関連出願の相互参照 本出願は、2016年9月15日出願の米国出願第62/395,316号及び2016年10月25日出願の米国出願第62/412,787号の米国特許法第119条(e)に基づく恩典を主張し、これらの文献は、参照によってそれらの内容全体が本明細書に組み込まれる。

発明の分野 本発明は概して、ゲノム解析に関し、より具体的には、生体試料における微生物の多様な集団から核酸分子を抽出及び解析する方法に関する。

背景情報 ヒトの体内及び体表には約100兆個の微生物が生存しており、この数は、体に存在するヒト細胞数である約10兆個をはるかに凌ぐものである。こうした通常は無害なウイルス、細菌、及び真菌は、片利共生生物または相利共生生物と称される。片利共生生物及び相利共生生物は、多くの点で我々の体の健康維持に役立っている。体内及び体表に生存する微生物は、共生、相利共生、及び病原性のものであり、これらはすべてまとめてマイクロバイオームと称され、それらの平衡及び関連メタボロームは個体の健康状態と密接に結び付いており、逆もまた同様である。

核酸シークエンシングが進んだことで、腸及び皮下組織に生息するマイクロバイオームが迅速かつ正確に同定及び特性解明される状況がつくられている。最適なフローラは、相乗的な様式で宿主免疫系とも相互作用することでその健康利点をさらに伝播させる。個体の関連メタボロームは、質量分析に基づく系によって特性を解明するか、またはゲノミクスに基づくメタボロームモデリング及びフラックスバランス解析を使用して特性を解明し、健康なメタボロームプロファイルの作成に使用することもできる。こうした方法論はすべて、微生物コミュニティーの複雑性の分析に使用することができる。

本発明は、生体、環境、栄養補助食品、または他の生態学的微生物異種集団の試料における微生物の多様な集団から核酸分子を抽出する方法と、処理段階を通じた核酸または抽出物の使用と、個体へのプロバイオティクスのカスタマイズを決定するための分析とを対象とする。本発明に特有の処理段階には、RNAまたはDNAの精製、断片化、分離、または消化と、下流の用途(PCR、qPCR、デジタルPCR、またはシークエンシングなど)のためのライブラリーまたは核酸の調製と、バイオインフォマティクスによるQC、フィルタリング、アライメント、またはデータ分離のための前処理と、微生物種の分類学的割り当てのためのメタゲノミクスまたはヒトゲノムバイオインフォマティクスパイプラインと、他の生物アライメント、同定、及び変異解釈とが含まれる。

したがって、1つの態様では、本発明は、解析のための試料を調製するための方法を提供する。この方法は、a)試料を、界面活性剤(例えば、SDS)とキレート剤(例えば、EDTA)とを含む第1の溶解溶液と混合すること、b)リゾチームを含む第2の溶解溶液を、段階a)の混合物に添加すること、及びc)カオトロピック剤(例えば、尿素、酢酸リチウム、塩酸グアニジン、及び同様のもの)を含む第3の溶解溶液を、段階b)の混合物に添加することを含む。前処理段階は、物理的溶解を含み得、核酸の収率をさらに最適化するために使用され得る。機械的溶解の例には、超音波処理、ビーズによる混合、及びビーズミルによるホモジナイゼーションが含まれる。

別の態様では、本発明は、対象のプロバイオティクス治療をモニターする方法を提供する。この方法は、 対象から得られた第1の試料中に存在する任意の微生物から遺伝物質を抽出することであって、当該遺伝物質が、請求項1〜11のいずれか1項に従って抽出される、前記抽出すること、 第1の試料から抽出された遺伝物質をメタゲノム解析に供すること、 対象をプロバイオティクスで治療すること、及びその後、第1の試料からの遺伝物質の前記抽出と同一の様式で、対象から得られた第2の試料中に存在する任意の微生物から遺伝物質を抽出すること、 第2の試料から抽出された遺伝物質に対してメタゲノム解析を実施すること、ならびに 第1の試料のメタゲノム解析の結果と、第2の試料のメタゲノム解析の結果とを比較すること を含む。

さらに別の態様では、本発明は、追加の化学的検査または遺伝子検査を伴うかまたは伴わずに、腸において検出されたプロバイオティクス生物からプロバイオティクススコアを計算することを含む方法を提供する。

さらに別の態様では、本発明は、マイクロバイオームに対するスコアを計算することを含む方法を提供し、該スコアは、該マイクロバイオームがディスバイオシス、中立的、または安定的であるかを評価するために使用される。

本発明は、メモリと、メモリに結合された1つまたは複数のプロセッサとを含むコンピュータシステムをさらに提供し、該1つまたは複数のプロセッサは、本発明の方法を実施するための演算を実施するように構成される。

本発明は、本発明の方法を実施するための自動化プラットフォームも提供する。

本発明は、生体、環境、栄養補助食品、または他の生態学的微生物異種集団の試料からの、微生物の多様なフローラに由来する核酸のオールインワンの抽出方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プロバイオティクス及び環境試料における微生物のそれぞれの核酸を解析することによる、微生物の組成及び相対存在量の決定において使用され得る。DNAは、精製され、下流の核酸解析(特に、複数の種/亜種のゲノムが同定されるメタゲノム解析)に使用される。

前述の一般的な説明と下記の詳細な説明とは両方共、例示及び説明にすぎず、請求される本発明の追加説明を提供することを意図する。添付の図面はいずれも、本発明の理解促進のために含められており、こうした図面は、本明細書に組み込まれ、その一部を構成し、本発明のいくつかの実施形態を示すと共に、説明と併せて本発明の原理説明に役立つものである。

ヒト(高タンパク質食、50歳超、栄養補助食品使用者)のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物を示す模式図である。

ヒト(高炭水化物食、18〜50歳、ベジタリアン食)のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物(細菌)を示す模式図である。

