来自乳汁的抗原特异性抗体、其制备方法以及应用专利检索-泌乳母牛畜牧业专利检索查询-专利查询网

来自乳汁的抗原特异性抗体、其制备方法以及应用

阅读：460发布：2020-06-18

专利汇可以提供来自乳汁的抗原特异性抗体、其制备方法以及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及用于从来自非人哺乳动物的乳汁获得抗原特异性抗体的方式和方法，其中在收集所述乳汁以前所述非人哺乳动物没有用所述抗原加以免疫。本发明发现来自非人哺乳动物的抗原特异性抗体可以穿过个体肠道的粘膜侧。本发明提供了通过抗原特异性非人哺乳动物抗体来治疗疾病的新方式和方法。此外，还提供了用于口服的制剂，其包括反刍动物的所述抗原特异性抗体。，下面是来自乳汁的抗原特异性抗体、其制备方法以及应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于由乳汁获得抗原特异性抗体的方法，其特征在于，所述乳汁来自在收集所述乳汁以前没有用所述抗原进行免疫的非人哺乳动物。
2.根据权利要求1所述的方法，包括从泌乳的哺乳动物收集乳汁，并从所述乳汁收集所述抗体。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，在收集所述抗体以前，汇集相同物种的至少10个个体的哺乳动物乳汁。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，在收集所述抗体以前，所述乳汁经受处理步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述乳汁处理步骤包括分离步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述分离步骤包括将所述乳汁分离成至少两部分，并且其中至少一个部分是富含蛋白质部分。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其中，所述处理步骤是(半)连续过程的一部分。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，乳清部分由所述乳汁制备，而所述抗体收集自所述乳清。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，基于另外的标准来选择所述哺乳动物，用于收集所述乳汁。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述另外的标准包括所述乳汁的抗体含量、所收集的乳汁中的抗体特异性、通过所述哺乳动物进行的食物或食物补充物的摄取、针对所述哺乳动物的病原体的抗原接种疫苗、或所述标准中的两种或更多种的组合。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述哺乳动物是反刍动物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述反刍动物是母牛、山羊或绵羊。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中，所述抗体是IgG1、IgA、IgG2或IgM抗体。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述抗原是变应性抗原、病毒抗原、细菌抗原、或它们的组合。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，富含抗体的部分收集自所述乳汁。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，进一步包括专门收集IgG1、IgA或它们的组合的步骤。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，进一步包括用于获得富含所述抗原特异性抗体的抗体部分的亲和纯化步骤。
18.一种通过根据权利要求1-17中任一项所述的方法获得的抗原特异性抗体，优选多克隆抗原特异性抗体。
19.一种包括根据权利要求18所述的抗体的组合物，其中，所述抗原特异性抗体的含量小于所述组合物中的抗体总量的0.1％。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中，至少15％的所述抗体是IgG1、IgA或它们的组合。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的组合物，其富含IgG1。
22.一种药物组合物，包括根据权利要求18所述的抗体、或根据权利要求19-21中任一项所述的组合物。
23.根据权利要求18所述的抗体或根据权利要求19-21中任一项所述的组合物在用于制备药物中的应用。
24.根据权利要求18所述的抗体或根据权利要求19-21中任一项所述的组合物在用于制备口服的药物中的应用。
25.一种用于口服的制剂，包括根据权利要求18所述的抗体或根据权利要求19-21中任一项所述的组合物。
26.根据权利要求25所述的制剂，包括递送载体，所述递送载体包括所述抗体或组合物。
27.根据权利要求26所述的制剂，其中，所述递送载体能够从所述载体靶向肠道释放所述抗体。
28.一种新生儿或婴儿配方，包括根据权利要求25-27中任一项所述的制剂。
29.一种新生儿或婴儿配方，包括根据权利要求18所述的抗体或根据权利要求19-21中任一项所述的组合物。
30.一种新生儿或婴儿配方，其中，所述配方的蛋白含量的至少0.1％是抗体蛋白。
31.根据权利要求30所述的新生儿或婴儿配方，其中，所述配方的蛋白含量的至少
0.1％由根据权利要求18所述的抗体或根据权利要求19-21中任一项所述的组合物组成。
32.一种用于将反刍动物的抗体、优选反刍动物的抗原特异性抗体递送至个体肠道的粘膜侧的方法，包括提供包括反刍动物的所述抗体的用于口服的制剂以及将所述制剂经口服给予所述个体。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述用于口服的制剂包括包含所述优选为抗原特异性抗体的递送载体，其中所述递送载体能够从所述载体靶向肠道释放所述抗体。
34.根据权利要求32或权利要求33所述的方法，其中，所述抗体由泌乳反刍动物的乳汁获得。
35.根据权利要求32-34中任一项所述的方法，其中，所述抗体对于变应性抗原是特异的。
36.根据权利要求32-35中任一项所述的方法，其中，所述个体患有自身免疫病或相反免疫系统过度活跃。
37.根据权利要求32-36中任一项所述的方法，其中，所述个体患有炎性肠病。
38.根据权利要求36所述的方法，其中，所述抗体对于与所述自身免疫病有关的微生物的抗原是特异性的。
39.根据权利要求36所述的方法，其中，所述抗体对于由免疫细胞分泌的因子是特异性的。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，所述抗体是抗TNF-α抗体或抗IL-23抗体。
41.根据权利要求32-40中任一项所述的方法，其中，所述个体为至少1岁。
42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述个体为至少两岁。
43.根据权利要求32-42中任一项所述的方法，其中，所述抗体为IgG1型、IgA型或它们的组合。
44.根据权利要求32-43中任一项所述的方法，其中，所述抗体经由胃肠道被递送至血流。
45.根据权利要求32-36、38-44中任一项所述的方法，用于将所述抗体递送至肺。
46.根据权利要求45所述的方法，其中，所述抗体对于病毒或细菌病原体的抗原或变态反应的抗原是特异性的。
47.根据权利要求46所述的方法，其中，所述抗体对于变态反应有关的草或树木花粉抗原、或在人类中引起变应性反应的任何其它吸入性变应原是特异性的。
48.根据权利要求46所述的方法，其中，所述抗体对于对所述肺具有向性的微生物或病毒是特异性的。
49.根据权利要求48所述的方法，其中，所述抗体对于肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、粘膜炎莫拉氏菌、肺炎衣原体、肺炎支原体、嗜肺军团菌、A型流感病毒、B型流感病毒、呼吸道合胞病毒或腺病毒是特异性的。
50.反刍动物的抗原特异性抗体在用于制备系统治疗非反刍动物体内的疾病的药物中的应用。
51.根据权利要求50所述的应用，其中，所述非反刍动物是人。
52.根据权利要求50或权利要求51所述的应用，其中，所述药物是用于口服给药的。
53.根据权利要求18-21中任一项所述的组合物，进一步包括益生元。
54.根据权利要求53所述的组合物在用于增强所述抗体从肠上皮细胞的顶侧到基底外侧的转运中的应用。

