水稻温敏雄性不育基因TMS10的应用及育性恢复方法
阅读：636发布：2020-05-13
专利汇可以提供水稻温敏雄性不育基因TMS10的应用及育性恢复方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种 水 稻温敏雄性不育基因TMS10的应用及育性恢复方法。所述的TMS10的 氨 基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的应用是:采用常规方法，基因敲除、改变或抑制TMS10基因，使得常规水稻品种中的TMS10基因表达水平降低，进而获得水稻雄性不育株系。本发明制备的水稻雄性不育株系在水稻营养生长时期无异常表型出现，但在生殖生长时期的花药发育过程中出现异常，这一表型在籼稻和粳稻突变体中表现一致，平均生长 温度 28℃条件下不育，平均温度22℃生长条件下可育。这一温敏特性在两系杂交制种过程中可以在农业生产上有广泛应用。，下面是水稻温敏雄性不育基因TMS10的应用及育性恢复方法专利的具体信息内容。
1.一种水稻雄性不育基因TMS10的应用，其特征在于，所述雄性不育基因TMS10编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的应用具体是，采用常规方法，基因敲除、改变或抑制TMS10基因，使得常规水稻品种中的TMS10基因表达水平降低，进而获得水稻雄性不育株系；
所述基因敲除、改变或抑制TMS10基因的方法具体为：将雄性不育基因TMS10编码的SEQ ID NO.1所示氨基酸序列突变为SEQ ID NO.4所示氨基酸序列。
2.一种水稻雄性不育株系创制的方法，其特征在于，包括如下步骤：选择常规水稻品种，处理，培育，即得所述水稻雄性不育株系，所述处理为，采用常规方法，使得水稻中编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸的核苷酸序列突变为编码SEQ ID NO.4的序列，进而使得所述SEQ ID NO.1所示氨基酸序列对应多肽的表达水平降低或活性丧失。
3.如权利要求2所述的水稻雄性不育株系创制的方法，其特征在于，所述水稻品种为粳稻品种9522，或籼稻品种黄花占。
4.如权利要求2所述的水稻雄性不育株系创制的方法，其特征在于，所述编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.一种如权利要求2所述的水稻雄性不育株系创制的方法获得的水稻雄性不育株系在水稻制种中的用途，其特征在于，所述用途包括：将所述水稻雄性不育株系经处理后自交结实制种；或者将所述水稻雄性不育株系经处理后作为母本，配合具有杂种优势的父本，生产杂种F1代，进行杂交育种。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述水稻雄性不育株系经处理后自交结实制种中的处理具体为：在水稻雄性不育株系的幼穗发育期至花药减数分裂时期，保持平均温度为22～24℃，每天光照12-14.5小时；所述水稻雄性不育株系经处理后作为母本中的处理具体为：在水稻雄性不育株系的幼穗发育期至花药减数分裂时期，在平均生长温度大于
28℃条件下，每天光照12-14.5小时。
7.一种恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用常规遗传手段将TMS10基因，转入如权利要求2所述方法获得的水稻雄性不育株系中，进而使得突变体恢复野生型表型，所述TMS10基因编码的序列为SEQ ID NO.1。
8.一种恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(a)从水稻日本晴BAC克隆中用碱基序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的引物扩增出TMS10基因的如SEQ ID NO.11所示序列片段；
(b)提供携带表达TMS10互补构建载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105；
(c)将含TMS10互补构建载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中TMS10互补构建载体含有序列如SEQ ID NO.11所示的核苷酸。