ヒト(高炭水化物食、18〜50歳、ベジタリアン食)のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物(ウイルス及びファージ)を示す模式図である。

ヒト(高炭水化物食、18〜50歳、ベジタリアン食)のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物(古細菌)を示す模式図である。

ヒト(高炭水化物食、18〜50歳、ベジタリアン食)のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物(真菌及び他の真核生物)を示す模式図である。

ヒト(高炭水化物食、18〜50歳、非ベジタリアン食)のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物(細菌)を示す模式図である。

ヒト(高炭水化物食、18〜50歳、非ベジタリアン食)のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物(ウイルス及びファージ)を示す模式図である。

ヒト(高炭水化物食、18〜50歳、非ベジタリアン食)のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物(古細菌)を示す模式図である。

ヒト(高炭水化物食、18〜50歳、非ベジタリアン食)のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物(真菌及び他の真核生物)を示す模式図である。

ヒト(高乳タンパク質食、0〜2歳、ベジタリアン食(非授乳))のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物(細菌)を示す模式図である。

ヒト(高乳タンパク質食、0〜2歳、ベジタリアン食(非授乳))のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物(ウイルス及びファージ)を示す模式図である。

ヒト(高乳タンパク質食、0〜2歳、ベジタリアン食(非授乳))のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物(古細菌)を示す模式図である。

ヒト(高乳タンパク質食、0〜2歳、ベジタリアン食(非授乳))のマイクロバイオームシグネチャーに高頻度で存在する生物(真菌及び他の真核生物)を示す模式図である。

ヒトのマイクロバイオームシグネチャーにおける、より低い頻度で存在する生物と、日和見病原体の同定とを示す模式図である。

ヒトのマイクロバイオームシグネチャーにおいて検出される典型的なプロバイオティクスを示す模式図である。

ヒトのマイクロバイオームシグネチャーにおいて検出される典型的なプロバイオティクスを示す模式図である。

個体における相対存在量を正常な集団のデータベース平均値に対して比較したものを示すグラフ図である。

栄養補助食品混合培地から本発明の方法を介して同定された生物を示す表である。

本発明のデータベースに保存されているさまざまな微生物の特有種の分類を示す表である。

発明の詳細な説明 本発明は、試料における1つまたは複数のタイプの微生物の多様な集団から核酸分子を抽出するための普遍的方法を提供する。微生物のタイプには、グラム陽性細菌、グラム陽性細菌胞子、グラム陰性細菌、古細菌、原生動物、蠕虫、藻類、真菌、真菌胞子、ウイルス、ウイロイド、バクテリオファージ、及びワムシが含まれる。いくつかの実施形態では、多様な集団は、同一のタイプの複数の異なる微生物(例えば、グラム陽性細菌)である。いくつかの実施形態では、多様な集団は、複数の異なるタイプの微生物(例えば、細菌(グラム陽性細菌、グラム陽性細菌胞子、及び/またはグラム陰性)、真菌、ウイルス、ならびにバクテリオファージ)である。

異なるタイプの微生物は、それ自体の遺伝物質を保護するために異なる組成及び機構を有するため、あるタイプの微生物から遺伝物質の抽出を行うことについて、同一の生体試料における別のタイプの微生物の遺伝物質も併せて抽出するという能力を損なうことなく行うことは困難であることが多い。しかしながら、本発明によれば、同一の試料における別のタイプの微生物の遺伝物質が抽出されることによって、あるタイプの微生物から得ることができる遺伝物質の量を犠牲にすることなく、試料における異なるタイプの微生物から遺伝物質を抽出することが可能になる。本発明によれば、微生物を含む試料は、生体試料、環境試料、人工的に作製された試料(例えば、実験室の試験試料もしくは対照試料、プロバイオティクス組成物もしくは栄養補助食品の試料など)、または同様のものであり得る。生体試料の例には、組織試料、血液試料、血漿試料、脳脊髄液試料、尿試料、糞便試料、消化管から得られる物質の試料、生体分泌物(例えば、精液、腟分泌物、母乳、涙、唾液など)、及び同様のものが含まれる。固体試料は、液体とされるか、または溶液と混合され得、その後、液体試料、混合物、または混合物から得られる溶液に存在する微生物の遺伝物質が、本発明に従って抽出され得る。抽出された遺伝物質は、追加の処理及び解析(精製、増幅、及びシークエンシングなど)に供され得る。

いくつかの実施形態では、抽出された遺伝物質は、メタゲノム解析に供され、その結果、例えば、その遺伝物質の抽出元である試料における1つまたは複数のタイプの微生物が同定される。追加の実施形態では、ヒト糞便試料から調製された抽出核酸物質に対して全ゲノムショットガンシークエンシングを実施することができる。調製には、有機溶媒、不純物、塩、フェノール、及び処理の妨げになる他の混入物を除去するための核酸精製反応が含まれる。追加の調製には、それぞれの試料からの核酸ライブラリーの調製が含まれ、この調製では、合成による超並列シークエンシング、ナノポア、ロングリード、及び/またはCMOS電子によるシークエンシング法などのシークエンシングプラットフォームでのシークエンシングのための試料を調製するための改変及び/または増幅にgDNAが供される。

本明細書に開示されるように、本発明の方法によれば、3つの異なる組成物に微生物を特定の順序で供することによって、同一の試料中に存在する1つまたは複数の異なるタイプの微生物から遺伝物質を良好に抽出することが可能になる。本発明による方法は、試料中に存在する任意のグラム陰性細菌を最初に溶解した後、試料中に存在する任意の酵母及び細菌の細胞壁の多糖成分を消化し、その後、第2の段階の後に無傷の任意の細胞壁をカオトロピック剤で破壊することを含む。

