胞生物学新见]16:223-229(2004);Dugas等人
Curr.Opin.Plant Biol.[植物生物学新见]7:512-520(2004)和Kim Nature Rev.Mol.Cell 
Biol[自然综述分子细胞生物学]6:376-385(2005)。
[0093] 如在此使用的,术语“植物微小RNA前体分子”描述一种(约70nt-300nt)小非编码性RNA序列,它由植物酶加工以产生约19-24个核苷酸的产物,称作成熟微小RNA序列。这些成熟序列通过与信使RNA(mRNA)的互补性而具有调节作用。术语“人工植物微小RNA前体分
子”描述在加工之前的非编码miRNA前体序列,其中经由以下方式使用该前体序列作为递送siRNA分子的主链序列,将这种miRNA前体分子的内源性天然miRNA/miRNA*双链体置换为一
种非天然异源性miRNA的双链体(amiRNA/amiRNA*;例如siRNA/siRNA*),后一种双链体然后与该siRNA序列一起加工为成熟miRNA序列。
[0094] 在本发明的背景下,用于描述本发明的dsRNA的术语“有毒的”意指本发明的这些dsRNA分子以及此类dsRNA分子的组合作为对昆虫具有负面作用的口服有效昆虫控制试剂
而起作用。当本发明的一种组合物被递送至昆虫时,这种结果典型地是该昆虫的死亡,或者该昆虫不以使该组合物可供该昆虫使用的来源为食。这样一种组合物可以是一种表达本发
明的dsRNA的转基因植物。
[0095] “控制(control或controlling)”昆虫意指通过一种毒性作用抑制一种或多种昆虫有害生物存活、生长、摄食和/或繁殖的能力,或限制昆虫相关的损害或作物植物损失。
“控制”昆虫可以是或可以不是意为杀死昆虫,尽管它优选意指杀死昆虫。控制靶昆虫的组合物具有针对靶昆虫的杀昆虫活性。
[0096] “递送(deliver或delivering)”一种组合物或dsRNA意指该组合物或dsRNA与一种昆虫接触,产生一种毒性作用和对昆虫的控制。可以按照许多公认方式,例如,通过昆虫经口摄取、经由转基因植物表达、一种或多种配制的组合物、一种或多种可喷洒的组合物、一种饵基(bait matrix)、或任何其他的领域公认的毒物递送系统来递送该组合物或dsRNA。
[0097] 如在此使用的术语“昆虫”包括现在已知或以后鉴定的任何生物,其被分类在动物界、节肢动物、昆虫纲中,包括但不限于鞘翅目(甲虫)、鳞翅目(蛾、蝴蝶)、双翅目(蝇)、原尾目、弹尾目(跳虫)、双尾目、石蛹目(跳蛀虫)、缨翅目(蛀虫、蠹虫)、蜉蝣目(蜉蝣)、蜻蜓目(蜻蜓、豆娘)、直翅目(草蜢、蟋蟀、蝈蝈)、竹节虫目(竹节虫)、蛩蠊目(岩石爬虫)、螳 目、革翅目(地蜈蚣)、襀翅目(石蝇)、纺足目(纺足虫)、缺翅目、等翅目(白蚁)、螳螂目(螳螂)、蜚蠊目(蟑螂)、半翅目(蝽虫、蝉、叶蝉、蚜虫、蚧)、缨翅目(牧草虫)、啮虫目(书虱和树虱)、虱毛目(虱;包括但不限于钝亚目、丝角亚目和虱亚目)、脉翅目(草蜻蛉、蝶角蛉、螳蛉、蚁蛉)、膜翅目(蜜蜂、蚁、黄蜂)、毛翅目(毛翅蝇)、蚤目(跳蚤)、长翅目(蝎蛉)、捻翅目(捻翅寄生虫)的昆虫及其任何组合。
[0098] 如在此使用的,“鞘翅目昆虫”是指鞘翅目的任何成员,包括鞘翅目植物有害生物。鞘翅目昆虫包括但不限于现在已知或以后鉴定的任何鞘翅目昆虫,包括原鞘亚目、粘食亚
目、肉食亚目和多食亚目的那些及其任何组合。
[0099] “根萤叶甲属”是一种甲虫属(来自鞘翅目),通常称为“玉米根虫”或“黄瓜甲虫”。根萤叶甲属昆虫是作物植物的有害生物,这些昆虫包括但不限于,巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫;NCR)、西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫;WCR)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫;SCR)、墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫;MCR)以及南美叶甲。在本发明的背景下,术语“玉米根虫”或“黄瓜甲虫”与术语“根萤叶甲属”是可互换的。
[0100] 根据本发明的鞘翅目昆虫有害生物的其他非限制性实例包括马铃薯叶甲属,如马铃薯叶甲(科罗拉多马铃薯甲虫);叶甲属,如黑杨叶甲(黑杨叶甲虫);咪小蠹属,如咖啡果小蠹(H.hampei或coffee berry borer);象虫属,如玉米象(S.zeamais或maize weevil);
毛跳甲属,如烟草跳甲(E.hirtipennis或tobacco flea  beetle)和马铃薯跳甲
(E.cucumeris或potato flea beetle);条跳甲属,如十字花科植物跳甲(P.cruciferae或
crucifer flea beetle)和西方黑色跳甲(P.pusilla或western black flea beetle);花
象属,如胡椒茎象甲(A.eugenii或pepper weevil);金针虫属,如金针虫(H.memnonius或
wireworm);纹叩甲属,如普通梳爪叩头甲(金针虫);荚象甲属,如甘蓝荚象甲(C.assimilis或cabbage seedpod weevil);条跳甲属,如十字花科条跳甲(P.cruciferae或crucifer 
flea beetle);Aeolus属,如A.mellillus(金针虫);Aeolus属,如A.mancus(小麦线虫);
砂铁线属,如砂铁线虫(H.uhlerii或sand wireworm);尖隐喙象属,如玉米隐啄象(玉米谷象)、S.zeae(梯牧草谷象)、牧草长喙象(早熟禾谷象)、和南方玉米谷象(S.callosus或
southern corn billbug);鳃角金龟属(蛴螬);凹胫跳甲属,如玉米色跳甲(玉米跳甲);
弧丽金龟属,如日本甲虫(P.japonica或Japanese beetle);食植瓢虫属,如墨西哥豆瓢虫(E.varivestis或Mexican bean beetle);萤叶甲属,如C.trifurcate(豆叶甲);豆芫菁属,如E.Pestifera和E.lemniscata(斑蝥);以及前述的任何组合。
[0101] “根萤叶甲属生活期”或“玉米根虫生活期”意指根萤叶甲属物种的卵、幼虫、蛹或成虫发育形式。
[0102] “有效的昆虫控制量”意指dsRNA的浓度,它通过一种毒性作用抑制昆虫存活、生长、摄食和/或繁殖的能力,或限制昆虫相关的损害或作物植物损失。“有效的昆虫控制量”可以或可以不意指杀死昆虫的浓度,尽管优选它意指杀死昆虫。
[0103] 术语“农用化学活性成分”是指化学和/或生物学组合物,如在此描述的那些,它们在杀害、预防或者控制所不希望的有害生物的生长方面有效,如植物、昆虫、小鼠、微生物、藻类、真菌、细菌以及类似物(如杀生物活性成分)。本发明的干扰RNA分子是农用化学活性成分。
[0104] “农业上可接受的载体”包括有益于活性成分(如本发明的干扰RNA分子)施用的佐剂、混合剂、增强剂等。合适的载体不应对有价值的作物具有植物毒性,特别是在作物存在下施用组合物时所用的浓度,并且不应与在此的活性成分的化合物(即本发明的干扰RNA或
其他组合物成分)发生化学反应。此类混合物可以设计用于直接施用于作物,或者可以是浓缩物或配制品,其通常在施用前用另外的载体和佐剂稀释。它们可包括惰性或活性组分,并且可以是固体,如例如尘剂、颗粒剂、水可分散颗粒剂、或可湿性粉剂,或液体,如例如可乳化的浓缩物、溶液、乳液或悬浮液。合适的农业载体可包括液体载体,例如水、甲苯、二甲苯、石脑油、作物油、丙、甲基乙基酮、环己酮、三氯乙烯、全氯乙烯、乙酸乙酯、乙酸戊酯、乙酸丁酯、丙二醇单甲醚和二乙二醇单甲醚、甲醇、乙醇、异丙醇、戊醇、乙二醇、丙二醇、甘油以及类似物。水通常是用以稀释浓缩物的选用载体。合适的固体载体可包括滑石、叶腊石粘
土、石、凹凸棒粘土、硅藻土(kieselguhr)、白垩、硅藻土(diatomaxeous earth)、石灰、膨润土、漂白土、棉子壳、小麦粉、大豆粉浮石、木粉、核桃壳粉、木质素以及类似物。
[0105] 对于本发明,农业上可接受的载体还可以包括携带昆虫控制试剂(即本发明的干扰RNA分子)的非致病性减毒微生物菌株。在这种情况下,携带干扰RNA的微生物也可称为昆虫控制试剂。可将微生物工程化以表达靶基因的核苷酸序列以产生干扰RNA分子,该干扰
RNA分子包含与典型地在昆虫细胞内发现的RNA序列同源或互补的RNA序列。昆虫暴露于微
生物导致微生物的摄入和由干扰RNA分子或其片段或衍生物直接或间接介导的靶基因表达
的下调。
[0106] 在另一个实施例中,干扰RNA分子可以被包封在合成基体(如聚合物)中,并施用于宿主(如植物)的表面。昆虫摄入宿主细胞允许将昆虫控制试剂递送至昆虫并导致宿主中靶
基因的下调。
[0107] 本发明的组合物,例如包含本发明的干扰RNA分子和农业上可接受的载体的组合物,可用于常规农业方法中。例如,可以将本发明的组合物与水和/或肥料混合,并且能以任何装置将其在出苗前和/或出苗后施用至所希望的场所,该装置是如飞机喷雾桶、灌溉
备、直接注入喷雾设备、背囊喷雾桶、家畜浸渍槽、在地面喷雾中使用的农场设备(例如,喷管式喷雾器、手动喷雾器),以及类似工具。所希望的场所可以是土壤、植物以及类似的场所。
[0108] 本发明的组合物可以在种子收获和种子播种之间的任何时间;播种期间或之后;和/或发芽后以任何生理状态施用于种子或植物繁殖体。优选地是,种子或植物繁殖体处于足够耐用的状态,在处理过程中不会造成或造成最小的损害,包括物理损害或生物损害。配制品可以使用常规的涂覆技术以及机器,如流化床技术、滚筒研磨方法、静态转动
(rotostatic)种子处理器和转鼓包衣器施用到种子或植物繁殖体上。
[0109] 如在此使用的“表达盒”意指能够在适当宿主细胞中指导特定核酸序列表达的核酸序列(其包含启动子,该启动子可操作地连接至感兴趣的核酸序列上,该核酸序列可操作地连接至终止信号序列)。它还典型地包含正确翻译该核酸序列所需要的序列。包含该感兴趣的核酸序列的表达盒可以是嵌合的,意味着至少一个它的组分相对于至少一个它的其他
组分是异源的。该表达盒还可以是一种天然存在的表达盒,但已经是以对于异源表达有用
的重组形式而获得的。然而,典型地,该表达盒相对于该宿主而言是异源的,即该表达盒的特定核酸序列不是天然存在于该宿主细胞中的,并且必须已经通过转化事件引入到该宿主
细胞或该宿主细胞的祖先中。该核酸序列在该表达盒中的表达可以是在例如组成型启动子
或诱导型启动子的控制之下,只有当该宿主细胞暴露于某一特定的外部刺激时该启动子才
引发转录。在多细胞生物体(如植物)的情况下,该启动子也可以特异于特定组织、或器官、或者发育阶段。
[0110] “基因”是如下限定的区域,该区域位于基因组之内,并且除了前述的编码序列之外,它还包含其他负责该编码部分的表达控制(也就是转录和翻译)的主要调节核酸序列。基因还可以包含其他5'和3'未翻译序列和终止序列。其他可能存在的元件是,例如,内含
子。
[0111] 如在此使用的,术语“种植者”意指从事农业,养殖生物机体(如玉米植物,例如玉米)用于食物、饲料、或原料的个人或实体。
[0112] “异源”核酸序列是天然地不与将该核酸序列引入其中的宿主细胞相关联的核酸序列,包括天然存在的核酸序列的非天然存在的多拷贝。
[0113] “同源”核酸序列是与其被引入的宿主细胞天然相关的核酸序列。
[0114] “杀昆虫”被定义为有毒的生物活性,它能够控制昆虫,优选地通过杀死它们来控制。
[0115] 本发明的“分离的”核酸分子或核苷酸序列或核酸构建体或dsRNA分子或蛋白通常与其天然环境分离而存在并且因此不是自然的产物。分离的核酸分子或核苷酸序列或核酸
构建体或dsRNA分子或蛋白能以纯化形式存在,或能存在于非天然环境(例如像重组宿主或
宿主细胞,如转基因植物或转基因植物细胞)中。
[0116] 在本发明的背景下,后缀“mer”前的数字指示亚基的特定数目。当应用于RNA或DNA时,这指定了分子中碱基的数目。例如,具有序列ACUGGUCGCGUUGCAUGCU的mRNA的19个核苷酸子序列是“19-mer”。
[0117] “植物”是在发育的任何阶段的任何植物,特别是种子植物。
[0118] “植物细胞”是植物的结构和生理单位,包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以处于分离的单细胞或培养细胞的形式,或者是作为较高级的组织单位(例如像,植物组织、植物器官、或整株植物)的一部分。
[0119] “植物细胞培养物”意指植物单元(例如像,原生质体、细胞培养物细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、接合子以及处于不同发育阶段的胚)的培养物。
[0120] 植物材料:是指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、接合子、种子、切条、细胞或组织培养物、或一种植物的任何其他部分或产物。
[0121] “植物器官”是植物的独特而明显的已结构化并且分化的部分,如根、茎、叶、花蕾或胚。
[0122] 如在此使用的“植物组织”意指组织化成结构和功能单元的一组植物细胞。包括植物中或培养物中的任何植物组织。这个术语包括但不限于全株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织化成结构和/或功能单元的任何植物细胞群组。这个术语与如以上列出的或由该定义以其他方式涵盖的任何具体类型的植物组织的联合应用或单独应用并
不旨在排除任何其他类型的植物组织。
[0123] 玉米根虫“转录组”是玉米根虫细胞中的所有或几乎所有的核糖核酸(RNA)转录物的集合。
[0124] “转化”是用于将异源核酸引入到宿主细胞或生物的方法。具体地,“转化”意指DNA分子稳定地整合到感兴趣生物的基因组中。
[0125] “转化的/转基因的/重组的”是指异源核酸分子已经引入其中的宿主生物如细菌或植物。该核酸分子可以被稳定地整合到宿主的基因组中,或者该核酸分子还可以作为染
色体外分子存在。这样的染色体外分子能够自主复制。转化的细胞、组织或植物应当理解为不仅涵盖转化过程的终产物,而且涵盖其转基因子代。“非转化的”、“非转基因的”、或“非重组的”宿主是指不含有该异源的核酸分子的野生型生物,例如细菌或植物。
[0126] 在此使用的对于DNA或RNA碱基和氨基酸给出的命名法如在37 C.F.R.§1.822中给出。
[0127] 本发明是基于以下出乎意料的发现,设计用于靶向可从在此描述的根萤叶甲属基因转录的mRNA的双链RNA(dsRNA)或小干扰RNA(siRNA),对根萤叶甲属昆虫有害生物具有毒
性并且可以用于控制植物的根萤叶甲属或鞘翅目侵染并赋予转基因植物对根萤叶甲属或
鞘翅目侵染的耐受性。因此,在一个实施例中,本发明提供了包含正义链和反义链的双链
RNA(dsRNA)分子,其中该反义链的核苷酸序列与可从本披露描述的根萤叶甲属昆虫基因转
录的mRNA多核苷酸的一部分互补,其中该dsRNA分子对根萤叶甲属昆虫或鞘翅目植物有害
生物是具有毒性的。
[0128] 本领域已知,与靶序列不完全互补的dsRNA分子(例如,与靶基因仅具有95%同一性)对控制鞘翅目有害生物是有效的(参见,例如,Narva等人,美国专利号9,012,722)。本发明提供了包含至少一种dsRNA的干扰RNA分子,其中该dsRNA是包含退火的至少部分互补的
链的双链RNA的区域。该dsRNA的一条链包含具有至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少