说明书全文

来自乳汁的抗原特异性抗体、其制备方法以及应用

[0001] 本发明涉及抗体领域。尤其是，本发明涉及来自于乳汁的抗原特异性抗体、其制备方法以及应用。这样的应用涉及(伴随)例如婴儿营养、诊断和医疗用途。

[0002] 存在多种通过提供乳制品来增强人体免疫力的方式。母乳和牛奶包含特异于各种潜在的病原微生物、病毒以及其它抗原的抗体。这些抗体可以保护还未能建立起有效的免疫反应的婴儿免受母体已经暴露于其中的传染性病原体。IgA是人乳中的主要抗体，而IgG1是在牛奶中发现的主要抗体同种型。通常已知，人乳中的IgA在肠中发挥其作用，而在出生之前母亲经由胎盘将IgG转移给婴儿。大多数反刍动物、猪以及啮齿动物经由肠上皮将乳汁中存在的部分IgG主动运输到血液中。因此，这些动物，与人类一样，在哺乳期雌性的乳汁中也具有抗体，尤其在出生后的初期乳汁(first milk)(初乳)中，虽然与人乳中的抗体相比，这些抗体在新生儿体内的实际功能具有另外的性能。

[0003] 由于反刍动物产生包含抗体的乳汁，所以乳汁或其抗体制剂(制备品)被认为可用于人类以补充或替代母乳的功能。为了能够收集乳汁中的抗原特异性抗体，通常用抗体所期望的特定抗原对反刍动物进行免疫。该抗原通常是人类病原体，例如肠道微生物或病毒，并且收集在这些被免疫的动物的乳汁中的抗体。收集的抗体用来结合并中和(消除，nutralize)或以其他方式削弱在摄入该抗体的个体的肠中的人类病原体。

[0004] 除了乳汁外，初乳是用于分离牛抗体的另一来源。牛初乳是由母牛在生下小牛不久之前和刚刚生下小牛之后产生的初期乳汁。初乳包含非常高水平的牛抗体，高达50-100mg/ml(相对于正常乳汁的约1mg/ml)。IgG1是牛初乳和牛奶中的主要抗体同种型。如上所述，初乳中的免疫球蛋白被小牛吸收到血液中以保护它们免于感染。初乳中的抗体水平比正常乳汁高约50-100倍。由于这个原因，在很多表明对腹泻症状的显著影响的研究中，高度免疫母牛的初乳已被用作牛抗体的来源以治疗和防止腹泻。(Clin infect dis 199826：1324-9成人；Acta pediatr.1995 84：996-1001婴儿；Acta paediatr.2001
90 1373-8 1-12岁的儿童；J.Pediatr.Gastroenterol Nutr 199929：452-6)。在Indian J.Pediatr.2005 72：849-52中综述了这些研究中的一些。

[0005] 除了用于预防/治疗腹泻以外，初乳还用作运动员的补充物(eur.J.Nutrition2003 42：228-232 和 Int.J.Sport Ntr.Excerc Metab2006 16：47-64.J.Appl Physiol
2006 93：732-39)。

[0006] 在另一项研究中(JT van Dissel et al J.Med.Microbiol 200554-197-205)，用艰难梭菌(Clostridium difficile)免疫的母牛的40％乳清蛋白浓缩物用来预防艰难梭菌腹泻的复发-结果是初步的，但没有注意到由MucoMilk引起的不良事件(Scand J.Gastroenterol2000 35：711-8；N.Engl J Med 1988 318：1240-3)。

[0007] 这些数据表明，来自母牛的初乳包含高抗体水平并且在成人和婴儿中口服这些抗体并没有不利影响(至少在这些研究中)，这表明母牛抗体在食物中的应用是安全的。

[0008] EP0152270B1的实施例4和实施例5表明，在人类中在摄取牛奶和注射纯化的IgG以后，没有发生血清病。饮用乳汁的兔在注射IgG以前并没有产生抗牛IgG抗体。这些实施例再次说明了对于牛IgG的安全性和口服耐受诱导。

[0009] 在本发明中发现，来自反刍动物乳汁的抗体通过人肠中的黏膜屏障并可以结合并抵抗存在于其血流侧上的抗原。因此，抗体穿过(cross)肠的上皮层(粘膜上皮)并存在于肠上皮细胞的基底外侧(basolateral side)。不受理论约束，据信来自反刍动物乳汁的抗体会结合于人肠道细胞上的Ig受体并被从肠侧转运到肠道粘膜的血流侧。在任何情况下，提供到肠上皮细胞的顶侧的抗体穿过衬里(lining)到达基底外侧。因此，本发明提供了一种通过将抗体给予肠上皮细胞的顶侧而用于向肠上皮细胞的基底外侧提供所述抗体的方法。在一种优选的实施方式中，通过向顶侧提供益生碳水化合物来进一步增强经上皮细胞的转运。益生碳水化合物是不可消化的碳水化合物(寡糖和多糖)，如在Gibson和Roberfroid等人(1995，J.Nutr.125：1402-1412)中所描述的。益生成分优选为乳酰-N-四糖、乳酰-N-岩藻-戊糖、乳果糖(LOS)、低聚乳果糖(乳蔗糖)、棉子糖、半乳糖-低聚糖(GOS)、果糖-低聚糖(FOS)、来自大豆多糖的低聚糖、甘露糖基低聚糖、阿拉伯糖-低聚糖、木糖-低聚糖、异麦芽寡糖、葡聚糖、唾液酸低聚糖以及岩藻低聚糖(fuco-oligosaccharide)。益生成分进一步优选为产生自葡萄糖、半乳糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、岩藻糖、阿拉伯糖、葡糖胺、甘露糖、乳糖、淀粉、木聚糖、半纤维素、菊糖、或它们的混合物的低聚糖。大多数反刍动物、猪、以及啮齿动物具有特异性新生受体，用来将IgG转运穿过肠上皮。该受体称作FcRN，新生Fc受体，其在出生后不久被表达并到断奶时被下调。人类在肠上皮细胞上组成型表达FcrN(Immunology 92：69-74)并在人类中已呈现出人IgG经上皮细胞的双向FcRN依赖性转运(J.Clin Invest 1999 104：903-911)。FcRN还在人类的髓样细胞上表达(J.Immunol.2001 166：3266-76)。

[0010] pIgR是多聚Ig受体。该受体结合于连接链(j链)，其是为形成二聚IgA和五聚IgM所需要的。因此认为该受体可以转运IgA和IgM两者。一种最近的出版物已表明，还可以发生抗原复合的IgA从肠腔到组织中的转运(J.Gen Virol 2005 86：2747-51)。CD23，低亲和力IgE受体，还在肠上皮上表达，并且已表明在动物模型中在食物变应原的内化方面中起作用(gastroenterology 2006 131：47-58；J.Clin Invest.2000：106：879-886)。

[0011] 因此，本发明提供了一种用于将反刍动物的抗原特异性抗体递送至个体肠道的粘膜侧，即上皮的基底外侧的方法，该方法包括提供包括反刍动物的所述抗原特异性抗体的口服制剂并将所述制剂口服给予所述个体。提供的反刍动物抗体穿过肠上皮并且能够进入肠粘膜，并随后进入血流并可以与对该抗体特异性的抗原相互作用。

