技术领域
[0001] 本
发明涉及反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)组合物，并特别涉及用于反义寡核苷酸(ASO)胞质递送(cytosolic delivery)的组合物和方法。提供部分单链和部分双链的杂合ASO，杂交形成可非共价地键合至核酸结合蛋白区域(nucleic-acid-binding protein regions)的双链区。这样，可产生促进反义DNA向靶细胞中递送的ASO::蛋白
复合体。此类复合体可用于下调细胞中的基因表达。
背景技术
[0002] 反义寡核苷酸已经被FDA批准用作
治疗巨细胞病毒(cytomegalovirus)介导的
视网膜炎和慢性溃疡性结肠炎的抗病毒药(Roehr,1998；Yacychyn等人，1998)。ASO包括设计为与源自特定基因的信使RNA(mRNA)转录本杂交的单链DNA
片段或其类似物。如此形成的mRNA::ASO杂交体可被RNAse H降解。在受
病毒感染的
生物体中，病毒的遗传物质进入特定细胞以复制，该复制过程需要病毒特异性mRNA的翻译。通过用对病毒mRNA特异的反义寡核苷酸处理受感染的细胞，可防止靶病毒基因表达并阻断病毒生命周期。
[0003] 反义寡核苷酸治疗有效性的重要因素是寡核苷酸的生物利用度(Biroccio等人，2003)。生物利用度可受到反义寡核苷酸不能穿透细胞的质膜或内膜系统的限制。由于反义寡核苷酸的靶标(如，mRNA)位于细胞的细胞溶胶(cytosol)内，因此寡核苷酸需要在它们接近细胞溶胶之前能够跨过细胞膜。
[0004] 解决这类反义寡核苷酸的胞质接近(cytosolic access)问题的一种方式是将所述治疗局部施用而不是全身施用，特别是将反义寡核苷酸施用至独立的药代动
力学房室，升高反义寡核苷酸的局部浓度。例如，巨细胞病毒-介导的视网膜炎的反义寡核苷酸治疗涉及通过玻璃体内注射将福米韦生(fomivirsen) 施用至独立的药代动力学房室。然而，胞质接近，即，反义寡核苷酸向其靶mRNA的接近，即使在玻璃体内施用之后仍存在大量限制(Lysik和Wu-Pong,2003)。
[0005] 反义寡核苷酸细胞内递送的其它方法可涉及：对细胞膜的机械和电的细胞损伤、高分子和脂质运载体(carriers)(已知非特异性地使膜不稳定)、或病毒载体。然而，这些及类似的方法还未被证明是临床安全或可靠的，并且(迄今为止)市场上还未产生任何批准用于反义产品的递送技术。
发明内容
[0006] 本发明旨在借助下述新颖排列而提供用于下调细胞内的一种或多种基因的体系中所使用的组合物和方法，所述新颖结构为，活性反义序列(例如单链DNA的活性反义序列)作为部分重叠的第二寡核苷酸链的侧翼，所述部分重叠的第二寡核苷酸链形成可结合至
蛋白质的核酸结合结构域的结合位点。我们将这些部分单链和部分双链的核苷酸命名为“ASO杂交体”。出乎意料地，我们已发现并已经验地示出(未公布的数据)：
[0007] 1)ASO杂交体在无细胞试验中例如以30pMol的ASO浓度可显示与对照的单链反义寡核苷酸相当的反义活性谱。
[0008] 2)ASO杂交体结合至核酸结合结构域(例如酿酒
酵母(S.cerevisiae)GAL4)来形成复合体，而不需要先前所使用的聚阳离子亲和处理(polycationic affinity handle)(例如聚(L-赖
氨酸)(Gaur等人，2002；WO97/23236))或其它共价化学缀合法。
[0009] 3)如果在ASO杂交复合体(例如GAL4::ASO)中，核酸结合结构域融合至减毒的致死因子结构域1(来自炭疽杆菌(Bacillus anthracis)，即，LFn)，该超分子组装体可穿过源自细菌
