뉴라미니데이즈 억제활성을 가지는 들깨 추출물{Effective Perilla extract for inhibiting neuraminidase}

본 발명은 뉴라미니데이즈 억제 활성을 가지는 들깨과(科) 식물의 추출물 및이를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스는 급성 호흡기 질환을 일으키는 질환으로 전염성이 매우 강한 바이러스로 고열, 두통, 근육통, 기침 등의 전반적인 신체 증상을 유발한다. 이러한 인플루엔자 바이러스는 크게 A, B, C형 세 가지가 존재하지만 사람에게 병을 일으키는 것은 A형과 B형이다. 인플루엔자 A형은 바이러스 표면 단백질인 헤마글루티닌 (hemagglutinin: HA)과 뉴라미니데이즈 (neuraminidase: NA)의 종류에 따라 여러 가지 종류가 존재하며, HA의 변이 양상에 따라서 H1~H15형으로, NA 변이에 따라서 N1~N9형으로 분류되고 있다. 인플루엔자 바이러스 B형은 A형에 비하여 증상이 약하고, 인플루엔자 바이러스 C형에 의한 인체 감염은 드문 것으로 알려져 있다. 하지만 최근 조류에서 나타나는 HA항원과 NA항원은 보통 사람에게는 병을 일으키지 않지만, 바이러스 내에서 유전자 돌연변이가 일어나거나 사람에게 병을 일 으키는 종류의 항원과 유전자를 교환하면 사람에게도 쉽게 병을 일으키는 형태로 변할 수 있어 국제적 사회적 문제로 대두되고 있다. 특히 2009년 초 멕시코 및 미국 등에서 돼지인플루엔자가 인체 감염증 추정환자가 발생하면서 전 세계적으로 신종인플루엔자 감염 환자수가 급격히 증가하고 있는 추세이며, 2009년 7월 31일 기준 WHO 보고에 의하면 신종인플루엔자에 감염된 환자는 162,380명, 감염으로 인한 사망자는 1,154명에 달하는 것으로 보고하였다. 따라서 인플루엔자 바이러스 치료 및 예방 물질 개발에 전 세계적으로 많은 연구를 수행하고 있다. 이에 따라 신종플루 치료제로 사용되는 뉴라미니데이즈 억제제인 타미플루(Roche Holding사)의 2009년도 9월말까지 판매량이 128억불에 달한다.

현재 뉴라미니데이즈(neuraminidase inhibitors) 억제제는 인플루엔자 바이러스 치료제로 사용되는 약제로서, 뉴라미니데이즈는 인플루엔자 바이러스 표면 항원인 동시에 새로 생성된 바이러스를 세포 밖으로 방출하는데 중요한 역할을 한다. 따라서 인플루엔자 바이러스 치료제 개발을 위한 주요 타겟(target)인 뉴라미니데이즈의 억제를 위한 물질의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

본 발명에서는 상기 문제를 해결하기 위해 연구를 거듭한 결과 본 발명을 완성하였다. 따라서, 본 발명의 목적은 뉴라미니데이즈 억제활성을 가지는 들깨 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 예방 또는 치료용 조성물을 제공하 는 것이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 뉴라미니데이즈(neuraminidase) 억제 활성을 가지는 들깨과(科) 식물 추출물이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 들깨과(科) 식물은 들깨(Perilla frutescens var. frutescens), 차조기(Perilla frutescens var. crispa), 레몬들깨(Perilla citriodora), 범꼬리소엽(Perilla hirtella) 및 페릴라 세토엔시스(Perilla setoyensis)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 들깨과(科) 식물 추출물은 들깨과(科) 식물을 탄소수 1 내지 6의 저급 알코올 또는 이의 수용액으로 추출한 들깨과(科) 식물 조추출물일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 들깨과(科) 식물 조추출물이 들깨과(科) 식물의 에탄올 추출물일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 들깨과(科) 식물 추출물은 들깨과(科) 식물 조추출물을 극성이 다른 용매인 n-헥산, 에틸 아세테이트, 메탄올을 순차적으로 분획하여 얻은 용매 가용성 추출물일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 들깨과(科) 식물 추출물은 용매 가용성추출물로부터 분리해낸 폴리페놀계 화합물일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 분리방법은 실리카겔 칼럼크로마토그래 피일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 폴리페놀계 화합물은 하이드록시플라본, 3',4'5,7-테드라하이드록시플라본 및 2R-2[[(2E)-3-(3,4-디하이드록시페닐)-1-옥소-2-프로페닐]옥시]-3-(3,4-디하이드록시페닐)프로파노익 에시드로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 들깨과(科) 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 예방 또는 치료용 약학조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 들깨과(科) 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 예방 또는 치료용 식품 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 들깨과(科) 식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 예방 또는 치료용 가축 사료가 제공된다.

