利用RNAi沉默翻译起始因子基因培育抗花叶病甘蔗的方法
阅读：939发布：2020-05-12
专利汇可以提供利用RNAi沉默翻译起始因子基因培育抗花叶病甘蔗的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种利用RNAi沉默翻译起始因子基因培育抗花叶病 甘蔗 的方法，包括SceIF4E1基因和SceIF4E2基因的克隆、RNAi干扰载体构建、遗传转化、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定。以SceIF4E1和SceIF4E2作为RNAi干扰靶序列，经遗传转化后获得的转基因植株，产生了对甘蔗花叶病的三种病原即甘蔗花叶病毒、 高粱 花叶病毒和甘蔗条纹花叶病毒不同株系的广谱抗性，具有抗病性好、抗性持久且 生物 安全性高的特点，使转基因甘蔗的培育摆脱了对抗源基因的依赖，并且可以有效缩短甘蔗抗花叶病育种周期。采用本发明的方法培育抗花叶病转基因甘蔗，在 转基因生物 安全上，优于转入病毒序列的转基因甘蔗。，下面是利用RNAi沉默翻译起始因子基因培育抗花叶病甘蔗的方法专利的具体信息内容。
1.甘蔗翻译起始因子基因在培育甘蔗抗SCSMV品种中的应用，其特征在于所述甘蔗翻译起始因子基因为SceIF4E1和SceIF4E2；所述SceIF4E1基因与SCMV，SrMV，SCSMV三种病毒的VPg均互作，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；所述SceIF4E2基因与SCMV，SrMV两种病毒的VPg均互作，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
2.一种利用RNAi沉默翻译起始因子基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法，其特征在于：
(1)RNAi干扰靶序列的获得
针对SceIF4E1基因设计一对特异性引物Sc4E1-F和Sc4E1-R，在上游引物Sc4E1-F上引入Xba I和Xho I酶切位点；针对SceIF4E2基因设计一对特异性引物Sc4E2-F和Sc4E2-R，在下游引物Sc4E2-R上引入HindⅢ和Kpn I酶切位点；引物Sc4E1-R与Sc4E2-F有20个碱基互补，通过融合PCR反应获得5′端带有Xba I和Xho I酶切位点，3′带有HindⅢ和Kpn I酶切位点的PCR产物，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和回收，获得含有SceIF4E1基因片段和SceIF4E2基因片段的RNAi干扰靶序列；所述上游引物Sc4E1-F的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；下游引物Sc4E1-R的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:
8所示的核苷酸序列；上游引物Sc4E2-F的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；下游引物Sc4E2-R的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；所述RNAi干扰靶序列的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；所述SceIF4E1基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；所述SceIF4E2基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
(2)RNAi干扰载体构建：
a.正向片段S1的获得：用Kpn I和Xho I对RNAi干扰靶序列进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和回收，获得正向片段S1；S1的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；
b.中间载体pS1的获得：用Kpn I和Xho I对pHANNIBAL载体进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和回收，用T4 DNA连接酶将回收产物与正向片段S1连接，即将正向片段S1克隆到pHANNIBAL载体上，得到重组质粒pS1；
c.反向互补片段S2的获得：用Xba I和HindⅢ对RNAi干扰靶序列进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和回收，获得反向互补片段S2；S2的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列；
d.中间载体pS1S2的获得：用Xba I和HindⅢ对中间载体pS1进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和回收，用T4 DNA连接酶将回收产物与反向互补片段S2连接，即将反向互补片段S2克隆到重组质粒pS1上，得到以pHANNIBAL载体上的内含子intron作为间隔区、具有发卡结构反向重复序列的中间载体pS1S2；
e.发夹结构片段的获得：用Not I对中间载体pS1S2进行单酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和回收，获得发夹结构片段；发夹结构片段的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；
f.RNAi干扰载体pG0229-4E1+2的获得：用Not I单酶切pGreenII0229载体，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和回收，用T4 DNA连接酶将回收产物与发夹结构片段连接，并将连接产物转化至受态大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α中，挑取阳性克隆验证，得到可用于甘蔗遗传转化的RNAi干扰载体pG0229-SceIF4E1+2；