毒力因子(virulence factor)(炭疽杆菌PA63)的孔。这是出乎意料的，因为已报道了经PA孔的通过要求货物(cargo)的结构去组装(熔球态转变(molten globular transition))(Zornetta等人，2010)。对于超分子复合体经PA孔转变成胞质溶胶，一定不能发生货物的熔球态转变，即，由有序结构向无规卷曲的转变。再者，在不使用聚阳离子亲和处理(例如聚(L-赖氨酸)下已示出该转变(Gaur等人,2002:WO97/23236))。
[0010] 本发明的具体目的是提供能够使反义寡核苷酸的组合物跨过细胞膜的缀合策略。这样，反义寡核苷酸可递送至细胞的胞质溶胶，经所记载的反义-至-蛋白缀合策略提供对胞质溶胶内的RNA或DNA靶标(例如病毒mRNA转录本)的直接接近。
[0011] 一方面，本发明提供包括一对反义寡核苷酸的反义寡核苷酸组合物，其中两条反义寡核苷酸杂交以给出至少一单链反义序列和至少一双链蛋白结合序列。优选地，所述组合物进一步包括穿梭蛋白(如，重组体LFn-GAL4)，其中穿梭蛋白包括识别双链蛋白结合序列的核酸结合结构域(例如GAL4)，和其中穿梭蛋白非共价地键合至这对反义寡核苷酸。
[0012] 另一方面，本发明提供用于递送反义寡核苷酸跨过细胞的膜的体系，该体系包括(i)一对反义寡核苷酸，这对包括双链蛋白结合序列(如，GAL4)和至少一单链反义序列(例如，如图1所示)，和(ii)穿梭蛋白，其具有能识别包含在双链蛋白结合核酸序列内的特定序列(如，CGG-N11-CCG)的核酸结合结构域，以便该穿梭蛋白非共价地结合至这对反义寡核苷酸。
[0013] 在另一方面，本发明提供将反义寡核苷酸非共价地缀合至穿梭蛋白(如，LFn-GAL4)的方法，所述方法包括：(i)提供两条反义寡核苷酸，(ii)将两条反义寡核苷酸杂交以形成反义杂交体，其中所述反义杂交体包括至少一单链反义序列和至少一双链蛋白结合序列，(iii)提供含有识别双链蛋白结合靶序列的核酸结合结构域的穿梭蛋白，和(iv)借助蛋白的核酸结合结构域和反义杂交体的蛋白结合序列将穿梭蛋白非共价地缀合至反义杂交体。
[0014] 缀合和膜移位(membrane translocation)的方法不需要使用(聚阳离子或离子)DNA凝聚剂(DNA condensing agents)(例如聚(乙烯亚胺)或聚(L-赖氨酸))，因为这些物质通常有毒，且这种毒性被认为至少部分是由于它们使细胞膜不稳定的倾向(Richardson等人，1999)(并参见下表1)。在本发明的背景下，穿梭蛋白定义为能够传送遗传物质通过细胞膜的孔的蛋白质。该孔可包括成孔蛋白(pore-forming protein)，例如炭疽杆菌PA83或PA63。
[0015] 本发明的寡核苷酸包括核酸序列，该核酸序列可为DNA或DNA类似物(例如某些
氧原子被硫取代的硫化类似物)的核酸序列。可发现适合的其它DNA类似物包括由Leumann(2002)公开的那些。序列可彼此直接邻接或通过间插DNA序列(优选至少部分双链的)而连接。
[0016] 在优选实施方案中，穿梭蛋白为减毒的毒素蛋白。特别地，穿梭蛋白可为炭疽杆菌致死因子结构域I(B.anthracis lethal factor domain I,LFn)。
[0017] 优选地，在减毒毒素中，至少一毒素结构域，如炭疽杆菌致死因子蛋白毒素的毒素结构域II-IV中的一个或多个被核酸结合结构域所代替。例如，核酸结合结构域可为
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GAL4(与LFn融合)。
[0018] 有利地是，反义寡核苷酸组合物进一步包括成孔蛋白。优选地，成孔蛋白为无毒性蛋白。一种优选的成孔蛋白为炭疽杆菌毒力因子保护性
抗原(Protective Antigen,PA)。具体地，成孔蛋白可为炭疽杆菌PA83或PA63。
