水稻OsPPR2-1基因在构建自然条件下育性提高的植株中的应用
阅读：984发布：2020-05-11
专利汇可以提供水稻OsPPR2-1基因在构建自然条件下育性提高的植株中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了 水 稻OsPPR2-1基因在构建自然条件下育性提高的植株中的应用，以及利用基因编辑技术构建育性提高植株的方法。本发明首次研究显示，OsPPR2-1基因与水稻育性有关，对其进行突变，降低OsPPR2-1蛋白表达量或者阻断OsPPR2-1蛋白的产生，育性可以对自然环境 温度 敏感，因此OsPPR2-1基因可以作为水稻遗传育种的一个有效的靶点。并基于此开发了一种利用基因编辑技术突变OsPPR2-1获得自然 环境温度 敏感突变体的方法，具有目的性强、对基因组的损伤小、规避了转基因带来的可能 风 险等优势，相比野生型植株，所得突变植株在自然低温条件下育性明显提高，结实率明显升高，显著提高水稻产量，因此本发明为培育高产水稻提供了一种新的基因编辑靶点及新的有效育种途径和方法。，下面是水稻OsPPR2-1基因在构建自然条件下育性提高的植株中的应用专利的具体信息内容。
1.水稻OsPPR2-1基因在提高水稻产量方面或构建自然条件下育性提高的植株中的应用。
2.一种构建自然条件下育性与产量提高的水稻植株的方法，其特征在于，降低水稻OsPPR2-1蛋白表达量或者阻断OsPPR2-1蛋白的产生。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，是突变水稻OsPPR2-1基因以降低OsPPR2-1蛋白表达量或者阻断OsPPR2-1蛋白的产生。
4.根据权利要求2或3所述方法，其特征在于，OsPPR2-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，OsPPR2-1基因的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，突变后的表现为NGG或NAG或NGA上游第3个碱基与第4个碱基之间插入碱基或在其5’和/或3’丢失碱基。
6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，突变水稻OsPPR2-1基因的方法为利于基因编辑技术突变OsPPR2-1。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，针对OsPPR2-1基因的Os02g0110400或LOC_Os02g0202设计基因编辑靶标序列。
8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，基因编辑的靶标序列为SEQ ID NO.2所示序列中的片段5’-NX-NGG-3’、5’-NX-NAG-3’或5’-NX-NGA-3’。
9.根据权利要求7或8所述方法，其特征在于，基因编辑的靶标序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.15所示。
10.根据权利要求6或7所述方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9系统突变OsPPR2-1构建自然条件下育性与产量提高的水稻植株的方法为：针对OsPPR2-1基因设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas9的载体中，转化水稻，实现对水稻OsPPR2-1基因的定点突变。
水稻OsPPR2-1基因在构建自然条件下育性提高的植株中的
应用
技术领域
背景技术
[0002] 水稻(Oryza sativa L.)是重要的粮食作物及单子叶模式植物。当前，全球人口数量增加，耕地面积减少，环境污染严重，极端气候频繁发生，粮食的供需变得越来越不平衡(Gupta et al.,2006)。杂交水稻的产生从一定程度上解决了粮食的短缺问题。而传统育种方法周期长、投入大、风险高，且受种间隔离和不良基因连锁影响，往往多方面性状优良的品种因为一个或两个不良性状而不能通过审定，给育种工作者带来极大遗憾。随着生物科技的发展，分子育种越来越多的体现出优势，实现从“经验育种”到“定向、高效、精确育种”的转变。