水稻温敏雄性不育基因TMS10的应用及育性恢复方法
技术领域
[0001] 本发明属于水稻育种技术领域，具体涉及一种水稻温敏雄性不育基因TMS10的应用及及育性恢复方法。
背景技术
[0002] 水稻是世界上主要的粮食作物之一，养活了世界上以大米为主食的人口。因此提高水稻产量和品质成为国计民生问题。从第一次绿色革命以来伴随着矮秆品种的应用，三系杂交制种和两系杂交制种也依次成为增产的重要因素。目前生产上常用的杂交水稻育种的方法有三系法杂交水稻和两系法杂交水稻。三系包括不育系、保持系和恢复系。三系制种确实已经提供了大量优秀的品种，但是在实际操作上各系的繁殖保存都需要耗费大量的人力财力。因此两系法杂交育种的出现可以节约相当一部分资源。两系包括不育系和恢复系；相比于三系，两系中的不育系在一定的环境条件下可以转换育性，因此不需要保持系来配套生产不育系的种子。目前常用的两系杂交制种中的不育系依育性转换条件的不同分为光敏不育系，温敏不育系和光温敏不育系。目前生产上常用的光温敏不育系有农垦58S、培矮
64S、安农810S、株1S等一大批实用光/温敏不育材料。但是目前已经报道的控制光温敏雄性不育基因的数目还屈指可数，因此发现和研究新的光温敏不育材料为育种工作提供了更多的线索和增产的可能。
64S、安农810S、株1S等一大批实用光/温敏不育材料。但是目前已经报道的控制光温敏雄性不育基因的数目还屈指可数，因此发现和研究新的光温敏不育材料为育种工作提供了更多的线索和增产的可能。
发明内容
[0003] 本发明针对现有技术上两系生产中报道的不育系种质资源较少的不足，提供一种温敏雄性不育基因TMS10的应用及恢复水稻雄性不育的方法，利用TMS10基因及其蛋白参与调控水稻雄性生殖的特点，及其利用转基因技术控制水稻雄性生殖发育，通过突变该蛋白序列或抑制该蛋白的表达产生新的水稻雄性不育株系，在农业生产上具有十分重要的应用。
[0004] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0005] 第一方面，本发明提供一种水稻雄性不育基因TMS10的应用，所述雄性不育基因 TMS10编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的应用具体是，采用常规方法，敲除、改变或抑制TMS10基因，使得常规水稻品种中的TMS10基因表达水平降低，进而获得水稻雄性不育株系。
[0006] 第二方面，本发明提供一种水稻雄性不育株系创制的方法，包括如下步骤：选择常规水稻品种，处理，培育，即得所述水稻雄性不育株系，所述处理为，采用常规方法，使得水稻中编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸的核苷酸序列发生缺失，变异或抑制，进而使得所述氨基酸序列对应多肽的表达水平降低或活性丧失。
[0007] 优选地，所述水稻品种为粳稻品种9522，或籼稻品种黄花占。
[0008] 优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009] 本发明采用常规方法，使常规水稻品种中如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列突变为SEQ ID NO.3，进而获得水稻雄性不育株系，即tms10突变体。
[0010] 本发明采用常规方法，使常规水稻品种中如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列突变为SEQ ID NO.4，进而获得水稻雄性不育株系，即tms10突变体。
[0011] 优选地，包括如下步骤：采用RNAi干扰技术，抑制或者降低编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO.2的表达，降低所述氨基酸序列对应多肽的表达水平。
[0012] 优选地，所述RNAi干扰技术中RNAi表达载体的构建方法包括如下步骤：
[0013] 从水稻全长cDNA中用两对引物分别扩增出TMS10基因编码区序列的第1762位至3’UTR第355位共418bp的特异性片段；
[0014] 将这两个片段分别通过BamHI/XbaI,HindIII/EcoRI正反向插入连入加入含有水稻Intron序列的pBluescript SK载体；
