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陆地棉转化事件ICR24-397及其特异性鉴定方法

阅读：1026发布：2020-06-26

专利汇可以提供陆地棉转化事件ICR24-397及其特异性鉴定方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了陆地棉转化事件ICR24-397及其特异性鉴定方法。本发明在陆地棉CCRI24中过表达csRRM2基因，得到转基因棉花ICR24-397，其为将外源DNA 片段插入目的棉花基因组第A09号染色体的第7000726-7000849位间，替换掉第A09号染色体的第7000726-7000849位间122bp的碱基序列后得到的棉花。通过试验证明：转基因棉花ICR24-397不仅纤维长度、比强度、整齐度和籽棉产量高于受体材料，而且株高、叶片长度、叶片宽度、成铃数、单铃重等也均高于受体材料，为培育具有优良纤维品质的转基因棉花的研究奠定基础。，下面是陆地棉转化事件ICR24-397及其特异性鉴定方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种转基因棉花的培育方法，包括如下步骤：将目的棉花基因组第A09号染色体的第
7000726-7000849位之间的大小为122bp的片段替换为外源DNA片段，得到转基因棉花；
所述外源DNA片段为含有csRRM2基因的DNA分子；
所述转基因棉花的纤维品质高于所述目的棉花。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述外源DNA片段包括csRRM2基因表达盒和抗草甘膦基因Epsps表达盒。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于：所述外源DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1-3任一所述方法，其特征在于：
所述目的棉花为陆地棉CCRI24；
或，所述转基因棉花的保藏编号为CCTCC NO:P201821。
5.用于检测或辅助检测待测植物样品是否为权利要求1-4任一所述方法获得的转基因棉花或其后代的方法，包括如下步骤：检测所述待测植物样品的基因组DNA中是否含有DNA片段A，
所述DNA片段A依次由左侧翼序列、权利要求1-4中任一所述的外源DNA片段和右侧翼序列组成；
若所述待测植物样品的基因组DNA含有所述DNA片段A，则所述待测植物样品为或候选为所述转基因棉花或其后代；
若所述待测植物样品的基因组DNA不含有所述DNA片段A，则所述待测植物样品不为或候选不为所述转基因棉花或其后代；
所述左侧翼序列如SEQ ID NO.2所示；
所述右侧翼序列如SEQ ID NO.3所示。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法为如下1)或2)：
1)直接测序；
2)用引物对甲和/或引物对乙对待测植物样品的基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增产物大小，若引物对甲扩增得到大小为950bp的条带或引物对乙扩增得到大小为800bp的条带，则所述待测植物样品为或候选为所述转基因棉花或其后代；否则，所述待测植物样品不为或候选不为所述转基因棉花或其后代；
所述引物对甲由SEQ ID NO.5所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.6所示的单链DNA分子组成；
所述引物对乙由SEQ ID NO.7所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.8所示的单链DNA分子组成。
7.权利要求1-4任一所述的方法获得的转基因棉花在培育纤维品质提高的棉花中的应用；
或，权利要求1-4任一所述的方法获得的转基因棉花在棉花育种中的应用。
8.一种培育纤维品质提高的棉花的方法，包括如下步骤：
(1)按照权利要求1-4任一所述的方法获得转基因棉花；
(2)将所述转基因棉花自交或杂交，得到繁育后代，按照权利要求5或6所述的方法鉴定所述繁育后代，得到目标植株。
9.如下a)-c)中任一所述的生物材料：
a)权利要求5或6中所述的左侧翼序列和权利要求5或6中所述的右侧翼序列；
b)权利要求1-4中任一所述的外源DNA片段；
c)与权利要求1-4中任一所述的外源DNA片段相关的生物材料；
所述生物材料为下述A1)至A11)中的任一种：
A1)含有所述外源DNA片段的表达盒；
A2)含有所述外源DNA片段的重组载体；
A3)含有A1)所述表达盒的重组载体；
A4)含有所述外源DNA片段的重组微生物；
A5)含有A1)所述表达盒的重组微生物；
A6)含有A2)所述重组载体的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有所述外源DNA片段的转基因植物细胞系；
A9)含有A1)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系。
10.权利要求9所述的生物材料在调控棉花纤维品质和/或纤维长度和/或纤维马克隆值和/或纤维整齐度和/或纤维伸长率和/或纤维比强度和/或籽指和/或单铃重和/或成铃数和/或衣分和/或株高和/或叶面积中的应用。