(3)遗传转化、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定：提取构建完成的RNAi干扰载体pG0229-4E1+2质粒DNA，用核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度，并将其定量至1μg/μL，基因枪轰击法遗传转化甘蔗，分子检测获得阳性转基因植株，并进行抗病转基因甘蔗的抗病性鉴定。
利用RNAi沉默翻译起始因子基因培育抗花叶病甘蔗的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种培育甘蔗抗病品种的方法，具体涉及一种利用RNAi沉默翻译起始因子基因培育抗甘蔗花叶病品种的方法，即利用RNAi技术干扰甘蔗中真核翻译起始因子基因SceIF4E1和SceIF4E2培育抗甘蔗花叶病转基因甘蔗的方法，属于生物技术领域。
背景技术
[0002] 甘蔗(Saccharum sp.hybrid)是我国乃至全世界最重要的糖料作物和能源作物，甘蔗糖占我国食糖总量的92％，占世界食糖总量的74％，甘蔗乙醇占世界生物质燃料乙醇的60％。甘蔗花叶病是严重危害甘蔗生产的病毒性病害之一，在我国广西、云南、广东、海南等地蔗区普遍发生(李文凤等,2007；许东林等,2008)。甘蔗感染花叶病后，叶片出现黄绿相间、大小不一的条纹，种苗萌芽率下降，分蘖减少，植株矮小，生长缓慢，品质变劣，蔗糖结晶率下降(Joyce et al.,1998；Wu et al.,2012；Li et al.,2013)。甘蔗花叶病的病原主要有3种，即甘蔗条纹花叶病毒SCSMV，甘蔗花叶病毒(Sugarcane Mosaic Virus,SCMV)和高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)，均属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)(李文凤等,2007；许东林等,2008；Xu et al.,2008；熊果如等,2011)。SCMV和SrMV属于马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。SCSMV于1978年在美国首次发现并报道，1998年确定其属于Potyviridae，2012年国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)将其立为该科新属，即禾病毒属(Poacevirus)(http://www.ictvonline.org)。SCSMV主要分布在中国、孟加拉、印度、日本、印度尼西亚、巴基斯坦等地，在中国甘蔗主产区广西、云南呈现爆发式流行，在广东、浙江和福建等地普遍发生并广泛传播(Li et al.,2011)，田间发病率达到50％时，产量损失高达20％(Putra et al.,2013)。
[0003] SCMV，SrMV和SCSMV均为单链正义RNA病毒，基因组结构简单，长度约为10Kb，编码一个大的多聚蛋白(ployprotein)，经酶解后形成10个成熟蛋白，从N端到C端依次为：第一蛋白(P1)、辅助成分-蛋白酶(helper component proteinase，HC-Pro)、第三蛋白(P3)、第一个6K蛋白(6K1)、柱状内含体蛋白(cylindrical inclusion protein,CI)、第二个6K蛋白(6K2)、病毒的末端结合蛋白(Viral Protein Genome-linked，VPg)、核内含体a蛋白(Nuclear Inclusion a protein,NIa)、核内含体b蛋白(Nuclear Inclusion b protein,NIb)和外壳蛋白(Coat Protein,CP)(Riechmann et al.,1992；Urcuqui-Inchima et al.,2001)。另外，在P3基因内部，在G2A7保守结构域发生移码，编码一个新的蛋白，为P3NPIPO(Chung et al.,2008；Wei et al.,2010；Vijayapalani et al.,2012)。
[0004] 植物病毒作为一种细胞内专性寄生物，必须借助寄主的某些特异因子，才能在寄主体内建立侵染，完成翻译、复制、运动等基本生命活动(Charron et al.,2008)。植物病毒在寄主体内的翻译是病毒完成系统性侵染的关键环节。研究发现，在马铃薯Y病毒科病毒翻译的过程中，VPg起到关键作用。由于该类病毒基因组的5ˊ端没有帽子结构m7GpppN(N为任意核酸)，病毒要完成翻译，必须通过其编码的VPg充当帽子结构与真核翻译起始因子(Eukaryotic translation initiation factor,eIF)互作，形成四聚体并招募其他因子，才能启动病毒RNA翻译(Murphy et al.,1991,1996)。
[0005] 翻译起始因子eIF4E是马铃薯Y病毒科病毒在寄主体内启动翻译的必须寄主因子，长期被病毒选择利用，在病毒生命活动中的功能具有相对的保守性和稳定性，是病毒与植物协同进化的产物(Charron et al.,2008)，这类寄主因子基因突变产生的隐性抗病基因具有广谱性和持久性(Pavan et al.,2010)。隐性抗病基因在抗病毒植物中普遍存在，因其对病毒的广谱抗性，被广泛应用于作物抗病育种。最近10年，随着病毒与寄主的互作研究的深入，发现这些隐性抗病基因在生物学本质上都是与病毒互作的寄主因子基因的突变体，如辣椒中抗马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)和烟草蚀刻病毒(Tobacco etch virus,TEV)的pvr2、抗辣椒叶脉斑驳病毒(Pepper vein mottle virus,PVMY)的pvr6，豌豆中抗豌豆种传花叶病毒(Pea seed-born mosaic virus,PSbMV)的sbm1等，都是与病毒互作的寄主翻译起始因子基因eIF4E1或eIF4E2的突变体。这种抗性非常持久，辣椒的抗PVMY的pvr6使用了50多年，依然有效。已经报道的12个的对马铃薯Y病毒具有抗性的隐性抗病基因，其中7个自然突变产生的，5个是通过T-DNA基因敲除等方法产生的，都是翻译起始因子基因的突变体(Robaglia&Caranta,2006；Maule et al.,2007；Truniger et al.,2009)。