본 발명에 따르면, 들깨 추출물에 포함된 폴리페놀계 화합물들이 뉴라미니데이즈를 억제하여 인플루엔자를 예방, 치료할 수 있는 조성물, 건강식품, 가축 사료 첨가제 등을 제공할 수 있다.

들깨( Perilla frutescens var. frutescens )는 꿀풀과(Labiatae) 1년생 초본으로 아시아지역이 원산지이다. 이는 한국을 비롯한 인도 및 중국 동북부지역에 예 로부터 재배되어온 작물로, 지방성분이 44%, 오메가-3 지방산인 리놀렌산 함량이 63% 정도로 많이 함유되어있는 작물이다. 또한 들깨와 같은 과(科)로 근연관계에 있는 차조기( Perilla frutescens var. crispa )는 약용 또는 색소용 식물로서 오래전부터 재배하여 왔다. 차조기에 대하여 기록한 고농서와 명칭도 많으며, 색경에는 임료(荏蓼) 또는 소자(蘇子)로서 차조기를 설명하고 있고 해동농서, 행포지, 임원경제지에서는 자소(紫蘇)로 다루고 있다. 차조기의 잎은 진한 자주색을 비롯하여 녹색, 보라색 등 다양하며 향기 또한 들깨와 다르다. 이외 들깨속 식물로는 야생종 2배체로 Perilla citriodora , Perilla hirtella 및 Perilla setoyensis 가 있다.

우리나라 최초의 농서인 농사직설(農事直說, 1429)에서 들깨를 유마(油麻), 수임자(水荏子)로 기록하였으며, 종실(種實: 들깨의 씨열매) 및 잎을 주로 식용하여 왔으며, 동의보감에 따르면 들깨는 몸을 덥게 하고 맛이 매우며, 독이 없고 기(氣)를 내리게 하며, 기침과 갈증을 그치게 하고 간을 윤택하게 해 속을 보하고 정수 즉, 골수를 메워 준다고 알려져 있다. 또한 들깻잎은 속을 고르게 하고 취기를 없애 상기해수(上氣咳嗽)를 치료하고 벌레 물린데, 또는 종기치료에도 사용되어왔다. 또한 들깨의 오메가-3 지방산인 리놀렌산은 암세포 증식 억제 등 항암효과가 있는데, 특히 유방암과 대장암의 발생을 억제하는 효과가 있으며, 신경계의 필수지방산으로 시신경에도 영향을 주며 학습능력을 증진시킨다. 그리고 항산화작용과 항염증 활성 및 항암 활성을 가지는 이차대사산물인 로즈마린산(rosmarinic acid), 루테오린(luteolin), 아피게닌(apigenin), 크리소에리올(chrysoeriol), 카페익산 (caffeic acid) 및 안토시아닌(antocyanin) 등과 같은 화합물이 들깨에 함유되어 있다. 특히 경제성장과 더불어 국민의 식생활 소비형태가 다양화됨으로 인해 영양분 섭취와 함께 건강에 도움이 되는 식품을 선호하고 있다. 이러한 면에서 들깨는 다양한 생리활성물질을 유전적으로 지니고 있는 작물로 새로운 생리활성을 과학적으로 증명하여 농업적, 산업적으로 활용가치가 크다.

이하 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 인플루엔자 바이러스를 세포밖으로 방출하는데 관여하는 뉴라미니데이즈(neuraminidase)의 억제 활성을 가지는 들깨과(科) 식물 추출물을 제공한다.