簡潔に記載すると、第1の段階は、試料を、界面活性剤(例えば、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS))とキレート剤(例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA))とを含む第1の溶解溶液と混合することによって、試料中に存在する任意のグラム陰性細菌を溶解することを含む。第1の溶解溶液は、1つもしくは複数の緩衝剤(例えば、トリス)、1つもしくは複数の穏和な界面活性剤(例えば、TritonX−100)、及び/または1つもしくは複数のプロテアーゼ(例えば、プロテイナーゼK)をさらに含み得る。

第1の段階の後に、混合物中に存在する任意の酵母及び細菌の細胞壁の多糖成分を消化するために、試料は、リゾチームを含む第2の溶解溶液と混合される。リゾチームは、第1の溶解溶液の活性を阻害し得るため、試料と第2の溶解溶液との接触は、試料を第1の溶解溶液で処理した後に行われることが重要である。

第2の溶解溶液での処理の後に、第2の溶解溶液によって消化されなかった任意の細胞壁を破壊するために、カオトロピック剤(例えば、尿素、酢酸リチウム、塩酸グアニジンなど)を含む第3の溶解溶液が混合物に添加される。第3の溶解溶液は、SDSなどの界面活性剤を含み得る。

いくつかの実施形態では、第1の溶解溶液と第3の溶解溶液とは両方共、1〜10%w/vの使用濃度でSDSを含む。いくつかの実施形態では、第3の溶解溶液での処理の後に、カオトロピック剤(例えば、尿素、酢酸リチウム、塩酸グアニジンなど)とプロテイナーゼKとを含む第4の溶解溶液で混合物がさらに処理される。第3の溶解溶液のカオトロピック剤が酢酸リチウムであるいくつかの実施形態では、混合物は、次に、熱ショック処理に供された後、第4の溶解溶液で処理され得る。

いくつかの実施形態では、試料が細菌及び/または真菌の胞子を含むか、またはそれを含むと疑われるのであれば、試料は、第1の溶解溶液との接触前に、胞子の細胞壁の発芽を誘導する前処理段階に供され得る。前処理段階は、試料を、穏和な界面活性剤(例えば、Tween−80)などの化学物質と混合することによる発芽誘導、または発芽を誘導する条件(例えば、温度)下での試料の培養を含み得る。いくつかの実施形態では、化学物質で発芽が誘導される場合、化学物質は、好ましくは、第1の溶解溶液、第2の溶解溶液、及び第3の溶解溶液の活性または有効性を阻害、低減、または改変しないものである。

いくつかの実施形態では、本発明による方法は、超音波処理、ビーズによる混合、ビーズミルによるホモジナイゼーション、加圧、顕微溶液化、及び同様のものを含めて、機械的方法によって物理的溶解を生じさせる1つまたは複数の機械的処理段階をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、機械的処理段階は、試料を第1の溶解溶液に供する前に実施される。

本発明による方法によって、さまざまな微生物から核酸分子を抽出することが可能であり、こうした微生物には、酵母(すなわち、サッカロマイセス(Saccharomyces)属の種)、グラム陰性細菌(例えば、アシネトバクター(Acinetobacter)属の種)、グラム陽性細菌(例えば、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属の種)、ウイルス(例えば、スクレロティニア(Sclerotinia)属の種)、胞子(バチルス(Bacillus)属の種)、蠕虫(サナダムシ(エキノコックス(Echinococcus)属の種))、原生動物(肉質虫(Sarcodina)−アメーバ(例えば、エントアメーバ(Entamoeba))、及びファージ(例えば、ラクトバチルス(Lactobacillus)のファージ)が含まれる。

下記の例は、例示を意図するが、本発明の限定を意図しない。

抽出方法 無菌の2ミリリットル(mL)のマイクロ遠心チューブに10mg〜5000mgの範囲の試料を添加した。400マイクロリットル(μL)の純粋なビーズ混合物を添加し、8000rpmで約30秒間ボルテックスにより攪拌することによってビーズ破砕を任意選択で実施することができる。しかしながら、高分子量核酸(例えば、ゲノムDNA)を得ることが望まれるのであれば、ビーズ破砕は避けることが好ましい。

第1の溶解溶液での処理段階 試料における任意のグラム陰性細菌を溶解するために、約400μLの消化緩衝液(1%w/vのSDS、25mMのトリスHCl、2.5mMのEDTA、1%のトリデント(trident)−x100、pH8)及び約20μLのプロテイナーゼKを試料に添加することによって試料を第1の溶解溶液に供し、穏やかに混合した。その後、混合物を55℃で約30分間インキュベートした。

第2の溶解溶液での処理段階 試料における任意のグラム陽性細菌を溶解するために、グルコシドヒドロラーゼ(glucoside hydrolase)(「リゾチーム」)を含む第2の溶解溶液を、第1の溶解溶液での処理段階から得られた混合物に添加し、リゾチームの最終濃度を1mg/mLとし、pHを約8.0とした。適切なグルコシドヒドロラーゼは、さまざまな動物の卵白、涙、または粘液もしくは唾液を含めて、さまざまな供給源から得ることができる。その後、混合物を37℃で約1〜24時間インキュベートした。

第3の溶解溶液での処理段階 試料中に存在する任意の真菌及び/または酵母細胞を溶解するために、蒸留無菌H2Oに酢酸リチウム(1M)及びSDS(5%w/v)を含む第3の溶解溶液を添加することで、第2の溶解溶液での処理段階から得られた混合物が約1:5で希釈された溶液を得た。処理した混合物を70℃で15分間インキュベートした後、95℃で1分間熱ショックを与え、その後、22℃の水浴に置くことによって室温とした。

第2の溶解溶液での処理段階及び第3の溶解溶液での処理段階は、バクテリオファージ及びウイルスの外皮の溶解に十分であるため、試料中に存在し得るバクテリオファージ及びウイルスからの遺伝物質の抽出に追加の段階は必要ではない。