说明书全文

陆地棉转化事件ICR24-397及其特异性鉴定方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及陆地棉转化事件ICR24-397及其特异性鉴定方法。

背景技术

[0002] 转化事件是由外源基因在基因组插入位点的上下游侧翼区和外源基因构成的分子结构。通常，外源基因转化植物可以得到一个转化体群体，这个转化体群体包含大量独立的事件，其中每个事件都是独特的。外源基因在植物中的表达受到外源基因所插入的染色体位置的影响。这可能源自染色质结构或者整合位点附近转录调控元件的影响。相同基因在不同转化事件中的表达水平具有很大的差异，在表达的空间或时间模式上也可能存在差异。而且外源基因的插入也可能会影响内源基因的表达。因此，每个独立转化事件对受体植物的影响都是不同的。获得能有效表达外源基因，同时不影响植株本身农艺性状的植物转化事件在培育转基因作物新品种中具有重要的应用价值。

[0003] 棉花是我国重要的经济作物，主要种植目的是收获棉花纤维，作为纺织业原料。此外，棉籽油和棉籽蛋白是重要的植物油和蛋白质资源，分别占世界食用植物油和蛋白质总供应量的10％和6％，棉花的短绒、棉籽壳、棉杆、棉酚等都有工业用途。

[0004] 提高棉花的纤维品质和产量一直以来都是棉花领域的研究重点，一方面由于棉花纤维是自然界中目前已发现的最长的细胞，其为研究细胞伸长调控机制提供了最佳的实验材料；另一方面由于棉花纤维是单细胞凸起形成的，这为研究细胞命运决定提供了便利。此外，长纤维及高产量是纺织工业所期望，也是广大棉花所需要的，因此提高棉花的纤维品质及产量在生产上具有重要的意义。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种转基因棉花的培育方法。

[0006] 本发明提供的转基因棉花的培育方法包括如下步骤：将目的棉花基因组第A09号染色体的第7000726-7000849位之间的大小为122bp的片段替换为外源DNA片段，得到转基因棉花；

[0007] 所述外源DNA片段为含有csRRM2基因的DNA分子；

[0008] 所述转基因棉花的纤维品质高于所述目的棉花。

[0009] 进一步的，所述外源DNA片段包括csRRM2基因表达盒和抗草甘膦基因Epsps表达盒。

[0010] 所述csRRM2基因全长198bp，编码FCA蛋白，具有提高棉花纤维品质、皮棉产量、促进棉铃、种子增大等功能。所述csRRM2基因表达盒依次包括来自花椰菜花叶病毒的CAMV35S启动子、csRRM2基因和NOS终止子。其中CAMV35S启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第3451-3796位核苷酸所示；csRRM2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第3225-3422位核苷酸所示；NOS终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第2949-3201位核苷酸所示。所述csRRM2基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第2927-4198位核苷酸所示。

[0011] 所述抗草甘膦基因Epsps全长1551bp，编码5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶，过量表达EPSPS可使植物获得对除草剂的抗性。所述抗草甘膦基因Epsps表达盒依次包括来自花椰菜花叶病毒的CAMV35S增强启动子、抗草甘膦基因Epsps和Ploy A终止子。其中CAMV35S增强启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第1935-2612位所示；抗草甘膦基因Epsps的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第317-1867位所示；Ploy A终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第103-277位所示。所述抗草甘膦基因Epsps表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第103-2612位核苷酸所示。

[0012] 更进一步的，所述外源DNA片段的核苷酸序列具体如SEQ ID NO.1所示。

[0013] 在本发明的具体实施例中，利用上述方法获得了棉花转化事件ICR24-397，其为将SEQ ID NO.1所示的外源DNA片段插入目的棉花基因组第A09号染色体的第7000726-7000849位间，替换掉第A09号染色体的第7000726-7000849位间122bp的片段后得到的转基因棉花。且自第7000726位上游且紧邻第7000726位核苷酸的上游侧翼片段的核苷酸序列(左侧翼序列)如SEQ ID NO.2所示，自第7000849位下游且紧邻第7000849位核苷酸的下游侧翼片段的核苷酸序列(右侧翼序列)如SEQ ID NO.3所示。