[0012] 用于穿过肠上皮的反刍动物抗体可以来自先前没有针对所述抗体具有特异性的抗原加以免疫的反刍动物。可替换地，可以为反刍动物(其先前已用所述抗体对其具有特异性的抗原加以免疫)衍生反刍动物抗体。虽然反刍动物抗体对于在人胃肠道中的降解是相对耐受性的，但优选的是，所述口服制剂包括包含所述抗原特异性抗体的递送载体(delivery vehicle)，其中所述递送载体能够从所述载体靶向(定向)肠道释放所述抗体。在本领域中，各种递送载体是已知的，其使得能够在肠道中特异性释放封闭的或包封的物质。优选的是，所述载体允许在小肠中释放。优选地，所述制剂进一步包括用于在肠中保持和/或达到有利于抗体的摄取和/或功能的局部pH的缓冲剂。优选地，所述缓冲剂被设定为在小肠中达到在约6-8之间的pH。在一种优选的实施方式中，所述抗体获自泌乳(哺乳期)反刍动物的乳汁。当例如与血清相比时，所述反刍动物的乳汁包含较大比例的IgG1。
IgG1是反刍动物抗体亚型之一，其被转运穿过人的肠粘膜。因为抗体穿过粘膜，所以它们的作用可以超过胃肠道的内部的作用。在一种实施方式中，反刍动物抗体对于变应性抗原是特异的。以这种方式，变应原在被肠摄取以后，被结合于肠粘膜中并优选结合于肠粘膜的血流侧(即上皮的基底外侧)，从而至少与对所述抗原特异的人IgE竞争结合于所述抗原。在进一步优选的实施方式中，所述抗原特异性抗体对于食物变应性相关抗原，优选来自大豆、榛子、蛋或苹果的食物变应性相关抗原是特异的。在一种特别优选的实施方式中，所述变应性抗原是变应性相关花生抗原。在另一种实施方式中，所述变应原是吸入性变应原或毒液变应原(venom allergen)，其选自但不限于草花粉变应原、树木花粉变应原、屋尘螨变应原、猫变应原、霉菌或真菌变应原、或带刺昆虫毒液(stinging insect venoms)的组。所述吸入性和毒液变应原可以经由呼吸道或经由昆虫(如蜜蜂或黄蜂)的刺而进入人体。

[0013] 在另一种优选的实施方式中，所述个体患有自身免疫病或相反免疫系统过度活跃(免疫系统过度反应，过度活跃的免疫系统，over-active immune system)。在该实施方式中，优选的是，反刍动物的所述抗原特异性抗体对于由个体的免疫细胞产生的促炎细胞因子或刺激信号因子是特异的，并且有助于自身免疫病或相反免疫系统过度活跃的症状的维持和/或严重性。因此，优选地，本发明的抗体对于由免疫细胞分泌的因子是特异的。在一种特别优选的实施方式中，本发明的反刍动物抗体对于人TNF-α或人IL-23抗体是特异的。在又一种实施方式中，所述抗体对于待治疗个体的免疫细胞、上皮细胞、上皮内细胞、抗原呈递细胞或M细胞是特异的，优选T细胞、B细胞或树突状细胞(树突细胞)。在一种优选的实施方式中，所述个体患有炎性肠病。在一种进一步优选的实施方式中，本发明的所述反刍动物抗体对于与所述自身免疫病有关的微生物的抗原是特异的。

[0014] 人可以具有任何年龄。然而，优选的是，所述人类个体为至少1岁。优选地，所述个体为至少2岁。优选地，所述个体为至少6岁。在另一种优选的实施方式中，所述个体为至少16岁。在本发明的又一个方面，所述个体在0至24个月之间，优选在0至12个月之间，更优选在6至24个月之间(通常当固体食物包括在饮食中时)。与成年相比，0-6个月之间的个体的胃肠道还未完全发育，因而更容易使抗体通过到肠上皮细胞的基底外侧。此外，在0-24个月之间的个体的胃肠道中，抗体具有更长的半寿期。在一种优选的实施方式中，所述抗体为IgG1型、IgA型或它们的组合。优选地，所述抗体具有IgG1型或包含IgG1和IgA(对于所述抗原是特异性的)的组合(composition)。本发明的方法优选用来经由所述个体的胃肠道将所述反刍动物抗体递送至血流。在一种特别优选的实施方式中，所述血流递送用来将抗体递送至肺。在该实施方式中，优选的是，该抗体对于病毒或细菌病原体的抗原或变应性的抗原是特异性的。在该实施方式中，优选的是，所述抗体对于变应性相关草或树木花粉抗原、或在人类中引起变应性反应的任何其它吸入性变应原是特异性的。在另一种优选的实施方式中，所述抗体对于微生物或病毒(具有对于肺的向性)是特异性的。优选地，所述微生物包括肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、卡他莫拉菌、肺炎衣原体、肺炎支原体以及嗜肺军团菌。优选的病毒特异性抗体针对流感病毒的成员，优选A型流感病毒或B型流感病毒，呼吸道合胞病毒的成员或腺病毒的成员。

[0015] 因此，本发明提供了反刍动物的抗原特异性抗体在用于制备用于全身治疗非反刍动物的疾病的药物中的应用。优选地，所述非反刍动物是人。优选地，所述药物用于口服给药。

[0016] 本发明的抗体的一个特别的优点在于它是多克隆抗体。这便于更强劲的抗原结合。这进一步便于在提供了本发明抗体的个体之间减小变化。

[0017] 在本发明的另外的方面，发现来自先前未对抗原加以免疫的非人哺乳动物的乳汁可以特异性地与所述抗原反应。这表明，尽管未针对所述抗原对非人哺乳动物加以免疫，但是乳汁包含特异性地结合抗原的抗体。在本发明中，在工业环境(工业设备，industrialsetting)中利用了此方面，其中处理大容积的乳汁。因此，在这方面，本发明提供了一种用于从乳汁获得抗原特异性抗体的方法，其特征在于，乳汁来自在收集乳汁以前没有用所述抗原对其加以免疫的哺乳动物。针对抗原的免疫是指将包含抗原以及通常佐剂的组合物给予哺乳动物，以在所述哺乳动物中获得相对于所述抗原、所述佐剂或它们的组合的免疫反应。该给药涉及促进组合物的成分与哺乳动物的免疫细胞之间的密切接触。这样的给药通常涉及通过破坏皮肤层而将组合物沉积在哺乳动物体内。存在并可以采用其它给药方式。抗原的口服给药，例如作为所述哺乳动物的(部分)食物，经常伴随在哺乳动物中对所述抗原的耐受性的诱导，因此在本发明中并不被认为是免疫。在一种优选的实施方式中，所述方法包括从泌乳的哺乳动物收集乳汁并从所述乳汁收集所述抗体。优选地，在收集所述抗体以前，汇集相同物种的至少两个单独的哺乳动物的乳汁。以这种方式，还可以以足够量收集低丰度的抗体。为此目的，优选的是，优选从相同物种的至少10个以及更优选至少100个单独的哺乳动物的乳汁收集抗体。在一种优选的实施方式中，所述哺乳动物是反刍动物。优选地，所述反刍动物是母牛，优选地是牛属(genus Bos)的成员。在牛属中，商用物种是优选的。优选地，所述反刍动物是物种大额牛(Gayal)、大额牛(Bos frontalis)(驯养野牛)、野牦牛(Bos mutus)(牦牛)或家牛(Bos taurus)(驯养牛)。在另一种优选的实施方式中，所述反刍动物是山羊或绵羊，优选羊亚科的成员。在该亚科中，盘羊(Ovis)属或山羊(Capra)属的成员是优选的。在盘羊属中，物种盘羊(驯养绵羊)是优选的。在山羊属中，物种山羊(Capra aegagrus hircus)(驯养山羊)是优选的。在另一种优选的实施方式中，所述反刍动物是骆驼、驴、水牛(bufallo)、马或羊驼(lama)。
来自非免疫反刍动物的乳汁包含对于各种不同抗原具有特异性的抗体。优选的制剂包含这样的抗体，其靶向于埃希杆氏菌(Escherichia)属的成员，优选大肠杆菌(Escherichia coli)；沙门氏菌(Salmonella)属的成员，优选鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)；
弯曲杆菌(Campylobacter)属的成员，优选空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)；幽杆菌(Helicobacter)属的成员，优选幽门螺杆菌(Helicobacter pilori)；博德特氏菌(Bordotella)属的成员，优选百日咳博德特氏菌(Bordotella pertussis)；梭状芽孢杆菌(Clostridium)属的成员；志贺氏菌(Shigella)属的成员；链球菌属(Streptococcus)的成员，优选肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)；葡萄球菌(Staphylococcus)属的成员，优选金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；嗜血杆菌(Haemophilus)属的成员，优选流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；假单胞菌(Pseudomonas)属的成员，优选铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)；莫拉氏菌(Moraxella)属的成员，优选粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)；衣原体(Chlamydia)属的成员，优选肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)；支原体(Mycoplasma)属的成员，优选肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)，或军团菌(Legionella)属的成员，优选嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)。优选的病毒特异性抗体针对流感属的成员，优选A型流感病毒或B型流感病毒，呼吸道合胞病毒的成员，轮状病毒的成员，诺如病毒的成员，肠道病毒的成员，巨细胞病毒的成员或腺病毒的成员。

[0018] 因为乳汁包含多种成分，特别是脂肪类、油类非抗体蛋白以及碳水化合物，所以优选的是，在收集所述抗体以前，对所述乳汁进行加工步骤。用于收集抗体的适宜的起始制剂(starting preparation)是原料乳。还可以使用这样的乳汁，其经加热处理以达到细菌的对数杀灭，一种称作巴氏灭菌法的过程(处理)。巴氏灭菌法通常使用低于沸点(boiling)的温度，因为在高于乳汁沸点的温度下，酪蛋白微团将不可逆地聚集(或“凝结”)。目前使用的巴氏灭菌法主要有两种类型：高温/短时(HTST)和延长保质期(ESL)处理。在HTST方法中，迫使乳汁在金属板之间或通过管道，其在外侧由热水加热，并被加热至71.7℃(161°F)持续15-20秒。ESL乳汁具有微生物过滤步骤以及比HTST更低的温度。
仅标记有“巴氏灭菌的”乳汁通常用HTST法加以处理。还可以在低于71.7℃的温度和增加的压力下对乳汁进行巴氏灭菌。就细菌的对数杀灭来说，这与在高温、低压下进行巴氏灭菌是同样有效的。

[0019] 乳汁处理步骤优选包括分离步骤。优选的分离步骤包括从乳汁(部分地)脱除(排除)脂肪的步骤。因此用于收集抗体的另一种优选的起始制剂包括已经历脂肪脱除步骤的乳汁。在一种优选的实施方式中，所述分离步骤包括将乳汁分离成至少两部分并且其中至少一部分是富含蛋白质部分。从分批处理乳汁收集抗体是可能的，然而，优选的是，所述处理步骤是(半)-连续过程的一部分。在一种特别优选的实施方式中，乳清部分由所述乳汁制备并且所述抗体收集自所述乳清。因此，在一种优选的实施方式中，用于收集抗体的起始制剂包含乳清。在又一种实施方式中，用于收集抗体的起始制剂包括发酵乳汁。起点可以是如上文中所指出的，也可以是来自重建浓缩物或由其制备的干粉。如上所述，哺乳动物是基于其先前未针对所述抗原加以免疫的标准来选择的。在一种优选的实施方式中，所述哺乳动物是基于用于收集所述乳汁的进一步的标准来选择的。该进一步的标准可以是任何标准，例如，在泌乳周期中的时间。在一种优选的实施方式中，所述哺乳动物是基于其正在产生正常乳汁来选择的，即不是在分娩后立即产生的乳汁(其也被称作初乳)。在进一步优选的实施方式中，所述进一步的标准包括乳汁的抗体含量、在收集的乳汁中的抗体特异性、由所述哺乳动物摄取的食物类型或食物补充物的类型、针对所述哺乳动物的病原体的抗原的接种疫苗、或所述标准中的两种或更多种的组合。

[0020] 在一种优选的实施方式中，所述抗体是IgG1、IgA、IgG2或IgM抗体。优选地，所述抗体收集自获自所述乳汁的富含抗体的部分。优选地，所述方法进一步包括这样的步骤，当与富含抗体的部分中存在的其它蛋白相比时，该步骤可以提高IgG1、IgA或它们的组合的水平。优选地，β-乳球蛋白的量减少至少50％。这可以例如通过β-乳球蛋白的特异性水解，或通过尺寸分离来除去β-乳球蛋白，或通过利用对β-乳球蛋白特异的抗体来除去β-乳球蛋白来实现。因此，优选地，用于收集本发明的抗体的方法进一步包括在富含抗体的部分中减少β-乳球蛋白的量的步骤。本发明的方法优选进一步包括亲和纯化步骤，以获得富含所述抗原特异性抗体的抗体部分。已可以从相同物种的大量不同的哺乳动物收集抗原特异性抗体，这使得可以亲和纯化大量的亲和纯化的抗原特异性抗体，尽管在每个单独的乳汁样品中所述抗体的可能较低的流行率(prevalence)。

[0021] 另外提供了一种抗原特异性抗体，其可以通过根据本发明的用于收集抗原特异性抗体的方法来获得。优选地，所述抗体是多克隆抗体。在该实施方式中，所述抗原特异性抗体可以来自免疫的非人哺乳动物或来自非免疫的非人哺乳动物。在一种进一步优选的实施方式中，所述抗原是变应性抗原、病毒抗原、细菌抗原或它们的组合。

[0022] 在本发明的范围内，术语抗原是人的抗原、能够在人类体内感染和引起疾病的病原体、可以使人变得变应性的变应原、或它们的组合。因此在本发明的范围内，哺乳动物的免疫是指用人的抗原、能够在人类体内感染和引起疾病的病原体、可以使人变得变应性的变应原、或它们的组合来免疫所述哺乳动物。因此，在本发明的范围内，为所述哺乳动物的病原体的抗原接种疫苗所述哺乳动物以治疗或预防所述哺乳动物的疾病并不被认为是免疫。

[0023] 本发明进一步提供了一种包括本发明的非人哺乳动物的抗原特异性抗体的组合物。优选地，所述抗原特异性抗体的含量小于所述组合物中的抗体总量的1％。更优选地，所述抗原特异性抗体的含量小于所述组合物中的抗体总量的0.1％。在一种优选的实施方式中，至少15％，并且更优选至少25％，并且更优选至少35％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少75％，甚至更优选至少80％的抗体是IgG1、IgA或它们的组合。优选地，所述组合物富含的IgG1多于IgA。在本发明的另一种优选实施方式中，该组合物富含的IgA多于IgG1。