核酸の精製 溶解した微生物から抽出された遺伝物質(すなわち、第1の溶解溶液での処理段階、第2の溶解溶液での処理段階、及び第3の溶解溶液での処理段階に供した後の混合物中に存在する核酸分子)は、次に、2つのマイクロ遠心チューブに混合物を分割添加することによってDNA精製及びRNA精製に供した。DNAは、約20μLのRNAseAを添加し、室温で5分間インキュベートすることによって1つのチューブから抽出した。この混合物を生体高分子組織ホモジナイザーカラムに通した。ビーズ破砕を既に実施したのであれば、この混合物を組織ホモジナイザーカラムに供することは避けることが好ましい。

その後、溶出液を1000gで5分間遠心分離した。約400μLのDNA溶解溶液(グアニジンHCl、トリス−EDTA、及び70%のEtOH)ならびに約20μLのプロテイナーゼKで上清を処理し、混合した後、55℃で10分間インキュベートした。その後、−22℃のEtOHを添加し、混合物を反転させることよって混合した。この混合物は、当該技術分野において知られる1つまたは複数の追加のDNA抽出方法及びDNA精製方法に供することができる。

RNAは、混合物を生体高分子組織ホモジナイザーカラムに通すことによって第2のマイクロ遠心チューブから抽出した。ビーズ破砕を既に実施したのであれば、この場合も先の場合と同様に、この混合物を組織ホモジナイザーカラムに供することは避けることが好ましい。その後、溶出液を1000gで5分間遠心分離した。約40μLのDNaseI(1U)を含む25mMのMgCl2溶液で上清を処理した後、37℃で約15分間インキュベートした。その後、この混合物を酸性チオシアン酸グアニジン−フェノール−クロロホルムによる抽出に供した。この混合物は、当該技術分野において知られる1つまたは複数の追加のRNA抽出方法及びRNA精製方法に供することができる。

いくつかの実施形態では、RNA分子の定量的な発現が望まれる場合、RNA核酸分子を確実に遊離させ、その分解を確実に制限するために、RNA安定化緩衝液及びビーズ破砕を使用することが好ましい。

いくつかの実施形態では、高分子量の核酸分子の抽出が望まれる場合、ビーズ破砕及び組織ホモジナイゼーションカラムは避けられ、シリカカラムに基づく抽出の代わりに、フェノール−クロロホルム−アルコールによる抽出が実施される。

メタゲノム解析 抽出及び精製した遺伝物質を、Illuminaインデックスアダプターを使用するシークエンシングに向けて調製し、そのサイズ及び量を調べた。インプット量が50ng未満のDNAについてはいずれも、1〜20サイクルの間で低サイクル数のPCRを実施した。あるいは、50ng以上の核酸については、PCRを使用しないライブラリー調製方法を利用することができる。Qiagen Gel Purification Kit(商標)(Qiagen,Frederick,MD)を使用し、ゲルによる精製を実施した。Qubit(商標)2.0蛍光光度計(Life Technologies,Carlsbad,CA)を使用し、精製PCR産物を定量化した。試料を等モル量で合わせた。ライブラリープールは、Fragment Analyzer(商標)CE(Advanced Analytical Technologies Inc.,Ames IA)を使用してサイズを検証し、Qubit(商標)高感度dsDNAキット(Life Technologies,Carlsbad,CA)を使用して定量化した。PhiX(商標)V3ライブラリー対照(Illumina,San Diego CA)を1%〜10%となるように添加して希釈した後、プールの変性処理を等体積の0.1NのNaOHにおいて5分間実施し、その後、IlluminaのHT1緩衝液においてさらに希釈した。変性したPhiX添加プールを、Illuminaシークエンシングプライマーと共にIllumina Next Generation(商標)シークエンサーにロードし、50〜550塩基のペアエンドリードまたはシングルリードが得られるように設定した。

短いインサートを使用する方法については、1000以上の範囲のシークエンシングリードをこの方法に使用することができる。長いインサートを使用する方法(Pac Bio(商標)、Nanopore(商標)、または他の次世代遺伝子シークエンシング法など)では、1000未満のシークエンシングリードを使用することができる。分類の割り当てを行う前に、バイオインフォマティクスによるクオリティフィルタリングを実施した。生のシークエンシングファイルのクオリティトリミングには、シークエンシングアダプターまたはインデックスの除去と、クオリティスコア(Q20>)、末端の塩基対、またはシグナル強度に基づくリードの3’末端または5’末端のトリミングと、クオリティスコア、GC含量、またはアライメントされない塩基対に基づくリードの除去と、設定数の塩基対での重複リードの除去とが含まれ得る。処理されたシークエンシングファイルのアライメントは、refseq(商標)、Greengeens(商標)、HMP(商標)、NCBI(商標)、PATRIC(商標)、または他の公的/私的なデータリポジトリもしくは社内のデータセットに由来する配列からなるカスタム微生物ゲノムデータベースを使用して実施した。このデータベースは、全ゲノムアライメントスキャフォールド、k merの断片のアライメント、またはメタゲノミクス及びバイオインフォマティクスの分野において実施される他のスキームとして使用することができる。データベースゲノムと一致するシークエンシングリード/断片の数に基づき、発明者らは、生物に共通または特有の分類学的独自性(taxonomic identity)を割り当てている。この識別子は、バーコード、ヌクレオチド配列、または何らかの他の計算的なタグ(分類群内の生物もしくは株とシークエンシングリードが一致することと関連することになる)であり得る。識別子によっては、高次元のものとなり、こうした識別子によって、生物のドメイン、界、門、綱、目、科、または属が同定されることになる。