바람직하게는 상기 들깨과 식물은 들깨( Perilla frutescens var . frutescens ), 차조기( Perilla frutescens var . crispa ), 레몬들깨( Perilla citriodora ), 범꼬리소엽( Perilla hirtella ) 및 페릴라 세토엔시스( Perilla setoyensis )로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 또한 이들 들깨 작물의 종자 및 뿌리, 줄기, 잎 등의 전체인 전초를 포함한 들깨 모두를 본 발명에서 사용할 수 있다.

본 발명인 들깨과(科) 식물 추출물은 폴리페놀계 화합물일 수 있다.

바람직하게는, 상기 폴리페놀계 화합물은 하이드록시플라본, 3',4',5,7-테드라하이드록시플라본 및 2R-2[[(2E)-3-(3,4-디하이드록시페닐)-1-옥소-2-프로페닐]옥시]-3-(3,4-디하이드록시페닐)프로파노익 에시드로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 폴리페몰계 화합물의 구조 및 화학식을 표 1에 나타내었다.

상기 폴리페놀계 화합물은 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있으며, 통상의 방법에 의해 제조되는 모든 염, 수화물, 및 용매화물, 시판되는 시약을 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 들깨 종실로부터 추출, 분리 및 정제하여 사용한다.

본 발명에 따른 폴리페놀계 화합물의 추출, 분리 및 정제방법은 당업계에 널리 알려진 방법 또는 하기와 같은 본 발명에 따라 추출된 것, 합성된 것 또는 시판중인 것을 선택하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 폴리페놀계 화합물은 들깨 종실(種實)에서 추출될 수 있다.

추출과정은 들깨과 식물의 종실 또는 전초를 분쇄하여 탄소수 1 내지 6의 저급 알코올 또는 이의 수용액으로 교반하여 추출하여 조추출액을 제조하고, 그 조추출액을 여과 후 상등액을 감압하고 농축시켜 분말을 제조하고, 그 분말을 유기용매 조건하에서 실리카겔 칼럼크로마토그래피하는 과정으로 이루어진다. 상등액은 침전 또는 침전물의 상부에 존재하는 투명한 액체로서 상청액이라고도 한다.

자세하게는, 들깨 종실을 깨끗이 세척하고 건조한 뒤 분쇄기로 분쇄하여 추출용기에 넣고 적당한 양의 유기용매인 탄소수 1 내지 6의 저급 알코올 또는 이의 수용액, 바람직하게는 80% 에탄올 수용액으로 상온에서 3~7일 동안 방치하여 추출한다. 추출과정은 수회 반복할 수 있으며, 이후 농축 또는 동결 건조 등의 방법을 추가적으로 거칠 수 있다. 들깨의 기름성분을 제거하기 위하여 n-헥산 또는 에테르를 사용하여 제거할 수도 있다. 상기 저급 알코올 또는 이의 수용액은 상기 들깨속 식물 종실 또는 전초 분쇄가루 무게의 10 ~ 20 배일 수 있고, 상기 교반은 20 ~ 30℃에서 이루어질 수 있다. 이와 같은 방법으로 추출된 추출물은 조추출물에 해당한다.

다음으로, 들깨 종실 80% 에탄올 추출물에 물을 가하여 현탁시키고, n-헥산, 에틸아세테이트를 사용하여 순차적으로 분획하여 가용 추출물을 얻는다. 추출 용매 조건에 따른 수율이 달라지는데 바람직하게는 80% 에탄올 용매를 사용할 수 있다.

이때, 통상의 분별 추출 방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 분별깔데기를 사용할 수 있다. 상기 추출물은 n-헥산 가용추출물, 에틸아세테이트 가용추출물, 메탄올 가용추출물을 얻을 수 있다. 다만, 들깨 종실의 기름을 추출하고 남은 들깨 박 시료를 사용할 경우 n-헥산 분획물 과정을 생략할 수 있다.

다음으로, 에틸아세테이트 가용 추출물을 역상 또는 순상의 실리카겔 크로마토그래피를 이용하여 화합물을 분리하고 정제하여 폴리페놀계 화합물 1과 2를 얻을 수 있다.