[0003] 转基因育种(Genetically modified breeding,GMB)是指通过现代分子生物学技术将一个或多个基因添加到一个生物基因组，从而生产具有改良特征的生物的育种方法。但是转基因的潜在安全问题也尚未被人们认可接受，而且传统的改造动植物品种的转基因技术是将外源DNA片段插入受体的基因组中，改造基因功能，使其表达优良的性状，获得人类需要的品种，即转基因技术只能做“加法”，应用有一定的局限性。
[0004] 基因编辑技术是近几年发展起来的对基因组进行定向精确修饰的技术，可以对基因组中的靶位点进行精确敲除、插入、碱基替换、点突变等定点人工修饰，是对基因组中已经清楚的特定DNA序列做调整-改动(删除或者添加)，而且可以精确到基因组的某个特定字符-碱基对。基因编辑技术主要包括锌指核酸酶(ZFNs)技术、转录激活子样效应物核酸酶(TALENs)技术和CRISPR/Cas核酸酶(CRISPR/CasRGNs)技术。其中，CRISPR/Cas9系统除了可以在人类与动物细胞系中实现定点修饰，还可以在地钱、拟南芥、烟草、水稻、小麦、高粱、玉米等模式植物和粮食作物中实现定点基因组编辑，但目前只在拟南芥和水稻中可以获得稳定的突变体植株(瞿礼嘉等，2015)。近年来，以CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR associated)技术为代表的基因组定点编辑技术成为植物育种技术的研究新热点，为水稻种质资源，尤其是定点编辑控制水稻育性相关的基因并创制一些具有重要价值的非转基因水稻新种质和供水稻基础研究的突变体，提供了一种安全、高效的新途径。而基因编辑技术能够实现基因精准编辑的同时，其也依赖于靶点的发现选择，而且编辑靶序列及编辑体系的构建对于基因编辑效果影响很大。
发明内容
[0005] 本发明旨在利用基因编辑技术获得一种自然条件下温度敏感育性改变的非转基因水稻植株，本发明研究发现基因OsPPR2-1与水稻育性相关，对OsPPR2-1基因进行突变，降低OsPPR2-1蛋白表达量或者阻断OsPPR2-1的产生，水稻植株的育性对自然环境温度敏感而育性随之发生改变，因此可以作为基因编辑的靶点用于构建改变水稻育性的突变株；基于此本发明开发了基于CRISPR/Cas9基因编辑系统突变OsPPR2-1获得温度敏感的育性改变植株的方法，所得突变水稻植株在自然低温(低于22℃)条件下，育性显著增加4％-6％，结实率增加2％-7％，产量得到显著提升。
[0006] 本发明的目的是提供水稻OsPPR2-1基因在提高水稻产量方面的应用。
[0007] 本发明另一目的是提供水稻OsPPR2-1基因在构建自然条件下育性提高的植株中的应用。
[0008] 本发明另一目的是提供利用基因编辑技术突变OsPPR2-1获得温度敏感的育性改变植株的方法。
[0009] 本发明上述目的通过以下技术方案实现：
[0010] 本发明首次研究发现基因OsPPR2-1与水稻育性相关，对OsPPR2-1基因进行突变，降低OsPPR2-1蛋白表达量或者阻断OsPPR2-1的产生，水稻植株的育性对自然环境温度敏感而育性随之发生改变，可以作为基因编辑的靶点用于构建改变水稻育性的突变株。
[0011] 因此，水稻OsPPR2-1基因在提高水稻产量方面的应用，以及在构建自然条件下育性提高的植株中的应用，均应在本发明的保护范围之内。
[0012] 基于此本发明还提供一种提高水稻产量的方法，即构建自然条件下育性与产量提高的水稻植株的方法，是降低水稻OsPPR2-1蛋白表达量或者阻断OsPPR2-1蛋白的产生。
[0013] 作为一种实施方式，可以通过突变水稻OsPPR2-1基因以降低OsPPR2-1蛋白表达量或者阻断OsPPR2-1蛋白的产生。
[0014] 具体地，OsPPR2-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0015] OsPPR2-1基因保守性较低，作为一种可选的方式，OsPPR2-1基因的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0016] 所述突变为将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过添加、取代或缺失一个或几个氨基酸。上述突变可以采用现有技术中基因编辑的方式，如ZFN、TALEN或CRISPR基因编辑技术等，也可以采用还未开发的新的基因编辑技术，总之，能够实现核酸序列的一个或多个的碱基添加、取代或缺失以降低OsPPR2-1蛋白表达量或者阻断OsPPR2-1蛋白的产生的，均可以被采用。