本発明によって、種内の株の最低次元で生物を同定することができる。

いくつかの実施形態では、本発明は、発明者らのデータベース(図10)に含まれる1種または複数種の細菌の同定及び/または解析を含む。いくつかの選択的な例は、バチルス・クラウジイ(Bacillus clausii)、ビフィドバクテリウム・アニマリス(Bifidobacterium animalis)、Pediococcus acidilactici、アシネトバクター・インディカス(Acinetobacter indicus)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、アシネトバクター(Acinetobacter)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)の亜種であるインファンティス(infantis)、エンテロコッカス・ヒラエ(Enterococcus hirae)、ラクトバチルス・デルブリュッキ(Lactobacillus delbrueckii)の亜種であるブルガリクス(bulgaricus)、エンテロコッカス(Enterococcus)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、シュードモナス・スツッツェリ(Pseudomonas stutzeri)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、クレブシエラ(Klebsiella)、及びエンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)の株である。

いくつかの実施形態では、本発明は、発明者らのデータベース(図10)に含まれる1種または複数種の酵母の同定及び/または解析を含む。いくつかの選択的な例は、サッカロマイセス属の種であるブラウディ(Boulardii)、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ(Saccharomyces kudriavzevii)、サッカロマイセス・パストリアヌス(Saccharomyces pastorianus)、及びサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である。

いくつかの実施形態では、本発明は、発明者らのデータベース(図10)に含まれる1種または複数種のファージまたはウイルスの同定及び/または解析を含む。いくつかの選択的な例は、バチルスのファージであるφ29、腸内細菌(Enterobacteria)のファージであるHK022、ラクトバチルスのファージであるA2、エシェリキア(Escherichia)のファージであるHK639、ファージcdtI、スクレロティニア・スクレロティオラム・パルティティウイルス(Sclerotinia sclerotiorum partitivirus)Sのセグメント2、バークホルデリア(Burkholderia)のファージであるBcepMu、ラクトコッカスのプロファージであるbIL311、エンテロコッカスのファージであるφFL4A、及びストレプトコッカス(Streptococcus)のファージであるSM1である。

将来的にデータベースが改善されることで、この方法によって検出することができる生物が増加するまたは洗練されることになる。

プロバイオティクス治療のモニタリング いくつかの実施形態では、本発明は、対象におけるプロバイオティクス治療をモニターするのに使用され得る。例えば、プロバイオティクスでの治療の前に、対象の消化管から得られる試料が採取され得、そこに存在する微生物の遺伝物質が、本明細書に開示されるように抽出され、メタゲノム解析に供される。その後、所与のプロバイオティクスでの治療の間及び/または後に、対象の消化管から第2の試料が採取され得、第2の試料中に存在する微生物の遺伝物質が、本明細書に開示されるように抽出され、メタゲノム解析に供され、その結果が、第1の試料のメタゲノム解析の結果と比較される。その後、比較結果に基づき、対象の腸において微生物の所望の集団が得られるように、対象のプロバイオティクス治療が修正され得る。例えば、対象の腸においてその量が増加することが望まれる微生物を含むプロバイオティクスが対象に投与され得る。

いくつかの実施形態では、微生物の糞便コミュニティーのメタボロームを決定するために、糞便試料が混合または培養され得る。その後、個体に利益を与えると想定されるプロバイオティクス株を決定するために、メタボロームプロファイルを使用することができる。メタボロームプロファイルの例には、エネルギー代謝、栄養利用、インスリン抵抗性、脂肪症、脂質異常症、炎症、短鎖脂肪酸、有機酸、サイトカイン、神経伝達化学物質、または表現型に影響を与えるものが含まれると共に、他のメタボロームマーカーが含まれ得る。

マイクロバイオームのスクリーニング及びプロバイオティクスの選択 本発明は、さまざまな市販のプロバイオティクスの微生物含量の決定に使用することに成功している。さらに、本発明の方法は、さまざまなプロバイオティクスの微生物含量、及び対象の腸におけるマイクロバイオーム含量の決定に使用される。対象の腸におけるマイクロバイオーム含量及びそれに与えるいずれかの所望の変化に基づいて、対象のマイクロバイオームの健康において増加及び/または維持されることが望まれる微生物を含む1種または複数種のプロバイオティクスが選択され得る。マイクロバイオームが、そのマイクロバイオータ、ならびに細菌、真菌、ウイルス、ファージ、及び寄生虫由来のそこに含まれる生物の全体像を示す場合、例えば、本明細書に記載の方法を使用することで、対象の腸マイクロバイオームは、Aを25%含み、Bを75%含むと決定され、プロバイオティクス1は、Aを75%含み、Bを25%含むと決定され、プロバイオティクス2は、Aを25%含み、Bを75%含むと決定される。対象の腸マイクロバイオームの維持が望まれるのであれば、対象への投与にはプロバイオティクス2が選択されることになる。しかしながら、対象の腸におけるAの量とBの量とを50/50にすることが望まれるのであれば、プロバイオティクス1とプロバイオティクス2との両方が選択され、対象に投与され得る。あるいは、プロバイオティクス1が選択され、対象の腸におけるAの量とBの量とが50/50に達するまで対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、対象に投与するためのプロバイオティクス製剤が特別調製され得、こうしたプロバイオティクス製剤は、例えば、等量、異なる量、または多様な量のA及びBまたは他のプロバイオティクス株を含む。個体の腸に存在する微生物の相対存在量を利用する計算モデルは、プロバイオティクスに含める微生物のタイプ、用量、及び混合物の決定に役立つことになる。例えば、一般的な集団または以前のマイクロバイオーム解析と比較して生物Aが減少しているか、または存在しないと決定されるのであれば、生物Aの濃度を増加させると想定されるプロバイオティクスまたはプレバイオティクスを発明者らは提供することになる。このプロバイオティクスまたはプロバイオティクスは、生物Aそのものであるか、または生物Aの増殖を支援すると想定される別の生物であり得る。用量は、個体における生物の相対存在量、プレバイオティクス/プロバイオティクスの能力特性(増殖率、適合性、受容体もしくは受容体密度、遺伝子、もしくは発現パターン、またはメタボローム産物など)を考慮して投与されることになる。