실리카겔 크로마토그래피는 일반적으로 시료양의 약 20~30배에 해당하는 실리카겔 (silica gel)을 컬럼(column)에 채우고 시료를 가하여 실리카겔에 시료를 흡착시킨 다음, 비극성용매와 극성용매의 농도를 변화시키며 흘려주는 방식으로 진행된다. 가장 자주 사용되는 용매계로는 클로로포름과 메탄올 혼합, n- 헥산과 아세트산에틸 혼합 등이 있으며, 기본적으로는 박층 크로마토그래피(TLC)로써 각 종의 전개용매를 검토하여 분리능이 양호한 전개용매를 결정한다. 클로로포름을 전개용매로 사용하는 경우 다른 용매에 비해 비중이 커서 유출속도가 빨라지는 경향이 있으므로 주의하여야 한다. 마지막에는 극성용매인 메탄올로서 실리카겔에 흡착되어 있는 물질을 완전히 용출한다. 효과적인 실리카겔 크로마토그래피를 수행하는 경우 실리카겔의 양, 전개 용매, 유속이 중요하다.

실리카겔은 반응성이 강하고 극성이 커서 여러 가지 극성 관능기를 가진 천연물이 쉽게 결합하는 단점이 있다. 이 경우 실리카겔의 극성표면을 화학적으로 처리하여 C18, C8, 알킬기, 방향족인 페닐기, 시안기 등의 관능기를 결합시켜 그것을 고정상으로 이용하는 역상 크로마토그래피를 이용한다. 실리카겔에 비극성의 관능기가 결합되면 입자의 표면은 비극성으로 바뀌게 되고, 이에 따라 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)에 의해서 물질은 고정상과 이동상 사이에서 분리된다. 이 경우 이동상으로는 실리카겔 크로마토그래피와 달리 메탄올, 물 등의 극성용매가 이용된다. 일반적으로 실리카겔 크로마토그래피와 같이 고정상이 이동상보다 극성이 큰 경우를 순상 크로마토그래피라고 하는데 반해 이동상이 고정상보다 극성이 큰 경우를 역상 크로마토그래피라고 한다. 역상 크로마토그래피에서는 시료 중 극성이 작은 성분일수록 극성이 큰 시료 성분보다 늦게 용출되며 물, 메탄올, 아세토니트릴, 테트라히드로퓨란(THF), 완충용액 등과 이들의 혼합 용액이 이동상으로 사용 된다.

상기 화합물 분리를 위한 실리카겔 크로마토그래피시 이동상으로는 바람직하게 n-헥산, n-헥산·에틸아세테이트 혼합용매 및 메탄올을 순차적으로 사용할 수 있고, 추가되는 크로마토그래피에서는 n-헥산·아세톤 혼합용매를 사용할 수 있다. 이때 사용되는 n-헥산· 에틸아세테이트 혼합용매의 부피비는 99:1 ~ 1:2 부피비가 바람직하며, n-헥산·아세톤 혼합용매 경우에는 70:1 ~ 1:2 부피비가 바람직하다. 상기 크로마토그래피는 단일 화합물이 정제될 때까지 1회 내지 수회에 걸쳐 수행할 수 있으며, 필요에 따라 농축, 재결정을 실시할 수 있다. 분리된 화합물은 분자량측정, NMR 측정 등의 통상적인 방법으로 분석할 수 있다.

상기와 같은 방법에 의하여, 화합물 4',5,7-트리하이드록시플라본 (4',5,7-trihydroxyflavone: apigenin), 3',4',5,7-테트라하이드록시플라본 (3',4',5,7-tetrahydroxyflavone; luteolin)을 얻을 수 있다.

또한 메탄올 가용추출물을 실리카겔 크로마토그래피를 이용하여 화합물 3을 분리 정제할 수 있다. 상기 화합물 분리를 위한 실리카겔 크로마토그래피시 이동상으로는 바람직하게 클로로포름, 클로로포름·메탄올 혼합용매 및 메탄올을 순차적으로 사용할 수 있고, 때 사용되는 클로로포름·메탄올 혼합용매의 부피비는 99:1 ~ 1:2 부피비가 바람직하다. 역상 칼럼크로마토그래피(RP-C18)를 이용하여 분리를 하고자 할때는 물, 물·메탄올용매 및 메탄올을 순차적으로 사용하여, 용매 부피비 99:1 ~ 1:2 부피비를 이용하여 분리할 수 있다. 또한 상기 크로마토그래피는 단일 화합물이 정제될 때까지 1회 내지 수회에 걸쳐 수행할 수 있으며, 필요에 따라 농축, 재결정을 실시할 수 있다. 분리된 화합물은 분자량측정, NMR 측정 등의 통상적인 방법으로 분석할 수 있다.