[0019] 在一个实施方案中(在以突触融合蛋白5(syntaxin5,Syn5)为下调目标的实例中)，寡核苷酸之一包括反义序列5’AATTTGTTTGTTGAGGCTA 3’(SEQ ID No:18)。反义寡核苷酸对的各成员包括杂交以形成蛋白结合序列的两条互补链之一(参见图1)。反义序列可为蛋白结合序列的下游(3’)或上游(5’)(或者在产生的杂交体中存在不止一段反义序列的情况下，为两侧)(参见图1a)。
[0020] 在一个实施方案中，蛋白结合序列为CGG-N11-CCG，其中“N”为包括嘌呤或嘧啶
碱基的任意核苷酸。适当地，蛋白结合序列为5’CGGCTGCTCTGATGCCG 3’(SEQ ID No:19)。
[0021] 有利地，反义寡核苷酸组合物包括杂交以形成蛋白结合序列的寡核苷酸对，包括序列5’CGGCATCAGAGCAGCCG 3’(SEQ ID No:20)。此类序列的实例为下示SEQ ID Nos 9,11和13(
实施例4)。
[0022] 在一个实施方案中，寡核苷酸进一步包括蛋白结合序列和反义序列之间的侧翼序列(参见图1a)。
[0023] 有利地，用于本发明的寡核苷酸可以是硫化的，从而增加它们的
稳定性。在硫化的寡核苷酸中，寡核苷酸链中的一个或多个非桥接氧原子可被硫原子取代。硫化可通过例如使用Beaucage
试剂(3H-1,2-苯并二硫杂环戊二烯-3-
酮-1,1,-二氧化物)( 等人，2005)等的各种已知方法来实现。增加寡核苷酸稳定性的其它方式可用于本发明中：例如，Leumann(2002)中公开的那些。
[0024] 本发明还提供一种下调细胞的胞质溶胶中靶基因的表达的体外方法，所述方法使用如上所述的反义寡核苷酸组合物将反义寡核苷酸跨细胞的膜递送。
[0025] 本发明的替代方面为如上所述的反义寡核苷酸组合物，其在下调人
宫颈上皮细胞中的人
乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus,HPV)的基因表达的方法中使用(参见图5和实施例7)。
[0026] 进一步的方面中，本发明提供如上所述的反义寡核苷酸组合物，其作为潜在的治疗或
预防剂，用于癌症、特别是包括
宫颈癌和
口腔癌在内的由人乳头瘤病毒(HPV)引起的癌症。
[0027] 许多
植物和细菌毒素(毒力因子)已进化为将大分子催化活性蛋白结构域形式的毒素递送至细胞的胞质溶胶。实例包括霍乱毒素(Sandvig等人，2005)、蓖麻毒素(Sandvig等人，2010)和炭疽毒素(Gaur等人，2002)。这些物质已知在体内作用，引起人类的发病和死亡。
[0028] 本
发明人已制备了已知的减毒形式的炭疽杆菌致死因子(LFn)，其中野生型结构域II-IV(负责催化的毒性活性)已使用重组PCR移除。这些结构域(II-IV)随后被核酸结合结构域如酿酒酵母GAL4所代替。所有这些都是本领域已知的(Gaur等人，2002)。发明人已示出，在适宜条件下，即当两条适合的寡核苷酸杂交在一起形成包含单链反义序列和双链(DS)蛋白结合序列的杂交体时，GAL4可间接结合至活性反义寡核苷酸。发明人已进一步示出，可利用完整的复合体(LFn-GAL4::ASO)，通过其与另一蛋白PA83的相互作用而将反义寡核苷酸移位至细胞的胞质溶胶中。值得注意的是，本发明人用来生成完整反义寡核苷酸-蛋白复合体的方法和材料意味着，不需要迄今为止视为本领域中DNA复合体形成所必需的、但有毒且已知使膜不稳定(Richardson等人，1999))的凝聚剂或聚阳离子亲和处理(例如聚(L-赖氨酸)(Gaur等人，2002；WO97/23236)。