110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290或至少
300个连续核苷酸的序列,其与根萤叶甲属靶基因内的靶核苷酸序列是至少部分互补的。该干扰RNA分子(i)至少与SEQ ID NO:121-210、SEQ ID NO:274-276、SEQ ID NO:280-282、SEQ ID NO:304-324的19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、
75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、
250、260、270、280、290、或300个连续核苷酸的片段,或其互补序列具有至少80%同一性、至少85%同一性、至少86%同一性、至少87%同一性、至少88%同一性、至少89%同一性、至少
90%同一性、至少91%同一性、至少92%同一性、至少93%同一性、至少94%同一性、至少
95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性、至少99%同一性、或
100%同一性;(ii)至少包含SEQ ID NO:121-210、SEQ ID NO:274-276、SEQ ID NO:280-
282、SEQ ID NO:304-324的19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、
65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、
240、250、260、270、280、290、或300个连续核苷酸的片段,或其互补序列;(iii)至少包含编码由SEQ ID NO:121-210、SEQ ID NO:274-276、SEQ ID NO:280-282、SEQ ID NO:304-324编码的氨基酸序列的核苷酸序列的19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、
55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、
220、230、240、250、260、270、280、290、或300个连续核苷酸的片段,或其互补序列;或者(iv)可以在严格条件下与选自下组的多核苷酸杂交,该组由以下组成:SEQ ID NO:121-210、SEQ ID NO:274-276、SEQ ID NO:280-282、SEQ ID NO:304-324,及其互补序列,其中该干扰RNA分子对鞘翅目植物有害生物具有杀昆虫活性。
[0129] 在一些实施例中,该干扰RNA分子包含至少两种dsRNA,其中每种dsRNA包含如下核苷酸序列,该序列与该靶基因内的靶核苷酸序列是至少部分互补的。在一些实施例中,每种dsRNA包含不同的核苷酸序列,该核苷酸序列与该靶基因内的不同靶核苷酸序列是互补的。
在其他实施例中,每种dsRNA包含不同的核苷酸序列,该核苷酸序列与两个不同的靶基因内的靶核苷酸序列是互补的。
[0130] 在一些实施例中,该干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA可以包含从至少18至约25个连续核苷酸(例如18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29)到至少约300个连续核苷酸,基本由其组成或由其组成。可以在3'末端、5'末端或3'和5'末端二者处添加另外的核苷酸,以促进RNA分子的操作但是不实质地影响该dsRNA分子在RNA干扰(RNAi)中的基本特征
或功能。
[0131] 在一些实施例中,该干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含与SEQ ID NO:121-210、SEQ ID NO:274-276、SEQ ID NO:280-282、或SEQ ID NO:304-324的至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少
280、至少290、或至少300个连续核苷酸,或其互补序列互补的反义链。在其他实施例中,dsRNA的该部分包含SEQ ID NO:121-210、SEQ ID NO:274-276、SEQ ID NO:280-282、SEQ ID NO:304-324的至少从19、20或21个连续核苷酸到至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少
110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、或至少300个连续核苷酸,或其互补序列,基本由其组成或由其组成。
[0132] 在其他实施例中,本发明的干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含由N至N+20个核苷酸组成的SEQ ID NO:181-210的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成。例如,本发明的干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:181的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:181的核苷酸1至核苷酸776。换言之,被靶向的mRNA的该部分包含776个SEQ ID NO:181的21个
连续核苷酸(即21-mers)的子序列中的任一个,或其任何互补序列。将认识到的是,这些776个21个连续核苷酸的子序列包括来自SEQ ID NO:121和SEQ ID NO:151的所有可能的21个
连续核苷酸的子序列,以及它们的互补序列,因为SEQ ID NO 121、151和181都针对相同的靶标,即BPA_15366。类似地将认识到的是,SEQ ID NO:181-210的所有21-mer子序列及其所有互补序列子序列包括SEQ ID NO:121-180的所有可能的21个连续核苷酸的子序列,及其
互补序列子序列。
[0133] 类似地,本发明的干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:182的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:182的核苷酸1至核苷酸771。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID 
NO:183的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:183的核苷酸1至核苷酸2907。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:184的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:184的核苷酸1至核苷酸1600。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下
dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:185的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:185的核苷酸1至核苷酸2410。本发明的另一个干扰RNA
分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:186的任何21-mer子序列,或其任何互补序
列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:186的核苷酸1至核苷酸2802。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:187的任何21-mer子序列,或
其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:187的核苷酸1至核苷酸
3681。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:188的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:188的核苷酸1至核苷酸651。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:
189的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:189的核苷酸1至核苷酸673。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:190的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:190的核苷酸1至核苷酸2664。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,
该dsRNA包含SEQ ID NO:191的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由
其组成,其中N是SEQ ID NO:191的核苷酸1至核苷酸438。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:192的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:192的核苷酸1至核苷酸2458。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:193的任何21-mer子序列,或其任何互补
序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:193的核苷酸1至核苷酸3254。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:194的任何21-mer子序列,
或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:194的核苷酸1至核苷酸
3632。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:195的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:195的核苷酸1至核苷酸7611。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:
196的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:196的核苷酸1至核苷酸1008。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包
含SEQ ID NO:197的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:197的核苷酸1至核苷酸2992。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下
dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:198的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:198的核苷酸1至核苷酸1192。本发明的另一个干扰RNA
分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:199的任何21-mer子序列,或其任何互补序
列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:199的核苷酸1至核苷酸7626。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:200的任何21-mer子序列,或
其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:200的核苷酸1至核苷酸
2580。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:201的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:201的核苷酸1至核苷酸4628。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:
202的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:202的核苷酸1至核苷酸1557。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包
含SEQ ID NO:203的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:203的核苷酸1至核苷酸1019。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下
dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:204的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:204的核苷酸1至核苷酸677。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:205的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:205的核苷酸1至核苷酸764。本发明的另一
个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:206的任何21-mer子序列,或其任
何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:206的核苷酸1至核苷酸1830。
本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:207的任何21-mer子
序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:207的核苷酸1至核苷酸3225。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:208的
任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:208的核苷酸1至核苷酸1003。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ 
ID NO:209的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是