들깨 추출물 또는 이로부터 분리된 폴리페놀계 화합물을 이용한 항바이러스활성실험은 바이러스 H1N1 뉴라미니데이즈 억제 활성 검정방법을 사용할 수 있다. 바이러스 H1N1 뉴라미니데이즈 억제활성 평가는 시료와 뉴라미니데이즈를 일정량 3mL 큐벳에 넣고 50mM 트리스 버퍼 (pH 7.5, 5mM CaCl ₂ , 200mM NaCl포함)를 가하여 잘 혼합되게 하여 32℃에서 10분간 반응시킨 후 기질인 2'-(4-메칠움베리페릴)-알파-dn-아세틸뉴라미닉에시드 [2'-(4-methylumbellifery)-α-DN-acetylneuraminic acid]를 첨가하여 형광광도계 (excitation: 365nm; emission: 445nm)로 분석할 수 있다. 뉴라미니데이즈 억제활성 정도는 먼저 추출물 대신 동일 부피의 용매를 처리한 실험에서 효소 활성 정도를 100%로(바탕실험) 하고 추출물 처리에 의한 효소활성을 바탕실험과 비교할 수 있다.

상세하게는, 4',5,7-트리하이드록시플라본, 3',4',5,7-테드라하이드록시플라본, 및 2R-2[[(2E)-3-(3,4-디하이드록시페닐)-1-옥소-2-프로페닐]옥시]-3-(3,4-디하이드록시페닐)프로파노익 에시드 화합물들은 바이러스 H1N1 뉴라미니데이즈에 대하여 활성을 50% 저해하는 화합물 농도가 각각 80 μM, 8.5 μM 및 47 μM 로 나타났다. 들깨 종실의 폴리페놀계 화합물 중에서는 3',4',5,7-테드라하이드록시플라본, 즉 루테올린 성분이 가장 강한 효과를 나타내었다. 본 발명의 상기 들깨 추출물 또는 이로부터 분리된 폴리페놀계 화합물이 바이러스 H1N1 뉴라미니데이즈에 강한 억제 효과가 있음을 최초로 규명한 것이라 할 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 인플루엔자 바이러스 억제 효과가 있어 항바이러스, 조류, 돼지 인플루엔자 바이러스 예방 및 치료용 약학조성물, 건강기능성 식품 조성물 또는 기능성 농축산 사료 등으로 사용될 수 있다. 또한, 기름을 짜고 남은 들깨 박을 활용하여 추출함으로써 보다 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명인 조성물을 포함하여 제조되는 약제의 제형은 제한은 없으며, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등으로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물이 적용되는 식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물에는 포도당, 과당 등의 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스 등의 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 폴리사카라이드 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 포함된다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물 등의 천연 감미제, 또는 사카린, 아스파르탐 등의 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 0.01 ~ 0.04g, 바람직하게는 0.02 ~ 0.03g이다.

본 발명의 건강식품은 상기 성분 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품은 천연 과일 쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부에 대하여 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 아래 실시예에 의하여 제한되거나 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 들깨 추출물의 제조

들깨 종실의 추출, 분리 및 정제

들깨 종실(1.0kg)을 깨끗이 세척하고 건조한 뒤 분쇄기로 분쇄하여 추출용기에 넣고 n-헥산 또는 에테르를 사용하여 3일 동안 진탕하여 들깨 기름성분을 제거하였다. 기름성분을 제거한 시료는 80% 에탄올 수용액 (3ℓ)으로 상온에서 2일 동안 왕복 진탕 추출하였다. 추출된 시료는 여과지로 여과한 다음, 감압하에서 농축하여 연갈색 추출물 (100g)을 얻었다. 여기에 정제수 500㎖을 넣어 현탁시키고, n-헥산, 에틸아세테이트, 메탄올 순으로 분획하여 n-헥산 분획물(5g), 에틸아세테이트 분획물(30g) 및 메탄올 분획물 (65g)을 각각 얻었다. 얻은 에틸아세테이트 분획물(30g)은 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (500g, 70~230 메쉬, Merk)를 사용하였으며, 이동상 용매로는 n-헥산 대 에틸아세테이트 (99:1 ~ 1:2 혼합비) 혼합용매 및 메탄올을 순차적으로 사용하여 7개의 분획(분획.E1 ~분획.E7)을 얻었다. 분획.E3 (2g)을 실리카켈 (5g, 70~230 메쉬)에 흡착시킨 후, 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (20g, 230~400 메쉬)를 하였으며, 이때 이동상 용매는 n-헥산:에틸아세테이트 혼합용매를 사용하여 노란색 침전물을 얻고 이를 정제하여 화합물 1 (40mg)을 얻었다.

분획.E5 (3g)을 실리카켈 (10g, 70~230 메쉬)에 흡착시킨 후, 실리카겔 컬럼크로마토그래피(60g, 230~400 메쉬)를 하였으며, 이때 이동상 용매는 n-헥산:에틸아세테이트 혼합용매(50:1~1:2)를 사용하여 또다른 노란색 침전물을 얻고 이를 정제하여 화합물 2 (50mg)을 얻었다.

또한 메탄올 분획물 (65 g)을 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (700g, 70~230 메쉬, Merk)를 사용하였으며, 이동상 용매로는 클로로포름, 메탄올 (99:1 ~ 1:2 혼합비) 혼합용매 및 메탄올을 순차적으로 사용하여 5개의 분획(분획.M1 ~ 분획.M5)을 얻었다. 분획.M4 (5g)을 실리카켈 (6g, 70~230 메쉬)에 흡착시킨 후, 실리카겔 컬럼크로마토그래피 (100g, 230~400 메쉬)를 하였으며, 이때 이동상 용매는 클로로포름:메탄올 혼합용매를 사용하여 회갈색 침전물을 얻고 이를 정제하여 화합물 3 (80mg)을 얻었다. 분리한 폴리폐놀계 화합물의 실리카켈 TLC 페턴은 도 1a에 나타내었다.

들깨 종실의 폴리페놀계 화합물 분석

상기 실시예 1-1에서 얻은 물질은 HPLC-MS 분석기 (High-performance liquid chromatography mass chromatography)를 사용하여 분자랑 및 분자식을 결정하였으며, 핵자기공명분석 (Bruker AMX 500)을 통하여 ¹ H NMR, ¹³ C-NMR, 호모코지 (HOMO-COSY), HMQC ( ¹ H-Detected heteronuclear Multiple-Quantum Coherence), HMBC (Heteronuclear Multiple-Bond Coherence), DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization) 스펙트럼을 얻고 분자구조를 결정하였다.

측정결과는 하기와 같으며, 화합물 1인 4',5,7-트리하이드록시플라본 (4',5,7-trihydroxyflavone: apigenin), 화합물 2인 3',4',5,7-테드라하이드록시플라본 (3',4',5,7-tetrahydroxyflavone; luteolin), 폴리페놀계 화합물 3인 2R-2[[(2E)-3-(3,4-디하이드록시페닐)-1-옥소-2-프로페닐]옥시]-3-(3,4-디하이드록시페닐)프로파노익 에시드 ((2R)-2[[(2E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-1-oxo- 2-propenyl]oxy]-3-(3,4-dihydroxyphenyl)propanoic acid; rosmarinic acid)으로 동정하였다. 분리한 폴리폐놀계 화합물의 구조는 도 1b에 나타내었다.

[화합물 1]: 4', 5,7-트리하이드록시플라본

1) 물성 : 노란색 무정형 결정

2) 분자량 : 270

3) 분자식 : C ₁₅ H ₁₀ O ₅

4) ¹ H-NMR (500MHz, DMSO- d ₆ ) δ 7.91(d, J =8.8 Hz, H-2',6'), 6.92(d, J =8.8 Hz, H-3',5'), 6.76(s, H-3), 6.47(d, J =2.1 Hz, H-8), 6.18(d, J =2.1 Hz, H-6).

5) ¹³ C-NMR (125 MHz, DMSO- d ₆ ) δ 182.0(C-4), 164.5(C-5), 164.1(C-2), 161.8(C-7), 161.5(C-4'), 157.7(C-9), 128.8(C-2',6'), 121.5(C-1'), 116.3(C-3',5'), 104.1(C-10), 103.2(C-3), 99.2(C-6), 94.3(C-8).