[0029] 根据本发明的体系的优选实施方案将单链反义寡核苷酸序列3’和/或5’提供至双链(DS)蛋白结合序列。蛋白质如LFn可与成孔蛋白如PA83缀合使用。PA83具有增强LFn的膜移位能力。LFn和PA83之间的相互作用在别处记述(Krantz等人，2005)，但记载其在孔移位期间需要货物的熔球态转变。我们现已示出可使用超分子组装体作为货物，并且与该超分子组装体相关的反义序列可移位至胞质溶胶中。这是还未曾预测的。
[0030] 发明人还已开发了使用含有双链LFn-GAL4结合序列和3’和/或5’突出的单链反义序列的杂交寡核苷酸的体系，它们已示出在高于30pMol的反义寡核苷酸(ASO)浓度下并不比无任何侧翼序列的反义(单链核苷酸)序列的效果差。由本发明人开发的复合体可用作反义寡核苷酸缀合体系来促进反义寡核苷酸胞质递送，但在寡核苷酸和LFn-GAL4蛋白之间无共价附着。本发明提供用于体外研究的有用工具，以及用于反义寡核苷酸药物组合物和任何合适的反义治疗的递送方法的关键部分的
基础。特别地，本发明可形成用于治疗HPV-感染的宫颈上皮细胞的反义抗病毒组合物的基础。
[0031] 已使用小
角度
中子散射(SANS)示出对邻接于反义序列的双链蛋白识别核酸序列的存在作出应答的LFn-GAL4蛋白质的二聚作用(参见实施例5)。实施例5示出，在添加本发明的杂合寡核苷酸组合物时，蛋白质LFn-GAL4形成高分子量复合体(蛋白质回转半径(Rg)从大约5nm扩展至25nm)。
[0032] 为了试验根据本发明的三组分体系，发明人最初呈现一种
原型。在人上皮细胞(Hela)中试验体系下调基因的能力。LFn-GAL4::寡核苷酸复合体，当与PA83混合时促进与反义序列相对应的特定选择基因的下调(参见实施例6)。关于实施例6，其通过蛋白质印迹和免疫检测阐释了蛋白质突触融合蛋白5的下调(Suga等人，2005)。进一步通过将靶基因表达
水平相对于“管家”基因如Derlin1的表达水平而标准化，并通过包括“无义(non-sense)”对照来强调基因特异性(以及对细胞数量的控制)(参见图4)。‘无义’对照为包括单链DNA的对照，该单链DNA与表达的基因的靶RNA不互补，因而不期望抑制其表达。
[0033] 另外，反义活性还示出抗HPV基因E7的表达(参见实施例7)。HPV E7对于HPV病毒生命周期的增殖至关重要，且是治疗性干预的靶标(Jonson等人，2008)。
[0034] 提供双链蛋白结合区或序列、同时留下具有反义活性的序列的游离单链区的两条寡核苷酸链的排列提供方便的缀合法，该方法可用于将反义结构域结合至本领域已记载的试剂(例如LFn-GAL4和PA83)。这促进了可介导编码潜在的药物靶标(如HPV E7)的基因下调的反义试剂的胞质递送。
附图说明
[0035] 现参照附图更详细地描述本发明的具体实施方案，其中：
[0036] 图1包括图1a至1e，示出五种不同的根据本发明的组合物，说明用于由一对单链反义寡核苷酸建立双链蛋白结合位点的不同拓扑结构；
[0037] 图2比较了无细胞试验中根据本发明的组合物与其它反义组合物的抑制活性。
[0038] 图3，通过使用小角度中子散射(SANS)，示出了在本发明的反义组合物的存在下，LFn-GAL4二聚形成较高分子量的复合体。
[0039] 图4和5阐释了所记载的体系如何能够下调两种不同基因的表达：下调突触融合蛋白5的表达示于图4，下调HPV(血清型18)早期(Early,E)7的表达示于图5；
[0040] 图6为LFn-GAL4核苷酸序列(SEQ ID No:1)；
[0041] 图7为LFn(LF结构域I)蛋白质序列(SEQ ID No:2)；
[0042] 图8为GAL4(氨基酸1-147)蛋白质序列(SEQ ID No:3)；
[0043] 图9为V5-LFn-GAL4-6His DNA序列(SEQ ID No:4)；