[0024] 本发明进一步提供了一种包括本发明的非人哺乳动物的抗体的组合物，其中所述组合物包含的抗体的量在所述组合物中蛋白质总量的0.001％至30％之间。优选地，所述抗体以所述组合物中蛋白质总量的0.1％至30％的量存在。优选地，所述抗体以在蛋白质总量的约5-30％之间的量，更优选在10-30％之间的量，更优选在约20-30％之间的量存在。在一种优选的实施方式中，至少10％，更优选至少15％，更优选至少25％，更优选至少35％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少75％，甚至更优选至少80％的抗体是IgG1、IgA或它们的组合。优选地，所述组合物富含的IgG1多于IgA。在本发明的另一种优选实施方式中，该组合物富含的IgA多于IgG1。

[0025] 本发明进一步提供了一种药物组合物，其包括根据本发明的非人哺乳动物的抗原特异性抗体，或根据本发明的组合物。还进一步提供了根据本发明的非人哺乳动物的抗原特异性抗体、或根据本发明的组合物在用于制备药物中的应用。在一种优选的实施方式中，提供了根据本发明的非人哺乳动物的抗原特异性抗体或根据本发明的组合物在用于制备口服的药物中的应用。

[0026] 在又一个方面，本发明提供了一种用于口服(口服给药)的制剂，其包括根据本发明的非人哺乳动物的抗原特异性抗体或根据本发明的组合物。在一种优选的实施方式中，所述制剂包括递送载体，所述递送载体包括所述抗体或组合物。所述递送载体优选能够从所述载体靶向肠道释放所述抗体。

[0027] 在又一个方面，本发明提供了一种包括如上所述的根据本发明的制剂的新生儿或婴儿配方(配方食品，formula)。还提供了一种包括根据本发明的非人哺乳动物的抗原特异性抗体或根据本发明的组合物的新生儿或婴儿配方。还提供了一种新生儿或婴儿配方，其中所述配方的蛋白含量的0.001％至5％是根据本发明的非人哺乳动物的抗原特异性抗体蛋白，优选地所述配方包括的蛋白含量的至少0.1％、更优选至少1％、更优选至少2％、更优选至少5％是根据本发明的非人哺乳动物的抗原特异性抗体蛋白。优选地，本发明的非人哺乳动物的抗体以在蛋白质总量的约1-30％之间、更优选10-30％之间、更优选约20-30％之间的量存在。优选地，所述配方的至少5％、更优选至少10％，并且更优选至少
20％的蛋白含量是非人哺乳动物的抗体蛋白。优选地，所述配方的约5-10％的蛋白含量是抗体蛋白。更优选地，所述配方的约10-30％的蛋白含量是抗体蛋白。

[0028] 在又一种实施方式中，提供了一种如上所述的新生儿或婴儿配方，其中所述配方的蛋白含量的至少0.001％、更优选至少0.01％、更优选至少0.1％、更优选至少1％、更优选至少2％、更优选至少5％是抗原特异性抗体蛋白。优选地，所述配方的蛋白含量的约0.01-5％是根据本发明的非人哺乳动物的抗原特异性抗体蛋白。因此，优选地，所述配方的蛋白含量的约0.001-5％由根据本发明的抗原特异性抗体或根据本发明的组合物组成。

[0029] 本发明进一步提供了一种包括本发明的抗体和/或本发明的组合物的用于非人类的动物或人的食物补充物或食物。在该实施方式中，所述抗原特异性抗体可以来自免疫的非人哺乳动物或来自非免疫的非人哺乳动物。

[0030] 来自免疫或非免疫的非人哺乳动物的抗体优选对于变应原抗原、人生长因子、人抗原、呼吸道病毒、呼吸道细菌、寄生物、或其它有关的疾病相关抗原是特异的。在一种优选的实施方式中，所述抗体来自免疫的非人哺乳动物。

[0031] 可以口服给予本发明的牛和/或非人哺乳动物抗体，作为食品或保健品(nutraceutical)、饮料、胶囊或封装的含抗体制剂。还可以经由其它途径如经由肌肉注射、静脉内给予、或经由直肠或阴道来给予来自非免疫的或来自免疫的牛和/或非人哺乳动物的牛和/或非人哺乳动物抗体。

[0032] 口服递送的牛和/或非人哺乳动物抗体制剂可以被配制在液体如水溶液、乳汁、酸奶中，或配制成冻干的蛋白制剂，或加以包封以保护胃中的抗体。优选地，将这样的抗体加入到婴儿配方或人类食用的乳制品中。在本发明的另一种优选实施方式中，所述抗体被包封，与载体结合，与益生菌结合，或与益生元(例如，半乳糖低聚糖)结合。

[0033] 进一步提供了一种包括本发明的非人哺乳动物的抗原特异性抗体或根据本发明的组合物的保健品。所述保健品采取适用于口服的任何形式。优选地，所述保健品是胶囊、包封的蛋白、或液体溶液。该保健品用来预防、治疗、或至少部分地减轻进行中的疾病的症状。优选地，所述疾病是食物变态反应(食物变应原-特异性抗体；花生、大豆、榛子、蛋、苹果等)，炎性肠病(TNF-α或IL-23特异性抗体)，花粉变态反应(草和树木花粉特异的，优选桦树花粉特异性抗体)，其它吸入性变态反应(屋尘螨、猫、真菌等)，或毒液变态反应。因此，在一种优选的实施方式中，利用本发明的方法制备的抗体制剂包括这样的抗体，其对于食物变应原抗原是特异的(优选花生、大豆、榛子、蛋、苹果等变应性抗原)，或对于炎性肠病抗原是特异的(优选TNF-α或IL-23特异性抗体)，或对于花粉变应性抗原是特异的(草和树木花粉特异的，优选桦树花粉特异性抗体)，或对于其它吸入性变应性抗原是特异的(屋尘螨、猫、真菌等)，或对于毒液变应性抗原是特异的。
附图说明

[0034] 图1：来自初乳、乳汁、以及乳清的牛IgG1(左图)和IgA(右图)抗体与来自鼠伤寒沙门菌(顶图)和大肠杆菌(底图)的连续稀释的LPS的结合。数值表示为在450nm的波长处测得的OD。

[0035] 图2：来自初乳的牛IgG1和IgA抗体与连续稀释的变应原(屋尘螨、桦树花粉、以及草花粉变应原)的结合。数值表示为在450nm的波长处测得的OD。

[0036] 图3：初乳(顶图)中IgG1和IgA的经上皮转运以及穿过pH梯度的转运实验对TEER和FD4转运的影响。误差棒表示ELISA测量结果的标准差。顶图中的水平线表示在没有添加初乳的对照培养物中测得的IgG1和IgA的量。实施例

[0037] 实施例1

[0038] 来自非免疫母牛的乳汁衍生抗体对细菌粘附于人上皮的影响。

[0039] 在Transwell板中培养人小肠上皮细胞系Caco-2以及产生人粘蛋白的结肠上皮细胞系HT29-MTX，并使其在15-21天培养期间分化成单层细胞(单层，monolayers)。在粘附测定中，在使用前，通过测量经上皮电阻(TEER)，每周测量单层细胞完整性。在微生物与上皮细胞的预定范围内(例如，10∶1、100∶1以及500∶1)，用上皮细胞温育放射性标记的细菌(两种致病菌：肠致病性大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌、以及干酪乳杆菌作为益生菌菌株)规定的时间，然后洗掉未结合的微生物。通过d.p.m.(解体/分钟)计数来量化粘附细菌。在存在或不存在牛抗体制剂(对应于464μg/ml和46.4μg/mlIgG1)的条件下进行实验。抗体制剂减少了细菌与Caco-2和HT29-MTX的粘附。