[화합물 2]: 3',4'5,7-테드라하이드록시플라본

1) 물성 : 노란색 무정형 결정

2) 분자량 : 360

3) 분자식 : C ₁₅ H ₁₀ O ₆

4) ¹ H-NMR (500MHz, DMSO- d ₆ ) δ 7.42(dd, J =8.1, 2.3 Hz, H-6'), 7.40(d, J =2.3 Hz, H-2'), 6.90(d, J =8.1 Hz, H-5'), 6.66(s, H-3), 6.45(d, J =2.1 Hz, H-8), 6.20(d, J =2.1 Hz, H-6).

5) ¹³ C-NMR (125 MHz, DMSO- d ₆ ) δ 182.0(C-4), 164.5(C-5), 164.3(C-2), 161.9(C-7), 157.7(C-9), 150.1(C-4'), 146.1(C-3'), 121.9(C-1'), 119.3(C-6'), 116.4(C-5'), 113.8(C-2'), 104.1(C-10), 103.2(C-3), 99.2(C-6), 94.2(C-8).

[화합물 3]: 2R-2[[(2E)-3-(3,4-디하이드록시페닐)-1-옥소-2-프로페닐]옥시]-3-(3,4-디하이드록시페닐)프로파노익 에시드

1) 물성 : 회갈색 무정형 결정

2) 분자량 : 286

3) 분자식 : C ₁₈ H ₁₆ O ₈

4) ¹ H-NMR (500MHz, Methanol- d ₄ ) δ 7.57(d, J =15.9 Hz, H-7), 7.06(d, J =2.0 Hz, H-2), 6.95(dd, J =8.1, 2.0 Hz, H-6), 6.79(d, J =8.2 Hz, H-5'), 6.77(d, J =2.0 Hz, H-2'), 6.72(d, J =8.2 Hz, H-6'), 6.63(dd, J =8.1, 2.0 Hz, H5), 6.27(d, J =15.9 Hz, H-8), 5.22(dd, J =8.3, 4.4 Hz, H-8'), 3.10(dd, J =13.8, 8.8 Hz, H-7'α), 3.04(dd, J =13.8, 8.8 Hz, H-7' β).

5) ¹³ C-NMR (125 MHz, Methanol- d ₄ ) δ 173.4(C-9'), 168.4(C-9), 149.6(C-4'), 147.6(C-7), 146.6(C-3'), 146.0(C-4), 145.1(C-3), 129.2(C-1'), 127.6(C-1), 123.1(C-6), 121.8(C-5), 117.5(C-2'), 116.4(C-5'), 116.2(C-6'), 115.2(C-2), 114.3(C-8), 74.5(C-8'), 37.8(C-7').

들깨 종실의 기능성 성분 중 뉴라미니데이즈 억제 활성이 가장 우수한 화합물 2인 3',4',5,7-테드라하이드록시플라본의 ¹ H-NMR 및 ¹³ C-NMR 스펙트럼은 도 2a, 도 2b에 나타내었다.

들깨 종실 추출 화합물의 뉴라미니데이즈 억제 활성 시험

본 발명의 들깨 종실 추출물 또는 이로부터 분리된 폴리페놀계 화합물의 바이러스 H1N1 뉴라미니데이즈 억제활성을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

뉴라미니데이즈는 인플루엔자 바이러스 표면 항원인 동시에 새로 생성된 바이러스를 세포 밖으로 방출하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 기존 인플루엔자 바이러스 치료제 개발을 위한 주요 타겟으로 이용되고 있다. 따라서 본 발명에서는 바이러스유래 H1N1 뉴라미니데이즈를 R&D Systems사로부터 구매하였으며, 기질인 2'-(4-메칠움베리페릴)-알파-dn-아세틸뉴라미닉에시드 [2'-(4-methylumbellifery)-α-DN-acetylneuraminic acid]는 Sigma사에서 구매하여 사용하였다. 먼저 들깨 종실 추출물 또는 이로부터 분리된 폴리페놀계 화합물을 일정 농도별로 희석하여 준비한다. 시료가 준비되면 일정량의 시료와 H1N1 뉴라미니데이즈를 3mL 큐벳에 넣은 뒤 50 mM Tris 버퍼 (pH 7.5, 5mM CaCl ₂ , 200mM NaCl포함)를 가하여 잘 혼합되게 하여 32℃에서 10분간 인큐베이션 시킨 뒤 기질인 2'-(4-메칠움베리페릴)-알파-dn-아세틸뉴라미닉에시드를 가하여 형광광도계인 SpectraMax M2e(Molecular Divices, USA)로 excitation 파장 365nm 및 방출(emission) 파장 445nm로 분석하였다. 실험에 사용된 H1N1 뉴라미니데이즈 최종 농도는 2.5 ng이며, 기질의 최종 농도는 200 μM이며, 반응온도는 32℃ 이다.