[0044] 图10为V5-LFn-GAL4-6His蛋白质序列(SEQ ID No:5)；
[0045] 图11为MRGS-6His-PA83DNA序列(SEQ ID No:6)；和
[0046] 图12为MRGS-6His-PA83蛋白质序列(SEQ ID No:7)。
具体实施方式
[0047] 实施例1：穿梭蛋白的形成
[0048] LFn-GAL4从大肠杆菌(E.coli)的培养物中富集，收率大约5mg/l。编码蛋白质LFn-GAL4的DNA序列为SEQ ID No:4(图9)。该序列在质粒pET151/D(Invitrogen)(大肠杆菌表达盒)内。
[0049] LFn(LF结构域1)和GAL4(氨基酸1-147)的DNA序列(本领域已知-Gaur等人，2002)亚克隆至pET151/D细菌表达盒中。在N末端添加V5表位标签和在C末端添加6×组氨酸亲和标签分别允许从细菌裂解物中快速免疫检测及亲和纯化融合蛋白。
[0050] 重组蛋白的生产：化学感受态细菌(大肠杆菌BL21*DE3(Invitrogen))用纯化质粒(上述)转化，并且在含有氨苄青霉素(200μg/ml)培养基的2×酵母提取物胰蛋白胨(2×YT)细菌培养液中培养过夜(10mL)，之后在同样含有相似浓度氨苄青霉素的大体积(1L)2×YT中亚培养(sub-culturing)。细菌培养物接着在设定为180rpm(37℃)的定轨摇床中温育3小时。随后加入异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度500μM并温育另外3小时。通过离心(6000×g，10min，4℃)制备细菌丸粒，并使用设定至1500PSI的弗氏压碎器(French Press)进行裂解。细菌裂解物进行进一步离心(20 000×g，20min)。所得上清穿过6×His(Co2+
树脂(Clontech))亲和层析柱。用150mM咪唑将LFn-GAL4洗脱成1mL的级分。分析级分的蛋白质纯度和浓度，汇集并在
磷酸盐缓冲盐水中
透析。最终的蛋白制备物用SDS-PAGE评估，并进行考
马斯
染色(确定蛋白质纯度)和蛋白质印迹分析(使用V5和6×His特异性
抗体)。
[0051] 实施例2：成孔蛋白的制备
[0052] PA83从大肠杆菌BL21*DE3的培养物中富集，收率大约5mg/l。含已知编码PA83的DNA序列的质粒由Les Baillie教授(卡迪夫大学)馈赠。该质粒含有亚克隆至提供N末端6×组氨酸亲和标签的细菌表达载体pQE30中的PA83编码序列(Baillie等人，2010)。化学感受态细菌如前用纯化质粒转化并培养过夜。在生长期，1l细菌培养物在设定为180rpm(37℃)的定轨摇床中温育3小时。随后加入IPTG至终浓度500μM并温育另外2小时。通过离心(6000×g，10min)制备细菌丸粒，并如前使用弗氏压碎器进行裂解。细菌裂解物进行进一步离心(20000×g，20min)。所得上清穿过6×组氨酸亲和层析柱。用150mM咪唑将PA洗脱成1mL的级分。分析蛋白质级分的纯度和浓度，汇集并在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中透析。最终的蛋白制备物用SDS-PAGE评估，并进行考马斯染色(确定纯度)和蛋白质印迹分析(使用PA特异性抗体)。
[0053] PA83的氨基酸序列示于SEQ ID No:7(图12-MRGS-6His-PA83蛋白质)。
[0054] 实施例3：含双链蛋白结合区的反义寡核苷酸的形成
[0055] 将分别编码GAL4识别序列的一条链的两条互补的寡核苷酸