[0017] 作为一种优选的实施方式，可以利于基因编辑技术突变水稻OsPPR2-1基因，以提高水稻产量。
[0018] 优选地，可以针对OsPPR2-1基因的Os02g0110400或LOC_Os02g0202设计基因编辑靶标序列。
[0019] 优选地，基因编辑的靶标序列为5’-NX-NGG-3’，也可以是5’-NX-NAG-3’或5’-NX-NGA-3’。其中N表示A、T、C和G中的任意一个。
[0020] 作为一种优选的实施方式，突变后的表现为NGG或NAG或NGA上游第3个碱基与第4个碱基之间插入碱基或在其5’和/或3’丢失碱基。
[0021] 作为一种优选的实施方式，基因编辑的靶标序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.15所示。
[0022] 另外具体地，作为一种可选择的优选方案，利用CRISPR/Cas9系统突变OsPPR2-1构建自然条件下育性与产量提高的水稻植株的方法为：针对OsPPR2-1基因设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas9的载体中，转化水稻，实现对水稻OsPPR2-1基因的定点突变。
[0023] 更具体地，所述利用CRISPR/Cas9系统突变OsPPR2-1构建自然条件下育性与产量提高的水稻植株的方法包括如下步骤：
[0024] (1)构建含靶标序列片段的sgRNA载体；
[0025] 首先合成带粘性末端的靶标引物对，将引物变性后移至室温冷却完成退火；将退火后的引物链接到经酶切后的sgRNA载体上，经PCR扩增和测序验证得到阳性质粒载体；
[0026] (2)构建含靶标序列片段的pCRISPR/Cas9载体；
[0027] 将含靶位点序列片段的gRNA表达盒从阳性质粒载体上切下，然后连接到含Cas9表达盒的pCRISPR/Cas9载体上，得到含靶标的pCRISPR/Cas9载体；
[0028] (3)转化；
[0029] 将含靶标的pCRISPR/Cas9载体转化水稻愈伤组织，经筛选，分化和生根成苗，鉴定阳性突变植株(可以通过潮霉素鉴定阳性突变植株)。
[0030] 其中，作为优选的实施方式，步骤(1)中，所述sgRNA载体为pU3-gRNA或pU6-gRNA。
[0031] 作为优选的实施方式，步骤(1)中，所述带粘性末端的靶标引物对的序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，或所述带粘性末端的靶标引物对的序列如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示。
[0032] 另外，该方法还可加入对突变位点进行鉴定的步骤。具体地，提取阳性植株的DNA，设计鉴定引物扩增上述DNA，经纯化后，测序，分析突变情况。优选地，采用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所述的引物对进行鉴定。
[0033] 本发明上述方法根据OsPPR2-1基因设计靶标序列，构建含靶标序列片段的pU3-gRNA或pU6-gRNA载体，构建含靶标序列片段的pCRISPR/Cas9载体，获得非转基因的基因敲除材料。本方法敲除了OsPPR2-1的植株，可以实现人工培育不带转基因成分的水稻温度敏感的育性改变材料，同时育性和结实率随自然条件下的温度改变下能发生改变，可以运用于两系杂交水稻生产中，具有目的性强，同时与利用化学、物理诱变获得的突变体没有本质的区别，为培育高产水稻提供了一种新的有效途径。
[0034] 本发明具有以下有益效果：
[0035] 1、本发明首次研究显示，OsPPR2-1基因与水稻育性有关，对其进行突变，降低OsPPR2-1蛋白表达量或者阻断OsPPR2-1蛋白的产生，育性可以对自然环境温度敏感，因此OsPPR2-1基因可以作为水稻遗传育种的一个有效的靶点。
[0036] 2、基于上述研究成果，本发明还提供了一种利用CRISPR/Cas9系统突变OsPPR2-1获得自然环境温度敏感突变体的方法，为水稻设计育种提供一种新的有效途径；与利用化学、物理诱变获得的突变体没有本质的区别，同时具有目的性强、对基因组的损伤小、规避了转基因带来的可能风险等优势。