[0040] 实施例2

[0041] 在来自乳汁的抗体制剂中存在的病原体特异性抗体水平。

[0042] 测量大肠杆菌特异性抗体、沙门氏菌特异性抗体、以及梭状芽孢杆菌特异性抗体的夹心ELISA用来量化在包含牛抗体的制剂中细菌特异性IgG1、IgM以及IgA的量。用PBS中的100μL热杀死的细菌(大肠杆菌、沙门氏菌、梭状芽孢杆菌)涂布96孔ELISA平板。在4℃和加湿环境下，温育平板过夜。用200μl洗涤缓冲液/孔(PBS+0.05％吐温-20)洗涤平板三次，然后在37℃和加湿环境下用200μL封闭缓冲液/孔(＝洗涤缓冲液+1％明胶)封闭1小时。在该温育以后，用200μl洗涤缓冲液/孔(PBS+0.05％吐温-20)洗涤平板三次，然后添加100μL/孔的稀释在封闭缓冲液中的含牛抗体样品。

[0043] 在37℃和加湿环境下温育1小时以后，用200μl洗涤缓冲液/孔洗涤平板三次，然后每孔添加1∶50,000稀释在封闭缓冲液中的100μL抗牛IgG1-HRP(AbD Serotec，cat# AAI21P)，以检测细菌特异性IgG1。为了检测IgA，使用了100μL抗牛IgA-HRP(AbD Serotec，cat# AAI20P)，其在封闭缓冲液中被稀释至1∶50,000，而为了检测牛IgM，使用了100μL抗牛IgM-HRP，其在封闭缓冲液中被稀释至1∶50,000(AbD Serotec，cat# AAI19P)。

[0044] 在37℃和加湿环境下温育平板1小时，用200μl洗涤缓冲液/孔洗涤三次，接着用PBS洗涤第四次，然后将100μL TMB底物加入到每个孔中(在10mL底物缓冲液中的100μL TMB，两者均来自Biosource Int.Cat# 45.011.03和45.014.01)。

[0045] 通过添加100μL/孔的1M H2SO4来终止显色反应，然后在450nm的波长处读取平板。这些数据说明在来自非免疫的牛抗体的制剂中存在细菌特异性牛抗体。

[0046] 实施例3

[0047] 来自乳汁的抗体制剂中的变应原特异性IgG1、IgA或IgM抗体。

[0048] 测量草变应原-特异性抗体的夹心ELISA用来量化在包含牛抗体的制剂中草变应原特异性IgG1、IgM、以及IgA的量。用在PBS中的100μL的草花粉变应原提取物(多种温带草的混合物，ALK-Abello，Horsholm，丹麦)涂布96孔ELISA平板。在4℃和加湿环境下温育平板过夜。用200μl洗涤缓冲液/孔(PBS+0.05％吐温-20)洗涤平板三次，然后在37℃和加湿环境下用200μL封闭缓冲液/孔(＝洗涤缓冲液+1％明胶)1小时。在该温育以后，用200μl洗涤缓冲液/孔(PBS+0.05％吐温-20)洗涤平板三次，然后添加100μL/孔的稀释在封闭缓冲液中的含牛抗体样品。

[0049] 在37℃和加湿环境下温育1小时以后，用200μl洗涤缓冲液/孔洗涤平板三次，然后每孔添加在封闭缓冲液中稀释1∶50,000的100μL抗牛IgG1-HRP(AbD Serotec，cat# AAI21P)，以检测草花粉特异性IgG1。为了检测IgA，使用了在封闭缓冲液稀释至1∶50,000的100μL抗牛IgA-HRP(AbD Serotec，cat# AAI20P)，而为了检测牛IgM，使用了在封闭缓冲液中稀释至1∶50,000的100μL抗牛IgM-HRP(AbD Serotec，cat# AAI19P)。

[0050] 在37℃和加湿环境下温育平板1小时，用200μl洗涤缓冲液/孔洗涤三次，接着用PBS洗涤第四次，然后将100μL TMB底物加入到每个孔中(10mL底物缓冲液中的100μL TMB，均来自Biosource Int.Cat# 45.011.03和45.014.01)。

[0051] 通过添加100μL/孔的1M H2SO4来终止显色反应，并在450nm波长处读取平板。因此说明在来自非免疫母牛的牛抗体的制剂中存在草变应原特异性牛IgG1、IgA、以及IgM，这表明吃草会在反刍动物中诱导变应原特异性抗体反应。这表明，对反刍动物喂养潜在的食物变应原可以是一种诱导乳汁中的(食物)变应原特异性抗体反应的方式而无需对所述反刍动物接种。

[0052] 实施例4

[0053] 对于草变应原特异的来自牛奶的IgG1抗体可以防止IgE-变应原复合物结合于CD23(低亲和力IgE受体)并防止嗜碱性粒细胞组胺释放。

[0054] 当变应原提取物被预复合于对这些变应原特异的人IgE抗体时，这些复合物可以结合于低亲和力IgE受体CD23(在B细胞、单核细胞以及树突状细胞上表达)，并且结合于存在于嗜碱细胞和肥大细胞上的高亲和力IgE受体。这又导致高效率的变应原呈递到Th2细胞，从而导致延长时间的变应性反应以及嗜碱细胞和肥大细胞的脱粒。通过引入类型不同于IgE的变应原特异性阻断抗体，优选IgG抗体，可以防止该抗原呈递以及炎性介质从嗜碱细胞和肥大细胞的释放。

[0055] 借助于以下方式研究了结合于CD23的草花粉变应原-IgE复合物。在存在或不存在包含草花粉变应原特异性IgG1抗体的牛抗体制剂的条件下，在4ml FACS管中的20μl的FACS缓冲液(PBS，0.1％BSA，0.05％NaN3)中制备连续稀释的草花粉变应原提取物(多种温带草的混合物，ALK-Abello，Horsholm，丹麦)。在37℃下温育30分钟以后，添加包含草花粉变应原特异性IgE的30μL患者血清，并使血清和变应原在37℃和加湿气氛下形成变应原-IgE复合物1小时。在该温育以后，添加表达高水平的CD23(低亲和力IgE受体)的50,000个EBV转化的B细胞，并在4℃下温育细胞1小时，使IgE-变应原复合物可以结合于CD23。在该温育期以后，用4mL FACS缓冲液洗涤细胞并以1,500RPM离心5分钟。洗涤以后，在有5％正常山羊血清存在的条件下，将50μL与IgE的FITC-共轭抗体(山羊抗人多克隆抗体；Kirkegaard & Perry Laboratories)加入到细胞中，以防止FITC标记的抗IgE抗血清的非特异性结合。在4℃下对管温育半小时，用4mL FACS缓冲液洗涤细胞并在1,500RPM下离心5分钟。每支管添加200μL FACS缓冲液，并用FACSCalibur流式细胞仪对管直接进行测量。记录了10,000个事件。

[0056] 因此在有限量的草变应原存在的条件下证明了草变应原特异性IgE与在EBV-转化的B细胞系上表达的CD23的结合。通过添加包含草花粉变应原特异性IgG1抗体的来自牛奶的制剂可以减少该结合。