特別調製されるプロバイオティクスは、個体の腸/糞便試料から検出される相対存在量に基づいて製剤化される量が異なり得る。こうした製剤は、健康状態へとマイクロバイオームを調節することを対象としている。マイクロバイオームの健康状態は、現存する私的及び公的な集約データベースを使用することによって決定され、こうした集約データベースは、metaHIT(商標)、Human Microbiome Project(商標)、American Gut Project(商標)、及び同様のものなどである。血液バイオマーカー検査の視点から個体が既知の問題を有さず、良好な健康状態にあり、その後、個体の完全なマイクロバイオームプロファイルが完成したときに、健康状態が個別に決定されることもあり得る。その個体について、1つまたはいくつかのマイクロバイオームシグネチャーが完成した後に、見出された微生物のいくつか/すべての平均を理解することができ、その平均からの変動を評価することで、その個体がディスバイオシスの状態にあるかを決定することができる。マイクロバイオームプロファイルは、群に集約することができ、その後、こうした群には、バイオインフォマティクスによる迅速な割り当てを行うためのバーコードが割り当てられる。群は、試料の採取元である個体と関連する1つまたは複数の表現型情報、診断情報、または人口統計情報によって作製することができる。特有の群は、統計モデルを使用することによって別の群から決定することができ、こうした統計モデルは、直線距離計算、多様性値、分類指標(C4.5デシジョンツリーなど)、またはHuman Microbiome ProjectもしくはAmerican Gut Projectによって定義される「正常」などの既知の総集団と比較する主成分分析などである。

したがって、いくつかの実施形態では、所与の対象の腸マイクロバイオームをスクリーニングした後、対象の腸マイクロバイオームに基づいてその所与の対象に対するプロバイオティクスレジメンを特別調製するために本発明が使用され得る。

ディスバイオシスの治療 いくつかの実施形態では、負の副作用、障害、及び/または疾患を誘起または誘起し得るものへと、バランスのとれたマイクロバイオームから対象のマイクロバイオータをシフトさせた事象の後に、対象の腸フローラ及び/またはファウナをホメオスタシスへと回復させるために本発明が使用され得る。健康状態には、限定はされないが、ざ瘡及びアレルギーから、胃腸の不快感、肥満、及びがんまで、さまざまな状態が含まれ得る。そのようなディスバイオシスの1つの例は、肥満を発症している場合である。対象の腸における微生物のいくつかの株は、対象が被る肥満または体重の管理問題と関連することが示されている。例えば、Ley,et al.(2005)PNAS USA 102:11070−11075を参照のこと。例えば、肥満の動物及びヒト対象では、バクテロイデス(Bacterides)門とフィルミクテス(Firmicutes)門との微生物比が代謝能力において重要な役割を担っている。例えば、Turnbaugh,et al.(2012)PLOS ONE 7:e41079を参照のこと。肥満及び体重の管理問題と関連することが知られるいくつかの腸微生物には、バクテロイデス・ユニフォルミス(Bacteroides uniformis)、バクテロイデス・ペクチノフィラス(Bacteroides pectinophilus)、ロゼブリア・イヌリニボランス(Roseburia inulinivorans)、メタノブレビバクター・スミシイ(Methanobrevibacter smithii)、及びビフィドバクテリウム・アニマリスが含まれる。

したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して対象の腸における第1の所与の微生物と第2の所与の微生物との比が決定された後、その比が望ましくないか、または異常であるならば、所望の比へとその比を修正するための治療が対象に施される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して対象の腸におけるすべての微生物の総量と比較したときの、対象の腸における第1の所与の微生物の量が決定された後、第1の所与の微生物の相対量が望ましくないか、または異常であるならば、所望の量にその量を修正するための治療が対象に施される。そのような治療には、対象の腸においてその量が増加することが望まれる1種または複数種の微生物を含むプロバイオティクスを対象に投与すること、対象の腸においてその量が減少することが望まれる1種または複数種の微生物を死滅またはその増殖を遅延させるための抗微生物剤(例えば、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤など)を対象に投与すること、健康な腸マイクロバイオームの増殖または維持を支援する食品及び/または栄養補助食品(例えば、プレバイオティクス、マグネシウム、魚油、L−グルタミン、ビタミンDなど)を対象に投与すること、ならびに同様のものが含まれる。例えば、肥満の対象の腸マイクロバイオータは、ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)の存在量が高まっており、ビフィドバクテリウム・アニマリス及びメタノブレビバクター・スミシイは枯渇していることがMillion,et al.((2005)Int.J.Obes.36:817−825)によって示されている。したがって、本明細書に記載の方法を使用して対象の腸におけるラクトバチルス・ロイテリ、ビフィドバクテリウム・アニマリス、及びメタノブレビバクター・スミシイの量を決定し、その量が、肥満と関連する腸マイクロバイオータに典型的なものであるか、またはそれを示すものであることが明らかになった後に、ビフィドバクテリウム・アニマリス及びメタノブレビバクター・スミシイを含んでおり、ラクトバチルス・ロイテリの含量が相対的に少量〜皆無のプロバイオティクスが対象に投与され得る。

対象者のマイクロバイオームのスコア付け マイクロバイオームシグネチャー全体のスコア付けでは、表1に示されるものと類似のデシジョンツリー、アルゴリズム、人工知能、スクリプト、または論理ツリーが使用される。このシステムによれば、使用者が自身の腸マイクロバイオームがどのくらい健康であり、見つかった少数または多くの課題に対して使用者が対応策を講じる必要があるのかを理解することに役立つスコアを得ることが可能になるであろう。課題には、限定はされないが、既知の病原性生物の同定、日和見病原体(機会を得ると病原性作用を誘起することが知られる不顕性生物)の数及び同定、良好な微生物環境(その組成は除く)のための支援の欠如、または重要な株の欠如、上位10以内に見られる特有の生物及びもしくは存在率が0.1%を超える生物の全体的多様性及び数が含まれ得る。