退火，从而形成以单链反义序列为侧翼的双链(GAL4)蛋白结合序列。所记载的ASO组合物(SEQ ID Nos:8&9：参见实施例4)在此实例中使用。所得复合物示于图1a。反义寡核苷酸的杂交通过重复的(×10)热循环来进行，使两条部分重叠的寡核苷酸熔融(1min.，94℃)和再退火(1min.，55℃)，保持单链反义寡核苷酸序列游离，以序列特异方式与mRNA相互作用。
[0056] 图1a-1e示出与使用本文公开的蛋白质::寡核苷酸缀合策略的反义核酸序列(一种或多种)相关的DNA(或DNA类似物)的蛋白结合(DS)序列的几种可能的拓扑结构。图1a示出两条序列SEQ ID Nos:8和9，二者以相反意义取向并通过互补区域结合在一起–SEQ ID No:8中的碱基23至48与SEQ ID No.9的碱基48至23结合(SEQ ID No.9在图1a中以3'-5'示出)。本发明的ASO杂交体可包括或可不包括作为反义序列(一个或多个)侧翼的其它DNA序列。如图1a-1e所示，ASO杂交体的双链(蛋白结合)区可以多种不同的方式形成。例如，双链区可如图1a所示位于两个反义序列(二者可相同或不同)之间。可选地，双链区可如图1b-1e所示位于单个反义寡核苷酸的一侧。
[0057] 实施例4：用于抑制特定蛋白质表达的DNA序列的制备
[0058] 含侧翼和GAL4结合序列的突触融合蛋白5特异性反义寡核苷酸序列：正向寡核苷酸(SEQ ID No:8)
[0059] 5’AATTTGTTTGTTGAGGCTAATGCATGCCGGCTGCTCTGATGCCGGCAT 3’
[0060] 反向寡核苷酸(SEQ ID No:9)
[0061] 5’AATTTGTTTGTTGAGGCTAATGCATGCCGGCATCAGAGCAGCCGGCAT 3’
[0062] 含侧翼和GAL4结合序列的HPV(血清型18)早期(E)7 mRNA转录本特异性反义寡核苷酸序列：
[0063] 正向寡核苷酸(SEQ ID No:10)
[0064] 5’GGTCGTCTGCTGAGCTTTCTATGCATGCCGGCTGCTCTGATGCCGGCAT 3’[0065] 反向寡核苷酸(SEQ ID No:11)
[0066] 5’GGTCGTCTGCTGAGCTTTCTATGCATGCCGGCATCAGAGCAGCCGGCAT 3’[0067] 含侧翼和GAL4结合序列的TurboGFP mRNA转录本特异性反义寡核苷酸序列：
[0068] 正向寡核苷酸(SEQ ID No:12)
[0069] 5’GGTGCTCTTCATCTTGTTGGTATGCATGCCGGCTGCTCTGATGCCGGCAT 3’[0070] 反向寡核苷酸(SEQ ID No:13)
[0071] 5’GGTGCTCTTCATCTTGTTGGTATGCCGGCATCAGAGCAGCCGGCATGCAT 3’[0072] 上述寡核苷酸(SEQ ID Nos:8-13)合成为具有硫代磷酸酯修饰，以提高反义寡核苷酸的寿命。
[0073] 正向和反向引物对(SEQ ID Nos 8与9；10与11；12与13)用PCR循环仪以下列条件杂交：加热至94℃1min.，冷却至55℃1min.，×10。该退火过程产生根据本发明的杂合单链和双链DNA序列。
[0074] 实施例5：反义寡核苷酸-穿梭蛋白(LFn-GAL4)复合体的形成
[0075] 制备退火的ASO杂交体(如实施例4)。这些ASO杂交体与LFn-GAL4以适当的化学计量(即，以大约3:1的蛋白质对寡核苷酸摩尔比)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中室温下共温育30min。