[0015] 测序验证正确，再用XbaI和HindIII酶切切下含有tms10正反向特异性片段和Intron的片段，连入经同样酶切的PHB载体中；
[0016] 再次测序检验核苷酸序列是否正确，成功构建PHB-TMS10-RNAi质粒；
[0017] 所述两对引物的碱基序列如SEQ ID No.12和SEQ ID No.13、SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示。
[0018] 第三方面，本发明提供一种水稻雄性不育基因TMS10在粳稻和籼稻中保守性的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：通过杂交和回交，筛选出籼稻中具有tms10突变位点的不育株系。核苷酸序列突变为SEQ ID NO.3，导致氨基酸序列突变为SEQ ID NO.4的突变位点转入籼稻后，在籼稻替换系中得到同样温敏不育的突变株。
[0019] 第四方面，本发明提供一种水稻雄性不育株系创制的方法获得的水稻雄性不育株系在水稻制种中的用途，所述用途包括：将所述水稻雄性不育株系经处理后自交结实制种；或者将所述水稻雄性不育株系经处理后作为母本，配合具有杂种优势的父本，生产杂种F1代，进行杂交育种。
[0020] 优选地，将所述水稻雄性不育株系经处理后自交结实制种中，所述处理具体为：在水稻雄性不育株系的幼穗发育期至花药减数分裂时期，保持平均温度为22～24℃，每天光照12-14.5小时；将所述水稻雄性不育株系经处理后作为母本中，所述处理具体为：在水稻雄性不育株系的幼穗发育期至花药减数分裂时期，在平均生长温度大于28℃条件下，每天光照12-14.5小时。
[0021] 第五方面，本发明提供一种恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，包括如下步骤：采用常规遗传手段将所述TMS10基因，转入获得的水稻雄性不育株系中，进而使得突变体恢复野生型表型。
[0022] 优选地，所述方法具体包括如下步骤：
[0023] (a)从水稻日本晴BAC克隆中用碱基序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的引物扩增出TMS10基因的如SEQ ID NO.11所示序列片段；
[0024] (b)提供携带表达TMS10互补构建载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105；
[0025] (c)将含TMS10互补构建的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中TMS10互补构建含有序列如SEQ ID NO.11所示的核苷酸。
[0026] 优选地，所述步骤(c)具体为：
[0028] 选择转入所述核苷酸的水稻细胞或组织，进行再生，获得水稻植株。
[0029] 本发明通过基因工程的方法使得TMS10编码的一个亮氨酸富集重复序列受体激酶(LRR-RLK)失活，突变体花药在高温条件下败育；基因表达模式分析表明该基因在花药发育早期表达。
[0030] 本发明中所述基因纯合突变体在水稻营养生长时期无异常表型出现，但在生殖生长时期的花药发育过程中出现异常，这一表型在籼稻和粳稻突变体中表现一致，平均生长 温度28℃条件下不育，平均温度22℃生长条件下可育。
[0031] 本发明具有如下的有益效果：本发明通过控制水稻TMS10基因及其编码蛋白获得水稻雄性生殖发育的变异株，实现控制水稻生殖过程；本发明获得的水稻突变体在营养期与来源亲本无明显差异，进入生殖生长阶段后雄性生殖发育异常，花粉败育，得到完全不育的植株，在杂交水稻构建和农业生产上具有十分重要的应用。附图说明
[0032] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
[0033] 图1为温敏雄性不育tms10突变体的温敏不育表型，RNAi及基因组互补表型示意图；其中：图1A为28℃生长条件下粳稻9522去内外稃花表型图；图1B为22℃生长条件下粳稻9522去内外稃花表型图；图1C为28℃生长条件下tms10不育株去内外稃花表型图；图1D为28℃生长条件下tms10可育株去内外稃花表型图；图1E为TMS10-RNAi表达载体转化粳稻9522植株去内外稃花表型图；图1F为TMS10基因组DNA表达载体转化tms10不育株去内外稃花表型图；图1G为28℃生长条件下粳稻9522花粉粒I2-KI染色图；图1H为28℃生长条件下粳稻