[0014] 本发明所述的棉花转化事件ICR24-397是利用农杆菌介导法，将目的基因csRRM2和抗草甘膦基因Epsps构建到pCambia1300载体上，通过农杆菌介导法，将目的基因csRRM2和抗草甘膦基因Epsps导入受体棉花的外植体中，利用分子生物学和生物测定的方法筛选得到表现最佳的转化事件。

[0015] 上述方法中，所述转基因棉花的纤维品质高于所述目的棉花具体体现在如下B1)-B8)中任一种：

[0016] B1)转基因棉花纤维的长度高于所述目的棉花；

[0017] B2)转基因棉花纤维的马克隆值低于所述目的棉花；

[0018] B3)转基因棉花纤维的整齐度高于所述目的棉花；

[0019] B4)转基因棉花纤维的伸长率高于所述目的棉花；

[0020] B5)转基因棉花纤维的比强度高于所述目的棉花；

[0021] B6)转基因棉花的籽指高于所述目的棉花；

[0022] B7)转基因棉花的单铃重高于所述目的棉花；

[0023] B8)转基因棉花的单株结铃数高于所述目的棉花。

[0024] 上述方法中，所述目的棉花可为陆地棉CCRI24。

[0025] 本发明获得的转化事件ICR24-397于2018年10月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为棉花种子(Gossypium hirsutum L.)，保藏编号为CCTCC NO：P201821。

[0026] 本发明的另一个目的是提供用于检测或辅助检测待测植物样品是否为上述方法获得的转基因棉花或其后代的方法。

[0027] 本发明提供的用于检测或辅助检测待测植物样品是否为上述方法获得的转基因棉花或其后代的方法包括如下步骤：检测所述待测植物样品的基因组DNA中是否含有DNA片段A，

[0028] 所述DNA片段A依次由左侧翼序列、上述外源DNA片段和右侧翼序列组成；

[0029] 若所述待测植物样品的基因组DNA含有所述DNA片段A，则所述待测植物样品为或候选为所述转基因棉花或其后代；

[0030] 若所述待测植物样品的基因组DNA不含有所述DNA片段A，则所述待测植物样品不为或候选不为所述转基因棉花或其后代；

[0031] 所述左侧翼序列如SEQ ID NO.2所示；

[0032] 所述右侧翼序列如SEQ ID NO.3所示。

[0033] 上述用于检测或辅助检测待测植物样品是否为上述方法获得的转基因棉花或其后代的方法为如下1)或2)：

[0034] 1)直接测序；

[0035] 2)用引物对甲和/或引物对乙对待测植物样品的基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增产物大小，若引物对甲扩增得到大小为950bp的条带或引物对乙扩增得到大小为800bp的条带，则所述待测植物样品为或候选为所述转基因棉花或其后代；否则，所述待测植物样品不为或候选不为所述转基因棉花或其后代；

[0036] 所述引物对甲由SEQ ID NO.5所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.6所示的单链DNA分子组成；

[0037] 所述引物对乙由SEQ ID NO.7所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.8所示的单链DNA分子组成。

[0038] 本发明还有一个目的是提供上述方法获得的转基因棉花的新用途。

[0039] 本发明提供了上述方法获得的转基因棉花在培育纤维品质提高的棉花中的应用。

[0040] 本发明还提供了上述方法获得的转基因棉花在棉花育种中的应用。

[0041] 本发明的最后一个目的是提供一种培育纤维品质提高的棉花的方法。

[0042] 本发明提供的培育纤维品质提高的棉花的方法包括如下步骤：

[0043] (1)按照上述培育方法获得转基因棉花；

[0044] (2)将所述转基因棉花自交或杂交，得到繁育后代，按照上述方法鉴定所述繁育后代，得到目标植株。

[0045] 如下a)-c)中任一所述的生物材料也属于本发明的保护范围：

[0046] a)上述左侧翼序列和上述右侧翼序列；

[0047] b)上述外源DNA片段；

[0048] c)与上述外源DNA片段相关的生物材料；

[0049] 所述生物材料为下述A1)至A11)中的任一种：

[0050] A1)含有所述外源DNA片段的表达盒；

[0051] A2)含有所述外源DNA片段的重组载体；

[0052] A3)含有A1)所述表达盒的重组载体；

[0053] A4)含有所述外源DNA片段的重组微生物；

[0054] A5)含有A1)所述表达盒的重组微生物；

[0055] A6)含有A2)所述重组载体的重组微生物；

[0056] A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

[0057] A8)含有所述外源DNA片段的转基因植物细胞系；

[0058] A9)含有A1)所述表达盒的转基因植物细胞系；

[0059] A10)含有A2)所述重组载体的转基因植物细胞系；

[0060] A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系。

[0061] 所述生物材料在调控棉花纤维品质和/或纤维长度和/或纤维马克隆值和/或纤维整齐度和/或纤维伸长率和/或纤维比强度和/或籽指和/或单铃重和/或成铃数和/或衣分和/或株高和/或叶面积中的应用也属于本发明的保护范围。