[0076] 如此获得的一种此类产物通过小角度中子散射(SANS)来研究。所得谱在图3中与不存在任何反义寡核苷酸下获得的谱相比较。图3示出对图1a所示的反义寡核苷酸组合物的添加作出响应的LFn-GAL4二聚作用，该二聚作用如SANS所测定-由PBS中的LFn-GAL4和LFn-GAL4::DS-反义寡核苷酸(各实例中大约0.5mg/ml的LFn-GAL4)所致的小角度中子散射。图3的x-轴的单位为q/l/埃，y轴的单位为1/cm。上侧黑色粗线示出ASO存在下的结果，与之相比，下侧细线示出不存在ASO时的结果。散射谱中0.01至 的差异归因于LFn-GAL4的二聚，产生该二聚的原因与形成部分寡核苷酸的双链蛋白结合序列有关(图1a)。在此实例中，2mm比色皿(Hellman Analytics,Essex,UK)分别装有LFn-GAL4和化学计量为3:1(摩尔比)的LFn-GAL4::寡核苷酸。
[0077] 此散射
辐射的强度是散射体的大小和形状以及成分(即LFn-GAL4)的反映。检测单独的蛋白质及其共混物二者。对于单独组分，大体上未观察到散射，表明它们的尺寸相对小。在LFn-GAL4与杂交的寡核苷酸的混合物中，观察到散射，证明发生了相互作用而形成较大的结构(即，LFn-GAL4::ASO复合体)。
[0078] 实施例6：靶基因表达的下调(突触融合蛋白5)
[0079] 实施例5中制备的复合体之一用于靶向Hela细胞中突触融合蛋白5基因的表达。成孔蛋白PA83用于辅助介导反义寡核苷酸经与LFn-GAL4相互作用而膜移位。复合体的ASO部分由两个退火的(如实施例4的)ASO序列(SEQ ID Nos:8&9)组成。Hela细胞当在常规条件下培养时产生突触融合蛋白5。Hela细胞以各种方式在ASO复合体浓度为0(对照)、1、10、50、100和200pMol/升的范围内处理。
[0080] 图4中：黑色实心柱表示用PA83、LFn-GAL4和“非-突触融合蛋白5”(GFP特异性)ASO(由杂交的SEQ ID No:12和13形成)处理的Hela细胞。空心柱表示仅用PBS处理的Hela细胞。这两种处理示出对突触融合蛋白5下调的序列特异性(由于抗-GFP ASO序列在此对突触融合蛋白5无活性)并用作阴性对照。横线填充的柱表示用突触融合蛋白5特异性的杂交ASO(由SEQ ID Nos:8和9形成)电穿孔的Hela细胞。竖线填充的柱表示用PA83、LFn-GAL4和突触融合蛋白5特异性的杂交ASO(由SEQ ID Nos:8和9形成)处理的Hela细胞。斜线填充的柱表示遵循制造商的建议，用混有Oligofectamine(Invitrogen)的突触融合蛋白5特异性的杂交ASO(由SEQ ID Nos:8和9形成)处理的Hela细胞。
[0081] 细胞中突触融合蛋白5的表达水平在24小时后使用免疫印迹法测量。结果表示为对照(仅用PBS处理的Hela细胞)的％表达(y轴)。数据示出根据本发明的组合物以基因特异性方式下调突触融合蛋白5的表达。通过蛋白质印迹和免疫检测以群体水平示出。图4中的图显示出突触融合蛋白5的表达水平，并示出将反义寡核苷酸杂交体(3.2μg/mL)(SEQ ID Nos:8和9)加至与PA(50μg/mL)共温育的LFn-GAL4(50μg/mL)，在Hela细胞上相对于管家基因Derlin1(用于控制细胞数量的变化)的表达的效果。示出的数据来自3个单独的实验，并证实所述组合物的添加可介导编码反义序列的特定基因反义寡核苷酸(即，突触融合蛋白5)的敲减。数据表示各实验的三次重复，且误差线表示平均值的标准误差。
[0082] 实施例7:靶基因表达的下调(HPV18E7)