9522花粉粒I2-KI染色图；图1I为28℃生长条件下tms10花粉粒I2-KI染色图；图1J为22℃生长条件下tms10花粉粒I2-KI染色图；图1K为TMS10-RNAi表达载体转化粳稻9522植株花粉粒I2-KI染色图；图1L为TMS10基因组DNA表达载体转化tms10不育株花粉粒I2-KI染色图；图1A到图1F的图标等于1毫米；图1G到图1L的图标等于200微米；
9522花粉粒I2-KI染色图；图1I为28℃生长条件下tms10花粉粒I2-KI染色图；图1J为22℃生长条件下tms10花粉粒I2-KI染色图；图1K为TMS10-RNAi表达载体转化粳稻9522植株花粉粒I2-KI染色图；图1L为TMS10基因组DNA表达载体转化tms10不育株花粉粒I2-KI染色图；图1A到图1F的图标等于1毫米；图1G到图1L的图标等于200微米；
[0034] 图2为tms10在籼稻中发明效果示意图；其中图2A为28℃平均生长条件下籼稻黄花占野生型去内外稃花表型图；图2B为28℃平均生长条件下tms10在籼稻黄花占背景下去内外稃花表型图；图2C为22℃平均生长条件下tms10在籼稻黄花占背景下去内外稃花表型图；图2D为28℃生长条件下籼稻黄花占野生型花粉粒I2-KI染色图；图2E为28℃生长条件下tms10在籼稻黄花占背景下花粉粒I2-KI染色图；图2F为22℃生长条件下tms10在籼稻黄花占背景下花粉粒I2-KI染色图；图2A到图2C的图标等于2毫米；图2D到图2F的图标等于200微米；
[0035] 图3为粳稻9522和tms10表型示意图；其中，图3A粳稻9522和tms10背景下 抽穗期整株表型示意图；图3B粳稻9522开花期小穗表型示意图；图3C粳稻tms10开花期小穗表型示意图；图3D粳稻9522开花期小花表型示意图；图3E粳稻tms10开花期小花表型示意图；图3F粳稻9522开花期小花去除一半内外稃表型示意图；图3G粳稻tms10开花期小花去除一半内外稃表型示意图；图3H粳稻9522开花期花药表型示意图；图3I粳稻tms10开花期花药表型示意图；图3J粳稻9522开花期花药I2-KI示意图；图3K粳稻tms10开花期花药I2-KI示意图；图3A的图标等于15厘米；图3B和图3C的图标等于1厘米；图3D到图3G的图标等于2毫米；图3H和图3I的图标等于1毫米；图3J和图3K的图标等于100微米；
[0036] 图4为TMS10基因定位、结构和突变位点示意图；其中，图4A为TMS10基因定位示意图，竖线上标记的数字为所用的引物的名称，重组子和群体的数目；以“AP”开头的数字为BAC克隆名称；Chr.2表示基因位于2号染色体上；BAC克隆下面的数字BAC上的碱基数目；图4B为TMS10基因结构示意图，灰色框表示UTR区域；黑色框表示外显子；黑色细线表示内含子区域；图4C为野生型WT和tms10突变体中突变位点详细情况示意图；
[0037] 图5为TMS10基因的表达情况示意图；其中，横坐标所述的S5-6、S7-8a、S8b、S9、S10、S11、S12、S13表示水稻雄性生殖发育的各个时期野生型花药材料；
[0038] 图6为TMS10基因组DNA融合GUS报告基因的载体转化tms10突变体，转基因阳性植株中能互补表型的株系的小花的GUS染色结果图。
具体实施方式
[0039] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0040] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所述TMS10基因为编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。
[0041] 实施例1、水稻雄性不育株系创制的方法
[0042] 1.1 通过基因工程或其他手段创制tms10水稻雄性不育株系