[0057] 类似地，在来自人外周血嗜碱细胞(来自草花粉变应性患者)的组胺释放实验中证明了，在包含草花粉变应原特异性IgG1抗体的来自牛奶的制剂存在的条件下，嗜碱细胞的组胺释放会受到抑制。在该实验中，通过密度离心，人外周血单核细胞(PBMC)分离自草花粉变应性患者的肝素化血液。收集PBMC并用连续稀释的草花粉变应原温育，该连续稀释的草花粉变应原已在37℃下在有或没有包含草花粉变应原特异性IgG1抗体的来自牛奶的制剂的条件下预温育30分钟。在37℃下温育PBMC 30分钟，其后除去上清液以利用商购的组胺测定试剂盒来测量所释放的组胺量。以这种方式，说明了牛草花粉变应原特异性IgG1抗体的存在会减少人嗜碱细胞的组胺释放。

[0058] 实施例5

[0059] 牛IgG1(以及IgM、IgA)经人肠上皮细胞系Caco-2的单层细胞的转运。在Transwell板中培养人小肠上皮细胞系Caco-2并使其可以在15-21天的培养期间内分化成单层细胞。在转运测定中在使用前，通过测量经上皮电阻(TEER)来每周测量单层细胞完整性。为了测量牛抗体的转运，将包含牛抗体的制剂(参见实施例1)加入到Caco-2单层细胞中，并在多个时间点获取样品以测量牛抗体的转运。在没有或有旁细胞转运的诱导剂(癸酸钠)或跨细胞转运的抑制剂(用放线菌素D预处理细胞8小时)的条件下进行上述实验。此外，在所有孔中，使用FITC标记的葡聚糖作为另外的对照以使小分子的旁细胞转运可视化。通过夹心ELISA来测量转运穿过Caco-2单层细胞的抗体水平，其中夹心ELISA为测量总IgG1、IgM、以及IgA抗体而开发的，其类似于在先前实施例中描述的ELISA。简言之，用1∶800稀释在PBS中的100μL绵羊抗牛IgG(作为IgG捕获抗体-Bethyl Cat# A10-118A-8)、稀释在PBS中的100μL绵羊抗牛IgA/孔(IgA捕获抗体-Bethyl cat# A10-121A-8)、或稀释在PBS中的100μL绵羊抗牛IgM/孔(IgM捕获抗体-Bethyl cat #A10-101A-8)涂布96孔ELISA板。在4℃和加湿环境下温育平板过夜。在温育以后，用
200μl洗涤缓冲液/孔(PBS+0.05％吐温-20)洗涤平板三次，然后在37℃和加湿环境下用
200μL封闭缓冲液/孔(＝洗涤缓冲液+1％明胶)封闭1小时。用200μl洗涤缓冲液/孔(PBS+0.05％吐温-20)洗涤平板三次，然后添加100μL/孔的稀释在封闭缓冲液中的包含牛抗体的样品。

[0060] 在37℃和加湿环境下温育1小时以后，用200μl洗涤缓冲液/孔洗涤平板三次，然后每孔添加1∶50,000稀释在封闭缓冲液中的100μL抗牛IgG1-HRP(AbD Serotec，cat# AAI21P)，以检测牛IgG1的存在。为了检测IgA，使用了在封闭缓冲液中稀释至1∶50,000的100μL抗牛IgA-HRP(AbD Serotec，cat# AAI20P)，而为了检测牛IgM，使用了在封闭缓冲液中稀释至1∶50,000的100μL抗牛IgM-HRP(AbD Serotec，cat# AAI19P)。在37℃和加湿环境下温育平板1小时，用200μl洗涤缓冲液/孔洗涤三次，接着用PBS进行第四次洗涤，然后向每个孔中加入100μL TMB底物(在10mL底物缓冲液中的100μL TMB，二者均来自Biosource Int.Cat #45.011.03和45.014.01)。相对于包含牛IgG1、IgA、以及IgM的标准牛血清(Bethyl Cat # RS10-103)的标准曲线来量化在样品中存在的牛抗体的总量。

[0061] 因此证明了牛抗体经Caco-2单层细胞的转运。此外，通过用放线菌素D预处理细胞会减少转运，并且通过添加癸酸钠(旁细胞转运的诱导剂)会增强转运，表明了牛抗体经过人肠上皮被主动转运。

[0062] 实施例6

[0063] 食物变应原特异性牛IgG抗体可以防止摄取食物变应原以后的变应性反应。

[0064] 用花生蛋白提取物免疫母牛，直到在来自母牛的乳汁中检测到足够高的花生特异性抗体水平。收集乳汁，从奶酪制作后的乳清或直接从乳汁分离和纯化抗体，如果可能的话，不加热乳汁。

[0065] 选择花生变应性患者并分为两组。两组均经受双盲、安慰剂对照食物激发，以确定花生敏感度的阈值水平。该阈值被定义为在患者中诱导变应性症状所摄取的花生量。在上述激发以后，一组给予包含来自花生免疫母牛的抗体制剂的饮食，而对照组给予包含对照牛抗体制剂(非免疫母牛)的饮食。在给予上述饮食三周至三个月以后，所有患者经受第二次双盲、安慰剂对照食物激发以确定其花生阈值。

[0066] 在两个时间点均收集血液样品以确定牛抗体的量(花生特异性抗体和总牛抗体水平)。利用在实施例6中描述的ELISA(用于总抗体水平)以及在实施例3中描述的ELISA来检测这些抗体水平，不同之处在于，将花生变应原提取物而不是草花粉变应原提取物涂布到ELISA板的表面上。

[0067] 该研究的结果表明，花生变应原特异性牛抗体的摄取会增加花生变应性患者可以耐受的花生变应原的量，并且提示口服递送牛变应原特异性抗体可以是一种减少变应性患者的变应性反应的良好方法。此外，该研究证明了，抗原特异性牛抗体(在这种情况下为花生特异性抗体)被吸收到食物变应性患者的血液中，这表明可以将牛抗原特异性抗体全身递送到人类个体。

[0068] 实施例7

[0069] 在来自乳汁的抗体制剂中存在的病原体特异性抗体水平。

[0070] ELISA用来检测在初乳(溶解为20mg/ml)、乳汁、以及乳清(均来自非免疫母牛)中细菌特异性IgG1和IgA的存在。通过加入每孔100μl的10μg/ml的来自大肠杆菌或鼠伤寒沙门菌(Sigma)的商用LPS(稀释在PBS中)来涂布96孔ELISA板。在4℃和加湿环境下温育平板过夜。用200μl洗涤缓冲液/孔(PBS+0.05％吐温-20)洗涤平板三次，然后在37℃和加湿环境下用200μL封闭缓冲液/孔(＝洗涤缓冲液+1％明胶)封闭1小时。在上述温育以后，用200μl洗涤缓冲液/孔(PBS+0.05％吐温-20)洗涤平板三次，然后添加100μL/孔的稀释在封闭缓冲液中的连续稀释的包含牛免疫球蛋白的样品。在37℃和加湿环境下温育1小时以后，用200μl洗涤缓冲液/孔洗涤平板三次，然后每孔加入1∶20,000稀释在封闭缓冲液中的100μL抗牛IgG1-HRP(AbD Serotec，cat# AAI21P)，以检测细菌特异性IgG1。为了检测IgA，使用了在封闭缓冲液中稀释至1∶50,000的100μL抗牛IgA-HRP(AbD Serotec，cat# AAI20P)。