[0062] 上述生物材料中，所述重组载体为含有csRRM2基因表达盒和抗草甘膦基因Epsps表达盒的重组载体。在本发明的一个实施方案中，所述重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0063] 所述重组细胞为含有所述的重组载体的重组农杆菌细胞。在本发明的一个实验方案中，所述重组细胞为含有所述重组载体的重组农杆菌LBA4404细胞。

[0064] 本发明将csRRM2基因导入陆地棉CCRI24中，使csRRM2基因在陆地棉CCRI24中过表达，得到转基因棉花ICR24-397，转基因棉花ICR24-397为将外源DNA片段插入目的棉花基因组第A09号染色体的第7000726-7000849位间，替换掉第A09号染色体的第7000726-7000849位间大小为122bp的碱基序列后得到的棉花。通过试验证明：转基因棉花ICR24-397不仅纤维长度、比强度和整齐度高于受体材料，而且成铃数、单铃重、籽指等也均高于受体材料，为培育具有优良纤维品质的转基因棉花的研究奠定基础。附图说明

[0065] 图1为转化事件ICR24-397的图解表示。

[0066] 图2为转基因棉花ICR24-397和受体材料CCR124的棉铃、纤维及种子的表型比较。RRM2/T4代表转基因株系自交第四代。

[0067] 图3为转基因棉花ICR24-397和受体材料CCR124的结铃性及株型的表型比较。RRM2/T4、转基因/RRM2均代表转基因株系自交第四代。

具体实施方式

[0068] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0069] 下述实施例中的陆地棉CCRI24在文献“PAG1,a cotton brassinosteroid catabolism gene,modulates fiber elongation”中公开过，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。

[0070] 下述实施例中的农杆菌LBA4404在文献“Constitutive expression of the virulence genes improves the efficiency of plant transformation by Agrobacterium”中公开过，公众可从中国农业科学院棉花研究所获得。

[0071] 实施例1、转csRRM2棉花的获得及农艺性状分析

[0072] 一、转csRRM2棉花的获得及保藏

[0073] 1、重组载体的构建

[0074] 将csRRM2基因表达盒插入pCambia1300载体(该载体购于NTCC典型培养物保藏中心下属的BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心，货号为Biovectorpcambia1300)的EcoRI和HindIII酶切位点间，且保持pCambia1300载体的其他序列不变，得到重组载体(重组载体的核苷酸序列为SEQ ID NO.4)。

[0075] 上述csRRM2基因表达盒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第2927-4198位核苷酸所示。csRRM2基因表达盒依次包括来自花椰菜花叶病毒的CAMV35S启动子、csRRM2基因和NOS终止子；其中，CAMV35S启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第3451-3796位核苷酸所示；csRRM2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第3225-3422位核苷酸所示；NOS终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第2949-3201位核苷酸所示。

[0076] pCambia1300载体自身包括抗草甘膦基因Epsps表达盒，抗草甘膦基因Epsps表达盒的核苷酸序列如序列1第103-2612位核苷酸所示。抗草甘膦基因Epsps表达盒依次包括花椰菜花叶病毒的CAMV35S增强启动子、5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)和Ploy A终止子。其中CAMV35S增强启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第1935-2612位所示；抗草甘膦基因Epsps的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第317-1867位所示；Ploy A终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第103-277位所示。过量表达EPSPS可使植物获得对除草剂的抗性，同时在组织培养过程中使用草甘膦来进行阳性苗的筛选。

[0077] 2、重组菌的获得

[0078] 将步骤1获得的重组载体导入农杆菌LBA4404中，得到重组菌。

[0079] 3、转csRRM2棉花的获得

[0080] 采用农杆菌介导的方法将步骤2获得的重组菌转化陆地棉CCRI24的外植体(1500个)，在含有草甘膦的培养基上培养诱导形成愈伤组织，选择转化的愈伤组织，愈伤组织在草甘膦筛选培养基上形成胚性愈伤组织，挑选存活的胚性愈伤转化形成再生成棉花，最后共获得60个T0代转csRRM2棉花，并将其用于筛选。

[0081] 4、转csRRM2棉花的鉴定

[0082] (1)在温室种植收获的T1代转csRRM2棉花种子，得到T1代转csRRM2棉花。提取T1代转csRRM2棉花叶片的基因组DNA，采用引物5’-GGATCCATGGGTGCGGTAGAGTT-3’和5’-AGATCTTGTGCCACTTCCCTTG-3’进行PCR扩增，检测目的基因是否存在，并统计材料的分离比，根据孟德尔遗传定律，获得17个单拷贝的T1代转csRRM2棉花。

[0083] (2)采用Taqman PCR和Southern blot对上述步骤(1)获得的17个单拷贝的T1代转csRRM2棉花进一步验证。在花铃期对获得的17个单拷贝的T1代转csRRM2棉花进行csRRM2基因表达分析的测定。具体步骤如下：分别在开花后0天(开花当天记为0天)、5天、15天，对17个单拷贝的T1代转csRRM2棉花和受体材料CCRI24的csRRM2表达量进行分析。结果表明：17个单拷贝的T1代转csRRM2棉花中有9个T1代转csRRM2棉花的表达量较受体材料CCRI24大幅提高。

[0084] (3)在吐絮期测定上述步骤(2)获得的9个T1代转csRRM2棉花的纤维品质。结果表明：9个T1代转csRRM2棉花中有6个T1代转csRRM2棉花的棉花纤维长度较受体材料CCRI24改良或伸长。

[0085] (4)在第一年田间大田试验中在相同位置的成对地块中评估上述步骤(3)获得的6个T2代转csRRM2棉花的农艺学性状(纤维品质、单铃重、衣分、籽指、株高、始节高、果枝数、生育期，其中纤维品质包括长度、比强度、马克隆值、伸长率、整齐度)及转基因插入对棉花生长发育、棉花产量的影响。结果表明：6个T2代转csRRM2棉花中共有2个T2代转csRRM2棉花的农艺学性状好于受体材料CCRI24。

[0086] (5)在第二年田间大田试验中在相同位置的成对地块中评估上述步骤(4)获得的2个T2代转csRRM2棉花的农艺学性状(纤维品质、单铃重、衣分、籽指、株高、始节高、果枝数、生育期，其中纤维品质包括长度、比强度、马克隆值、伸长率、整齐度)及转基因插入对棉花生长发育、棉花产量的影响。结果表明：2个T2代转csRRM2棉花中有1个T2代转csRRM2棉花的农艺学性状好于受体材料CCRI24，将该T2代转csRRM2棉花的种子命名为ICR24-397。

[0087] 5、T4代转csRRM2棉花种子的保藏

[0088] 将T2代转csRRM2棉花ICR24-397进行自交，直至获得T4代转csRRM2棉花纯合株系ICR24-397。并于2018年10月16日将T4代转csRRM2棉花种子(Gossypium hirsutum L.)ICR24-397保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为棉花种子(Gossypium hirsutum L.)，保藏编号为CCTCC NO：P201821。

[0089] 二、转csRRM2棉花的农艺性状分析

[0090] 1、纤维品质和籽棉产量

[0091] 将T4代转csRRM2棉花纯合株系ICR24-397与受体材料CCRI24进行田间产量试验。在河南安阳设计小区试验，设置3个小区，3个小区设置完全相同，小区行长8m，每行种植30株，行间距80cm，每个材料种植3行，小区共6行。采用students’test对T4代转csRRM2棉花纯合株系ICR24-397与受体材料CCRI24纤维的纤维长度、马克隆值、整齐度、伸长率、比强度、单铃重、成铃数、籽指和衣分进行了统计分析。

[0092] 纤维长度、整齐度、比强度、伸长率和马克隆值的统计结果如表1所示：与受体材料CCRI24相比，T4代转csRRM2棉花纯合株系ICR24-397的纤维长度、整齐度、比强度、伸长率均有提高，马克隆值有所降低，更适合生产的需要，其中，纤维长度、伸长率、比强度和受体材料CCRI24之间呈极显极著性差异。

[0093] 单铃重、成铃数、籽指和衣分的统计结果如表2所示：与受体材料CCRI24相比，T4代转csRRM2棉花纯合株系ICR24-397的单铃重、成铃数(单株成铃数)、籽指均有提高，衣分有所降低，主要是由于转基因材料的棉铃体积变大，种子体积变大，更适合高产的需要。

[0094] 表1、转基因棉花ICR24-397和受体材料CCR124的纤维品质数据

[0095]

[0096] 表2、转基因棉花ICR24-397和受体材料CCR124的单铃重、成铃数、籽指、衣分[0097]

[0098] 2、其他方面的影响

[0099] 由于启动子是组成型启动子，因此不仅在种子和纤维中表达，其他组织也会受到一定影响，为了研究除了改良纤维品质尤其是纤维长度外，csRRM2基因对其他组织是否产生影响，对T4代转csRRM2棉花纯合株系ICR24-397与受体材料CCRI24的株高、叶面积、棉铃大小、种子大小进行了观察和检测。

[0100] 转csRRM2棉花和受体材料CCRI24的棉铃、纤维、种子及植株的表型观察结果如图2和图3所示。从图中可以看出，T4代转csRRM2棉花纯合株系ICR24-397的株高、叶面积、棉铃大小、种子大小显著高于受体材料CCRI24。说明csRRM2基因的表达对植物的株高、叶片大小、棉铃大小、种子大小产生了一定程度的影响。

[0101] 三、ICR24-397的DNA序列的表征分析

[0102] 采用分子生物学的方法分析ICR24-397基因组的插入物和与插入物相连接侧翼连接的基因组序列。具体步骤如下：

[0103] 1、棉花基因组DNA的提取。取转csRRM2棉花ICR24-397的幼嫩叶片约100mg置于2.0mL的EP管中，采用液氮冷冻EP管，然后采用冷冻研磨仪研磨，采用Qiagen公司DNeasy Plant Mini Kit(50)(货号为69104)提取基因组DNA。

[0104] 2、DNA文库的构建。根据Clontech公司的Universal Genome WalkerTM2.0 User Manual试剂盒(Cat.No.634923)中的说明书，采用4种不同的限制性内切酶(DraI、EcoRV、PvuII、StuI)进行基因组DNA的消化，过夜消化，得到消化产物。采用试剂盒内置的NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit盒子对消化产物回收，然后在回收产物两端采用T4 DNA连接酶加上试剂盒内置的接头，至此4个加接头的DNA文库构建完毕。

[0105] 3、测序。根据已知的转基因插入物序列，在其5’端和3’端分别设计两条巢式引物，然后采用试剂盒(Clontech公司的Universal Genome WalkerTM2.0 User Manual试剂盒)中提供的方案进行扩增。利用琼脂糖凝胶电泳分离从反应产生的扩增子，随后使用QIAGEN凝胶纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行纯化，按照大连宝生物生命科技有限公司的pMD-19T-Simple(货号为D104A)试剂盒中提供的方案将凝胶纯化的扩增子克隆至T克隆载体中，并转化大肠杆菌DH5α中，在氨苄抗性的平板上筛选转化子，并进行菌落PCR，阳性克隆进行单克隆测序。

[0106] 测序结果表明：转csRRM2棉花ICR24-397为将序列表中SEQ ID NO.1所示的外源DNA片段插入陆地棉CCRI24基因组第A09号染色体的第7000726-7000849位间，替换掉第A09号染色体的第7000726-7000849位间大小为122bp的碱基序列后得到的转基因棉花，且自第7000726位上游且紧邻第7000726位核苷酸的上游侧翼片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，自第7000849位下游且紧邻第7000849位核苷酸的下游侧翼片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

[0107] 实施例2、ICR24-397繁育后代性状的获得和鉴定及其农艺性状分析[0108] 一、ICR24-397繁育后代性状的获得

[0109] 1、杂交

[0110] 在开花前1天下午通过人手工或者人为行动除去第一棉花的花粉，并且采用蜡管套住花的柱头，防止外来花粉与柱头接触，第二天上午待第二棉花的花粉散粉时，通过人手工收集第二种棉花的花粉，并将该花粉与第一种植物的花柱或柱头接触，即完成杂交过程。其中，第一棉花为实施例1中的ICR24-397时，第二棉花为其他棉花(陆地棉CCRI24)，或者第二棉花为实施例1中的ICR24-397时，第一棉花为其他棉花(陆地棉CCRI24)。