SEQ ID NO:209的核苷酸1至核苷酸1419。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该
dsRNA包含SEQ ID NO:210的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其
组成,其中N是SEQ ID NO:210的核苷酸1至核苷酸5206。
[0134] 在仍其他实施例中,本发明的干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:121-210、SEQ ID NO:274-276、SEQ ID NO:280-282、SEQ ID NO:304-324,或其互补序列,基本上由其组成或由其组成。
[0135] 在本发明的干扰RNA分子的其他实施例中,本发明的dsRNA的反义链的核苷酸序列包含SEQ ID NO:220、224、230的核苷酸序列,基本由其组成或由其组成。本发明的dsRNA的反义链的核苷酸序列在3’或5’末端可以缺失一个核苷酸或在3’末端、5’末端或两者处可以添加多达6个核苷酸(以任何组合),以实现反义链基本由SEQ ID NO:211-240的任何19-
mer、任何20-mer、或任何21-mer核苷酸序列组成,因为将理解的是,缺失1个核苷酸或添加多达6个核苷酸不实质地影响本发明的双链RNA分子的基本特征或功能。这类另外的核苷酸
可以是沿靶序列延伸反义链互补性的核苷酸和/或这类核苷酸可以是促进RNA分子或编码
该RNA分子的核酸分子的操作的核苷酸,如本领域的普通技术人员将已知。例如,在3'末端可以存在TT突出端,使用该突出端来稳定siRNA双链体并且不影响该siRNA的特异性。
[0136] 在本发明的一些实施例中,该干扰RNA分子的双链RNA的反义链可以与该靶RNA多核苷酸完全互补,或该反义链可以与靶RNA多核苷酸基本上互补或部分互补。该干扰RNA分
子的dsRNA可以包含如下dsRNA,该dsRNA是包含基本上互补的退火链的双链RNA的区域,或
是包含完全互补的退火链的双链RNA的区域。基本上或部分互补意指反义链和靶RNA多核苷
酸可以按约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸配对错配。可以将这类错配引入反义链序列中,例如,靠近3'末端,以便增强双链RNA分子由切丁酶加工,以便在插入本发明的嵌合核酸分子或人工微小RNA前体分子内的siRNA分子中重复错配样式等,如本领域的普通技术人员
将已知。这类修饰将在双链体的一个末端削弱碱基配对作用并且产生链非对称性,因此增
大反义链(而非正义链)受到加工和沉默预期基因的几率(Geng和Ding“Double-mismatched siRNAs enhance selective gene silencing of a mutant ALS-causing Allele1[双错
配siRNA增强造成突变ALS的等位基因1的选择性基因沉默]”Acta Pharmacol.Sin.[中国药
理学报]29:211-216(2008);Schwarz等人“Asymmetry in the assembly of the RNAi 
enzyme complex[RNAi酶复合体的组合体中的非对称性]”Cell[细胞]115:199-208
(2003))。
[0137] 在本发明的一些实施例中,该干扰RNA包含一种含有短发夹RNA(shRNA)分子的dsRNA。shRNA在细胞中的表达典型地通过将质粒或重组载体递送例如进入转基因植物(如
转基因玉米)中而完成。
[0138] 本发明涵盖一种包含本发明的干扰RNA的核酸构建体。本发明进一步涵盖如下核酸分子,该核酸分子编码本发明的至少一种干扰分子。本发明进一步涵盖如下核酸构建体,该核酸构建体包含本发明的至少一种干扰分子,或包含编码本发明的至少一种干扰分子的
核酸分子。本发明进一步涵盖如下核酸构建体,其中该核酸构建体是一种表达载体。本发明进一步涵盖如下重组载体,该重组载体包含可操作地连接至编码本发明的干扰RNA分子的
核苷酸序列的调节序列。调节序列可以意指一种启动子、增强子、转录因子结合位点、隔离子、沉默子、或参与基因表达的任何其他DNA元件。
[0139] 本发明进一步涵盖如下嵌合核酸分子,该嵌合核酸分子包含具有dsRNA的反义链的干扰RNA分子,该dsRNA可操作地连接至植物微小RNA前体分子。在一些实施例中,该嵌合核酸分子包含如下反义链,该反义链具有SEQ ID NO:181-210的21-mer子序列中的任一个、或其任何互补序列的核苷酸序列,该反义链可操作地连接至植物微小RNA前体分子。在一些实施例中,该植物微小RNA前体分子是一种玉米微小RNA前体。
[0140] 在一些实施例中,本发明涵盖一种人工植物微小RNA前体分子,该前体分子包含本发明的干扰RNA分子的dsRNA的一条反义链。在其他实施例中,该人工植物微小RNA前体分子包含具有SEQ ID NO:211-240的19-mer、20-mer或21-mer子序列中的任一个的核苷酸序列
的反义链。使用人工植物微小RNA将感兴趣的核苷酸序列(例如人工miRNA;siRNA/siRNA*)
递送进植物中在本领域是已知的(参见例如,Schwab等人2006The Plant Cell[植物细胞]
18:1121-1133和在此的实例部分)。在本发明中,这些人工微小RNA是其中插入植物微小RNA前体主链和昆虫siRNA序列的嵌合或杂交分子。如本领域的普通技术人员将理解,典型地希望维持错配,这些错配正常情况下在植物微小RNA前体序列中存在于被置换入该植物微小
RNA前体主链中的任何核苷酸序列中。在仍其他实施例中,该人工植物微小RNA前体包含玉
米微小RNA前体分子的部分。任何玉米微小RNA(miRNA)前体都适于本发明的这些组合物和
方法。非限制性实例包括miR156、miR159、miR160、miR162、miR164、miR166、miR167、miR168、miR169、miR171、miR172、miR319、miR390、miR393、miR394、miR395、miR396、miR397、miR398、miR399、miR408、miR482、miR528、miR529、miR827、miR1432以及现在已知或后来被鉴定出的任何其他植物miRNA前体。
[0141] 在一些实施例中,本发明涵盖干扰RNA分子、核酸构建体、核酸分子、或重组载体,其包含本发明的干扰RNA分子的dsRNA的至少一条链,或包含本发明的嵌合核酸分子,或包含本发明的人工植物微小RNA。在一些实施例中,该核酸构建体包含本发明的核酸分子。在其他实施例中,该核酸构建体是一种重组表达载体。
[0142] 在一些实施例中,本发明的干扰RNA分子对根萤叶甲属昆虫具有杀昆虫活性。在一些实施例中,该根萤叶甲属昆虫选自下组,该组由以下组成:巴氏根萤叶甲(北方玉米根
虫)、西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)、黄瓜条根萤叶甲(D.balteata)(带状黄瓜甲虫)、黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctata 
undecimpunctata)(西方斑点黄瓜甲虫)、斯格尼根萤叶甲(D.significata)(3斑叶甲)、南
美叶甲(菊花甲虫)、墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)、班尼根萤叶甲
(D.beniensis)、克里斯塔根萤叶甲(D.cristata)、科威根萤叶甲(D.curvipustulata)、双斑根萤叶甲(D.dissimilis)、华丽根萤叶甲(D.elegantula)、伊墨根萤叶甲
(D.emorsitans)、禾本科根萤叶甲(D.graminea)、伊斯帕尼根萤叶甲(D.hispanolae)、莱米妮根萤叶甲(D.lemniscata)、赭腿根萤叶甲(D.linsleyi)、米勒根萤叶甲(D.milleri)、钱币形根萤叶甲(D.nummularis)、扇叶根萤叶甲(D.occlusa)、普拉根萤叶甲(D.porracea)、蜗根萤叶甲(D.scutellata)、胫骨根萤叶甲(D.tibialis)、三线根萤叶甲
(D.trifasciata)以及微绿根萤叶甲(D.viridula)。在另外的实施例中,该根萤叶甲属昆虫是西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫)、或巴氏
根萤叶甲(北方玉米根虫)。在一些实施例中,该靶基因的编码序列包含选自下组的序列,该组包含SEQ ID NO:91-120。
[0143] 在一些实施例中,本发明涵盖包含一种或多种或者两种或更多种本发明的干扰RNA分子的组合物。在一些实施例中,干扰RNA分子存在于同一核酸构建体上、不同的核酸构建体上或其任何组合上。例如,本发明的一种干扰RNA分子可以存在于核酸构建体上,并且本发明的第二干扰RNA分子可以存在于同一核酸构建体上或单独的第二核酸构建体上。本
发明的第二干扰RNA分子可以针对相同的靶基因或不同的靶基因。
[0144] 在一些实施例中,本发明涵盖包含如下干扰RNA分子的组合物,该干扰RNA分子包含至少一种dsRNA,其中该dsRNA是包含退火的互补链的双链RNA区域。该dsRNA的一条链包
含具有至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少
250、至少260、至少270、至少280、至少290或至少300个连续核苷酸的序列,其与根萤叶甲属靶基因内的靶核苷酸序列是至少部分互补的。该干扰RNA分子(i)至少与SEQ ID NO:121-
210、SEQ ID NO:274-276、SEQ ID NO:280-282、SEQ ID NO:304-324的19、20、21、22、23、24、
25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、
150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、或300个连续核苷酸的片段,或其互补序列具有至少80%同一性、至少85%同一性、至少86%同一性、至少87%同一性、至少88%同一性、至少89%同一性、至少90%同一性、至少91%同一性、至少92%同一性、至少93%同一性、至少94%同一性、至少95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性、至少99%同一性、或100%同一性;(ii)至少包含SEQ ID NO:121-210、SEQ ID NO:274-276、SEQ ID NO:280-282、SEQ ID NO:304-324的19、20、21、22、23、24、25、
26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、
150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、或300个连续核苷酸的片段,或其互补序列;(iii)至少包含编码由SEQ ID NO:121-210、SEQ ID NO:274-276、SEQ ID NO:280-282、SEQ ID NO:304-324编码的氨基酸序列的核苷酸序列的19、20、21、22、
23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、
130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、或300个连续核苷酸的片段,或其互补序列;或者(iv)可以在严格条件下与选自下组的多核苷酸杂交,该组由以下组成:SEQ ID NO:121-210、SEQ ID NO:274-276、SEQ ID NO:280-282、SEQ ID NO:304-324,及其互补序列。
[0145] 在一些实施例中,本发明涵盖包含一种干扰RNA分子的组合物,该干扰RNA分子包含两种或更多种dsRNA,其中这两种或更多种dsRNA各自包含不同的反义链。在一些实施例
中,本发明涵盖包含至少两种或更多种干扰RNA分子的组合物,其中这两种或更多种干扰
RNA分子各自包含含有不同的反义链的dsRNA。这两种或更多种干扰RNA可以在相同的核酸
构建体上、在不同的核酸构建体上、或其任何组合上存在。在其他实施例中,该组合物包含含有如下反义链的RNA分子,该反义链基本上由至少包含SEQ ID NO:211-240的19个连续核
苷酸的片段的核苷酸序列组成,并且在一些实施例中,该组合物可进一步包含含有如下反
义链的RNA分子,该反义链基本上由至少包含SEQ ID NO:211-240的19个连续核苷酸的片段
的第二核苷酸序列组成;并且在一些实施例中,该组合物可进一步包含含有如下反义链的
RNA分子,该反义链基本上由至少包含SEQ ID NO:211-240的19个连续核苷酸的片段的第三
核苷酸序列组成,并且在一些实施例中,该组合物可进一步包含含有如下反义链的RNA分
子,该反义链基本上由至少包含SEQ ID NO:211-240的19个连续核苷酸的片段的第四核苷
酸序列组成,并且在一些实施例中,该组合物可进一步包含含有如下反义链的RNA分子,该反义链基本上由至少包含SEQ ID NO:211-240的19个连续核苷酸的片段的第五核苷酸序列
组成,并且在一些实施例中,该组合物可进一步包含含有如下反义链的RNA分子,该反义链基本上由至少包含SEQ ID NO:211-240的19个连续核苷酸的片段的第六核苷酸序列组成,
并且在一些实施例中,该组合物可进一步包含含有如下反义链的RNA分子,该反义链基本上由至少包含SEQ ID NO:211-240的19个连续核苷酸的片段的第七核苷酸序列组成。在其他
实施例中,该组合物可以包含两种或更多种核酸分子,其中这两种或更多种核酸分子各自
编码不同的干扰RNA分子。在其他实施例中,该组合物可以包含两种或更多种核酸构建体,其中这两种或更多种核酸构建体各自包含编码不同干扰RNA的核酸分子。
[0146] 在其他实施例中,该组合物包含本发明的两种或更多种核酸构建体、两种或更多种核酸分子、两种或更多种嵌合核酸分子、两种或更多种人工植物微小RNA前体,其中这两种或更多种核酸构建体、两种或更多种核酸分子、两种或更多种嵌合核酸分子、或两种或更多种人工植物微小RNA前体各自包含一条不同的反义链。
[0147] 在一些实施例中,本发明涵盖一种用于抑制在此描述的根萤叶甲属昆虫基因表达的杀昆虫组合物,该组合物包含本发明的干扰RNA和农业上可接受的载体。在一些实施例
中,该可接受的农用载体是一种表达本发明的干扰RNA的转基因生物体。在一些实施例中,该转基因生物体可以是一种表达本发明的干扰RNA的转基因植物,当被靶鞘翅目植物有害
生物摄食时导致该靶鞘翅目植物有害生物停止摄食、生长、或繁殖,或导致该靶鞘翅目植物有害生物的死亡。在其他实施例中,该转基因植物是一种转基因玉米植物并且该靶有害生
物是一种根萤叶甲属昆虫有害生物。在仍其他实施例中,该根萤叶甲属昆虫有害生物选自
下组,该组由以下组成:巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫),西方玉米根萤叶甲(西方玉米根
虫),黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫),黄瓜条根萤叶甲(带状黄瓜甲虫),黄瓜十一星叶甲(西方斑点黄瓜甲虫),斯格尼根萤叶甲(3斑叶甲),南美叶甲(菊花甲虫),墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)。
[0148] 在其他实施例中,该转基因生物体选自(但不限于)下组,该组由以下组成:表达本发明的干扰RNA分子的酵母、真菌、藻类、细菌、病毒、或节肢动物。在一些实施例中,该转基因生物体是一种病毒,例如一种当侵染昆虫宿主时表达本发明的干扰RNA分子的昆虫杆状病毒。这样的一种杆状病毒比野生型未转化杆状病毒针对靶昆虫可能更具剧毒。在其他实
施例中,该转基因生物体是一种施用至靶有害生物出现或已知已经出现的环境的转基因细
菌。在一些实施例中,使用能够在植物组织内生活并复制的非致病共生细菌(所谓的内寄生菌),或能够定居在叶际或根际的非致病共生细菌(所谓的附生菌)。此类细菌包括以下属的细菌:农杆菌属、产碱菌属、固氮螺菌属、定氮菌属、芽孢杆菌属、棒形杆菌属、肠杆菌属、欧文菌属、黄杆菌属、克雷白菌属、假单胞菌属、根瘤菌属、沙雷菌属、链霉菌属以及黄单胞菌属。共生真菌(如木霉属和胶枝霉属)也是为了相同目的表达本发明的干扰RNA分子的可能
宿主。
[0149] 在一些实施例中,可接受的农用载体是一种可用于将包含该干扰RNA分子的组合物施用至植物或种子的配制品。在一些实施例中,这些干扰RNA分子稳定对抗降解,由于其双链性质和DNA酶/RNA酶抑制剂的引入。例如,可以通过包括胸苷或尿苷核苷酸3'突出端来稳定dsRNA或siRNA。包含在本发明的组合物中的dsRNA或siRNA能大量地以工业规模化学地
合成。可获得的方法将是通过化学合成或通过使用生物剂。
[0150] 在其他实施例中,该配制品包含一种转染促进剂。在其他实施例中,该转染促进剂是一种含脂质化合物。在另外的实施例中,该含脂质化合物选自下组,该组由以下组成:Lipofectamine、Cellfectin、DMRIE-C、DOTAP以及Lipofectin。在另一个实施例中,该含脂质化合物是Tris阳离子脂质。
[0151] 在一些实施例中,该配制品进一步包含一种核酸冷凝剂。该核酸冷凝剂可以是本领域已知的任何此类化合物。核酸冷凝剂的实例包括但不限于,亚精胺(N-[3-氨基丙基]-
1,4-丁二胺)、鱼精蛋白硫酸盐、聚赖氨酸以及其他带正电的肽。在一些实施例中,该核酸冷凝剂是亚精胺或鱼精蛋白硫酸盐。
[0152] 在仍另外的实施例中,该配制品进一步包含缓冲的蔗糖磷酸盐缓冲生理盐水。
[0153] 在一些实施例中,本发明涵盖转基因植物或其部分,其包含本发明的干扰RNA分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子、和/或组合物,其中当与对照植物相比时,该转基因植物对鞘翅目昆虫或根萤叶甲属昆虫具有增强的抗性。在其他实施例
中,该转基因植物或其部分是转基因玉米植物或其部分。本发明进一步涵盖本发明的转基
因植物的转基因种子,其中该转基因种子包含本发明的干扰RNA分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子、和/或组合物。在一些实施例中,该转基因种子是转基因玉米种子。
[0154] 表达本发明的干扰RNA的转基因植物对被靶昆虫有害生物袭击具有耐受性或抗性。当该昆虫开始摄食这样一种转基因植物时,它也摄取所表达的dsRNA或siRNA。这可以妨碍昆虫进一步咬食植物组织或者甚至可以伤害或杀死昆虫。编码本发明的dsRNA或siRNA的
核酸序列被插入到一种表达盒中,然后该表达盒被优选稳定地整合到该植物的基因组中。
引入到植物基因组中的表达盒的这些核酸序列对于该植物而言是异源的,并且是天然存在
的。跟据本发明所转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物,并且包括但不限于:玉米、小麦、大麦、黑麦、甘薯、豆、豌豆、菊苣、莴苣、卷心菜、花椰菜、西兰花、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、胡椒(pepper)、芹菜、小南瓜(squash)、大南瓜(pumpkin)、大麻、西葫芦、苹果、梨、榅桲、甜瓜、李子(plum)、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠萝、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高粱甘蔗、甜菜、向日葵、油菜籽、三叶草、烟草、胡萝卜、棉花、苜蓿、水稻、马铃薯、茄子、黄瓜、拟南芥属,以及木本植物,如针叶树以及落叶树。在另外的实施例中,该转基因植物是一种转基因玉米植物。
[0155] 在转基因植物中该干扰RNA分子的表达是由包含在植物中发挥作用的启动子的调节序列所驱动的。启动子的选择将依赖于表达的时间和空间需要而变化,并且还依赖于昆
虫目标种类而变化。因此,考虑了本发明的干扰RNA在叶、柄(stalk)或茎(stem)、穗、花序(例如穗状花序、圆锥花序、穗轴等)、根和/或幼苗中的表达。然而在许多情况下,寻求针对多于一种类型昆虫有害生物的保护,并且因此在多个组织中的表达是令人希望的。尽管已
经显示来自双子叶植物的很多启动子在单子叶植物中是可操作的并且反之亦然,但理想的
是选择双子叶植物启动子用于在双子叶植物中的表达,并且选择单子叶植物启动子用于在
单子叶植物中的表达。然而,对所选择的启动子的起源并没有限制;足够的是它们在驱动
dsRNA或siRNA在所希望的细胞中的表达中是操作性的。
[0156] 适用于本发明的启动子包括但不限于组成性地驱动核苷酸序列的表达的那些启动子、在诱导时驱动表达的那些启动子、以及以组织或发育特异性方式驱动表达的那些启
动子。这些不同类型的启动子在本领域是已知的。
[0157] 在一些实施例中,可以使用组织特异性/组织优选的启动子。组织特异性或组织优选的表达模式包括但不限于绿色组织特异性或优选的、根特异性或优选的、茎特异性或优
选的、以及花特异性或优选的。另外,可以使用在质体中起作用的启动子。在本发明的一些实施例中,可以使用诱导型启动子。在另外的方面中,本发明的核苷酸序列可以与一种启动子可操作地关联,该启动子是创伤诱导型或由有害生物或病原体侵染(例如,昆虫或线虫植物有害生物)进行的诱导型。
[0158] 在本发明的一些实施例中,使用“最小启动子”或“基本启动子”。最小启动子能够募集并结合RNA聚合酶II复合体及其辅助蛋白,以允许转录起始和延伸。在一些实施例中,最小启动子被构建成仅包含来自转录因子的结合和感兴趣的核苷酸序列的转录所必需的选定启动子的核苷酸/核苷酸序列的启动子,这一感兴趣的核苷酸序列可操作地与包含但
不局限于TATA盒序列的最小启动子相关联。在其他实施例中,最小启动子缺少募集并结合
转录因子的cis序列,这些转录因子调节(例如,增强、抑制、赋予组织特异性,赋予诱导性或抑制性)转录。最小启动子通常被放置在待表达的核苷酸序列的上游(即,5’)。因此,可以选择来自与本发明一起可用的任何启动子的核苷酸/核苷酸序列用作最小启动子。
[0159] 在一些实施例中,本发明的重组核酸分子可以是一种“表达盒”。如在此使用的,“表达盒”意指包含感兴趣的核苷酸序列(例如,本发明的核苷酸序列)的重组核酸分子,其中该核苷酸序列至少与控制序列(例如,启动子)可操作地关联。因此,本发明的一些实施例提供了被设计成表达编码本发明的dsRNA或siRNA的核苷酸序列的表达盒。以这种方式,例如,可操作地与本发明的一个或多个核苷酸序列相关联的一个或多个植物启动子可以提供
于表达盒中,用于玉米植物、植物部分和/或植物细胞中的表达。
[0160] 包含感兴趣的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的,意味着它的组分中的至少一种相对于它的其他组分中的至少一种是异源的。表达盒还可以是一种包含驱动其天然基因的
天然启动子,然而已经以适用于异源表达的重组形式而获得的。表达盒的这种用途使它如
此在其被引入的细胞中不是天然存在的。
[0161] 表达盒还可以任选地包括在植物中具有功能性的转录和/或翻译终止区(即,终止区)。多种转录终止子是可供用于在表达盒中使用并且负责在超出感兴趣的异源核苷酸序
列时的转录终止以及正确的mRNA聚腺苷酸化。该终止区对于该转录起始区可以是天然的,
对于该可操作地连接的感兴趣的核苷酸序列可以天然的,对于该植物宿主可以是天然的,
或者可以是源自另一种来源(即,对于该启动子、该感兴趣的核苷酸序列、该植物宿主、或其任意组合而言是外来的或异源的)。适当的转录终止子包括但不限于CAMV 35S终止子、tml
终止子、胭脂碱合酶终止子和/或豌豆rbcs E9终止子。这些终止子可以在单子叶植物和双
子叶植物二者中使用。此外,可以使用编码序列的天然转录终止子。
[0162] 本发明的表达盒还可以包括用于选择性标记的核苷酸序列,该选择性标记可以用于选择转化的植物、植物部分和/或植物细胞。如在此使用的,“选择性标记(selectable marker)”意为是一种核苷酸序列,当该核苷酸序列表达时赋予一种不同的表型给表达该标记的植物、植物部分和/或植物细胞,并且因此允许此类经转化的植物、植物部分和/或植物细胞与不具有该标记的那些区别开来。这样的核苷酸序列可以编码选择性或筛选性标记,
这取决于该标记是否赋予可以通过化学手段而被选择的性状,如通过使用选择剂(例如,抗生素、除草剂等),或者取决于该标记是否仅是人们可以通过观察或测试而鉴别的性状,如通过筛选(例如,R基因座性状)。当然,适合的选择性标记的许多实例在本领域是已知的并且可以用于在此描述的表达盒中。
[0163] 可选择性标志的实例包括但不限于:一种编码neo或nptll的核苷酸序列,它赋予对卡那霉素、G418、以及类似物的抗性(Potrykus等人(1985)Mol.Gen.Genet.[分子与普通
遗传学]199:183-188);一种编码bar的核苷酸序列,它赋予对草丁膦的抗性;一种编码改变的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合成酶的核苷酸序列,它赋予对草甘膦的抗性
(Hinchee等人(1988)Biotech.[生物技术]6:915-922);一种编码腈水解酶(如来自臭鼻克
雷白氏杆菌(Klebsiella ozaenae)的bxn)的核苷酸序列,它赋予对溴草腈的抗性(Stalker
等人(1988)Science[科学]242:419-423);一种编码改变的乙酰乳酸合成酶(ALS)的核苷酸
序列,它赋予对咪唑啉酮、磺酰脲或其他ALS-抑制化学品的抗性(欧洲专利申请号154204);
一种编码甲氨蝶呤-抗性的二氢叶酸还原酶(DHFR)的核苷酸序列(Thillet等人(1988)
J.Biol.Chem.[生物化学杂志]263:12500-12508);一种编码茅草枯脱卤素酶的核苷酸序
列,它赋予对茅草枯的抗性;一种编码甘露糖-6-磷酸异构酶(也称为磷酸甘露糖异构酶
(PMI))的核苷酸序列,它赋予代谢甘露糖的能力(美国专利号5,767,378和5,994,629);一
种编码改变的邻氨基苯甲酸盐合酶的核苷酸序列,它赋予对5-甲基色氨酸的抗性;和/或一种编码hph的核苷酸序列,它赋予对潮霉素的抗性。本领域技术人员能够选择用于在本发明的表达盒中使用的适合的选择性标记。
[0164] 本发明的表达盒还可以包括对其他所希望的性状进行编码的多核苷酸。此类所希望的性状可以是赋予昆虫抗性或赋予线虫抗性的其他多核苷酸,或其他农业上所希望的性
状。此类多核苷酸可以与核苷酸序列的任何组合叠加,以产生出具有所希望的表型的植物、植物部分或植物细胞。叠加的组合可以通过任何方法来产生,包括但不限于,通过任何常规的方法学的杂交育种植物或通过遗传转化。如果是通过遗传转化这些植物来进行叠加,则
编码其他所希望的性状的核苷酸序列可以在任何时间并且以任何次序进行组合。例如,单
个转基因可以包含多个表达盒,以致于多个表达盒被引入在单个基因组位置处的转化细胞
的基因组中。可替代地,包含一种或多种所希望的性状的转基因植物可以用作通过后续转
化而引入另外的性状的靶标。另外的核苷酸序列可以在共转化方案中与由表达盒的任何组
合提供的本发明的核苷酸序列、核酸分子、核酸构建体、和/或其他组合物同时引入。例如,如果将引入两个核苷酸序列,则它们可以合并在分开的盒(反式)中或可以合并在相同的盒
(顺式)上。这些核苷酸序列的表达可以通过相同的启动子或通过不同的启动子来驱动。进
一步认识到的是,核苷酸序列可以在所希望的基因组位置处使用位点特异性重组系统进行
叠加。参见,例如,国际专利申请公开号WO 99/25821;WO 99/25854;WO 99/25840;WO 99/
25855;以及WO 99/25853。
[0165] 因此,表达盒可以包括用于农艺性状的一种或多种多肽的编码序列,这些农艺性状的主要受益者是种子公司、种植者或谷粒加工者。感兴趣的多肽可以是由感兴趣的多核
苷酸序列编码的任何多肽。适合用于在植物中生产的感兴趣的多肽的非限制性实例包括产
生农艺学重要性状的那些多肽,这些性状如除草剂抗性(有时也称为“除草剂耐受性”)、病毒抗性、细菌病原体抗性、昆虫抗性、线虫抗性、和/或真菌抗性。参见,例如,美国专利号5,
569,823;5,304,730;5,495,071;6,329,504;以及6,337,431。
[0166] 适合于植物转化的载体说明于在本说明书的其他地方。对于农杆菌介导的转化,二元载体或携带至少一个T-DNA边界序列的载体是适合的,而对于直接基因转移,任何载体都是适合的,并且仅含有感兴趣的构建体的线性DNA也许是优选的。在直接基因转移的情况下,可以使用以单个DNA种类的转化或共转化(Schocher等人Biotechnology[生物技术]4:
1093-1096(1986))。对于直接基因转移以及农杆菌介导的转化这二者,转化通常(但不是必需的)用一种选择性标记进行,这种选择性标记可以提供针对一种抗生素(卡那霉素、潮霉
素、或甲氨蝶呤)或一种除草剂(Basta)的抗性。本发明的植物转化载体还可以包含其他选
择性标记基因,例如,在美国专利5,767,378和5,994,629中所披露的,包含提供转基因植物阳性选择的基因(如磷酸甘露糖异构酶(pmi))(通过引用将其合并在此)或提供对除草剂草
铵膦(草丁膦)耐受性的草铵膦乙酰转移酶(pat)。然而,选择性标记的选择对于本发明并不是至关重要的。
[0167] 在其他实施例中,本发明的核酸序列被直接转化进入质体基因组中。在美国专利号5,451,513、5,545,817和5,545,818中,在PCT申请号WO 95/16783中,以及在McBride等人(1994)Proc.Nati.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]91,7301-7305中广泛描述了质体
转化技术。基本的叶绿体转化技术涉及将位于选择性标记侧翼的经克隆的质体DNA区连同
感兴趣的基因一起引入适合的靶组织中,这是例如使用生物射弹(biolistic)或原生质体
转化(例如,氯化钙或PEG介导的转化)来进行的。这些1至1.5kb的侧翼区(被命名为靶向序
列)促进了与质体基因组的同源重组,并且因而允许置换或修饰原质体(plastome)的特定
区域。最初,将叶绿体16S rRNA和rps12基因的点突变(赋予对大观霉素和/或链霉素抗性)
用作用于转化的选择性标记(Svab,Z.,Hajdukiewicz,P.和Maliga,P.(1990)
Proc.Nati.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]87,8526-8530;Staub,J.M.和Maliga,P.
(1992)Plant Cell[植物细胞]4,39-45)。这以大约每100次靶叶轰击大约1个的频率产生稳
定的同质转化株。在这些标记之间克隆位点的存在允许建立质体靶向载体用于外来基因的
引入(Staub,J.M.和Maliga,P.(1993)EMBO J.[欧洲分子生物学杂志]12,601-606)。大幅度
提高转化效率是通过用显性的选择性标记(对大观霉素解毒酶氨基糖苷-3'-腺苷转移酶进
行编码的细菌aadA基因)置换隐性的rRNA或r蛋白抗生素抗性基因而获得的(Svab,Z.和
Maliga,P.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]90,913-917)。先前,这种标记已经被成功地用于莱茵衣藻这种绿藻的质体基因组的高频率转化(Goldschmidt-
Clermont,M.(1991)Nucl.Acids Res.[核酸研究]19:4083-4089)。有用于质体转化的其他
选择性标记在本领域是已知的,并且被包括在本发明的范围之内。典型地,转化之后需要大约15-20个细胞分裂循环以便达到同质状态。质体表达(其中基因通过同源重组被插入到在
每个植物细胞中存在的所有数千个环状质体基因组的拷贝中)利用了超过核表达的基因的
庞大的拷贝数目的优点,以便允许能够很容易超过总的可溶性植物蛋白的10%的表达水
平。在一个优选的实施例中,将本发明的核酸序列插入至质体靶向的载体中并且转化至所
希望的植物宿主的质体基因组中。获得了对于包含本发明的核酸序列的质体基因组同型的
植物,并且这些植物优选地能够高度表达该核酸序列。
[0168] 包含本发明的干扰RNA的转基因植物或种子还可以用杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣进行处理,如描述于美国专利号5,849,320和5,876,739(通过引用结合在此)中。在本发明
的杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣以及转基因植物或种子有效对抗同一靶昆虫(例如鞘翅目有
害生物或根萤叶甲属靶有害生物)的情况下,该组合(i)在一种用于进一步增强本发明的组
合物对抗该靶昆虫的活性的方法中以及(ii)在一种用于通过提供对抗该靶昆虫的又另一
种作用机制而防止对本发明的组合物产生抗性的方法中是有用的。因此,本发明提供了一
种增强对根萤叶甲属昆虫种群控制的方法,该方法包括提供一种本发明的转基因植物或种
子并且向该植物或该种子施用本发明的杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣。此类杀昆虫剂和/或
杀昆虫种子包衣的实例包括但不限于,氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、有机磷酸酯、friprole、新烟碱、有机氯化物、沙蚕毒素或其组合。在另一个实施例中,该杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣选自下组,该组由以下组成:克百威,胺甲,灭多虫,联苯菊酯,七氟菊酯,氯菊酯,氟氯氰菊酯,λ-氯氟氰菊酯,氯氰菊酯,溴氰菊酯,毒死蜱,氯磷,乐果,灭线磷,马拉硫磷,甲基对硫磷,甲拌磷,特丁磷,叔丁嘧啶磷(tebupirimiphos),氟虫腈,啶虫脒,吡虫啉,噻虫啉,噻虫嗪,硫丹,杀虫磺,及其组合。包含此类杀昆虫剂和杀昆虫种子包衣的商业产品包括但不限于 (卡巴呋喃)、 (灭多虫、灭多威、mesomile)、 (胺甲
萘)、 (联苯菊酯)、 (七氟菊酯)、 (氯氰菊酯)、
(氯氰菊酯)、Delta (溴氰菊酯)、 (高效氯氟氰菊酯)、
(苄氯菊酯)、 (苄氯菊酯)、 (联苯菊酯)、
(联苯菊酯)、 (七氟菊酯)、 (高效氯氟氰菊酯)、
(毒死蜱)、 (氯氧磷)、 (灭克磷)、 (甲拌磷)、
(甲拌磷、烯虫酯)、 (甲拌磷)、 (特丁磷)、
(乐果)、异氯硫磷、 (氟虫腈)、 (噻虫嗪)、 (吡虫啉)、
(吡虫啉)、 (噻虫胺)以及 (氟氯氰菊酯、嘧丙磷)。
[0169] 本发明的组合物还可以与其他生物控制试剂组合,以增强鞘翅目昆虫或根萤叶甲属昆虫种群的控制。因此,通过提供如下转基因植物,本发明提供了增强对鞘翅目昆虫种群或根萤叶甲属昆虫种群的控制的方法,该转基因植物产生本发明的干扰RNA并且进一步包
含编码第二杀昆虫剂的多核苷酸。该第二杀昆虫剂可以源自苏云金芽孢杆菌的杀昆虫蛋
白。苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白可以是许多杀昆虫蛋白中的任何一种,包括但不限于Cry1
蛋白、Cry3蛋白、Cry7蛋白、Cry8蛋白、Cry11蛋白、Cry22蛋白、Cry23蛋白、Cry36蛋白、Cry37蛋白、Cry34蛋白连同Cry35蛋白、二元杀昆虫蛋白CryET33和CryET34、二元杀昆虫蛋白
TIC100和TIC101、二元杀昆虫蛋白PS149B1、VIP、TIC900或相关蛋白、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、修饰的Cry3A蛋白、或杂合蛋白或由任何前述杀昆虫蛋白制成的嵌合体。在其他实施例中,该苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白选自下组,该组由以下组成:Cry3Bb1、
Cry34Ab1连同Cry35Ab1、mCry3A以及eCry3.1Ab。
[0170] 在其他实施例中,该转基因植物可以产生本发明的干扰RNA和源自苏云金芽孢杆菌以外来源的第二杀昆虫剂。该第二杀昆虫剂可以是选自下组的试剂,该组包含:马铃薯糖蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、几丁质酶、脲酶、α-淀粉酶抑制剂、成孔蛋白、凝集素、工程化抗体或抗体片段、蜡样芽孢杆菌杀昆虫蛋白、致病杆菌属(如嗜线虫致病杆菌或伯氏致病杆菌)杀昆虫蛋白、光杆菌属(如发光杆菌或非共生光杆菌)杀昆虫蛋白、侧孢短芽孢杆菌杀昆虫蛋白、球形赖氨酸芽胞杆菌杀昆虫蛋白、色杆菌属杀昆虫蛋白、噬虫霉耶尔森菌杀昆虫蛋白、乳状芽孢杆菌杀昆虫蛋白、梭菌属(如双酶梭菌)杀昆虫蛋白、和木质素。在其他实施例中,该第二试剂可以是至少一种源自来自发光杆菌、致病杆菌、沙雷氏菌或耶尔森氏菌的杀昆虫毒素复合物(Tc)的杀昆虫蛋白。在其他实施例中,该杀昆虫蛋白可以是源自杀昆虫细
菌(如光杆菌属)的ADP-核糖基转移酶。在其他实施例中,该杀昆虫蛋白可以是VIP蛋白,如来自蜡样芽孢杆菌的VIP1或VIP2。在仍其他实施例中,该杀昆虫蛋白可以是源自杀昆虫细
菌的二元毒素,如来自侧孢芽孢杆菌的ISP1A和ISP2A或来自球形赖氨酸芽胞杆菌的BinA和
BinB。在仍其他实施例中,该杀昆虫蛋白可以是工程化的或可以是任何前述杀昆虫蛋白的
杂合体或嵌合体。
[0171] 在另一个实施例中,该转基因植物和转基因种子是一种玉米植物或玉米种子。在另一个实施例中,该转基因玉米植物通过一种包含本发明的dsRNA的第一转基因玉米植物
与一种包含选自下组的转基因事件的转基因玉米植物杂交而提供,该组由以下各项组成:
MIR604、事件5307、DAS51922-7、MON863以及MON88017。
[0172] 即使在该杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣能有效对抗一种不同的昆虫的情况下,该杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣对于扩展昆虫控制的范围是有用的,例如通过将一种具有对抗鳞
翅目昆虫活性的杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣加入本发明的转基因植物或种子(具有对抗鞘
翅目昆虫的活性)中,所处理的植物或包衣的转基因种子控制鳞翅目和鞘翅目有害生物两
者。
[0173] 在另外的实施例中,本发明涵盖来自本发明的转基因植物、种子或其部分的生物样品,其中该样品包含作为本发明的dsRNA或编码本发明的dsRNA的至少一条链的核酸。在
其他实施例中,本发明涵盖一种衍生自本发明的转基因植物、种子或其部分的商品产品。在一些实施例中,该商品产品选自下组,该组由以下组成:整个或经处理的种子、豆类、谷物、籽粒、壳、粉、粗碾去壳谷类、面粉、糖、糖、淀粉、蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、蜡、油、提取物、汁、浓缩物、液体、糖浆、饲料、青贮饲料纤维、纸或其他从植物生产的食物或产品。在其他实施例中,该生物样品或商品产品对昆虫具有毒性。在其他实施例中,该转基因植物是一种转基因玉米植物。
[0174] 本发明进一步涵盖一种控制鞘翅目昆虫或根萤叶甲属昆虫的方法,该方法包括使该根萤叶甲属昆虫与一种作为本发明的干扰RNA分子或能够产生本发明的干扰RNA分子的
核酸分子接触,该干扰RNA分子用于抑制靶基因在该昆虫中的表达,从而控制该鞘翅目昆虫或根萤叶甲属昆虫。在一些实施例中,该靶基因包含如下编码序列,该编码序列(i)至少与SEQ ID NO:1-30、SEQ ID NO:91-120、SEQ ID NO:271-273、SEQ ID NO:277-279、SEQ ID NO:283-303的19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、
80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、
260、270、280、290、或300个连续核苷酸的片段具有至少80%同一性、至少85%同一性、至少
86%同一性、至少87%同一性、至少88%同一性、至少89%同一性、至少90%同一性、至少
91%同一性、至少92%同一性、至少93%同一性、至少94%同一性、至少95%同一性、至少
96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性、至少99%同一性、或100%同一性;或者(ii)至少包含SEQ ID NO:1-30、SEQ ID NO:91-120、SEQ ID NO:271-273、SEQ ID NO:277-
279、SEQ ID NO:283-303的19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、
65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、
240、250、260、270、280、290、或300个连续核苷酸的片段;(iii)至少包含编码由SEQ ID NO:
1-30、SEQ ID NO:91-120、SEQ ID NO:271-273、SEQ ID NO:277-279、或SEQ ID NO:283-303编码的氨基酸序列的核苷酸序列的19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、
50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、
210、220、230、240、250、260、270、280、290、或300个连续核苷酸的片段;或者(iv)可以在严格条件下与选自下组的多核苷酸杂交,该组由以下组成:SEQ ID NO:1-30、SEQ ID NO:91-
120、SEQ ID NO:271-273、SEQ ID NO:277-279、SEQ ID NO:283-303,及其互补序列。在一些实施例中,该靶基因编码序列包含SEQ ID NO:1-30、SEQ ID NO:91-120、SEQ ID NO:271-
273、SEQ ID NO:277-279、SEQ ID NO:283-303,或其互补序列。在其他实施例中,本发明的干扰RNA分子与可从在此描述的根萤叶甲属靶基因转录的mRNA多核苷酸的一部分互补。
[0175] 在控制鞘翅目昆虫有害生物或根萤叶甲属昆虫有害生物的方法的一些实施例中,本发明的干扰RNA分子包含至少一种dsRNA,其中该dsRNA是包含退火的互补链的双链RNA的
区域,其中的一条链包含具有至少19个连续核苷酸的序列,该序列(i)至少与SEQ ID NO:
121-210、SEQ ID NO:274-276、SEQ ID NO:280-282、SEQ ID NO:304-324的19、20、21、22、
23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、
130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、或300个连续核苷酸的片段,或其互补序列具有至少80%同一性、至少85%同一性、至少86%同一性、至少87%同一性、至少88%同一性、至少89%同一性、至少90%同一性、至少91%同一性、至少92%同一性、至少93%同一性、至少94%同一性、至少95%同一性、至少96%同一性、至少
97%同一性、至少98%同一性、至少99%同一性、或100%同一性;(ii)至少包含SEQ ID NO:
121-210、SEQ ID NO:274-276、SEQ ID NO:280-282、SEQ ID NO:304-324的19、20、21、22、
23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、
130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、或300个连续核苷酸的片段,或其互补序列;(iii)至少包含编码由SEQ ID NO:121-210、SEQ ID NO:
274-276、SEQ ID NO:280-282、SEQ ID NO:304-324编码的氨基酸序列的核苷酸序列的19、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、
110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、或300个连续核苷酸的片段,或其互补序列;或者(iv)可以在严格条件下与选自下组的多核苷酸杂交,该组由以下组成:SEQ ID NO:1-30、SEQ ID NO:91-120、SEQ ID NO:271-273、SEQ ID NO:277-279、SEQ ID NO:283-303,及其互补序列。