추출물 대신 에탄올을 넣어준 반응액과의 형광광도 차이로부터 저해율을 계산하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. 또한, 효소의 활성 평가에 적용된 수학식 1은 다음과 같다.

[수학식 1]

뉴라미니데이즈 활성(%) = 100[1/(1+([시료농도]/IC ₅₀ ))]

상기 IC ₅₀ 은 알파-글루코시데이즈 활성을 50% 저해하는 추출물 농도를 나타낸다.

들깨 종실 추출물 및 분리된 폴리페놀계 화합물의 H1N1 뉴라미니데이즈 억제활성은 아래 표 2에 나타내었다.

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 들깨 종실 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물이 바이러스 H1N1 뉴라미니데이즈를 억제함을 알 수 있다. 특히 화합물 2는 항바이러스 억제효과가 분리한 화합물 중 가장 우수하였다. 화합물 2 및 3의 시료 농도에 따른 뉴라미니데이즈 저해율은 도 4에 나타내었다.

들깨 추출물의 독성시험

본 발명의 유효성분인 들깨 추출물에 대하여 독성실험을 다음과 같이 수행하였다.

들깨 추출물을 1% 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스(sodium carboxymethyl cellulose)에 용해하고 물로 희석한 후 이를 마우스(군당 10 마리)에 각각 0, 4, 20, 100, 500㎎/㎏이 되도록 경구 투여한 다음 7일간 관찰하였다. 들깨 추출물 경구 투여로 인하여 사망한 쥐는 없었으며, 이후 7일간 사망하는 쥐는 없었다.

실시예2 : 들깨 추출물을 포함하는 정제의 제조

유효성분으로 들깨 추출물 15mg이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조한다.

유효성분 250g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

실시예3 : 들깨 추출물을 포함하는 캅셀의 제조

유효성분으로 들개 추출물 500 ㎎을 경질 젤라틴 캅셀에 충전하여 캅셀제를 제조하였다.

실시예4 : 들깨 추출물을 포함하는 음료의 제조

들개 추출물 또는 유효성분 500㎎을 적당량의 물에 용해시킨 후에 보조성분으로서 비타민 C, 교미제로서 구연산, 구연산나트륨, 올리고당을 적당량 가하고, 보존제로서 적당량의 나트륨벤조에이트를 가한 후에 물을 가하여 전량을 100㎖로 만들어 음료용 조성물을 제조하였다. 이때 타우린이나 마이오 이노시톨, 엽산, 판토텐산 등을 단독으로 혹은 함께 첨가할 수 있다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 전술한 실시예 외의 많은 실시예들이 본 발명의 특허청구범위 내에 존재한다.

도 1a는 들깨 추출물 및 분리한 활성 단일 성분에 대한 TLC 전개 사진이다.

도 1b는 들깨 종실로부터 분리 구조동정한 화합물 구조이다

도 2a, 2b는 들깨 주요성분인 3',4',5,7-테드라하이드록시플라본의 ¹ H-NMR 및 ¹³ C-NMR 스펙트럼이다.

도 3는 들깨 주요성분에 대한 뉴라미니데이즈 억제활성 효과를 도시화한 그래프이다.

도 4a은 들깨 유효성분 중 화합물 1의 농도에 따른 뉴라미니데이즈 저해효과를 형광분광기로 변화를 도시화한 그래프이다.

도 4b는 들깨 유효성분 중 화합물 2 및 화합물 3 성분 농도변화에 따른 뉴라미니데이즈 억제 효과를 도시화한 그래프이다.