[0037] 3、本发明构建水稻OsPPR2-1基因突变株的方法，育性调控基因的调控效果好，与野生型相比，所得突变植株育性在自然低温(低于22摄氏度)下，可以使育性明显提高，结实率明显升高，显著提高水稻产量。
[0039] 图1.为本发明获得的突变植株在自然高低温下的植株表型，其中ZH11表示野生型水稻中花11，CasPPR2-1-1、CasPPR2-1-2表示突变OsPPR2-1的株系。
[0040] 图2.为本发明获得的突变植株在自然高低温下的育性和结实小穗对比的表型，其中ZH11表示野生型水稻中花11，CasPPR2-1-1、CasPPR2-1-2表示突变OsPPR2-1的株系。
[0041] 图3.为本发明获得的突变植株的花粉在自然高低温下碘化钾染色后可染率统计的表型，其中ZH11表示野生型水稻中花11，CasPPR2-1-1、CasPPR2-1-2表示突变OsPPR2-1的株系。
[0042] 图4.为本发明获得的突变植株在自然高低温下的结实率统计的表型，其中ZH11表示野生型水稻中花11，CasPPR2-1-1、CasPPR2-1-2表示突变OsPPR2-1的株系。
具体实施方式
[0044] 除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0045] 实施例1构建基因OsPPR2-1突变水稻植株
[0046] 在粳稻品种中花11中利用CRISPR/Cas9系统突变OsPPR2-1(Os02g0110400或LOC_Os02g0202)获得自然环境温度育性敏感的植株，具体方法如下：
[0047] 1、构建方法
[0048] (1)靶点序列设计：
[0049] Target-PPR2-1-U3(SEQ ID NO.5)：GGTGGTTCCGGCGTGTCGA
[0050] (2)含有Target-PPR2-1-U3的pU3-gRNA载体构建：
[0051] 首先合成带粘性末端的靶标接头引物对：
[0052] Target-PPR2-1-U3 F(SEQ ID NO.6)：GGCAGGTGGTTCCGGCGTGTCGA，
[0053] Target-PPR2-1-U3 R(SEQ ID NO.7)：AAACTCGACACGCCGGAACCACC；
[0054] 将接头引物变性后移至室温冷却完成退火，将退火后的引物链接到经酶切后的pU3-gRNA载体上；经PCR扩增和测序验证阳性质粒。得到含有Target-PPR2-1-U3片段的pU3-gRNA载体。
[0055] (3)含Target-PPR2-1片段的pCRISPR/Cas9载体构建：
[0056] 将含有Target-PPR2-1-U3片段的表达盒从pU3-gRNA载体上切下，然后连接到含Cas9表达盒的pCRISPR/Cas9载体上，得到含靶标的pCRISPR/Cas9载体；
[0057] (4)突变植株的获得：
[0058] 将含靶标的pCRISPR/Cas9载体通过根瘤农杆菌介导的遗传转化法转化水稻品种中花11(ZH11)愈伤组织；经二次筛选，分化和生根成苗，将突变植株种植于网室，通过潮霉素鉴定并筛选阴性非转基因植株。
[0059] 2、突变植株突变位点的鉴定
[0060] 提取阳性植株的基因组DNA，用引物C1F(SEQ ID NO.3)：GCCGCCGCAGCCATGTCGCG和C1R(SEQ ID NO.4)：GGCGACGGTGGCCTCCTCGG扩增上述基因组DNA，产物经纯化后送公司测序，测序结果与转基因前的野生型植株序列比较，具体参见SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.14；分析突变情况，如表1；
[0061] 表1
[0062]
[0063]
[0064] 注：表中，WT表示野生型；CasPPR2-1-1，CasPPR2-1-2，CasPPR2-1-3，CasPPR2-1-4，CasPPR2-1-5和CasPPR2-1-6表示不同的突变株系；序列中“A”、“G”、“C”、“T”表示突变的碱基，“*”表示碱基缺失；碱基的缺失和突变说明定点突变成功。
[0065] 由SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.14的序列可知，本发明的突变植物均定点突变成功。
[0066] 实施例2构建基因OsPPR2-1突变水稻植株
[0067] 在粳稻品种中花11中利用CRISPR/Cas9系统突变OsPPR2-1(Os02g0110400或LOC_Os02g0202)获得产量提高的植株，具体方法如下：
[0068] 1、构建方法
[0069] (1)靶点序列设计：
[0070] Target-OsPPR2-1-U6(SEQ ID NO.15)：CTGAAGCCGGCGCGACGGT
[0071] (2)含有Target-PPR2-1-U6片段的pU6-gRNA载体构建，
[0072] 首先合成带粘性末端的靶标接头引物对：
[0073] Target-PPR2-1-U6 F(SEQ ID NO.16)：GCCGCTGAAGCCGGCGCGACGGT，
[0074] Target-PPR2-1-U6 R(SEQ ID NO.17)：AAACACCGTCGCGCCGGCTTCAG；
[0075] 将接头引物变性后移至室温冷却完成退火，将退火后的引物链接到经酶切后的pU6-gRNA载体上；经PCR扩增和测序验证阳性质粒，得到含有Target-OsPPR2-1-U6片段的pU6-gRNA载体；
[0076] (3)含Target-OsPPR2-1片段的pCRISPR/Cas9载体构建：
[0077] 将含有Target-OsPPR2-1-U6片段的表达盒从pU6-gRNA载体上切下，然后连接到含Cas9表达盒的pCRISPR/Cas9载体上，得到含靶标的pCRISPR/Cas9载体；
[0078] (4)转基因植株的获得：
[0079] 将含靶标的pCRISPR/Cas9载体通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻品种中花11(ZH11)愈伤组织；经筛选，分化和生根成苗，将转基因植株种植于网室，通过潮霉素鉴定阳性转基因植株。
[0080] 2、突变植株突变位点的鉴定
[0081] 提取阳性植株的基因组DNA，用引物C1F(SEQ ID NO.3)：GCCGCCGCAGCCATGTCGCG和C1R(SEQ ID NO.4)：GGCGACGGTGGCCTCCTCGG扩增上述基因组DNA，产物经纯化后送公司测序，测序结果与转基因前的野生型植株序列比较，具体参见SEQ ID NO.18-SEQ ID NO.22；分析突变情况，如表2；
[0082] 表2
[0083]
[0084] 注：表中，WT表示野生型；CasPPR2-1-7、CasPPR2-1-8、CasPPR2-1-9和CasPPR2-1-10表示不同的突变株系；序列中“A”、“G”、“C”、“T”表示突变的碱基，“*”表示碱基缺失；碱基的缺失和突变说明定点突变成功。
[0085] 由SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.22的序列可知，本发明的突变植物均定点突变成功。
[0086] 如上实施例1和实施例2可知，无论采用pU3-gRNA或者pU6-gRNA构建载体，本发明中涉及的靶标序列均可成功突变OsPPR2-1基因。
[0087] 实施例3基因OsPPR2-1突变植株在不同温度下的育性性状鉴定
[0088] 1、实验方法
[0089] 将经过PCR鉴定为阳性的实施例1和2中构建的突变植株培养至成熟，均分别培养，使植株孕穗期分别处于高低温环境下，高温指高于30℃-38℃，低温指低于16℃-22℃，观察不同时期的植株形态。
[0090] 2、实验结果
[0091] 结果显示，突变植株从外观上皆表现出正常的表型。突变植株与对照植株(粳稻品种中花11)相比，在以下2个性状有明显变化：可育的花粉的数目增加；结实的粒数增加。其中，突变株CasPPR2-1-1、CasPPR2-1-2的植株表型、育性和结实小穗对比、碘化钾染色后可染率、结实率的观察统计数据呈现如图1-4。
[0092] 结果表明，突变株CasPPR2-1-1、CasPPR2-1-2的植株表型从外观上皆表现出正常的表型，可育花粉数目和结实粒数相对于野生型植株有明显增加。
[0093] 同时结果还表明，与未进行基因OsPPR2-1突变的野生型水稻相比，基因OsPPR2-1突变水稻在自然低温条件(不高于22℃左右)下产量得到明显提升，育性增加4％-6％；结实率增加2％-7％。
[0094] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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