[0176] 在控制鞘翅目昆虫有害生物或根萤叶甲属昆虫有害生物的方法的一些实施例中,该干扰RNA分子包含SEQ ID NO:181-210的从18、19、20、或21个连续核苷酸到至少约300个连续核苷酸,基本由其组成或由其组成。在其他实施例中,本发明的干扰RNA包含由N至N+20个核苷酸组成的SEQ ID NO:181-210的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成。例如,本发明的干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:181的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:181的核苷酸1至核苷酸776。换言之,被靶向的mRNA的该部分包含776个SEQ ID NO:181的21个
连续核苷酸(即21-mers)的子序列中的任一个,或其任何互补序列。将认识到的是,这些776个21个连续核苷酸的子序列包括来自SEQ ID NO:121和SEQ ID NO:151的所有可能的21个
连续核苷酸的子序列,以及它们的互补序列,因为SEQ ID NO 121、151和181都针对相同的靶标,即BPA_15366。类似地将认识到的是,SEQ ID NO:181-210的所有21-mer子序列及其所有互补序列子序列包括SEQ ID NO:121-180的所有可能的21个连续核苷酸的子序列,及其
互补序列子序列。
[0177] 类似地,本发明的干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:182的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:182的核苷酸1至核苷酸771。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID 
NO:183的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:183的核苷酸1至核苷酸2907。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:184的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:184的核苷酸1至核苷酸1600。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下
dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:185的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:185的核苷酸1至核苷酸2410。本发明的另一个干扰RNA
分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:186的任何21-mer子序列,或其任何互补序
列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:186的核苷酸1至核苷酸2802。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:187的任何21-mer子序列,或
其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:187的核苷酸1至核苷酸
3681。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:188的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:188的核苷酸1至核苷酸651。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:
189的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:189的核苷酸1至核苷酸673。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:190的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:190的核苷酸1至核苷酸2664。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,
该dsRNA包含SEQ ID NO:191的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由
其组成,其中N是SEQ ID NO:191的核苷酸1至核苷酸438。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:192的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:192的核苷酸1至核苷酸2458。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:193的任何21-mer子序列,或其任何互补
序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:193的核苷酸1至核苷酸3254。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:194的任何21-mer子序列,
或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:194的核苷酸1至核苷酸
3632。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:195的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:195的核苷酸1至核苷酸7611。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:
196的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:196的核苷酸1至核苷酸1008。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包
含SEQ ID NO:197的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:197的核苷酸1至核苷酸2992。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下
dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:198的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:198的核苷酸1至核苷酸1192。本发明的另一个干扰RNA
分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:199的任何21-mer子序列,或其任何互补序
列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:199的核苷酸1至核苷酸7626。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:200的任何21-mer子序列,或
其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:200的核苷酸1至核苷酸
2580。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:201的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:201的核苷酸1至核苷酸4628。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:
202的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:202的核苷酸1至核苷酸1557。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包
含SEQ ID NO:203的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:203的核苷酸1至核苷酸1019。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下
dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:204的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:204的核苷酸1至核苷酸677。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:205的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:205的核苷酸1至核苷酸764。本发明的另一
个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:206的任何21-mer子序列,或其任
何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:206的核苷酸1至核苷酸1830。
本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:207的任何21-mer子
序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:207的核苷酸1至核苷酸3225。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ ID NO:208的
任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是SEQ ID NO:208的核苷酸1至核苷酸1003。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该dsRNA包含SEQ 
ID NO:209的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其组成,其中N是
SEQ ID NO:209的核苷酸1至核苷酸1419。本发明的另一个干扰RNA分子包含如下dsRNA,该
dsRNA包含SEQ ID NO:210的任何21-mer子序列,或其任何互补序列,基本由其组成或由其
组成,其中N是SEQ ID NO:210的核苷酸1至核苷酸5206。
[0178] 在控制根萤叶甲属昆虫有害生物的方法的一些实施例中,该根萤叶甲属昆虫选自下组,该组由以下组成:巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫),西方玉米根萤叶甲(西方玉米根
虫),黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫),黄瓜条根萤叶甲(带状黄瓜甲虫),黄瓜十一星叶甲(西方斑点黄瓜甲虫),斯格尼根萤叶甲(3斑叶甲),南美叶甲(菊花甲虫)以及墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)。
[0179] 在控制鞘翅目昆虫有害生物或根萤叶甲属昆虫有害生物的方法的其他实施例中,该接触包括(a)种植转基因种子,该转基因种子能够产生一种表达该核酸分子的转基因植
物,其中该昆虫摄食该转基因植物或其部分;或(b)将包含该核酸分子的组合物施用至种子或植物或其部分,其中该昆虫摄食该种子、该植物或其部分。在一些实施例中,该转基因种子和该转基因植物是一种玉米种子或一种玉米植物。在其他施例中,该种子或植物是一种
玉米种子或一种玉米植物。
[0180] 本发明还涵盖一种控制根萤叶甲属昆虫的方法,该方法包括使该根萤叶甲属昆虫与作为本发明的干扰RNA分子或能够产生本发明的干扰RNA分子的核酸分子接触,该干扰
RNA分子用于抑制靶基因在根萤叶甲属昆虫中的表达,并且还使该根萤叶甲属昆虫至少与
用于控制根萤叶甲属的第二杀昆虫剂接触,其中所述第二杀昆虫剂包含苏云金芽孢杆菌杀
昆虫蛋白,从而控制该根萤叶甲属昆虫。本发明还涵盖一种控制植物上的根萤叶甲属昆虫
有害生物的方法,该方法包括向所述植物局部施用包含本发明的干扰RNA和至少用于控制
根萤叶甲属的第二杀昆虫剂的杀有害生物剂组合物,其中所述第二杀昆虫剂不包含苏云金
芽孢杆菌杀昆虫蛋白,并且在所述根萤叶甲属昆虫的饲料中提供所述植物。本发明还涵盖
一种方法,其中该第二杀昆虫剂包含马铃薯糖蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、脲酶、α-淀粉酶抑制剂、成孔蛋白、凝集素、工程化抗体或抗体片段、或几丁质酶。该第二杀昆虫剂可以是蜡样芽孢杆菌杀昆虫蛋白、致病杆菌属杀昆虫蛋白、光杆菌属杀昆虫蛋白、侧孢短芽孢杆菌杀昆虫蛋白、球形赖氨酸芽胞杆菌杀昆虫蛋白、色杆菌属杀昆虫蛋白、噬虫霉耶尔森菌杀昆虫蛋白、乳状芽孢杆菌杀昆虫蛋白、或梭菌属杀昆虫蛋白。
[0181] 本发明还涵盖一种减少转基因植物上的成虫鞘翅目昆虫种群或成虫根萤叶甲属昆虫种群的方法,该转基因植物表达Cry蛋白、杂种Cry蛋白、或修饰的Cry蛋白,该方法包括在该转基因植物中表达一种作为本发明的干扰RNA分子或能够产生本发明的干扰RNA分子
的核酸分子,从而减少该成虫鞘翅目昆虫种群或成虫根萤叶甲属昆虫种群,该干扰RNA分子能够抑制如在此描述的靶基因在成虫昆虫中的表达。
[0182] 在一些实施例中,本发明涵盖一种降低可从在此描述的靶基因转录的靶mRNA在鞘翅目昆虫或根萤叶甲属昆虫中的水平的方法,该方法包括使该昆虫与包含本发明的干扰
RNA分子的组合物接触,其中该干扰RNA分子降低该靶RNA在昆虫的细胞中的水平。在一些实施例中,本方法的干扰RNA包含至少一种dsRNA,其中该dsRNA是包含退火的互补链的双链
RNA的区域,其中的一条链包含具有至少19个连续核苷酸的序列,该序列(i)至少与SEQ ID NO:121-210、SEQ ID NO:274-276、SEQ ID NO:280-282、SEQ ID NO:304-324的19、20、21、
22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、