[0083] 除了使用不同的寡核苷酸序列以外，如上文实施例6的记载进行实验，检测抗-HPV E7反义寡核苷酸在Hela细胞中抗人乳头瘤病毒(血清型18)早期7的表达的效力。在此实例中，实施例6的突触融合蛋白5-特异性ASO杂交体(由SEQ ID No:8和SEQ ID No:9形成)被同样包含杂交蛋白-结合区和小的侧翼区的HPV-E7-特异性ASO杂交体(由SEQ ID No:10和SEQ ID No:11形成)代替。在本实施例中，200pM寡核苷酸与LFn-GAL4和PA83联合使用(其为图5中图上的黑色柱)。结果示于图5：％基因表达示于y轴。对照处理即PBS取作100％：其为图5中图上的白色柱。数据表示各实验的三次重复，且误差线表示平均值的标准误差。两次处理之间存在统计学差异(p＝0.0104，根据单尾、非
配对t检验测量)。
[0084] 实施例8：与聚(乙烯亚胺)相比本发明组合物的体外毒性
[0085] 试验如实施例5中制备的ASO杂交体-穿梭复合体相对于聚(乙烯亚胺)(PEI)的毒性(表1)。这些数据显示相对于暴露于不同浓度的PEI(其为文献中已详尽表征为能够介导
转染的阳离子
聚合物)的细胞，在50μg/mL PA的存在下与ASO杂交体杂交超过72h后的LFn-GAL4蛋白在毒性上的差异。细胞活力根据未处理细胞进行标准化并通过添加MTT来测定(Richardson等人，1999)。
[0086] 表1
[0087] HeLa中的IC50(微克/ml) Vero中的IC50(微克/ml)25KDa支链PEI 2.9+/-0.6 7.3+/-0.1
0.8KDa支链PEI 2.4+/-0.2 7.4+/-0.3
20KDa直链PEI 3.0+/-0.1 6.9+/-0.5
PA83 >100 >100
ASO >100 >100
GAL4-LFn >100 >100
ASO::GAL4-LFn+PA83 >100 >100
[0088] 实施例9:使用不同反义寡核苷酸组合物的体外翻译试验的反义抑制[0089] 图2示出无细胞试验中本发明组合物相比于组分ASO的效果(其中膜移位不是速率-限制性的)。
[0090] 对照反应使用“一步法人类高收率迷你-体外翻译
试剂盒(One step human high yield mini-in vitro translation kit)”(Thermo Scientific)、连同编码蛋白质turboGFP(绿色
荧光蛋白-Evrogen)的对照质粒一起进行。反应以4.5μl体积进行(30℃温育3h)，并通过使用抗-6His一抗(1:1000稀释)和抗鼠HRP-缀合的二抗(1:1000)的蛋白质免疫印迹来监测turboGFP的表达。用Picostable ECL试剂盒(GE Healthcare)进行检测。在前述
3h温育时期开始时，将三种抗-turbo GFP反义寡核苷酸(ASO)组合物以不同浓度加入反应。
[0091] 结果示于图2，(n＝3±SEM)，相对于不含反义寡核苷酸的对照。图2中，y轴表示turboGPF相对于未处理对照的表达(％)，而x轴表示加入反应的反义寡核苷酸的浓度(以pMol计)。以方形表示的数据点来自单链ASO寡核苷酸SEQ ID No:12，由turboGPF反义序列和蛋白结合序列(的一条链)组成。以三角形表示的数据点仅由并入SEQ ID No:12的反义序列(即，21-
单体单元(mer)GGTGCTCTTCATCTTGTTGGA，SEQ ID No:21)产生。以圆形表示的数据点由通过SEQ ID Nos:12和13一起退火而形成的本发明ASO杂交体产生。图2示出的结果阐明了(体外)在高于30pMol的ASO浓度下，ASO杂交体中蛋白结合序列的存在并不抑制反义序列的活性。
[0092] 本发明可用于制备反义组合物，其中在不低于30pMol的反义寡核苷酸(ASO)浓度下，所述反义组合物的反义活性(如，以无细胞试验所测定的)相对于不具有蛋白结合序列或侧翼序列的反义对照实质上无显著降低。上述实施例9(图2)阐明了这一点。
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