[0006] 寄主隐性抗病基因的这种因失去与病毒互作能力而产生对病毒广谱抗性的功能，为利用RNAi技术开展广谱抗病转基因研究奠定了生物学基础。利用RNAi技术，已经成功的沉默了拟南芥、西红柿等植物的翻译起始因子基因，获得了具有广谱抗性的突变体。拟南芥AteIF4E1基因突变时，产生了对苜蓿黄脉病毒(Clover yellow vein virus,ClYVV)的抗性；AteIF4E2基因突变时，突变株产生了对芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)、莴苣花叶病毒(Lettuce mosaic virus,LMV)和李痘病毒(Plum pox virus,PPV)的抗性(Duprat et al.,2002；Sato,2005；Decroocq et al.,2006)。在西红柿中，沉默SleIF4E1基因，突变株同时免疫马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)和辣椒斑驳病毒(Pepper mottle virus,PepMoV)两种病毒(Piron et al.,2010)，同时沉默番茄的SleIF4E1和SleIF4E2基因，突变株产生的对PVY、TEV、辣椒斑驳病毒(Pepper mottle virus,PepMoV)、彩叶椒病毒(Ecuadorian rocotto virus,ERV)、辣椒重型花叶病毒(Pepper severe mosaic virus,PepSMV)、辣椒黄花叶病毒(Pepper yellow mosaic virus,PepYMV)及马铃薯V病毒(Potato virus V,PVV)共7种病毒的抗性(Mazier et al.,2011)。特别值得注意的是，在这些具有广谱抗性的突变体中，都出现了表型没有或基本没有发生变化，能够正常生长发育、完成生命周期的株系(Duprat et al.,2002；Sato,2005；Decroocq et al.,2006；Piron et al.,2010；Mazier et al.,2011)。
[0007] 甘蔗花叶病病原主要由蚜虫以非持续性方式传播，通过常规手段难以防止。抗花叶病一直是甘蔗育种目标之一，通过传统的杂交方式，可以选育出抗花叶病的甘蔗品种。但是，因为花期不遇、优良基因型难以聚合、周期长等原因，很难获得高产高糖等农艺性状与抗花叶病聚合的基因型。由病毒自身基因介导的转基因植株抗病性(pathogen-derived resistance,PDR)(Abel et al.,1986)的发现和转基因技术的发展，使利用生物工程手段培育抗花叶病转基因甘蔗成为可能。PDR的原理是RNAi，RNAi技术是在真核生物体内发生的、基于核酸序列同源性的一种基因表达调控机制。即双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)被Dicer降解为21-26nt的小干扰RNA，而后者指导同源RNA进行识别和切割，导致靶标mRNA的降解，从而造成基因沉默。RNAi技术已经应用与抗花叶病转基因甘蔗材料的培育，但是其干扰对象主要是病毒的CP基因，由于CP基因多态性非常高，获得的转基因材料仅对CP基因来源病毒株系免疫，对同一病毒的其他株系抗性不足或失去抗性。Joyce(1998)将SCMV-E的外壳蛋白基因(CP)转入甘蔗，随机取田间发病甘蔗叶片汁液(未明确病毒种类和株系)对突变体摩擦接种，突变体产生由抗到感一系列类型。Ingelbrecht(1999)将SrMV-H株系的CP基因导入甘蔗，以SrMV-H、SrMV-I、SrMV-M和SCMV-D对突变体做病毒侵染实验，发现突变体对病毒的抗性与CP基因序列相似度呈正相关：对SrMV-H高抗，同一病毒株系CP基因同源性为100％；对SrMV-I和SrMV-M中抗，这两个病毒株系的CP基因与SrMV-H的CP基因的同源性均为95％；对SCMV-D高感，该病毒株系与SrMV-H的CP基因同源性为75％。
[0008] 翻译起始因子基因是植物的内源基因，是控制病毒在寄主体内翻译的关键基因，干扰其表达或敲除该基因将获得对某一种病毒所有株系均产生抗性的转基因材料或株系。
发明内容
[0009] 本发明的目的是提供一种利用RNAi沉默翻译起始因子基因培育甘蔗抗甘蔗花叶病品种的方法。采用RNAi技术，以甘蔗的SceIF4E1基因和SceIF4E2基因的保守区作为RNAi干扰片段，构建反向重复序列，得到一个RNAi载体。通过基因枪轰击法遗传转化甘蔗，以获得对花叶病具有广谱抗性的转基因甘蔗。
[0010] 本发明的目的是通过以下方法实现的。
[0011] 一种与SCMV，SrMV，SCSMV三种病毒的VPg均互作的甘蔗翻译起始因子的基因SceIF4E1，其特征在于所述基因的核苷酸序列如下：
[0012] ATGGCCGACGAGATCGACACGAGGCCGGCCTCCGCGGGCTCCCGGGGCCGCCCCGCGCACGCTACGGAGGAGGACGACAGGGAGGAGGGCGAGATCGCCGATGACGCCCCCGCGCCCGCCCTCCCCGCCACGCACCCGCTCGAGCACTCGTGGACCTTCTGGTTCGACAACCAGCAGGGCAAGAGCAAGCAGGCCGCCTGGGGGAGCTCCATCCGACCCATCCACACCTTCTCCACCGTCGAGGACTTCTGGGGCCTTTACAATAATATTCATCACCCTAGCAAGTTGGCCATGGGAGCTGACTTCCATTGCTTCAAGAACAAGATTGAACCAAAATGGGAAGACCCTATTTGTGCTAATGGCGGTAAATGGACCATCAGCTGTGGAAGAGGAAAATCTGACACGCTGTGGCTGCACACCCTGTTGGCTATGATTGGCGAACAATTCGACTATGGTGATGAAATTTGTGGAGCAGTCGTCAGCGTGCGTGGCAAGCAGGAAAGAATAGCTATCTGGACAAAAAATGCTGCTAATGAAGCTGCTCAGATAAGCATTGGGAAGCAGTGGAAGGAATTCCTGGATTACAAGGACTCCATTGGATTCATTGTTCATGACGATGCAAAGAAGGCGGACAAGGGACCGAGGAACCGTTACACGGTTTGA。
[0013] SceIF4E1氨基酸序列如下：
[0014] MADEIDTRPASAGSRGRPAHATEEDDREEGEIADDAPAPALPATHPLEHSWTFWFDNQQGKSKQAAWGSSIRPIHTFSTVEDFWGLYNNIHHPSKLAMGADFHCFKNKIEPKWEDPICANGGKWTISCGRGKSDTLWLHTLLAMIGEQFDYGDEICGAVVSVRGKQERIAIWTKNAANEAAQISIGKQWKEFLDYKDSIGFIVHDDAKKADKGPRNRYTV。
[0015] 一种与SCMV，SrMV两种病毒的VPg均互作的甘蔗翻译起始因子的基因SceIF4E2，其特征在于所述基因的核苷酸序列如下：
[0016] ATGGCGGAGGTCGAGGTTCCAGCTGCTGCGGTTGCGACGACGACCCCTGAGGCGGCGGCGACCGAGGGCGGAGCCGCGACGGAGGCGAAGGGTCCGCACAAGCTGCACCGGCAGTGGACCTTCTGGTACGACATCCAGTCGAAGCCCAAGCCGGGCGCTGCGTGGGGCACCTCCCTCAAAAAGGCCTACACCTTCGACACCGTCGAGGATTTTTGGAGCTTGTATGATCAGATTTTTCGTCCAAGCAAGCTGTCTGGGAATGCTGATTTTCATCTGTTCAAGGCTGGAGTAGAGCCAAAATGGGAAGACCCAGAGTGTGCAAATGGTGGCAAATGGACTGTCCCATGCAACAGAAAGGCAACCTTTGAGAACATGTGGCTTGAAACGTTGATGGCACTTATTGGGGAGCAGTTTGATGAAACAGAGGACATTTGTGGAATTGTTGCTAGTGTCCGTGCGAGAGGAGATAAGCTTGCATTATGGACTAGGACTGCCAGCAATGAAGCTGTCCAGGTAAACATTGGCAAGAAATGGAAGGATGTCATCGACTACAATGACAAGATCACCTACACTTTCCATGACGACTCGAGAAGAGAGGAGCCGAGCAGAGGCGGACGGTACACCGTGTAA。
[0017] SceIF4E2氨基酸序列如下：
[0018] MAEVEVPAAAVATTTPEAAATEGGAATEAKGPHKLHRQWTFWYDIQSKPKPGAAWGTSLKKAYTFDTVEDFWSLYDQIFRPSKLSGNADFHLFKAGVEPKWEDPECANGGKWTVPCNRKATFENMWLETLMALIGEQFDETEDICGIVASVRARGDKLALWTRTASNEAVQVNIGKKWKDVIDYNDKITYTFHDDSRREEPSRGGRYTV。
[0019] 一种针对SceIF4E1基因设计的一对特异性引物Sc4E1-F(上游引物)和Sc4E1-R(下游引物)，其特征在于所述引物的序列如下：
[0020] Sc4E1-F：TCTAGACTCGAGATCCACACCTTCTCCACCGTC
[0021] Sc4E1-R：CAATCATAGCCAACAGGGTGCTTGCTTGGACGAAAAATCT。
[0022] 一种针对SceIF4E2基因设计的一对特异性引物Sc4E1-F(上游引物)和Sc4E1-R(下游引物)，其特征在于所述引物的序列如下：
[0023] Sc4E2-F：CACCCTGTTGGCTATGATTGAGATTTTTCGTCCAAGCAAG
[0024] Sc4E2-R：AAGCTTGGTACCTTCCACAAATGTCCTCTGTT。
[0025] 一种利用RNAi沉默翻译起始因子基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法，包括SceIF4E1基因和SceIF4E2基因的克隆、RNAi干扰载体构建、遗传转化、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定；其特征在于：
[0026] 1.SceIF4E1基因的克隆：
[0027] 利用同源克隆技术克隆甘蔗的SceIF4E1基因，以易感花叶病的热带种甘蔗Badila的叶片为实验材料，利用Trizol方法提取RNA，反转录成cDNA；比较高粱、玉米、水稻、拟南芥的eIF4E1基因的保守区段，设计PCR引物，以cDNA为模板，经PCR扩增，获得甘蔗SceIF4E1基因，该基因全长663bp，编码220个氨基酸；所述SceIF4E1基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；其编码氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
[0028] 2.SceIF4E2基因的克隆：
[0029] 利用同源克隆技术克隆甘蔗的SceIF4E2基因，以易感花叶病的热带种甘蔗Badila的叶片为实验材料，利用Trizol方法提取RNA，反转录成cDNA；比较高粱、玉米、水稻、拟南芥的eIF4E1基因的保守区段，设计PCR引物，以cDNA为模板，经PCR扩增，获得甘蔗SceIF4E2基因，该基因全长630bp，编码209个氨基酸；所述SceIF4E2基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；其编码氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
[0030] 3.RNAi干扰靶序列的获得
[0031] 针对SceIF4E1基因设计一对特异性引物Sc4E1-F和Sc4E1-R，在上游引物Sc4E1-F上引入Xba I和Xho I酶切位点；针对SceIF4E2基因设计一对特异性引物Sc4E2-F和Sc4E2-R，在下游引物Sc4E2-R上引入HindⅢ和Kpn I酶切位点；引物Sc4E1-R与Sc4E2-F有20个碱基互补，通过融合PCR反应获得5′端带有Xba I和Xho I酶切位点，3′带有HindⅢ和Kpn I酶切位点的PCR产物，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和回收，获得含有SceIF4E1基因片段和SceIF4E1基因片段的RNAi干扰靶序列；所述上游引物Sc4E1-F的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；下游引物Sc4E1-R的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；上游引物Sc4E2-F的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；下游引物Sc4E2-R的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；RNAi干扰靶序列的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；
[0032] 4.RNAi干扰载体构建：
[0033] a.正向片段S1的获得：用Kpn I和Xho I对RNAi干扰靶序列进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和回收，获得正向片段S1；S1的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；
[0034] b.中间载体pS1的获得：用Kpn I和Xho I对pHANNIBAL载体进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和回收，用T4DNA连接酶将回收产物与正向片段S1连接，即将正向片段S1克隆到pHANNIBAL载体上，得到重组质粒pS1；
[0035] c.反向互补片段S2的获得：用Xba I和HindⅢ对RNAi干扰靶序列进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和回收，获得反向互补片段S2；S2的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列；
[0036] d.中间载体pS1S2的获得：用Xba I和HindⅢ对中间载体pS1进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和回收，用T4DNA连接酶将回收产物与反向互补片段S2连接，即将反向互补片段S2克隆到重组质粒pS1上，得到以pHANNIBAL载体上的内含子intron作为间隔区、具有发卡结构反向重复序列的中间载体pS1S2；
[0037] e.发夹结构片段的获得：用Not I对中间载体pS1S2进行单酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和回收，获得发夹结构片段；所述发夹结构是由一对反向重复序列折叠配对形成的特定空间结构。发夹结构片段的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列；
[0038] f.RNAi干扰载体pG0229-4E1+2的获得：用Not I单酶切pGreenII0229载体，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和回收，用T4DNA连接酶将回收产物与发夹结构片段连接，并将连接产物转化至受态大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α中，挑取阳性克隆验证，得到可用于甘蔗遗传转化的RNAi干扰载体pG0229-SceIF4E1+2；
[0039] 4.遗传转化、抗花叶病转基因甘蔗材料的培育及抗病性鉴定：提取构建完成的RNAi干扰载体pG0229-4E1+2质粒DNA，用核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度，并将其定量至1μg/μL，基因枪轰击法遗传转化甘蔗，分子检测获得阳性转基因植株，并进行抗病转基因甘蔗的抗病性鉴定。
[0040] 所述pHANNIBAL载体、pGreenII0229载体、大肠杆菌DH5α，内切酶均由商业购买获得。
[0041] 对利用本发明的RNAi载体转化甘蔗获得抗花叶病甘蔗材料，通过人工接种，分别接种了SCMV的A，D，E株系病毒，属于SrMV的H，M株系病毒，属于SCSMV的JP1，JP2，FJ株系病毒，对照侵染率分别达到了88.0％、84.0％、80.0％、88.0％、92.0％、88.0％、92.0％、和92.0％，而43株转基因甘蔗均未发病，但是其中有6株转基因甘蔗的接种叶的上位叶检测出了CP基因扩增产物。说明沉默了与SCMV-，SrMV-，SCSMV-VPg互作的甘蔗SceIF4E1基因和SceIF4E1基因，阻断了病毒基因组的翻译，使转基因甘蔗获得了对SCMV，SrMV和SCSMV的广谱抗性。采用本发明的方法筛选、鉴定获得的37株转基因甘蔗植株，都具有抗性广谱、抗病性好、抗性持久及生物安全性高的特点。
[0042] 本发明的优点和有益效果：
[0043] 1.本发明获得的植物表达载体采用了RNAi技术，使得甘蔗抗病毒育种避开了病毒株系复杂的问题，使转基因甘蔗的培育摆脱了对抗源基因的依赖。
[0044] 2.本发明选择与SCMV-，SrMV-，SCSMV-VPg互作的甘蔗因子基因作为RNAi干扰靶序列获得的转基因植株，具有抗性广谱、抗病性好、抗性持久及生物安全性高等特点。
[0045] 3.本发明获得的RNAi干扰载体用于转基因甘蔗，对其他农艺性状优良但不抗花叶病的甘蔗品种进行遗传改良，可以有效地缩短甘蔗抗花叶病育种周期。
[0047] 图1为pG0229-4E1+2质粒图谱。
具体实施方式
[0049] 实施例一：甘蔗翻译起始因子基因SceIF4E1、SceIF4E2、SceIF4E3基因的克隆及其与SCSMV-，SCMV-，SrMV-VPg互作关系的验证：