120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、或300个连续核苷酸的片段,或其互补序列具有至少80%同一性、至少85%同一性、至少86%同一性、至少87%同一性、至少88%同一性、至少89%同一性、至少90%同一性、至少91%同一性、至少92%同一性、至少93%同一性、至少94%同一性、至少95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性、至少99%同一性、或100%同一性;(ii)至少包含SEQ ID NO:121-210、SEQ ID NO:274-276、SEQ ID NO:280-282、SEQ ID NO:304-324的19、20、
21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、
120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、或300个连续核苷酸的片段,或其互补序列;(iii)至少包含编码由SEQ ID NO:121-210、SEQ ID NO:274-276、SEQ ID NO:280-282、SEQ ID NO:304-324编码的氨基酸序列的核苷酸序列的
19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、
100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、
290、或300个连续核苷酸的片段,或其互补序列,或者(iv)可以在严格条件下与选自下组的多核苷酸杂交,该组由以下组成:SEQ ID NO:121-210、SEQ ID NO:274-276、SEQ ID NO:
280-282、SEQ ID NO:304-324,及其互补序列,其中该干扰RNA分子对抗靶鞘翅目昆虫或根萤叶甲属昆虫具有杀昆虫活性。在另一个实施例中,通过靶昆虫摄食该组合物来实现接触。
在其他实施例中,由该靶mRNA编码的蛋白质的产生减少。在其他实施例中,该靶蛋白包含与SEQ ID NO:241-270具有至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或至少约
99%同一性的氨基酸。在其他实施例中,该靶蛋白包含SEQ ID NO:241-270。在其他实施例中,该干扰RNA通过表达该干扰RNA的转基因生物体与鞘翅目昆虫或根萤叶甲属昆虫接触。
在其他实施例中,该转基因生物体是转基因植物、转基因微生物、转基因细菌或转基因内寄生菌。在其他实施例中,通过将可接受的农用载体中的干扰RNA局部地施用至昆虫摄食的植物或植物部分来使该干扰RNA与鞘翅目昆虫或根萤叶甲属昆虫接触。在一些实施例中,减少可从在此描述的靶基因转录的靶mRNA的水平的干扰RNA对该鞘翅目昆虫或根萤叶甲属昆虫
而言是致死的。在一些实施例中,该根萤叶甲属昆虫选自下组,该组由以下组成:巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫),西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫),黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫),黄瓜条根萤叶甲(带状黄瓜甲虫),黄瓜十一星叶甲(西方斑点黄瓜甲虫),斯格尼根萤叶甲(3斑叶甲),南美叶甲(菊花甲虫)以及墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)。
[0183] 在一些实施例中,本发明涵盖一种赋予植物或其部分对鞘翅目昆虫耐受性或根萤叶甲属昆虫耐受性的方法,该方法包括向该植物或其部分中引入本发明的干扰RNA分子、
dsRNA分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子、和/或组合物,其中本发明的dsRNA分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子、和/或组合物对于该昆虫是有毒的,从而赋予该植物或其部分对该鞘翅目昆虫或根萤叶甲属昆虫的耐受
性。在其他实施例中,通过转化植物细胞并且自该转化的植物细胞产生该转基因植物来进
行该引入步骤。在仍其他实施例中,通过共同培育两种植物来进行该引入步骤。
[0184] 在其他实施例中,本发明涵盖一种减少被根萤叶甲属昆虫摄食的植物的根损害的方法,该方法包括向该植物的细胞中引入本发明的干扰RNA分子、dsRNA、核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子、和/或组合物,其中本发明的dsRNA、核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子、和/或组合物对于根萤叶甲属昆虫是有毒的,从而减少对该植物的根损害。在其他实施例中,通过转化植物细胞并且自该转化的植物细胞产生该转基因植物来进行该引入步骤。在仍其他实施例中,通过共同培
育两种植物来进行该引入步骤。
[0185] 在仍其他的实施例中,本发明涵盖一种产生对鞘翅目昆虫或根萤叶甲属昆虫具有毒性的转基因植物细胞的方法,该方法包括向植物细胞中引入本发明的干扰RNA分子、
dsRNA、核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子、和/或组合物,从而产生与对照植物细胞相比,对该昆虫具有毒性的转基因植物细胞。在一些实施例中,本发明涵盖多个由这一方法产生的转基因植物细胞。在其他实施例中,使该多个转基因植物细
胞在包括天然日光的条件下生长。在其他实施例中,通过转化一种植物细胞并且自该转化
的植物细胞产生该转基因植物来进行该引入步骤。在仍其他实施例中,通过共同培育两种
植物来进行该引入步骤。
[0186] 在一些实施例中,本发明涵盖一种产生对鞘翅目或根萤叶甲属昆虫摄食损害具有增强的耐受性的转基因植物的方法,该方法包括向植物中引入本发明的干扰RNA分子、
dsRNA、核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子、和/或组合物,从而产生与对照植物相比,对鞘翅目或根萤叶甲属昆虫摄食损害具有增强的耐受性的转基因
植物。在其他实施例中,通过转化植物细胞并且自该转化的植物细胞产生该转基因植物来
进行该引入步骤。在仍其他实施例中,通过共同培育两种植物来进行该引入步骤。
[0187] 在一些实施例中,本发明涵盖一种为玉米种植者提供控制玉米作物中的鞘翅目昆虫有害生物种群或根萤叶甲属昆虫有害生物种群的手段的方法,该方法包括(a)向该种植
者销售或为其提供包含一种本发明的干扰RNA、核酸分子、核酸构建体、嵌合核酸分子、人工植物微小RNA前体分子、和/或组合物的转基因玉米种子;并且(b)向该种植者做广告宣传该转基因玉米种子产生控制鞘翅目或根萤叶甲属有害生物种群的转基因玉米植物。
[0188] 在一些实施例中,本发明涵盖一种鉴定靶基因的方法,该方法用作RNAi策略用于在鞘翅目植物有害生物中产生RNAi用于控制植物有害生物,所述方法包括以下步骤:a)产
生具有选自下组的序列的引物对,该组包含SEQ ID NO:31-90或其互补序列,或由其组成;
b)扩增来自该植物有害生物的核酸样品的直系同源靶标;c)鉴定直系同源靶基因的序列;
d)产生干扰RNA分子,其中该RNA包含至少一种dsRNA,其中该dsRNA是包含退火的互补链的
双链RNA的区域,其中的一条链包含具有至少19个连续核苷酸的序列,该序列与鞘翅目靶基因中的靶核苷酸序列是至少部分互补的;以及e)确定该干扰RNA分子是否对该植物有害生
物具有杀昆虫活性。如果该干扰RNA对鞘翅目有害生物具有杀昆虫活性,则已鉴定出用于控制植物有害生物的靶基因。在一些实施例中,该植物有害生物是鞘翅目植物有害生物。
[0189] 实例
[0190] 通过参考以下具体的实例可以进一步描述本发明。这些实例仅仅是出于说明性目的而提供的,并且并不旨在进行限制,除非另外指明。实例1.鉴定西方玉米根萤叶甲中的
RNAi基因靶标
[0191] 这一实例描述了来自根萤叶甲属昆虫的RNAi靶基因和编码序列的克隆和测序。
[0192] 西方玉米根萤叶甲焦磷酸测序文库制备和测序
[0193] 基本根据制造商的说明,在454平台(454生命科学公司(454 Life Sciences),布兰福德,康涅狄格州)上通过焦磷酸测序对全身新生西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫
(WCR))转录组进行测序。将所得测定序列(read)(即,核酸序列的短片段)进行修整并使用
MIRA组装器组装成重叠群(参见例如,Chevreux等人2004Genome Res.[基因组研究]14:
1147-1159,通过引用结合在此)。
[0194] 鉴定来自根萤叶甲属的最重要的靶基因
[0195] 通过BLAST将组装的重叠群与已知的致死基因和其他生物中的等位基因进行比较,基于以下公开的披露对所述基因进行鉴定,包括网站线虫数据库(wormbase.org)中的
那些和Boutros等人(2004,Science[科学]303:832-835)。根据该分析,鉴定了4,608个靶基因。这些靶基因中的每一个都是非冗余的并且已知具有一个或多个致死的等位基因,或者
已知当在线虫、果蝇或两者中被RNAi靶向时导致致死性。因此,这些靶标中的每一个都被认为是必需的。预期的是,显著大比例的这些靶基因将在WCR中具有杀昆虫效果。令人惊讶的是,事实并非如此。
[0196] 在384孔自动化文库合成平台上产生4,608个靶标的dsRNA。使用引物设计工具Primer3自动设计所有测试的dsRNA样品,以基于每个靶基因的编码序列合成约500bp-
600bp的dsRNA片段。如果编码序列的大小不允许500bp片段,则设计较小的片段。这些样品在24孔WCR测定中以一种浓度(100ng dsRNA/cm2,即190ng dsRNA/孔)进行筛选,每孔具有
10个L2WCR幼虫。10天之后对死亡率进行评分。候选物命中的截止值为69%死亡率。在4,608个候选dsRNA靶标中,鉴定了183个靶基因。这些结果是令人惊讶的,因为本领域技术人员预期这4,608个候选靶标中有更大数量的标靶在生物测定中赋予毒性。
[0197] 在第一测定中,从1μg dsRNA/孔开始,以10倍稀释系列在实验室生物测定中测试7个靶标。使用RNA处理的人工饲料法进行生物测定。简言之,将修改自Marrone等人1985,(J.Econ.Entomol.[经济昆虫学杂志]78:290-293)的饲料的熔化的人工饲料倾倒进48孔板
的每个孔中并允许凝固。将dsRNA分子稀释至适当浓度,这样使得将20μl的溶液添加至48孔板的一半的孔中的饲料的表面,最终覆盖浓度为每孔1μg、0.1μg、0.01μg和0.001μg。向每个孔中添加一个或两个WCR幼虫,以具有24至48个重复幼虫/dsRNA测试浓度。将每个48孔板保持在约26℃,伴随16小时:8小时的光照:黑暗光周期。在侵染后第1、2、3、4、6和7天记录死亡率。将被设计成靶向绿色荧光蛋白(GFP)的dsRNA用作所有生物测定中的阴性对照,并且将
被设计成靶向WCR的泛素基因的dsRNA用作阳性对照。根据该测定,BPA_46378(α-snap)被确认为阳性。四种候选物未被确认为阳性。
[0198] 在确认筛选中同时测试其他176个靶基因。在自动化文库合成平台上产生176个靶标的dsRNA,以及阳性和阴性对照dsRNA。在该筛选下对BPA_46378也进行了测试。使用RNA处理的人工饲料法进行生物测定。简言之,将修改自Marrone等人1985(J.Econ.Entomol.[经
济昆虫学杂志]78:290-293)的饲料的熔化的人工饲料倾倒进48孔板的每个孔中并允许凝
固。将dsRNA分子稀释至适当浓度,这样使得将20μl的溶液添加至48孔板的一半的孔中的饲料的表面,最终覆盖浓度为每孔0.5μg dsRNA。向每个孔中添加一个或两个WCR幼虫,以具有
24至48个重复幼虫/测试dsRNA。将每个48孔板保持在约26℃和16:8的光照:黑暗光周期中。
处理后7天记录死亡率。
[0199] 示于表1中的结果发现最初鉴定的176种dsRNA分子中的29种dsRNA分子被确认为对西方玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)具有高毒性,除了被重新确认的α-snap靶标外。SEQ ID NO:1-30是筛选中鉴定的每种毒性靶基因的核酸片段的核苷酸序列。SEQ ID NO:31-90
或其互补序列是用于合成筛选中鉴定的每种靶基因的核酸片段的引物对的核苷酸序列。
SEQ ID NO:91-120是通过该筛选鉴定的每种靶基因的全长编码序列的核苷酸序列。
[0200] 先前已经表明,根萤叶甲属的某些基因可用于RNAi介导的昆虫控制。参见美国专利公开号2007/0124836(其披露了906个序列)和美国专利号7,612,194(其披露了9,112个
序列)。然而,如在此证明的,任何给定基因靶标通过RNAi方法赋予毒性的能力都无法被预测,并且只能按照经验确定。Narva等人(美国公开号2015/0322456)已经达成了类似的结
论。本发明鉴定了30种靶基因,每种靶基因提供令人惊讶和意想不到的对根萤叶甲属的优
异控制。
[0201] 表1.处理后7天dsRNA对抗西方玉米根萤叶甲的活性
[0202]
[0203]
[0204] 实例2.dsRNA(4种浓度)对抗西方玉米根萤叶甲-DRC的活性
[0205] 这一实例描述了测试本发明的dsRNA对抗西方玉米根萤叶甲(WCR)的生物活性。
[0206] 从1μg dsRNA/孔开始,以10倍稀释系列在实验室生物测定中测试上述30种dsRNA分子对抗WCR的毒性。使用RNA处理的人工饲料法进行生物测定。简言之,将修改自Marrone等人1985(J.Econ.Entomol.[经济昆虫学杂志]78:290-293)的饲料的熔化的人工饲料倾倒
进48孔板的每个孔中并允许凝固。将合成的dsRNA分子稀释至适当浓度,这样使得将20μl的溶液添加至48孔板的一半的孔中的饲料的表面,最终覆盖浓度为每孔1μg、0.1μg、0.01μg和
0.001μg。向每个孔中添加一个或两个WCR幼虫,以具有24至48个重复幼虫/dsRNA测试浓度。
将每个48孔板保持在约26℃和16:8的光照:黑暗光周期中。在侵染后第1、2、3、4、6和7天记录死亡率。将被设计成靶向GFP的dsRNA用作阴性对照,并且将被设计成靶向WCR的泛素基因的dsRNA用作阳性对照。
[0207] 示于表2中的结果证明,被设计成靶向可从WCR基因转录的mRNA的30种dsRNA分子对WCR具有毒性至高毒性。在对GFP dsRNA的对照死亡率进行校正后,通过曲线拟合分析计