試料解析を集約したものから多様性カットオフ値を決定した。カットオフ値は、相対存在量xにおいて決定される。例えば、x=0.1%であるならば、352の特有の生物が平均健康プロファイルを構成する。その後、この数を中心として標準偏差を適用し、ガウス分布及び曲線下パーセンタイル解析を使用することで、発明者らは、発明者らのデータベース平均に由来する平均多様性数にどのくらい近いかをスコア付けすることができる。対象者における多様性数が少なくなればなるほど、平均値から離れれば離れるほど、対象者のマイクロバイオームに付けられることになるスコアが低くなる。数が多くなればなるほど、対象者における多様性が豊かであればあるほど、マイクロバイオームに付けられるスコアが高くなる。このタイプのスコア付けカテゴリーをプロバイオティクススコアと併せることで、対象者向けに数的及び視覚的に計量されたスコアが決定されることになり、その結果、その対象者のマイクロバイオームがどのくらい健康であるかが分かる。図的に視覚化する例が以下に示される。この場合、低は、マイクロバイオームのクオリティが低いことに相当し、高は、マイクロバイオームのクオリティ及びスコアが高いことに相当する。低(100中>30)、中(100中>65)、高(100中65以上)。

以下の表1には、スコア付け及びプロバイオティクスの式アルゴリズムの例が示される。表1は、デシジョンツリー、アルゴリズム、人工知能、スクリプト、または論理ツリーと表現することができる。そのようなデシジョンツリー、アルゴリズム、人工知能、スクリプト、または論理ツリーの機能は、検出されるプロバイオティクスと関連付けて個体のマイクロバイオームの健康のスコアを出力し、プロバイオティクスの使用向けに製剤化及び投薬の推奨事項を与えるであろう。

以下の表2には、微生物の分類先となり得る可能性のあるカテゴリーのリストの例が示される。

(表1)プロバイオティクスのスコア付け及び製剤化のためのデシジョンテーブルの例。プロバイオティクス株データベース、メタゲノム解析データベース、及び文献キュレーションデータベースの利用を含む。

(表2)群の作製元となる、可能性のあるカテゴリー

本出願において使用される科学用語及び専門用語はすべて、別段の記載がない限り、当該技術分野において一般に使用される意味を有する。

本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒト及び非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物を含み、こうした脊椎動物は、例えば、哺乳類及び非哺乳類(非ヒト霊長類、ウマ、ヒツジ、イヌ、雌ウシ、ブタ、ニワトリ、ならびに獣医学的対象及び試験動物など)である。

単数の使用は、別段の具体的な記載がない限り、複数を含み得る。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」という単数形は、文脈上別段の明確な記載がない限り、複数の参照対象を含み得る。「または」の使用は、別段の記載がない限り、「及び/または」を意味し得る。本明細書で使用される「及び/または」は、「及び」または「または」を意味する。例えば、「A及び/またはB」は、「A、B、またはAとBとの両方」を意味し、「A、B、C、及び/またはD」は、「A、B、C、D、またはそれらの組み合わせ」を意味し、当該「それらの組み合わせ」は、A、B、C、及びDの任意の部分集合を意味し、こうした部分集合は、例えば、メンバーが1つの部分集合(例えば、AもしくはBもしくはCもしくはD)、メンバーが2つの部分集合(例えば、A及びB、A及びCなど)、またはメンバーが3つの部分集合(例えば、A、B、及びC、もしくはA、B、及びDなど)、または4つすべてのメンバー(例えば、A、B、C、及びD)である。

本明細書で使用される「試料」及び「生体試料」という用語は、本発明によって提供される方法に適した任意の試料を指す。細胞の試料は、任意の試料であり得、こうした試料には、例えば、非侵襲的手法または侵襲的手法(対象の生検など)によって得られる腸または糞便の試料が含まれる。1つの実施形態では、「試料」という用語は、対象の糞便物質または腸組織から得られる任意の調製物を指す。例えば、本明細書に記載の非侵襲的方法を使用して得られる細胞の試料を、本発明の方法のための核酸分子またはタンパク質を単離するために使用することができる。

いくつかの実施形態では、解析は、任意の核酸を用いるものであり得、こうした核酸には、DNA、RNA、cDNA、miRNA、mtDNA、一本鎖、または二本鎖が含まれる。この核酸は、任意の長さのものであり得、こうした長さは、最短で約5bpのオリゴから最長でメガ塩基対またはそれを超える長さにさえ至るものである。本明細書で使用される「核酸分子」という用語は、DNA、RNA、一本鎖、二本鎖、または三本鎖、及びそれらの任意の化学的改変物を意味する。事実上任意の核酸改変が企図される。「核酸分子」は、ほとんど任意の長さのものであり得、こうした長さは、10、20、30、40、50、60、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000、100,000、150,000、200,000、500,000、1,000,000、1,500,000、2,000,000、5,000,000、またはそれを超える塩基数の長さであり、最長で全長の染色体DNA分子に達する。遺伝子の発現を解析する方法については、試料から単離される核酸は、典型的には、RNAである。

一本鎖核酸分子は、グアニン(G)がシトシン(C)と塩基対を形成し、アデニン(A)がチミン(T)またはウリジン(U)と塩基対を形成する能力に基づき、もう一方の核酸分子のすべてまたは一部と塩基対を形成(ハイブリダイズ)することで二重らせん(二本鎖核酸分子)を形成することができるとき、別の一本鎖核酸分子に「相補的」である。例えば、5’−TATAC−3’というヌクレオチド配列は、5’−GTATA−3’というヌクレオチド配列に相補的である。