[0050] 利用同源克隆技术克隆甘蔗的SceIF4E1，SceIF4E2和SceIF4E3基因。以易感SCSMV的热带种甘蔗Badila的叶片为实验材料，利用Trizol方法提取RNA，反转录成cDNA。比较高粱、玉米的eIF4E1，eIF4E2，eIF4E3基因的开放读码框(open reading frame,ORF)序列，设计3对特异PCR引物，以cDNA为模板，经PCR扩增和RACE，获得甘蔗SceIF4E1，SceIF4E2和SceIF4E3基因的ORF。SceIF4E1基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，全长663bp，其编码氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，编码220个氨基酸；SceIF4E2基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，全长630bp；其编码氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，编码209个氨基酸；
SceIF4E3基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，全长690bp；其编码氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，编码229个氨基酸。
SceIF4E3基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，全长690bp；其编码氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，编码229个氨基酸。
[0051] 利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术，明确了SceIF4E1、SceIF4E2、SceIF4E3与SCSMV-、SCMV-、SrMV-VPg的互作关系，结果如表1所示，表明SrMV-VPg和SCMV-VPg均与SceIF4E1、SceIF4E2互作，但是SCSMV-VPg仅与SceIF4E1互作，证明SceIF4E1是参与SCSMV翻译的寄主因子，即SCSMV选择性利用SceIF4E1完成基因组的翻译。所述VPg为病毒基因组末端结合蛋白。
[0052] 表1.酵母双杂交和双分子荧光互补验证SCSMV-，SCMV-，SrMV-VPg与SceIF4E1，SceIF4E2，SceIF4E3的互作关系
[0053]
[0054] 实施例二：构建抗甘蔗花叶病的RNAi干扰载体
[0055] 构建抗甘蔗花叶病的RNAi干扰载体的方法，包括以下步骤：
[0056] 1、RNAi干扰靶序列的获得：利用GenBank中的RNAi载体设计库对SceIF4E1基因的中间靶位区段进行筛选，选择了SceIF4E1基因的第220至436位碱基片段作为RNAi的靶位区段，对SceIF4E2基因的中间靶位区段进行筛选，选择了SceIF4E2基因的第200至439位碱基片段作为RNAi的靶位区段。针对SceIF4E1基因的RNAi的靶位区段设计一对特异性引物Sc4E1-F(上游引物)和Sc4E1-R(下游引物)，并在Sc4E1-F引入引入Xba I和Xho I酶切位点，针对SceIF4E2基因的RNAi的靶位区段设计一对特异性引物Sc4E2-F(上游引物)和Sc4E2-R(下游引物)，并在Sc4E2-R引入HindⅢ和Kpn I酶切位点，Sc4E1-R与Sc4E2-F长度均为40bp，且有20bp相同。Sc4E1-F的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，Sc4E1-R的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，Sc4E2-F的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，Sc4E2-R的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
[0057] 使用Sc4E1-F和Sc4E1-R，对SceIF4E1基因进行扩增，PCR反应体系为25μL：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPs 2.0μL，上游引物Sc4E1-F(10μmol/L)1.0μL，下游引物Sc4E1-R(10μmol/L)1.0μL，Taq酶(5U/μL)0.125μL，ddH2O 17.375μL，模板(cDNA)1.0μL，总体积25μL。PCR反应程序：94℃预变性4min；然后运行35个循环，94℃30s，60℃30s，72℃1min；最后72℃10min。将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和回收，浓缩至400ng/μL。
[0058] 使用Sc4E2-F和Sc4E2-R，对SceIF4E2基因进行扩增，PCR反应体系为25μL：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPs 2.0μL，上游引物Sc4E1-F(10μmol/L)1.0μL，下游引物Sc4E1-R(10μmol/L)1.0μL，Taq酶(5U/μL)0.125μL，ddH2O 17.375μL，模板(cDNA)1.0μL，总体积25μL。PCR反应程序：94℃预变性4min；然后运行35个循环，94℃30s，60℃30s，72℃1min；最后72℃10min。将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和回收，浓缩至400ng/μL。
[0059] 利用融合PCR获得RNAi干扰靶序列：将SceIF4E1基因和SceIF4E2基因的PCR产物等量混合，作为模板，使用带有Xba I和Xho I酶切位点的引物Sc4E1-F和带有HindⅢ和Kpn I酶切位点的引物Sc4E2-R进行PCR扩增，PCR反应体系为25μL：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTPs 2.0μL，上游引物Sc4E1-F(10μmol/L)1.0μL，下游引物Sc4E1-R(10μmol/L)1.0μL，Taq酶(5U/μL)0.125μL，ddH2O12.375μL，模板(cDNA)6.0μL，总体积25μL。PCR反应程序：94℃预变性
4min；然后运行35个循环，94℃30s，60℃30s，72℃1min；最后72℃10min。将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和回收，获得RNAi干扰靶序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；
4min；然后运行35个循环，94℃30s，60℃30s，72℃1min；最后72℃10min。将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和回收，获得RNAi干扰靶序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；
[0060] 2、RNAi干扰载体的构建：用Xho I和Kpn I双酶切RNAi干扰靶序列，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，获得正向片段S1，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；同时用Xho I和Kpn I双酶切pHANNIBAL载体，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，用T4-DNA连接酶将酶切产物与正向片段S1连接，即将正向片段克隆到pHANNIBAL载体上，得到重组质粒pS1。将pS1转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取含有阳性克隆的菌落，测序验证。用Xba I和HindⅢ对RNAi干扰靶序列进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，获得反向互补片段S2，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列；用XbaI和HindⅢ双酶切载体pS1，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，用T4-DNA连接酶将酶切产物与反向互补片段S2连接，即将反向互补片段S2克隆到重组质粒pS1上，得到以pHANNIBAL载体内含子(intron)作为间隔区、具有发卡结构反向重复序列的中间载体pS1S2。将中间载体pS1S2转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取含有阳性克隆的菌落，测序验证。用Not I单酶切中间载体pS1S2，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收发夹结构片段；同时用Not I单酶切pGreenII0229载体，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，用T4-DNA连接酶将回收产物与发夹结构片段连接，并将连接产物转化至受态大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆验证，获得RNAi干扰载体pG0229-4E1+2。所述琼脂糖凝胶电泳，参照《分子克隆实验指南》(第二版)第六章第一节中琼脂糖凝胶电泳的方法；所述将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，转化方法参照《分子克隆实验指南》(第二版)第一章第五节中用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌的方法；所述含有阳性克隆的菌落的挑取，参照《分子克隆实验指南》(第二版)第一章第六节中含重组质粒的细菌菌落的鉴定方法；所述提取质粒DNA的方法，参照质粒提取试剂盒说明书；所述酶切方法，参照限制性内切酶的说明书；所述回收方法，参照胶回收试剂盒说明书；所述用T4-DNA连接酶进行连接方法，参照T4-DNA连接酶操作说明书；构建完成的pG0229-4E1+2质粒图谱如图1所示。
[0061] 实施例三：一种对花叶病具有广谱抗性的转基因甘蔗材料培育
[0062] 一种对花叶病具有广谱抗性的转基因甘蔗培育，包括以下步骤：
[0063] 1、材料准备：提取构建完成的RNAi干扰载体pG0229-4E1+2质粒DNA，用核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度，并将其定量至1μg/μL；受体甘蔗品种为ROC22；
[0064] 2、基因枪轰击法遗传转化甘蔗：
[0065] 受体材料的预处理：在甘蔗植株顶端部分，取白色心叶的肥厚带中生长点以上10cm内的幼嫩心叶，用体积浓度为75％的乙醇消毒后，并将其切成厚度不大于3mm的圆片，接种至MS+3.0mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉pH 5.8的诱导培养上诱导培养7d，在基因枪轰击前4h转至MS+2mg/L 2,4-D+0.2mol/L山梨醇+0.2mol/L甘露醇+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉pH 5.8的渗透培养基中，进行预处理；
[0066] 基因枪轰击转化：按照Bio-Rad公司的PDS-1000/He型基因枪操作说明书制备微弹，调整轰击距离6cm、气压1,100psi，轰击预处理的材料，将轰击后的材料分散开，继续在渗透培养基上处理20h；
[0067] 转化后材料培养和再生植株的获得：将基因枪轰击转化后的材料转至MS+2.0mg/L 2.4-D+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉pH 5.8的恢复培养基，恢复培养6d；然后将恢复培养后的材料移至MS+2.0mg/L 2.4-D+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂粉+4mg/L PPT pH 5.8的继代筛选培养基中，在28℃黑暗条件下筛选培养2-3代，15d/代；然后将材料转至MS+1.0mg/L 6-BA+
0.5mg/L KT+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂粉+4mg/L PPT pH 5.8的分化筛选培养基中，在28℃下，每天给予12～14h 2,000Lx的光照，筛选培养2-3代，15d/代，直至长出幼苗；待幼苗长高至3-4cm时，将其转至1/2MS+0.2mg/L 6-BA+3mg/L NAA+60g/L蔗糖+6g/L琼脂粉pH 5.8的生根培养基中，在28℃下，每天给予12～14h 2000Lx的光照，直至幼苗生根；
0.5mg/L KT+30.0g/L蔗糖+6.0g/L琼脂粉+4mg/L PPT pH 5.8的分化筛选培养基中，在28℃下，每天给予12～14h 2,000Lx的光照，筛选培养2-3代，15d/代，直至长出幼苗；待幼苗长高至3-4cm时，将其转至1/2MS+0.2mg/L 6-BA+3mg/L NAA+60g/L蔗糖+6g/L琼脂粉pH 5.8的生根培养基中，在28℃下，每天给予12～14h 2000Lx的光照，直至幼苗生根；
[0068] 3、分子检测：将生根后的幼苗移栽至小花盆中(草木灰∶沙子∶耕作土＝1∶1∶1)，待幼苗成活后，分别剪取叶片提取RNA，反转录成cDNA，利用定量PCR技术检测SceIF4E1基因和SceIF4E2基因的表达情况。共获得58株SceIF4E1基因和SceIF4E1基因同时沉默的转基因植株，其中43株转基因甘蔗植株在株高、叶姿、茎径等农艺性状方面与受体材料相比没有明显差异，将其编号为SFJT1，SFJT2，……，SFJT43；
[0069] 4、转基因甘蔗抗病性鉴定
[0070] 首先通过无性繁殖，扩繁转基因甘蔗。将生物学性状与受体材料相似的43株转基因甘蔗植株种植在温室内，每个盆钵种植1株转基因甘蔗，正常水肥管理，成熟期取甘蔗茎单芽种植于温室内，每个盆钵种植2个单芽茎。受体材料ROC22号以同样的方式种植于温室内。待植株进入快速生长期时，参照专利号为ZL200710009226.8的发明专利“利用SrMV-P1基因培育抗花叶病甘蔗品种的方法”中接种鉴定方法，对转基因甘蔗植株进行攻毒实验。每个转基因材料取8株，分别接种了属于SCMV的A，D，E株系，属于SrMV的H，M株系，属于SCSMV的JP1、JP2，FJ株系病毒共8个株系的花叶病病毒。对照为受体材料ROC22号，共200株，分成8组，每组25株，分别接种SCMV，SrMV，SCSMV病毒。同时，针对SCMV，SrMV和SCSMV的CP基因的保守区分别设计特异引物，采用PCR技术，对接种叶片的上位叶进行PCR检测，明确病毒是否建立系统性侵染。
[0071] 结果：以受体材料ROC22为对照，对43株转基因甘蔗人工接种属于SCMV的A，D，E株系病毒，属于SrMV的H，M株系病毒，属于SCSMV的JP1、JP2，FJ株系病毒，进行攻毒试验，结果表明这43株转基因甘蔗均未发病。接种SCMV-A的转基因甘蔗植株中，接种叶的上位叶均未检测出CP基因扩增产物；25株对照中，22株表现出典型的花叶病症状，在3株未发病植株的接种叶的上位叶上未检测出CP基因扩增产物，侵染率为88.0％。接种SCMV-D的转基因甘蔗植株中，SFJT11，SFJT23，SFJT34的接种叶的上位叶检测出CP基因扩增产物；25株对照中，21株表现出典型的花叶病症状，在4株未发病植株的接种叶的上位叶上未检测出CP基因扩增产物，侵染率为84.0％。接种SCMV-E的转基因甘蔗植株中，SFJT7，SFJT11的接种叶的上位叶检测出CP基因扩增产物；25株对照中，19株表现出典型的花叶病症状，在6株未发病植株的接种叶的上位叶上有1株检测出CP基因扩增产物，侵染率为80.0％。接种SrMV-H的转基因甘蔗植株中，接种叶的上位叶均未检测出SrMV的CP基因扩增产物；25株对照中，22株表现出典型的花叶病症状，3株未发病植株的接种叶的上位叶未检测出CP基因扩增产物，侵染率为88.0％。接种SrMV-M的转基因甘蔗植株中，SFJT7和SFJT11的接种叶的上位叶检测出CP基因扩增产物；25株对照中，23株表现出典型的花叶病症状，3株未发病植株的接种叶的上位叶未检测出CP基因扩增产物，侵染率为92.0％。接种SCSMV-JP1的转基因甘蔗植株中，SFJT7和SFJT11的接种叶的上位叶上检测出SCSMV的CP基因扩增产物；25株对照中，22株表现出典型的花叶病症状，在3株未显症植株的接种叶的上位叶未检测出CP基因扩增产物，侵染率为
88.0％。分别接种SCSMV-JP2和SCSMV-FJ的两组转基因甘蔗植株中，SFJT7和SFJT11的接种叶的上位叶上均检测了出SCSMV的CP基因扩增产物；两组对照中，均有21株表现出典型的花叶病症状，在未显症植株的接种叶的上位叶均有2株检测出CP基因扩增产物，侵染率均未为
92.0％。
88.0％。分别接种SCSMV-JP2和SCSMV-FJ的两组转基因甘蔗植株中，SFJT7和SFJT11的接种叶的上位叶上均检测了出SCSMV的CP基因扩增产物；两组对照中，均有21株表现出典型的花叶病症状，在未显症植株的接种叶的上位叶均有2株检测出CP基因扩增产物，侵染率均未为
92.0％。
[0072] 病毒接种实验结果详见表2。在58株转基因甘蔗中，有43株生长正常且对SCMV，SrMV，SCSMV表现出广谱抗性，剔除上位叶检测出CP基因的SFJT-7、SFJT-11、SFJT-23、SFJT-34、SFJT-41和SFJT-42，共获得37株对SCMV、SrMV、SCSMV不同株系病毒均免疫的转基因甘蔗材料，说明沉默SceIF4E1基因和SceIF4E2基因使转基因甘蔗获得了对SCMV，SrMV，SCSMV的广谱抗性。
[0073] 表2.转基因甘蔗病毒接种鉴定结果
[0074]
[0075] 抗甘蔗花叶病的植物表达载体是基于RNAi原理构建获得的，本发明的方法可以使抗病毒育种摆脱了对抗源基因的依赖，以与SCMV-，SrMV-，SCSMV-VPg互作的甘蔗内源基因作为RNAi干扰序列所获得的转基因植株，具有甘蔗花叶病的三种病原的广谱抗性。同时，因为沉默的是甘蔗内源基因，在转基因生物安全上，优于转入病毒序列的转基因甘蔗。
[0076] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
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