算估计的LT50和LC50。LT50代表致死时间,以获得测试昆虫中50%的死亡率。LC50代表dsRNA的浓度,该浓度导致50%的测试昆虫死亡。在表2中,第7天的死亡率%基于1μg dsRNA/孔。LT50基于使用1μg dsRNA/天并以天数进行测量。LC50以μg dsRNA/孔进行测量。
[0208] 表2.处理后7天dsRNA对抗西方玉米根萤叶甲的活性
[0209]
[0210] 基于这些结果,优选一个亚组的靶标进行进一步研究。这些靶标的结果如下所示。
[0211] 实例3.dsRNA对抗西方玉米根萤叶甲的活性
[0212] 这一实例描述了测试一个亚组的本发明的经鉴定的靶dsRNA对抗西方玉米根萤叶甲(WCR)的生物活性。
[0213] 以0.5μg dsRNA/孔开始,以3倍稀释系列在实验室生物测定中测试上述dsRNA分子对抗WCR的毒性。使用RNA处理的人工饲料法进行生物测定。简言之,将修改自Marrone等人
1985(J.Econ.Entomol.[经济昆虫学杂志]78:290-293)的饲料的熔化的人工饲料倾倒进48
孔板的每个孔中并允许凝固。将dsRNA分子稀释至适当浓度,这样使得将20μl的溶液添加至
48孔板的一半的孔中的饲料的表面,最终覆盖浓度为每孔0.5μg、0.16μg、0.05μg、0.02μg、
0.006μg、0.002μg、0.0007μg和0.0002μg。向每个孔中添加一个或两个WCR幼虫,以具有24至
48个重复幼虫/dsRNA测试浓度。将每个48孔板保持在约26℃和16:8的光照:黑暗光周期中。
在侵染后第1、2、3、4、6和7天记录死亡率。将被设计成靶向GFP的dsRNA用作阴性对照,并且将被设计成靶向WCR的泛素基因的dsRNA用作阳性对照。
[0214] 示于表3中的结果证明,被设计成靶向可从WCR基因转录的mRNA的dsRNA分子对WCR具有毒性至高毒性。在对GFP dsRNA的对照死亡率进行校正后,通过曲线拟合分析计算估计的LT50和LC50。LT50代表致死时间,以获得测试昆虫中50%的死亡率。LC50代表dsRNA的浓度,该浓度导致50%的测试昆虫死亡。在表3中,第7天的死亡率%基于0.5μg dsRNA/孔。LT50基于使用0.5μg dsRNA/天并以天数进行测量。LC50以μg dsRNA/孔进行测量。这些结果确认了候选靶标的毒性。
[0215] 表3.dsRNA对抗西方玉米根萤叶甲的活性
[0216]
[0217] 实例4.dsRNA对抗黄瓜十一星叶甲食根亚种的活性
[0218] 这一实例描述了测试本发明的dsRNA对抗黄瓜十一星叶甲食根亚种(南方玉米根虫(SCR))的生物活性。
[0219] 以0.5μg dsRNA/孔开始,以10倍稀释系列在实验室生物测定中测试上述dsRNA分子对抗SCR的毒性。使用RNA处理的人工饲料法进行生物测定。简言之,将修改自Marrone等人1985(J.Econ.Entomol.[经济昆虫学杂志]78:290-293)的饲料的熔化的人工饲料倾倒进
48孔板的每个孔中并允许凝固。将合成的dsRNA分子稀释至适当浓度,这样使得将20μl的溶液添加至每个孔中的饲料的表面,3x稀释步骤中的最终8种覆盖浓度的浓度系列为从0.5μ
g/孔低至0.00022μg/孔。向每个孔中添加一个或两个SCR幼虫,以具有24至48个重复幼虫/dsRNA测试浓度。将每个48孔板保持在约26℃和16:8的光照:黑暗光周期中。在侵染后第1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、和14天记录死亡率。将被设计成靶向GFP的dsRNA用作阴性对照,并且将被设计成靶向西方玉米根萤叶甲(Dv)泛素基因和黄瓜十一星叶甲食根亚种(Du)泛素基
因的dsRNA用作阳性对照。
[0220] 在对GFP dsRNA的对照死亡率进行校正后,通过曲线拟合分析计算估计的LT50和LC50。LT50代表致死时间,以获得测试昆虫中50%的死亡率。LC50代表dsRNA的浓度,该浓度导致50%的测试昆虫死亡。在表4中,第14天的死亡率%基于0.5μg dsRNA/孔。LT50基于使用
0.5μg dsRNA/天并以天数进行测量。LC50以μg dsRNA/孔进行测量。示于表4中的结果证明,被设计成靶向可从西方玉米根萤叶甲(WCR)基因转录的mRNA的dsRNA分子也对黄瓜十一星
叶甲食根亚种(SCR)具有毒性。这表明本发明的靶标也是SCR的合适靶标,这样使得基于天
然SCR mRNA的dsRNA分子也对SCR和其他根萤叶甲属具有毒性。
[0221] 表4.处理后14天dsRNA对抗黄瓜十一星叶甲食根亚种的活性
[0222]
[0223] 实例5.dsRNA对抗巴氏根萤叶甲的活性
[0224] 这一实例描述了测试本发明的dsRNA对抗巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫(NCR))的生物活性。
[0225] 在实验室生物测定中,测试上述dsRNA分子对抗NCR的毒性。使用RNA处理的人工饲料法进行生物测定。简言之,将修改自Marrone等人1985(J.Econ.Entomol.[经济昆虫学杂
志]78:290-293)的饲料的熔化的人工饲料倾倒进48孔板的每个孔中并允许凝固。将合成的
dsRNA分子稀释至适当浓度,这样使得将20μl的溶液添加至48孔板的一半的孔中的饲料的
表面,最终覆盖浓度为每孔0.5μg dsRNA。向每个孔中添加一个或两个NCR幼虫,以具有24至
48个重复幼虫/测试dsRNA。将每个48孔板保持在约26℃和16:8的光照:黑暗光周期中。在侵染后第7天记录死亡率。将被设计成靶向GFP的dsRNA用作所有生物测定中的阴性对照,并且将被设计成靶向巴氏根萤叶甲(Dr)泛素基因的dsRNA用作阳性对照。
[0226] 示于表5中的结果证明,被设计成靶向可从西方玉米根萤叶甲基因转录的mRNA的dsRNA分子也对巴氏根萤叶甲具有毒性。这表明本发明的靶标也是NCR的合适靶标,这样使
得基于天然NCR mRNA的dsRNA分子也对NCR和其他根萤叶甲属具有毒性。
[0227] 表5.处理后7天dsRNA对抗巴氏根萤叶甲的活性
[0228]
[0229] 实例6.WCR中的片段大小测定
[0230] 使用引物设计工具Primer3自动设计在先前实例中测试的所有dsRNA样品,以基于每种靶基因的编码序列合成约500bp的dsRNA片段。如果编码序列的大小不允许500bp片段,则设计较小的片段。
[0231] 在片段大小实验中,基于每种靶基因的完整编码序列设计不同的dsRNA片段。如果可获得并且如果不大于1000bp,则将完整编码序列作为整体进行测试。编码序列也被分成
约200bp的片段,在后续片段之间具有一些25bp-30bp的重叠。对于每个片段,设计新引物并在自动化文库合成平台上合成dsRNA。然后在WCR生物测定中以两种不同浓度(0.1μg 
dsRNA/孔和0.01μg dsRNA/孔)测试所有dsRNA片段,并在第7天对死亡率进行评分。
[0232] 在实验室生物测定中,测试上述dsRNA分子对抗西方玉米根萤叶甲的毒性。使用RNA处理的人工饲料法进行生物测定。简言之,将修改自Marrone等人1985
(J.Econ.Entomol.[经济昆虫学杂志]78:290-293)的饲料的熔化的人工饲料倾倒进48孔板
的每个孔中并允许凝固。将合成的dsRNA分子稀释至适当浓度,这样使得将20μl的溶液添加至48孔板的一半的孔中的饲料的表面,最终覆盖浓度为每孔0.1μg dsRNA或0.01μg dsRNA。
向每个孔中添加一个或两个西方玉米根萤叶甲幼虫,以具有24至48个重复幼虫/测试
dsRNA。将每个48孔板保持在约26℃和16:8的光照:黑暗光周期中。在侵染后第7天记录死亡率。将被设计成靶向GFP的dsRNA用作所有生物测定中的阴性对照,并且将被设计成靶向西
方玉米根萤叶甲的泛素基因的dsRNA用作阳性对照。
[0233] 示于表6中的结果证明,被设计成靶向可从西方玉米根萤叶甲基因转录的mRNA的dsRNA片段对西方玉米根萤叶甲具有毒性至高毒性。
[0234] 表6.处理后7天dsRNA亚片段对抗西方玉米根萤叶甲的活性
[0235]
[0236]
[0237] 实例7.含有靶dsRNA的干扰RNA分子在玉米植物中的表达
[0238] 该实例描述了将表达干扰RNA分子的构建体引入植物细胞。
[0239] 载体构建
[0240] 被设计成产生发夹RNA(hpRNA)的表达载体由含有启动子、正义链、用作环序列的内含子、反义链、以及终止子的盒组成。二元载体23160包含如下表达盒,该表达盒包含被设计成产生靶向BPA_2526(SEQ ID NO:325)的524个核苷酸的片段的hpRNA的DNA序列。二元载
体23564包含如下表达盒,该表达盒包含被设计成产生靶向BPA_46378(SEQ ID NO:326)的
197个核苷酸的片段的hpRNA的DNA序列。在植物转化过程中,设计还含有在左边缘与右边缘之间的第二盒的每个二元载体以表达作为选择性标记的磷酸甘露糖异构酶(PMI),该磷酸
甘露糖异构酶提供代谢甘露糖的能力(美国专利号5,767,378和5,994,629,其通过引用结
合在此)。这些载体还包含用于在细菌中进行选择的选择性标记。
[0241] 农杆菌介导的转化
[0242] 使用本领域的普通技术人员已知的标准分子生物学技术将含有发夹盒的每个生成的质粒转化进根癌土壤杆菌中。将以上描述的载体转化进玉米中。基本如描述于
Negrotto等人,2000,Plant Cell Reports[植物细胞报告]19:798-803中的进行未成熟的
玉蜀黍胚的农杆菌转化。对于这个实例,所有的培养基组分基本上如在以上Negrotto等人
所说明。然而,本领域内已知的各种培养基成分可以被代替。转化、选择、和再生之后,测试植物的pmi基因和发夹dsRNA干扰RNA分子的存在。将来自PCR测定的阳性植物转移至温室
中,并针对至少西方玉米根虫的抗性进行了测试。
[0243] 转基因玉米WCR杀昆虫测定
[0244] 使包含二元载体23160或二元载体23564的转基因的转基因玉米植物的六个F1子代发芽并允许其生长。使用PMI ELISA试纸条检测(strip  test,Romer Labs
PMI(#7000052))鉴定转基因阳性的植物和无效的非转基因的分离的姊妹
植物。每个植物在基部用10只新生的西方玉米根虫进行侵染。侵染7天之后,评估根虫的存活率和大小。另外,检测来自每个植物的玉米根的摄食损害。对于包含二元载体23160或二元载体23564的转基因的转基因玉米植物的每个F1子代,将该实验重复八次,评估了总共48个F1子代/转基因。
[0245] 代表性结果示于表7和8中。表7显示了用二元载体23160的转基因转化的转基因玉米的结果。表8显示了用二元载体23564的转基因转化的转基因玉米的结果。对于每个转基
因,显示了来自两个不同转基因事件的F1子代的结果。如果F1子代未能发芽,则表中所有大田注明为“N/A”。对于由载体23160的RNAi构建体靶向的BPA_2526靶标,检测来自转基因事件ID 1283和1610的F1子代。对于由载体23564的RNAi构建体靶向的BPA_46378靶标,检测来自转基因事件ID 4850和4853的F1子代。示出侵染7天后回收的西部玉米根虫(WCR)的数量
(#WCR)。回收的根虫按大小(WCR大小)分级,分为中等(m)、中等/大(mb)、大(b)或非常大
(vb)。还分析了玉米植物根部的摄食损害。“轻微的”根损害指示根部看起来强壮而健康。
“明显的”根损害指示与对照相比,根部情况稍微差一些。“显著的”根损害指示较小的根受损或缺失。“严重的”根损害指示只有最大的根仍然与植物附接。
[0246] 表7:hpRNA BPA_2526转基因玉米植物中的WCR耐受性
[0247]
[0248]
[0249] 表8:hpRNA BPA_46378转基因玉米植物中的WCR耐受性
[0250]植物ID PMI? #WCR WCR大小 根损害
4850-1 否 7 5vb,1b,1mb 明显的
4850-2 否 9 9vb 轻微的
4850-3 否 10 10vb 轻微的
4850-4 否 9 7vb,1b,1mb 严重的
4850-5 是 4 2vb,2mb 明显的
4850-6 是 6 2vb,4b 严重的
4853-1 是 4 4vb 明显的
4853-2 是 6 1m,1b,4vb 显著的
4853-3 否 10 9vb,1b 严重的
4853-4 否 10 10vb 显著的
4853-5 N/A N/A N/A N/A
4853-6 否 9 9vb 显著的
[0251] 表7和8中的数据表明与非转基因、阴性对照姊妹植物相比,表达靶向昆虫基因BPA_2526或BPA_46378的dsRNA的转基因玉米植物可经受更少的根损害。表7和8显示如与非
转基因对照植物相比,包含本发明的干扰RNA分子的转基因植物对昆虫有害生物具有增强
的抗性。
[0252] 转基因玉米CRW根测定
[0253] 使表达来自二元载体23160的转基因的转基因玉米生长,并去除来自植物的支根或冠根。将根置于2%琼脂板上并用80至100个L1WCR幼虫侵染。在黑暗中于26℃孵育24至
48小时后,将L1幼虫转移至48孔WCR饲料板中并在黑暗中于26℃孵育并每天对WCR幼虫的死
亡率进行评分,直到侵染后7天。该实验在三种不同的转基因玉米事件和非转基因对照玉米植物上进行。累积结果显示在表9中。死亡率%指示死亡的WCR幼虫的总百分比。
[0254] 表9:hpRNA BPA_2526转基因玉米的CRW根测定
[0255]植物ID %死亡率
非转基因 14
事件1 77
事件2 72
事件3 78
[0256] 表9中的数据表明,表达靶向昆虫基因BPA_2526的dsRNA的转基因玉米植物对昆虫有害生物具有杀昆虫效果。这进一步显示如与非转基因对照植物相比,包含本发明的干扰
RNA分子的转基因植物对昆虫有害生物具有增强的抗性。
[0257] 实例8.用第二杀昆虫剂生物测定的干扰RNA分子
[0258] 这个实例说明了与第二杀昆虫剂组合的本发明的干扰RNA分子的毒性。
[0259] 针对BPA_15366靶标产生双链RNA分子。另外,制备第二杀昆虫剂。在实验室生物测定中,组合测试RNA和第二杀昆虫剂对抗WCR的毒性。
[0260] 应当理解的是,在此描述的实例和实施例仅是出于说明性的目的,并且根据其说明书的不同修改或变化将提示本领域的技术人员并且将会包含在本申请以及随附的权利
要求书的范围的精神和范围之内。
[0261] 在本说明书中提到的所有公开物和专利申请对于本发明所涉及领域的技术人员的技术水平是指示性的。所有这些公开物和专利申请均通过引用结合在此,其程度如同每
个单独的公开物或专利申请被确切地并单独地指明通过引用而被结合。
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