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一种利用微卫星鉴定和划分湖羊家系的方法及其应用

阅读：383发布：2020-05-11

专利汇可以提供一种利用微卫星鉴定和划分湖羊家系的方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种利用微卫星鉴定和划分湖羊家系的方法及其应用，包括以下步骤：湖羊基因组DNA的提取；湖羊多态性微卫星标记的选择与荧光基团修饰；降落式PCR扩增；分析基因型等数据，进行家系的鉴定与划分等步骤。本发明选择了多个微卫星位点，这些位点分布于多个常染色体，连锁性低、等位基因数目多、多态性高、杂合度高，利用降落式PCR扩增，操作便捷、产物特异性强，可快速、准确地鉴定和划分湖羊家系。累积单亲排除率、父权排除率、双亲排除率分别达到99.6072%，99.8808%，99.9999%，完全能够满足遗传育种中亲子鉴定和系谱分析的要求，在湖羊家系选育和育种中有很大的应用价值。，下面是一种利用微卫星鉴定和划分湖羊家系的方法及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.用于鉴定和划分湖羊家系的微卫星标记，其特征在于，由9个微卫星标记组成，具体如下，
。
2.一种利用微卫星鉴定和划分湖羊家系的方法及其应用，包括以下步骤：
（1）提取待测湖羊的DNA：对样本湖羊颈静脉采血1 2 mL，储存在含EDTA采血管中待用，~
采用TIANGEN血液基因组DNA提取试剂盒提取待鉴别家系湖羊的DNA，作为模板待用；
（2）荧光基团修饰微卫星引物：选取权利要求1所述的9对微卫星引物，分成3组，其中BM3501、INRA023和MAF33为一组，TGLA137、HH64和FCB48为一组，MCM527、ETH152和VH72为一组，在每组引物的正向引物5’ 端分别用FAM、HEX、TAMRA三种不同的荧光基团进行修饰，用于降落式PCR；
（3）降落式PCR扩增：使用步骤（2）所述修饰后的9对引物，对步骤（1）获得的DNA模板进行降落式PCR扩增，扩增产物以步骤（2）所述分组进行混合，混合物作为上机样本；
（4）鉴定和划分湖羊家系：对步骤（3）所述上机样本采用基因分析仪进行分析，读取每个样本的基因型信息，用遗传软件计算个体之间的遗传距离，根据遗传距离绘制聚类图，以此进行湖羊家系的鉴定与划分。
3.根据权利要求2所述一种利用微卫星鉴定和划分湖羊家系的方法及其应用，其特征在于，所述步骤（3）中降落式PCR扩增的反应体系为25µL，包括超纯水10.5µL，2×Mix 12.5µL，正反引物各0.5µL，DNA模板 1µL。
4.根据权利要求2所述一种利用微卫星鉴定和划分湖羊家系的方法及其应用，其特征在于，所述步骤（3）中降落式PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，64℃退火
30s，72℃延伸40s，以后每个循环退火温度依次降低1℃，直到58℃，共10个循环；之后95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，共25个循环；最后72℃延伸10min。
5.根据权利要求2所述一种利用微卫星鉴定和划分湖羊家系的方法及其应用，其特征在于，所述步骤（4）中上机样本在ABI3730XL基因分析仪上进行分型，以Rox-500为内参，使用GENEMAPPER 4.0软件读取个体等位基因型，使用CERVUS 3.0.7软件分析待测湖羊基因型信息和个体间亲缘关系，使用POPGENE 1.32软件计算个体间的Nei’s遗传距离，以此构建UPGMA聚类图，划分家系。

说明书全文

一种利用微卫星鉴定和划分湖羊家系的方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及动物遗传育种的分子标记技术领域，具体为一种利用微卫星鉴定和划分湖羊家系的方法及其应用。

背景技术

[0002] 湖羊是中国特有的绵羊品种，原产于浙江嘉兴和太湖流域，具有早熟、常年发情、多胎、泌乳性能好、生长发育快、改良后产肉性能理想、适应性强等优良性状，具有重要的经济价值，是我国一级保护地方畜禽品种。近年来，养殖湖羊成为脱贫攻坚的重点项目，发展湖羊产业对我国畜牧业有着重要的意义。