[0043] 本实施例中TMS10基因的编码区序列如SEQ ID NO.2所示。本实施例的粳稻品种tms10突变材料是由常规粳稻品种武育粳7号(又名9522)经过对TMS10基因的序列变异获得，籼稻材料黄花占品种中tms10突变体是由粳稻品种中温敏不育突变体经过反复与籼稻黄花占杂交回交分离得到的。
[0044] 1.2 水稻育性控制蛋白基因的克隆
[0045] 利用发明人构建的包含育性控制蛋白基因TMS10及其突变基因tms10组成的、本领域内技术人员清楚的水稻基因定位克隆(map-based cloning或position cloning)群体，按分子标记定位于3个BAC之间,分别是AP005694,AP005533,AP004001约240kb。在此基础上，通过RGAP(Rice Genome Annotation Project)网站对该区域内基因的注释分析，经测序确定其中一个水稻雄性生殖发育控制蛋白TMS10基因发生突变(图4A)，具体突变类型为在第七个外显子上缺失7个碱基导致翻译提前终止(图4B,4C)。
[0046] 经全核苷酸序列分析结果表明：水稻雄性育性TMS10基因全长为6439bp(SEQ ID NO.16，包含调控区和内含子)。经软件分析和cDNA克隆，其ORF如SEQ ID NO.2所示，编码全长为607个氨基酸的水稻雄性生殖发育控制蛋白，其序列如SEQ ID NO.1所示。
[0047] 1.3 水稻育性控制蛋白基因的点突变
[0048] 本实施例的tms10突变材料由常规粳稻品种武育粳7号(又名9522)经过突变而得，具体而言，是将野生型9522中的TMS10序列进行突变，将变体tms10中该基因在第七个外显子上有七个碱基的缺失(其序列如SEQ ID NO.3所示)(图4B)，导致蛋白的移码和提前终止(其序列如SEQ ID NO.4所示)(图4C)，会使得水稻雄性生殖器官花药不能正常发育，造成植株不育。本实施例的突变可以采用本领域的常规方法实施。
[0049] 本领域人员知晓，还可以采用诸如射线照射诱变水稻常规品种进行突变，若使得tms10发生突变，进而导致其编码蛋白的的移码和提前终止，同样会使得水稻雄性生殖器官花药不能正常发育(图1,图3F-3I)，造成植株不育(图1，图2)。
[0050] 1.4 通过RNAi手段敲除水稻品种中的TMS10
[0051] 为了对TMS10蛋白进行应用，构建了TMS10基因RNAi的载体，并转化野生型9522植株，以期降低TMS10的表达，从而达到改变水稻育性的目的。
[0052] 从水稻全长cDNA中用两对引物
[0053] YW2F:5’ATTGGATCCTTCGACTGGGGAGAGGACTCT 3’(SEQ ID NO.12)和[0054] YW2R:5’AAATCTAGAGGTGATTTGCTACAATAATCAC 3’(SEQ ID NO.13)[0055] RNAi-L-F：5’GAATTCTTCGACTGGGGAGAGGACTCT 3’(SEQ ID NO.14)和[0056] RNAi-L-R：5’AAGCTTGGTGATTTGCTACAATAATCAC 3’(SEQ ID NO.15)[0057] 分别扩增出tms10基因编码区序列的第1762位至3’UTR第355位共418bp的特异性片段；将这两个片段分别通过BamHI/XbaI,HindIII/EcoRI正反向插入连入加入含有水稻Intron序列的pBluescript SK载体；测序验证正确，再用XbaI和HindIII酶切切下含有TMS10正反向特异性片段和Intron的片段，连入经同样酶切的PHB载体中。再次测序检验核苷酸序列是否正确，成功构建PHB-TMS10-RNAi质粒。
[0058] 将含有PHB-TMS10-RNAi构建的农杆菌在含有Kan(50μg/μl)的YEB平板上划线，获的单菌落。挑单菌落接种到3ml含(Kan和rif)抗生素的YEB液体培养基中于28℃振荡培养过夜，第2天按1％接种量转接入50ml含抗生素的YEB液体培养基中，200rpm继续振荡培养至OD600为0.3至0.6左右时，将新鲜的农杆菌菌液于5000rpm、离心5分钟，收集并重悬于1/3体积的AAM-AS液体培养基中，此时即可用于转化水稻各种受体材料。
[0059] 本实施例采用常规的农杆菌转化方法转化水稻9522的幼穗愈伤。取幼穗分化形成后穗长约3-5cm的小穗进行诱导，N6D2培养基上诱导愈伤组织，在26±1℃、避光条件下培育，15天后继代，培养8天后可用于转化。将愈伤浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液中并不时摇动，20分钟后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到N6D2C培养基上，于26℃共培养3天。共培养时，在共培养培养基中加入乙酰丁香酮，使用浓度为100μM/L。3天后，从共培养培养基上取出愈伤组织，切去胚芽并转入含有50mg/L Hyg和特美汀的选择培养基上进行选择培养。12天后将抗性愈伤组织转到含有50mg/L Hyg和特美汀的选择培养基上继续筛选。12天后生长旺盛的抗性愈伤组织转移到分化培养基上培养两周左右(24小时光照)，代绿芽点长出后更换新的分化培养基继续分化培养至有芽长出。再生的小苗在1/2M培养基上生根壮苗，随后移入人工气候室营养液栽培。
[0060] 阳性植株提取叶片总DNA，用鉴定引物进一步鉴定转化植株，用定量PCR的方法进行分析转基因阳性植株中TMS10基因的表达量，挑选表达下调的株系进行种植。
[0061] 从表型上来看，TMS10-RNAi突变体在成熟时期，花药偏小(图1E),进行碘染发现，不能形成正常的花粉粒(图1K)，而野生型的花粉碘染正常(图1G,1H)，这说明TMS10基因敲除后使花粉的发育受到影响，能够得到获得新的水稻雄性不育系。
[0062] 1.5 TMS10蛋白活性丧失导致水稻雄性发育异常，出现温敏的表型[0063] 对tms10突变体植株的形态学观察。如图3所示，tms10突变体株高并不受影响(图3A)，能正常开花(图3B-E)。如图1所示高温条件下，野生型和突变型tms10的表型对比显示野生型9522花药发育正常(图1A)，而tms10突变型花药变白变小(图1C)；野生型9522碘染正常(图1G,3J)，突变型tms10花药碘染，几乎没有花粉粒(图1I，3K)。而在低温条件下，野生型和突变型tms10花药几乎没有差异(图1B,1D),碘染都能形成正常的花粉粒(图1H,1J)[0064] 1.6 TMS10表达特征
[0065] 利用tms10突变株的来源亲本9522各个器官组织，提取RNA，进行反转录得到cDNA第一链，利用荧光定量PCR的方法确定TMS10基因的表达模式(如图5)，发现TMS10基因在水稻雄性生殖发育时期stage9之前有着显著的表达；除此之外，营养发育过程中的根、茎和叶中也有表达。通过构建启动子TMS10融合GUS的载体的构建并转化tms10愈伤组织，得到的转基因阳性苗GUS染色结果表明TMS10蛋白在花药发育早期的花药中特异表达(图6)。
[0066] 实施例2 tms10突变体育性转换条件及其在水稻制种中的用途
[0067] 2.1 tms10突变体育性转换条件
[0068] 通过多年的试验检测，在水稻生长时期的幼穗分化时期到花药减数分裂时期进行处理tms10的表型出现分化。观察表明野生型在12h-14.5h光照及22-28℃条件下都能形成正常花粉粒并正常结实。tms10突变体，从在光照12h-14.5h之间，低温22℃条件下育性得到完全恢复(图1D,1J)，能够正常结实。tms10突变体在光照12h-14.5h之间，温度23-26℃之间，能够形成少量成熟花粉粒，少量结实并且随着温度的升高，花粉碘染率及结实率都下降。tms10突变体在光照12h-14.5h之间，在平均温度28℃条件下没有花粉粒形成，自交不能结实，表现完全不育的表型(图1C,1I)。
[0069] 2.2 TMS10基因在创制其他水稻品系雄性不育株系中的应用
[0070] 将tms10突变体与籼稻黄花占进行杂交得到的F1代，F1代自交F2代中筛选具有籼稻特征的雄性不育系，进一步测序验证F2代中有tms10突变位点的存在。F2代与黄花占回交得到BC1F2,BC1F2再次自交得到BC1F3，从BC1F3再次筛选具有黄花占特征的雄性不育系并测序确保tms10突变位点的存在。BC1F3再次与黄花占回交得到BC2F3,BC2F3再次自交从其中挑选具有黄花占背景的雄性不育株系。经过持续的回交和自交得到籼稻中的替换系为温敏雄性不育表型(图2A-F)，在平均温度28℃条件下tms10相比于野生型黄花占表现出不育表型，花药偏小偏白(图2B)，碘染没有成熟花粉粒(图2E)；在平均温度22℃ 条件下tms10相比于野生型黄花占表现出类似的可育表型，花药正常发育饱满偏黄(图2C)，碘染富有成熟花粉粒(图2F)。进而证明TMS10基因在籼稻品种中发生核苷酸序列变化时，同样可以产生温敏雄性不育植株。