[0111] 吐絮期收获杂交铃，并将棉花自然晒干，轧花，并采用浓硫酸拖绒，即获得杂交种子。种植，获得杂种后代，即为ICR24-397繁育后代。

[0112] 2、自交

[0113] 在开花前1天，采用嫁接夹直接夹住ICR24-397的花蕾或者采用细线捆绑花蕾，防止开花时外来花粉与ICR24-397的柱头接触；或者通过网袋将整个棉花植株套住，可以有效的防止通过昆虫等传粉，能够实现棉花的自花授粉。通过上述步骤可以完成自交。

[0114] 吐絮期收获杂交铃，并将棉花自然晒干，轧花，并采用浓硫酸拖绒，即获得自交种子，种植，得到自交后代，即为ICR24-397繁育后代。

[0115] 二、ICR24-397繁育后代性状的鉴定及其农艺性状分析

[0116] 1、ICR24-397繁育后代性状的鉴定方法

[0117] 以ICR24-397繁育后代的基因组DNA为模板，采用特异性引物进行PCR扩增，若PCR扩增产物含有ICR24-397的扩增子(扩增子是指一条或者一段采用PCR扩增技术合成的DNA分子)，说明ICR24-397繁育后代具有和ICR24-397相同的性状，若PCR扩增产物不含ICR24-397的扩增子，说明ICR24-397繁育后代不具有和ICR24-397相同的性状。具体鉴定方法如下：

[0118] (1)引物的设计

[0119] 基于上游侧翼序列和外源DNA分子设计如下鉴定引物：

[0120] GSP1：CGCACACACATTTCAGGTC(SEQ ID NO.5)；

[0121] GSP2：GCCGATTCTCTCTCCGTTA(SEQ ID NO.6)。

[0122] 基于下游侧翼序列和外源DNA分子设计如下鉴定引物：

[0123] GSP3：GTTTCCCGCCTTCAGTTT(SEQ ID NO.7)；

[0124] GSP4：CAACCACAACACTACACCTCAT(SEQ ID NO.8)。

[0125] (2)PCR扩增

[0126] 以ICR24-397繁育后代的基因组DNA为模板，分别采用步骤(1)设计的引物GSP1/GSP2和引物GSP3/GSP4进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

[0127] PCR扩增体系如下：2×MASTRE PCR MIX 10μL、上游引物(10μM)0.5μL、下游引物(10μM)0.5μL、模板DNA(50ng/μL)1μL、超纯水8μL，总体积20μL。

[0128] PCR反应条件如下：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，32个循环；72℃5min。

[0129] (3)PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并对其进行测序。

[0130] 若引物GSP1/GSP2扩增产物的大小为950bp或引物GSP3/GSP4扩增产物的大小为800bp，则说明ICR24-397繁育后代含有ICR24-397扩增子，ICR24-397繁育后代具有ICR24-
397性状，否则不具有ICR24-397性状。

[0131] 2、ICR24-397繁育后代性状的农艺性状分析

[0132] 按照实施例1步骤二中的方法检测上述步骤1获得的具有ICR24-397扩增子的ICR24-397繁育后代(ICR24-397)和受体材料CCRI24的纤维品质。

[0133] 纤维长度、比强度、伸长率和马克隆值的统计结果如表3所示：从表中可以看出，与受体材料CCRI24相比，ICR24-397繁育后代(ICR24-397)的纤维长度、比强度和伸长率均有所提高，说明ICR24-397繁育后代(ICR24-397)的棉花纤维品质有所提高。

[0134] 表3、ICR24-397繁育后代(ICR24-397)的纤维品质的检测结果

[0135]

[0136] 因此可以按照如下方法检测或辅助检测植物样品是否来源于转基因棉花ICR24-397或其后代：

[0137] 用引物对1和/或引物对2对植物样品的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，检测PCR扩增产物；

[0138] 若引物对1扩增产物的大小为950bp或引物对2扩增产物的大小为800bp，则植物样品为或候选为转基因棉花ICR24-397或其后代；否则植物样品不为或候选不为转基因棉花ICR24-397或其后代。

[0139] 引物对1由SEQ ID NO.5所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.6所示的单链DNA分子组成；

[0140] 引物对2由SEQ ID NO.7所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.8所示的单链DNA分子组成。

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