[0003] 在绵羊育种中，准确的系谱信息对估计遗传参数、制定育种方案和避免近交衰退具有重要的意义。随着湖羊优秀的潜能被逐渐发掘，其饲养规模逐年扩大，然而大部分湖羊养殖场仍存在引种难、饲养技术落后等问题，往往需要多年、多次、多场进行引种，导致种羊在入场时便存在亲缘关系不清晰的问题。加上大多数管理人员育种理论薄弱，场内常发生近亲交配、混精、登记不规范等现象，致使湖羊群体家系混乱，严重影响了湖羊的产品品质、产量和养殖效益。因此，开展湖羊家系鉴定和对系谱混乱的湖羊群体估计遗传距离，重新划分家系已成为湖羊产业可持续发展亟待解决的重要问题。

[0004] 目前针对湖羊家系鉴定和划分研究的报道甚少。微卫星标记具有多态性高、稳定性强、特异性高、共显性遗传等优点。微卫星分子标记技术已成为动植物亲子关系鉴定最广泛可靠的手段之一。众多研究表明，微卫星标记在确认动物父母本和分析家系方面具有重要的应用价值。为进一步开展湖羊育种工作、挖掘湖羊品种潜力和保护湖羊品种资源，建立一种利用微卫星鉴定和划分湖羊家系的方法及其应用具有重要的理论和生产意义。

发明内容

[0005] 本发明旨在提供一种利用微卫星鉴定和划分湖羊家系的方法及其应用，为湖羊分子育种提供必要的分子标记、荧光基团修饰组合方式、降落式PCR扩增方法。本方法具有准确率高、速度快、成本低、PCR产物稳定且特异性高等优点，主要是通过湖羊微卫星标记位点进行降落式PCR扩增和基因分型检测来实现。

[0006] 本发明的技术方案如下：一种鉴定和划分湖羊家系的方法及其应用的微卫星引物，所述引物为分布在多个常染色体上，等位基因数目多、多态性高、PCR产物稳定可靠的9对微卫星引物，参见图1。

[0007] 一种利用微卫星鉴定和划分湖羊家系的方法及其应用，包括以下步骤：（1）提取待测湖羊的DNA：对样本湖羊颈静脉采血1 2 mL，储存在含EDTA采血管中待用，~
采用TIANGEN血液基因组DNA提取试剂盒提取待鉴别家系湖羊的DNA，作为模板待用；
（2）荧光基团修饰微卫星引物：选取9对微卫星引物，分成3组，其中BM3501、INRA023和MAF33为一组，TGLA137、HH64和FCB48为一组，MCM527、ETH152和VH72为一组，在每组引物的正向引物5’ 端分别用FAM、HEX、TAMRA三种不同的荧光基团进行修饰，用于降落式PCR；
（3）降落式PCR扩增：使用步骤（2）所述修饰后的9对引物，对步骤（1）获得的DNA模板进行降落式PCR扩增，扩增产物以步骤（2）所述分组进行混合，混合物作为上机样本；
（4）鉴定和划分湖羊家系：对步骤（3）所述上机样本采用基因分析仪进行分析，读取每个样本的基因型信息，用遗传软件计算个体之间的遗传距离，根据遗传距离绘制聚类图，以此进行湖羊家系的鉴定与划分。

[0008] 所述的一种利用微卫星鉴定和划分湖羊家系的方法及其应用步骤（3）具体方法优选：降落式PCR扩增的反应体系为25µL，包括超纯水10.5µL，2×Mix 12.5µL，正反引物各0.5µL，DNA模板1µL。

[0009] 所述的一种利用微卫星鉴定和划分湖羊家系的方法及其应用步骤（3）具体方法优选：所述的降落式PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，64℃退火30s， 72℃延伸40s，以后每个循环退火温度依次降低1℃，直到58℃，共10个循环；之后95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，共25个循环；最后72℃延伸10min。

[0010] 所述的一种利用微卫星鉴定和划分湖羊家系的方法及其应用步骤（4）具体方法优选：上机样本在ABI3730XL基因分析仪上进行分型，以Rox-500为内参，使用GENEMAPPER 4.0软件读取个体等位基因型，使用CERVUS 3.0.7软件分析待测湖羊基因型信息和个体间亲缘关系。使用POPGENE 1.32软件计算待测样本间的Nei’s遗传距离，以此构建UPGMA聚类图，划分家系。