[0071] 在37℃和加湿环境下温育平板1小时。用200μl洗涤缓冲液/孔洗涤三次，接着用PBS进行第四次洗涤，然后向每个孔中加入100μL TMB底物(在10mL底物缓冲液中的100μL TMB，二者均来自Biosource Int.Cat # 45.011.03和45.014.01)。

[0072] 通过加入100μL/孔的1M H2SO4来终止显色反应，然后在450nm的波长处读取平板。

[0073] 如图1所示，初乳包含IgA和IgG1免疫球蛋白，其特异性地与来自大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的LPS反应。在乳汁和乳清中也检测到这些LPS特异性免疫球蛋白，但其浓度较低。这些数据证明，在来自非免疫母牛的初乳、乳汁以及乳清中存在细菌特异性牛抗体。

[0074] 实施例8

[0075] 在来自乳汁的抗体制剂中存在的变应原特异性抗体水平。

[0076] ELISA用来确定在来自非免疫母牛的初乳中变应原特异性IgG1、以及IgA的存在。用稀释在PBS中的连续稀释的来自屋尘螨羽刺皮癣螨(Dermatophagoides pteronyssinus，Dp)、桦树花粉(疣枝桦(Betula verrucosa))、或草花粉的变应原蛋白提取物(均来自ALK Abello，Horsholm，丹麦)涂布96孔ELISA板。在4℃和加湿环境下温育平板过夜。用200μl洗涤缓冲液/孔(PBS+0.05％吐温-20)洗涤平板三次，然后在37℃和加湿环境下用200μL封闭缓冲液/孔(＝洗涤缓冲液+1％明胶)封闭1小时。在上述温育以后，用200μl洗涤缓冲液/孔(PBS+0.05％吐温-20)洗涤平板三次，然后添加100μL/孔的稀释在封闭缓冲液中的包含牛免疫球蛋白的样品。在37℃和加湿环境下温育1小时以后，用200μl洗涤缓冲液/孔洗涤平板三次，然后每孔添加1∶20,000稀释在封闭缓冲液中的100μL抗牛IgG1-HRP(AbD Serotec，cat# AAI21P)，以检测细菌特异性IgG1。为了检测IgA，使用了在封闭缓冲液中稀释至1∶50,000的100μL抗牛IgA-HRP(AbD Serotec，cat# AAI20P)。

[0077] 在37℃和加湿环境下温育平板1小时，用200μl洗涤缓冲液/孔洗涤三次，接着用PBS进行第四次洗涤，然后每孔加入100μLTMB底物(在10mL底物缓冲液中的100μL TMB，二者均来自Biosource Int.Cat# 45.011.03和45.014.01)。

[0078] 通过添加100μL/孔的1M H2SO4来终止显色反应，并在450nm的波长处读取平板。

[0079] 如图2所示，初乳包含特异性地与屋尘螨变应原、桦树花粉变应原、以及草花粉变应原反应的IgA以及IgG1免疫球蛋白。这些数据证明了在来自非免疫母牛的初乳中存在变应原特异性牛抗体。

[0080] 实施例9

[0081] 牛IgG1和IgA经人肠上皮细胞系Caco-2的单层细胞的转运。

[0082] 在Transwell板中培养人小肠上皮细胞系Caco-2并使其在15-21天培养期间分化成单层细胞。在转运测定中在使用前，通过测量经上皮电阻(TEER)来每周测量单层细胞2
完整性。在TEER已达到至少500欧姆/cm 的数值后进行实验。为了测量牛免疫球蛋白的转运，在pH为6.0、6.5以及7的10mM MES缓冲液中，将包含牛免疫球蛋白的牛初乳稀释至
20mg/ml的浓度(w/v，对应于2.4mg/mlIgG1和0.15mg/ml IgA)，并将其加入到Caco-2单层细胞的顶侧。Caco-2细胞的基底外侧处的pH为7.4，因而产生如在人肠中所出现的pH梯度。此外，将FITC标记的葡聚糖(FD4，0.01mg/ml)加入到顶侧处的培养基作为在所有孔中的对照，以使小分子的旁细胞转运可视化，从而排除由于渗漏的单层细胞所测得的转运。在
4小时温育期以后再次测量TEER，并在基底外侧获取样品以测量牛免疫球蛋白的转运以及FD4的渗漏。通过夹心ELISA来测量转运穿过Caco-2单层细胞的免疫球蛋白水平，该夹心ELISA是为了测量总牛IgG1和IgA而开发的。简言之，用1∶800稀释在PBS中的100μL绵羊抗牛IgG(作为IgG捕获免疫球蛋白-Bethyl Cat #A10-118A-8)、稀释在PBS中的每孔
100μL绵羊抗牛IgA(IgA捕获免疫球蛋白-Bethyl cat # A10-121A-8)、或稀释在PBS中的每孔100μL绵羊抗牛IgM(IgM捕获免疫球蛋白-Bethyl cat #A10-101A-8)涂布96孔ELISA板。在4℃和加湿环境下温育平板过夜。在上述温育以后，用200μl洗涤缓冲液/孔(PBS+0.05％吐温-20)洗涤平板三次，然后在37℃和加湿环境下用200μL封闭缓冲液/孔(＝洗涤缓冲液+1％明胶；DIFCO cat # 214340)封闭1小时。用200μl洗涤缓冲液/孔(PBS+0.05％吐温-20)洗涤平板三次，然后添加100μL/孔的稀释在封闭缓冲液中的包含牛免疫球蛋白的样品。

[0083] 在37℃和加湿环境下温育1小时以后，用200μl洗涤缓冲液/孔洗涤平板三次，然后每孔添加1∶20,000稀释在封闭缓冲液中的100μL抗牛IgG1-HRP(AbD Serotec，cat# AAI21P)，以检测牛IgG1的存在。为了检测IgA，使用了在封闭缓冲液中稀释至1∶50,000的100μL抗牛IgA-HRP(AbD Serotec，cat# AAI20P)，而为了检测牛IgM，使用了在封闭缓冲液中稀释至1∶50,000的100μL抗牛IgM-HRP(AbD Serotec，cat# AAI19P)。在37℃和加湿环境下温育平板1小时，用200μl洗涤缓冲液/孔洗涤三次，接着用PBS进行第四次洗涤，然后每孔添加100μL TMB底物(在10mL底物缓冲液中的100μL TMB，二者均来自Biosource Int.Cat # 45.011.03和45.014.01)。通过向每个孔中加入100μL的1M H2SO4来终止显色反应，然后在450nm的波长处读取平板。相对于包含牛IgG1、IgA、以及IgM的标准牛血清(Bethyl Cat # RS10-103)的标准曲线来量化样品中存在的牛IgG1、IgA以及IgM免疫球蛋白的总量。

[0084] 图3示出了IgA和IgG1被从顶侧转运到基底外侧，尤其是在pH为6.5的情况下。转运的IgG1和IgA的量相对较低，但正如通过测量旁细胞转运到基底外侧的FITC标记的葡聚糖、以及通过测量TEER所检测的，通过加入初乳并没有在上皮中诱导渗漏，这表明，牛IgA和IgG1可以经人肠上皮被主动转运。

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