[0071] 2.3 tms10温敏不育的应用
[0072] 在低温条件下(平均温度22-24℃之间)可以利用tms10雄蕊的可育性生产不育系的种子；在高温条件下(平均温度在28℃)及以上tms10作为一个彻底的完全不育系。因此在高温条件下tms10不育系作为母本可以配合具有杂种优势的恢复系父本例如已经得到验证的JP69生产杂交种子,结实率能达到80％以上。低温条件下例如海南春季2月份或者上海10月份，tms10可以自交结实用以不育系的制种。此外，采用传统的杂交和回交的方法可以将tms10突变位点转入到生产常用的常规品种中，得到常规育种品种中的温敏不育系。因此在育种中tms10温敏雄性不育突变体可以作为生产上可用的两系制种的育种材料。
[0073] 实施例3 恢复tms10突变体雄性不育性状的方法
[0074] 将编码TMS10基因的基因组核苷酸序列转入突变体tms10植株，能够使突变体恢复到野生型表型。
[0075] 从水稻日本晴BAC克隆(OSJNba18M09)中用引物：
[0076] POS9-1F 5’AAGTCGACGACATTAAGTTTGGGCCGAGATATG 3’(SalI)(SEQ ID NO.5)[0077] POS9-1R 5’AAACACGTGGGACTAGTTGTATTTCCCAGACACAATTCC’3(PmacI)(SEQ ID NO.6)
[0078] POS9-2F 5’GGCTTCACTGCAGCATTAATGTTATG’3(PstI)(SEQ ID NO.7)[0079] POS9-2R 5’TTGTTTGTCAACAAATGGAAGATG’3(SpeI)(SEQ ID NO.8)[0080] POS9-3F 5’TTCTGCTAACACTAGTTCATCTTCCATTTGTTGACAAA’3(SpeI)(SEQ ID NO.9)[0081] POS9-3R 5’ACCTGTAATTCACACGTGTAAAACTAAAGTACTAAACACA’3(SpeI)(SEQ ID NO.10)
[0082] 将TMS10基因的9236bp(SEQ ID NO.11)的基因组序列片段分步插入到pCAMBIA1301载体中。
[0083] 将该片段分三个片段依次通过三次酶切插入，分别为：SalI和PmacI,PstI和SpeI,SpeI单酶切插入到用于转化水稻的双元载体pCAMBIA1301载体中；测序验证正确，该 载体通过电击导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，得到TMS10gDNA互补根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，使用遗传转化手段转化突变体tms10成熟胚愈伤，从而使编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；再生，获得水稻植株；以观察是否会使突变体恢复到野生型表型。
[0084] T0代获得互补植株(图1F),通过观察显示T0代互补植株可以产生黄色花药(图1F)，并被I2-KI染色(图1L)，即表现出的野生型表型。SEQ ID NO.11为互补tms10突变体全长核苷酸序列，SEQ ID NO.2为TMS10全长cDNA序列，SEQ ID NO.1为TMS10全长氨基酸序列。
[0085] 综上所述，本发明通过控制一个编码LRR受体激酶TMS10基因及其编码蛋白获得水稻温敏雄性生殖发育异常的变异株，实现控制水稻雄性生殖发育和育性。本发明获得的水稻突变体在营养生长时期与来源亲本无明显差异，进入生殖生长阶段后，雄性生殖器官发育异常、花粉败育引起植株不育。本发明所述基因突变后导致tms10突变体出现高温平均温度28℃雄性不育的表型；在低温平均温度22-24℃之间出现雄性部分可育的表型，部分结实；作为杂交育种的母本可以和优势品种配组生产杂交种子。将该突变位点导入籼稻品种中能产生相似的温敏雄性不育的表型。在农业生产上为两系杂交育种提供了宝贵的资源，具有十分重要的应用价值。
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