[0011] 本发明的有益效果是：（1）本发明选择了多个微卫星位点，这些微卫星位点分布在多个常染色体上，具有连锁性低、等位基因数目多、多态性高、杂合度高等优点，利用降落式PCR扩增，操作便捷、产物特异性强，可以快速、准确地鉴定与划分湖羊家系。9个微卫星位点累积单亲排除率、父权排除率、双亲排除率分别达到99.6072%、99.8808%和99.9999%，完全能够满足遗传育种中亲子鉴定和系谱分析的要求，在湖羊家系选育和育种中有很大的应用价值；
（2）本发明首次公开了一种利用微卫星鉴定和划分湖羊家系的方法和应用，可以有效地解决湖羊家系混乱等问题，为推动湖羊传统育种工作、分子育种工作、保种保育工作打下了重要的基础。
附图说明

[0012] 图1为微卫星位点基本信息和荧光基团修饰分组。

[0013] 图2 为9个微卫星位点引物的遗传多样性统计及排除概率。

[0014] 图3为实施例1中根据Nei’s遗传距离画出的UPGMA聚类图。

具体实施方式

[0015] 下面结合实施例对本发明进行详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0016] 实施例1（1）提取待鉴别家系湖羊DNA
选择30只待测湖羊种公羊，颈静脉采血1 2 mL，储存在含EDTA采血管中待用，采用~
TIANGEN血液基因组DNA提取试剂盒提取样本基因组DNA，提取步骤参照产品说明书（http://www.tiangen.com/asset/imsupload/up0406252001543631420.pdf）。

[0017] （2）湖羊多态性微卫星标记选择与反应体系根据已发表文献（曾检华等《基于微卫星标记的湖羊资源保护效果的评价》）和国际动物遗传学会（https://www.isag.us/）推荐的绵羊微卫星位点，筛选出9个分布于多个常染色体，连锁性低、等位基因数目多、多态性和杂合度高的微卫星位点。将这9对微卫星的正向引物5’端分别用FAM、HEX、TAMRA三种不同的荧光基团进行修饰，引物在北京天一辉远生物科技有限公司合成，引物及荧光分组信息参见图1。

[0018] 降落式PCR扩增的反应体系为25μL，包括超纯水10.5µL，2×Mix 12.5µL，正反引物各0.5µL，DNA模板 1µL。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，64℃退火30s， 72℃延伸40s，以后每个循环退火温度依次降低1℃，直到58℃，共10个循环；之后95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，共25个循环；最后72℃延伸10min。

[0019] （3）微卫星位点基因分型及家系划分扩增产物在ABI3730XL基因分析仪上进行分型，以Rox-500为内参，使用GENEMAPPER
4.0软件读取个体等位基因型，使用CERVUS 3.0.7软件分析9个微卫星位点的遗传多样性及排除概率（图2）并进行亲子鉴定模拟分析，使用POPGENE 1.32软件计算个体间的Nei’s遗传距离，以此构建UPGMA聚类图，划分家系（图3）。

[0020] 注：图2中k为等位基因数目，HO为观察杂合度，HE为期望杂合度，PIC为多态含量，P1：单亲排除率，已知一个候选亲本和子代的基因型，排除候选亲本的概率；P2：父权排除率，已知一个亲本信息，排除子代与另一假设亲本是亲子关系的排除概率；P3：双亲排除率，候选父母双方和子代基因型已知，排除父母双方的概率。F（Null）表示无效等位基因频率。

[0021] （4）家系鉴定与划分结果在模拟分析中，用30个亲本模拟产生10000个子代，在80%和95%的置信区间范围内亲子鉴定成功率均可达到100%。从图2可知，9个微卫星位点的单亲排除率、父权排除率、双亲排除率分别达到99.6072%，99.8808%，99.9999%，能够满足遗传育种中亲子鉴定和系谱分析的要求。在实际鉴定的30只湖羊种公羊中，根据Nei’s遗传距离划分了6个家系，与实际生产相符合，能够完成湖羊的家系鉴定与划分。

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