本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」は、塩基対形成を介して核酸鎖が相補鎖と結合するプロセスを指す。ハイブリダイゼーション反応は、感受性かつ選択的であり得、その結果、特定の目的配列の存在濃度が低い試料においてさえ、その目的配列を同定することができる。インビトロの状況では、適切にストリンジェントな条件は、例えば、プレハイブリダイゼーション溶液及びハイブリダイゼーション溶液における塩もしくはホルムアミドの濃度によって定義するか、またはハイブリダイゼーション温度によって定義することができ、こうした条件は、当該技術分野においてよく知られている。具体的には、ストリンジェンシーは、塩濃度を減らすか、ホルムアミド濃度を増やすか、またはハイブリダイゼーション温度を上げることによって増加させることができる。例えば、高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションは、約37℃〜42℃の約50%ホルムアミドにおいて生じ得る。ハイブリダイゼーションは、約30℃〜35℃の約35%〜25%のホルムアミドにおけるストリンジェンシー低減条件下で生じ得る。具体的には、ハイブリダイゼーションは、50%のホルムアミド、5XのSSPE、0.3%のSDS、及び剪断され、かつ変性した200mg/mlのサケ精子DNAにおける42℃の高ストリンジェンシー条件下で生じ得る。ハイブリダイゼーションは、上記のとおりであるが、温度を35℃に下げた35%ホルムアミドにおけるストリンジェンシー低減条件下で生じ得る。特定レベルのストリンジェンシーに対応する温度範囲は、目的核酸のプリンとピリミジンとの比を計算し、それに沿って温度を調整することによってさらに狭めることができる。上記の範囲及び条件のバリエーションは、当該技術分野においてよく知られている。

本明細書で使用される「マイクロバイオーム」という用語は、微生物を指し、こうした微生物には、対象の腸に生息する細菌、ウイルス、及び真菌、古細菌、原生動物、アメーバ、または蠕虫が含まれる。

本明細書で使用される微生物(microbial)、微生物(microbe)、または微生物(microorganism)という用語は、任意の微細生物を指し、こうした微細生物には、原核生物もしくは真核生物、胞子、細菌、古細菌、真菌、ウイルス、または原生生物、単細胞、もしくは多細胞が含まれる。

本発明は、機能性要素及びさまざまな処理段階に関して部分的に記載されている。そのような機能性要素分及び処理段階は、特定の機能が実施され、さまざまな結果が達成されるように構成される任意の数の要素、操作、及び手法によって実現され得る。例えば、本発明では、さまざまな生体試料、バイオマーカー、要素、材料、コンピュータ、データソース、記憶システム及び記憶媒体、情報収集手法及び情報収集処理、データ処理基準、統計解析、回帰分析、ならびに同様のものが用いられ得、こうしたものは、さまざまな機能を担い得る。さらに、本発明は、医療診断の文脈で記載されているが、本発明は、任意の数の用途、環境、及びデータ解析と併せて実施され得る。本明細書に記載のシステムは、単に、本発明の用途例にすぎない。

本発明のさまざまな態様によるデータ解析方法は、任意の適切な様式で実行され得、例えば、コンピュータシステムで動作するコンピュータプログラムを使用して実行される。本発明のさまざまな態様による例示の解析システムは、コンピュータシステムと連動して実行され得、こうしたコンピュータシステムは、例えば、プロセッサ及びランダムアクセスメモリを備えた従来のコンピュータシステム(リモートアクセスが可能なアプリケーションサーバー、ネットワークサーバー、パーソナルコンピュータ、またはワークステーションなど)である。コンピュータシステムは、追加のメモリデバイスまたは情報記憶システム(大容量記憶システムなど)、及びユーザーインターフェース(例えば、従来のモニター、キーボード、及び追跡デバイス)も適切に備える。しかしながら、コンピュータシステムは、任意の適切なコンピュータシステム及び関連機器を備え得るものであり、任意の適切な様式で構成され得る。1つの実施形態では、コンピュータシステムは、スタンドアローンのシステムを備える。別の実施形態では、コンピュータシステムは、サーバー及びデータベースを含む、コンピュータのネットワークの一部である。

遺伝情報の受容、処理、及び解析に必要なソフトウェアは、単一のデバイスで実行されるか、または複数のデバイスで実行され得る。ソフトウェアは、ネットワークを介してアクセス可能であり得、その結果、情報の記憶及び処理は、使用者に対してリモートで実行される。本発明のさまざまな態様による解析システム及びそのさまざまな要素は、データの収集、処理、解析、報告、及び/または診断などのマイクロバイオーム解析が容易になるように機能及び操作を提供する。本解析システムは、マイクロバイオーム及び試料に関する情報を維持し、解析及び/または診断を容易にし、例えば、本実施形態では、コンピュータシステムは、コンピュータプログラムを実行し、このコンピュータプログラムは、マイクロバイオームに関する情報を受容、記憶、検索、解析、及び報告し得る。コンピュータプログラムは、さまざまな機能または操作を実施する複数のモジュールを備え得るものであり、こうしたモジュールは、生データの処理及び補足データの収集のための処理モジュール、ならびに生データ及び補足データを解析するための解析モジュールなどであり、こうしたモジュールによって、モデル及び/または予測が生成される。

解析システムは、さまざまな追加のモジュール及び/または個々の機能も提供し得る。例えば、解析システムは、報告機能も備えることで、例えば、処理機能及び解析機能に関する情報を提供し得る。解析システムは、アクセス制御及び他の管制機能の実施などの、さまざまな管制機能及び管理機能も提供し得る。

本発明の開示の理解または完成に必要な範囲で、本明細書で言及される刊行物、特許、及び特許出願はすべて、それぞれが個別にそのように組み込まれるのと同程度にそこでの参照によって明確に組み込まれる。

本発明は、上記の例に関して説明されているが、改変及び変形が本発明の趣旨及び範囲に包含されると理解されることになる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲のみによって限定される。