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一种用于遗传性耳聋致病基因SLC26A4突变快速检测的Cpf1 试剂盒及其检测方法

阅读：209发布：2020-05-13

专利汇可以提供一种用于遗传性耳聋致病基因SLC26A4突变快速检测的Cpf1 试剂盒及其检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种用于遗传性耳聋致病基因SLC26A4突变快速检测的Cpf1 试剂盒及其检测方法，所述Cpf1试剂盒包括用于Cpf1检测体系；所述Cpf1检测体系包括：针对SLC26A4的特异性crRNA、Cpf1蛋白和单链DNA报告系统；所述特异性crRNA为针对突变位点设计合成的任意一种或多种；所述单链DNA报告系统包括用于酶标仪荧光检测的ssDNA FQ reporter和/或用于免疫胶体金试纸条检测的ssDNA DB reporter。本发明系首次采用Cpf1检测SLC26A4基因突变位点，具有灵敏度高、特异性强、耗时短、不依赖大型实验设备等优势。，下面是一种用于遗传性耳聋致病基因SLC26A4突变快速检测的Cpf1 试剂盒及其检测方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于遗传性耳聋SLC26A4基因突变位点快速检测的Cpf1 试剂盒，其特征在于，包括适用于SLC26A4基因突变位点IVS7-2A>G，c.2168A>G，c.1174A>T，c.1229C>T的Cpf1检测体系；
所述Cpf1检测体系包括：针对SLC26A4基因的多个位点的特异性crRNA和对照crRNA、Cpf1蛋白和ssDNA报告系统；
所述特异性crRNA为针对SLC26A4基因突变位点IVS7-2A>G，c.2168A>G，c.1174A>T，c.1229C>T设计的任意一种或多种crRNA，其序列为SEQ NO.9到SEQ NO.38；
所述ssDNA报告系统包括用于酶标仪荧光检测的ssDNA FQ reporter和/或用于免疫胶体金试纸条检测的ssDNA DB reporter；其中，所述ssDNA FQ reporter为利用6-羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的ssDNA，标记产物如下：/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ1/，命名为ssDNA FQ reporter/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ1/；所述ssDNA DB reporter为利用地高辛和生物素标记的ssDNA，标记产物如下：/5Dig/TTTATTT/3Bio/，命名为ssDNA DB reporter/5Dig/TTTATTT/3Bio/。
2.如权利要求1所述的用于遗传性耳聋SLC26A4基因突变位点快速检测的Cpf1试剂盒，其特征在于，还包括免疫胶体金试纸条；
所述免疫胶体金试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬；PVC背衬上依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述的结合垫上包被有被胶体金标记鼠抗地高辛抗体的缀合物；所述的硝酸纤维素膜上分别包被有链霉亲和素构成的质控线和由兔抗鼠IgG抗体构成的检测线。
3.如权利要求1所述的用于遗传性耳聋SLC26A4基因突变位点快速检测的Cpf1试剂盒，其特征在于，优化了Cpf1检测体系以更好的区分正常位点及突变位点：针对SLC26A4基因突变位点c.1229C>T和c.1174A>T，寻找包含cpf1识别序列TTTN的靶向序列，分别设计17nt，
19nt，21nt，23nt长度的crRNA，以检测crRNA长度对区分正常位点及突变位点的影响；针对SLC26A4基因突变位点IVS7-2A>G和c.2168A>G位点，寻找包含cpf1识别序列TTTN的靶向序列，分别在crRNA的不同位点引入单个点突变，以检测额外引入单个碱基突变对区分正常位点及突变位点的影响，设计完成后，合成oligo，构建到载体LbCpf1-pGL3-T7-crRNA，通过体外转录获得目的crRNA，通过对crRNA的设计优化与检测，找到更好区分正常位点与突变位点的最适crRNA以用于后续试剂盒的检测。
4.如权利要求1所述的用于遗传性耳聋SLC26A4基因突变位点快速检测的Cpf1试剂盒，其特征在于，所述特异性crRNA的制备方法包括：针对SLC26A4基因突变位点与各自的对照序列，寻找包含cpf1识别序列TTTN的靶向序列，设计21nt长度的crRNA，设计完成后，合成oligo，构建到载体LbCpf1-pGL3-T7-crRNA，通过体外转录获得目的crRNA。
5.如权利要求1所述的用于遗传性耳聋SLC26A4基因突变位点快速检测的Cpf1试剂盒，其特征在于，所述Cpf1蛋白的制备方法包括：针对cpf1蛋白核酸序列进行原核密码子优化获得序列SEQ NO.39，构建到pET28a表达载体，进行低温诱导可溶蛋白表达，通过亲和纯化和分子筛纯化获得目的蛋白。
6.一种遗传性耳聋SLC26A4基因突变位点快速检测方法，其特征在于，采用权利要求1～5任一项所述用于SLC26A4基因突变位点IVS7-2A>G，c.2168A>G，c.1174A>T，c.1229C>T快速检测的Cpf1试剂盒。
7.如权利要求6所述的遗传性耳聋SLC26A4基因突变位点快速检测方法，其特征在于，所述SLC26A4基因突变位点快速检测方法包括以下步骤：
步骤a：利用核酸快速释放试剂释放待测样品中核酸；
步骤b：利用等温扩增引物扩增待测样品中核酸：将步骤a获得产物，利用不同位点的特异性引物SEQ NO.40至SEQ NO.45，加入RPA等温扩增体系，在37℃反应20min扩增获得特异性产物；
步骤c：利用Cpf1检测体系检测SLC26A4基因突变位点及对照位点的信号：将步骤b中产物加入Cpf1检测体系，于37℃反应30min；
步骤d：利用免疫胶体金试纸条检测样品中SLC26A4基因IVS7-2A>G，c.2168A>G，c.1174A>T，c.1229C>T位点的检测信号和对照序列信号，做比值后进行分型。

说明书全文

一种用于遗传性耳聋致病基因SLC26A4突变快速检测的Cpf1

试剂盒及其检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及遗传性耳聋的基因检测领域，特别是涉及一种针对临床诊断前庭导水管扩大/Pendred综合征中应用的SLC26A4基因多个突变位点的快速检测方法及检测试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

[0002] 耳聋是临床上常见的听力神经系统缺陷疾病，严重影响人类的生活质量，导致耳聋发生的原因有多种，遗传因素和环境因素以及药物、创伤、感染等都会导致耳聋的发生。全球新生儿耳聋的发病率约为1/1000，其中50％以上是由遗传因素引起的。在遗传性耳聋，约80％是常染色体隐性遗传，虽然耳聋基因具有较高的基因和位点异质性，但大部分遗传性耳聋多由少数几个热点基因突变引起，包括GJB2基因、SLC26A4基因和线粒体12S rRNA基因等，这使得遗传性耳聋的筛查成为可能。

[0003] 大前庭水管综合症是非综合症型相关的常染色体隐性遗传疾病，和pendred综合征具有相同的致病基因。在1997年Everett首先报道SLC26A4基因为前庭导水管扩大/pendred综合征的致病基因。SLC26A4基因位于常染色体7q31区域，含有21个外显子，开放阅读框为2343bp，其编码含有780个氨基酸残基的多次跨膜蛋白Pendrin，该蛋白主要有疏水氨基酸组成，属于阴离子转运家族SLC26A中的一员，主要是介导Cl-，HCO3-，OH-等阴离子的转运。在内耳，Pendrin蛋白可能能够通过调节Cl-的转运来维持淋巴液的离子平衡，还有研究发现Pendrin蛋白参与协调内耳的发育。目前已发现SLC26A4基因上百个突变位点与耳聋发生相关，且突变谱和不同位点的突变频率在不同人群中差异较大，在中国，最常见的SLC26A4基因的突变位点为IVS7-2A>G和c.2168A>G等。这种与SLC26A4基因突变相关的耳聋临床表现为先天性感音神经性或混合型耳聋，有时呈波动性或渐进性，其波动性常与感冒或头部外伤相关，或伴有眩晕发生。

[0004] 当前针对耳聋尚无治疗方法，只能通过孕前耳聋基因热点突变的携带者筛查，孕期无创和侵入性产前诊断以及产后基因检测的方法，建立遗传性耳聋的三级预防干预措施。目前，对于耳聋的检测技术有很多，主要有等位基因特异性PCR，微列阵基因芯片以及核酸质谱和测序技术等，这些技术或检测通量高，或准确定高，但不足之处在于检测样本主要来源是成人静脉血或新生儿足跟血，是侵入性取样，并且样品制备过程操作繁琐，检测时间较长，测序成本高，数据分析难度较大，基于这些技术开发的灵敏度高，特异性高且快速便捷的无创检测较少。

[0005] CRISPR-Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs)是细菌中一种适应性免疫系统，Cas蛋白通过RNA引导的核酸酶靶向降解外来核酸。其中，CRISPR-Cas9蛋白家族已被广泛应用到基因编辑、抗病毒制剂和生物影像等众多领域。CRISPR-Cas12a(Cpf1)属于Cas酶第二家族，用来引导RNA指导双链DNA裂解单个RuvC催化结构域。Cpf1酶识别富含胸腺嘧啶(Thymine,T)核苷酸的间隔区相邻基序(PAM)，催化它们自身的指导CRISPR RNA(crRNA)成熟，并产生具有交错5'的PAM远端dsDNA断裂和3'端不通顺。当CRISPR/Cpf1蛋白以序列特异性方式切割双链DNA(dsDNA)时，能诱导强大的非特异性单链DNA(ssDNA)反式切割活性。基于Cpf1上述特性，我们开发了一种快速准确的检测方法，用于检测临床标本中遗传性耳聋的突变位点。从待检临床样品中提取基因组dsDNA，并在等温条件下进行重组酶聚合酶扩增(RPA)。Cpf1-crRNA复合物结合并切割靶标SLC26A4dsDNA，其激活ssDNA的反式切割。与ssDNA偶联的荧光报告分子在切割时产生荧光信号。这种称为DNA核酸内切酶靶向CRISPR反式报告基因的新方法，为快速准确检测遗传性疾病的遗传突变提供了强有力的平台。

[0006] 胶体金免疫测定是临床快速检测的一种高效技术方案。当胶体金颗粒标记的抗体与相应的抗原结合时，可目视检测有色免疫反应物。胶体金检测作用时间短、可以长期稳定保存以及相对低成本，这些特性使其广泛适用临床上针对耳聋基因SLC26A4突变位点的高特异性，高灵敏度，方便快捷的检测。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于针对临床遗传性耳聋前庭导水管扩大/pendred综合征致病基因SLC26A4突变位点IVS7-2A>G，c.2168A>G，c.1174A>T，c.1229C>T的快速检测，提供一种灵敏度高、特异性强、快速可视化的耳聋检测的Cpf1试剂盒及其检测方法。

[0008] 为了达到上述目的，本发明提供了一种用于遗传性耳聋前庭导水管扩大/pendred综合征致病基因SLC26A4多个位点的快速检测的Cpf1试剂盒，其特征在于，包括适用于前庭导水管扩大/pendred综合征多个致病位点突变的Cpf1检测体系。

[0009] 所述Cpf1检测体系包括：针对SLC26A4基因部分突变位点的特异性crRNA和对照crRNA，Cpf1蛋白以及单链DNA(ssDNA)报告系统。

[0010] 所述特异性crRNA为针对SLC26A4基因突变位点IVS7-2A>G，c.2168A>G，c.1174A>T，c.1229C>T设计的任意一种或多种crRNA，其序列见文中表2，4，5，6和7(或SEQ NO.9到SEQ NO.38)。

[0011] 所述单链DNA(ssDNA)报告系统包括用于酶标仪荧光检测的ssDNA FQ reporter和/或用于免疫胶体金试纸条检测的ssDNA DB reporter；其中，所述ssDNA FQ reporter为利用6-羧基荧光素(6-FAM)和荧光淬灭剂(BHQ1)标记的ssDNA，标记产物如下：/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ1/，命名为ssDNA FQ reporter/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ1/；所述ssDNA DB reporter为利用地高辛(Digoxin)和生物素(Biotin)标记的ssDNA,标记产物如下：/5Dig/TTTATTT/3Bio/，命名为ssDNA DB reporter/5Dig/TTTATTT/3Bio/。

[0012] 优选地，上述用于遗传性耳聋SLC26A4基因突变位点快速检测的Cpf1试剂盒还进一步包括免疫胶体金试纸条；所述免疫胶体金试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬；PVC背衬上依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述的结合垫上包被有被胶体金标记鼠抗地高辛抗体的缀合物；所述的硝酸纤维素膜上分别包被有链霉亲和素构成的质控线和由兔抗鼠IgG抗体构成的检测线。

[0013] 优选地，所述特异性crRNA的制备方法包括：针对SLC26A4基因的多个突变位点IVS7-2A>G，c.1174A>T，c.1229>T，c.2168A>G，寻找包含cpf1识别序列(PAM)TTTN的靶向序列，设计23nt长度的crRNA，分别命名为IVS7-2-G-23，c.1174-T-23，c.1229-T-23，c.2168-G-23，设计完成后，合成DNA oligo，构建到载体pGL3-T7-crRNA，通过体外转录获得目的crRNA。

[0014] 本发明还优化了Cpf1检测体系以更好的区分正常位点及突变位点：针对SLC26A4基因突变位点c.1229C>T和c.1174A>T，寻找包含cpf1识别序列TTTN的靶向序列，分别设计17nt，19nt，21nt，23nt长度的crRNA，以检测crRNA长度对区分正常位点及突变位点的影响；
针对SLC26A4基因突变位点IVS7-2A>G和c.2168A>G位点，寻找包含cpf1识别序列TTTN的靶向序列，分别在crRNA的不同位点引入单个点突变，以检测额外引入单个碱基突变对区分正常位点及突变位点的影响，设计完成后，合成oligo，构建到载体LbCpf1-pGL3-T7-crRNA，通过体外转录获得目的crRNA，通过对crRNA的设计优化与检测，找到更好区分正常位点与突变位点的最适crRNA以用于后续试剂盒的检测。

[0015] 优选地，所述对照crRNA的制备方法包括：根据方案一(图1)，针对SLC26A4基因突变位点，分别在每个位点附近引入一条阳性对照crRNA，分别命名为IVS7-2-G-ctrl，c.1174-T-ctrl，c.1229T-ctrl和c.2168-G-ctrl，通过对比该突变位点与阳性对照的比值，确定检测样本的纯和与杂合类型；根据方案二(图1)，分别对突变位点设计两条crRNA，一条On crRNA与WT完全匹配，一条Off crRNA与突变序列完全匹配，分别命名为IVS7-2-A-21，IVS7-2-G-21，c.1174-A-21，c.1174-T-21，c.1229-C-21，c.1229-T-21，c.2168-A-21，c.2168-G-21，根据两条crRNA的检测信号，得出检测的样本类型。crRNA设计完成后，合成oligo，构建到载体pGL3-T7-crRNA，通过体外转录获得目的crRNA。

[0016] 优选地，所述Cpf1蛋白的制备方法包括：针对Cpf1蛋白核酸序列进行原核密码子优化获得序列，构建到pET28a表达载体，进行低温诱导可溶蛋白表达，通过亲和纯化和分子筛纯化获得目的蛋白。

[0017] 本发明提供的用于耳聋基因SLC26A4基因多个突变位点快速检测的Cpf1试剂盒既可利用酶标仪荧光检测也可以利用免疫胶体金试纸条检测。当使用酶标仪荧光检测时，Cpf1检测体系中DNA(ssDNA)报告系统为ssDNA FQ reporter，当使用免疫胶体金试纸条检测时，DNA(ssDNA)报告系统为ssDNA DB reporter。

[0018] 在使用酶标仪荧光检测时，当Cpf1检测体系中存在突变的SLC26A4基因位点，会由在SLC26A4特异性crRNA介导下特异性激活Cpf1蛋白的核酸内切酶活性。激活后的Cpf1蛋白会切割由荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA FQ reporter,从而释放激活荧光基团，使用酶标仪可以检测到荧光读数。相对应的，待检测样品中存在正常SLC26A4基因序列时，荧光读书显示为基底值。

[0019] 在使用免疫胶体金试纸条检测时，当Cpf1切割后待检测样品加入到胶体金试纸条后，被胶体金标的鼠抗地高辛抗体会与地高辛标记的ssDNA报告系统结合，复合物随液流方向从质控线走向检测线；质控线链霉亲和素饱和抓获标记有生物素标的ssDNA报告系统，从而显示条带；当Cpf1检测到SLC26A4突变位点时，会将标记有地高辛和生物素ssDNA报告系统切割断开，从而会有地高辛标记的ssDNA片段被检测线抓获显色，当Cpf1检测到SLC26A4基因正常序列时，不能将标记有地高辛和生物素ssDNA报告系统切割断开，从而不会产生地高辛标记的ssDNA片段被检测线抓获的显色。

[0020] 本发明还提供了一种耳聋基因SLC26A4多个突变位点的核酸快速检测方法，其特征在于，采用上述用于耳聋相关基因SLC26A4部分突变位点的核酸快速检测Cpf1试剂盒。

[0021] 优选地，所述耳聋基因SLC26A4多个突变位点核酸快速检测方法包括以下步骤：

[0022] 步骤a：利用核酸快速释放试剂释放待测样品中核酸；

[0023] 步骤b：利用等温扩增引物扩增待测样品中核酸：将步骤a获得产物，利用SLC26A4不同突变位点的特异性引物SEQ ID NO.40至SEQ ID NO.45，加入RPA等温扩增体系，在37℃反应20min扩增获得特异性产物；

[0024] 步骤c：利用Cpf1检测体系切割SLC26A4核酸：将步骤b中产物加入Cpf1检测体系，于37℃反应30min；

[0025] 步骤d：利用酶标仪或免疫胶体金试纸条检测样品中SLC26A4基因致病位点。

[0026] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

[0027] (1)本发明通过利用Cpf1特异识别核酸联合免疫测流层析技术，实现对遗传性耳聋前庭导水管扩大/pendred综合征的致病基因SLC26A4的多个致病突变的高灵敏度、高特异性及快速可视化检测。根据研究发现，对SLC26A4基因突变位点进行检测时，正常人，耳聋患者和携带者的检测信号不同，为了更好的判读阳性结果，我们设计两种方案，一是在检测的每个特异性crRNA附近挑选了没有突变位点以及SNP的包含cpf1识别序列(PAM)TTTN的对照序列，将针对突变位点设计的crRNA的荧光值或免疫胶体金试纸条阳性条带的灰度值与对照序列结果进行对比，根据比值判定所得阳性结果为纯和患者或突变携带者；二是分别对突变位点设计两条crRNA，一条On crRNA与WT完全匹配，一条Off crRNA与突变序列完全匹配，根据两条crRNA得出的检测信号，得出检测样本类型为纯和患者或突变携带者。

[0028] (2)本发明是基于Cpf1-耳聋前庭导水管扩大/pendred综合征的致病基因SLC26A4的快速检测工具，该工具包含免疫层析条带检测，能实现方便快捷的结果判读。

[0029] (3)本发明利用Cpf1对特异性序列切割和免疫测流层析技术实现对SLC26A4核酸的快速、高特异性、高灵敏性和可视化检测。同时，基于设计不同crRNA长度，或在特异性crRNA序列中引入突变位点，探索能够区分正常位点与突变位点的crRNA最佳检测信号，明显区分SLC26A4基因突变的纯和与杂合。本发明所建立的SLC26A4核酸突变位点的快速检测方法，为临床诊断和实验室研究提供了一个准确、快速、简便的检测方法。

[0030] (4)本发明公开了一系列用于SLC26A4核酸检测的Cpf1反应体系和crRNA组合以及RPA扩增引物，其序列依次如SEQ ID NO.9至NO.45所示。所述Cpf1，crRNA和RPA扩增引物组合可用于SLC26A4核酸耳聋致病突变位点IVS7-2A>G，c.1174A>T，c.1229>T，c.2168A>G的检测。本发明系首次采用Cpf1检测遗传性耳聋，具有灵敏度高、特异性强、耗时短、高通量、不依赖大型实验设备等优势。这些优势使得本发明开发的基于Cpf1胶体金试纸检测方法方便用于实验室和临床医学对遗传性耳聋的快速检测和诊断。附图说明

[0031] 图1基于Cpf1快速检测遗传性耳聋SLC26A4核酸致病突变方法示意图；

[0032] 图2基于Cpf1快速检测SLC26A4核酸多个突变位点的特异性crRNA设计；

[0033] 图3Cpf1不同crRNA检测SLC26A4突变位点荧光检测结果；

[0034] 图4Cpf1检测体系中crRNA长度对荧光信号的影响；

[0035] 图5Cpf1检测体系crRNA引入突变位点位置对荧光信号的影响；

[0036] 图6Cpf1基于Cpf1快速检测方案一对SLC26A4 IVS7-2A>G位点分型；

[0037] 图7Cpf1基于Cpf1快速检测方案二对SLC26A4 IVS7-2A>G位点分型。

具体实施方式

[0038] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0039] 本发明中：RPA扩增试剂盒Twist Basic kit购自TwistAmp公司；crRNA体外转录盒子MEGAshortscript T7 Transcription Kit和纯化盒子MEGA clear Kit购自Ambion公司；常规试剂如Tris-Base,NaCl,Tris-HCl，MgCl2,BSA和甘油等购自Thermo Fisher；核酸和ssDNA探针合成由南京金斯瑞公司完成；本发明使用购自诺唯赞公司的快速核酸释放剂获得预处理的核酸。

[0040] 本发明的总体技术示意图如附图1所示，包括以下3大部分：待检测核酸样品制备、Cpf1检测成分设计制备和体系构建、荧光及胶体金试纸条设计和结果解读。

[0041] 实施例1：SLC26A4基因突变位点片段快速灵敏检测

[0042] 1.1核酸制备

[0043] 本案例中SLC26A2基因片段，是参考NCBI数据库中SLC26A4基因序列，根据每个突变位点设计扩增引物，利用人源基因组DNA为模板，PCR扩增获取目的片段后，采用同源重组的方式构建到pUC57载体上，分别命名为pUC57-IVS7-2-A(SEQ NO.1)，pUC57-IVS7-2-G(SEQ NO.2)，pUC57-1174-A(SEQ NO.3)，pUC57-1174-T(SEQ NO.4)，pUC57-1229-C(SEQ NO.5)，pUC57-1229-T(SEQ NO.6)，pUC57-2168-A(SEQ NO.7)，pUC57-2168->G(SEQ NO.8)。扩增体系见表1。

[0044] 表1.SLC26A4基因突变位点片段扩增体系

[0045]

[0046] 反应体系如下：

[0047]

[0048] 获取样品后进行下一步核酸检测。

[0049] 1.2SLC26A4多位点特异性crRNA的设计制备

[0050] 如图2所示，crRNA制备按照如下方案进行，针对SLC26A4基因中选定突变位点，寻找包含cpf1识别序列(PAM)TTTN的靶向序列，设计23nt长度的crRNA，分别命名为IVS7-2-G-23，c.1174-T-23，c.1229-T-23，c.2168-G-23。设计完成后，交于铂尚生物技术有限公司合成DNA oligo，构建到载体LbCpf1-pGL3-T7载体上，通过体外转录获得目的crRNA。

[0051] 本发明提供的SLC26A4 crRNA包括SEQ ID NO.9到SEQ ID NO.12，具体信息如表2所示。

[0052] 表2.SLC26A4基因特异性crRNA

[0053]

[0054] 本检测采用20μL体系如表3所示，但不限于此，包含对相应成分的比例调整：

[0055] 表3.SLC26A4多个突变位点cpf1检测体系

[0056]

[0057] 其中，ssDNA reporter为ssDNA FQ reporter或ssDNA DB reporter。

[0058] 1.3全波长酶标仪荧光检测

[0059] 酶标仪荧光检测中，Cpf1对目的基因检测体系依次加入各种组分。各组分混合均匀后于37℃反应30min。其中，上述反应体系中Rnase Inhibitors浓度为40U/μL，Cpf1为200ng/μL，ssDNA FQ reporter浓度为25pmol/μL，crRNA浓度为1pmol/μL。

[0060] 利用荧光检测判定Cpf1检测体系检测活性。使用全波长酶标仪用于测量检测反应的荧光，监测荧光动力学，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，每5分钟检测一次，持续检测2小时。取检测30min荧光数值为反应值。其中SLC26A4中各位点的切割检测如图3，该发明利用荧光法结果判定方案，可实现对SLC26A4多个突变位点超高灵敏度检测。

[0061] 1.4胶体金试纸条检测

[0062] 胶体金试纸条检测中，Cpf1对目的基因检测体系依次加入各种组分。各组分混合均匀后于37℃反应30min。其中，上述反应体系中Rnase Inhibitors浓度为40U/μL，Cpf1为200ng/μL，ssDNA DB reporter浓度为25pnol/μL，crRNA浓度为1pmol/μL。

[0063] 本发明中免疫胶体金试纸条检测步骤如下：将20μL Cpf1切割产物与40μL胶体金试纸条缓冲液(4XSSC，2％BSA和0.05％Tween-20，pH 7.0)混合。将测试条浸入混合物中，反应3分钟后，可由肉眼进行结果判定，及进行拍照记录。

[0064] 实施例2：SLC26A4基因片段快速检测条件优化

[0065] SLC26A4基因突变位点的快速检测，有助于明确判断临床样本中的突变，对早期耳聋的检出有重要的意义。本实施案例中，以SLC26A4基因的IVS7-2A>G，c.2168A>G，c.1229C>T和c.1174A>T位点为范例，示范利用本发明的Cpf1检测试剂盒对SLC26A4致病位点的检出条件的优化。

[0066] 基于Cpf1是在crRNA引导下对目标序列进行高特异性识别切割的特性，提出假设：与SLC26A4基因的精准配对crRNA的长度的缩短，可以导致Cpf1切割系统不能高效识别，表现为检测荧光数值在一定程度降低但野生型和突变型的信号差异有所提高。基于此原理，我们并制备了如表4所示的不同长度的crRNA，比对了与SLC26A4基因匹配的crRNA长度对检测信号的影响。对SLC26A4基因的c.1229C>T位点和c.1174A>T进行crRNA长度对荧光信号值的影响检测试验中，结果比对如图4所示，根据野生型与突变型之间的的信号差异，选定最适的crRNA长度。

[0067] 表4.SLC26A4基因特异性长度梯度crRNA

[0068]

[0069] 基于Cpf1是在crRNA引导下对目标序列进行高特异性识别然后切割的特性，提出假设：与SLC26A4基因的精准配对crRNA如果增加一个点突变，可以导致Cpf1切割系统不能高效识别，表现为检测荧光数值虽然在一定程度降低但正常基因与突变基因的信号差异有所提高。基于此原理，我们并引入了如表5所示的错配位点的crRNA，比对了与SLC26A4基因匹配的crRNA长度对检测信号的影响。对SLC26A4基因的c.2168A>G位点进行crRNA错配位点的引入对荧光信号值的影响检测试验中，结果比对如图5所示。

[0070] 表5.C.2168位点引入点突变crRNA

[0071]

[0072]

[0073] 在荧光检测中，在Cpf1检测体系中，依次加入组分。各组分混合均匀，在37℃反应30min。本检测体系中，crRNA是指以上提及设计的的不同crRNA。其中，上述反应体系中Rnase Inhibitors浓度为40U/μL，Cpf1为200ng/μL，ssDNA DB reporter浓度为25pmol/μL，crRNA浓度为1pmol/μL。

[0074] 本实施案例中，利用荧光检测判定Cpf1检测体系检测活性。使用全波长酶标仪用于测量检测反应的荧光，监测荧光动力学，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，每5分钟检测一次，持续检测2小时。取检测30min荧光数值为反应值。

[0075] 本实施例中，首先通过检测与SLC26A4基因精准配长度梯度的crRNA信号，验证上述长度对野生型与突变型信号差异的假设。结果如图4所示，不同SLC26A4识别核酸区段长度的crRNA得到的荧光信号存在差异，c.1174A>T位点针对野生型与突变型序列检测的信号差异最显著。基于此，验证了可以通过Cpf1检测到不同匹配长度crRNA对检测信号影响的假设，并且在我们的检测结果中发现，21nt的crRNA具有更好的荧光信号差异，所以后续的crRNA设计及检测选用21nt进行。接下来，通过在crRNA的不同位置引入点突变，检测与SLC26A4基因精准配对的crRNA对荧光或试纸条信号的影响，验证crRNA不同位置的突变对野生型与突变型信号差异的假设。结果如图5所示，与SLC26A4识别核酸区段的crRNA的不同位点引入点突变得到的荧光信号存在差异，引入的点突变在crRNA自身突变后一位和后两位(c.2168-G-mut+1，c.2168-G-mut+2)，对荧光信号的区分有较好结果。基于此，验证了可以通过Cpf1检测在crRNA中引入不同点突变可以更明显的区分野生型与突变型的假设。

[0076] 在胶体金试纸条检测中，在Cpf1检测体系中，依次加入各种组分。各组分混合均匀，在37℃反应30min。本检测体系中，crRNA是指以上提及设计的不同crRNA。将20μL Cpf1切割产物与40μL胶体金试纸条缓冲液(4*SSC，2％BSA和0.05％Tween-20，pH 7.0)混合。将测试条浸入混合物中，反应3分钟后，可由肉眼进行结果判定，及进行拍照记录。

[0077] 实施例3：利用方案一对SLC26A4基因突变位点快速灵敏分型

[0078] 前庭导水管扩大/Pendred综合征为常染色体隐性遗传疾病，对其致病基因SLC26A4基因突变位点的分型检测，有助于明确判断临床样本为正常人群，突变携带者或者耳聋患者，对早期耳聋的检出有重要的意义。本实施案例中，以SLC26A4基因的IVS7-2A>G的位点为范例，示范应用本发明的Cpf1检测试剂盒对耳聋致病位点分型。

[0079] 基于Cpf1根据crRNA与靶序列匹配程度影响切割效率，提出假设：在IVS7-2A>G位点附近选择一条适合的对照序列，体外转录为IVS7-2-G-ctrl，通过将IVS7-2-G的检测信号与IVS7-2-G-ctrl的检测信号做比值，进而明确检测样本为正常人，携带者，耳聋患者。基于此原理，我们并制备了如表6所示的对照crRNA，其检测结果见图6。

[0080] 表6.SLC26A4基因特异性对照crRNA

[0081]

[0082] 在Cpf1检测体系中，依次加入各种组分。各组分混合均匀，在37℃反应30min。利用荧光检测判定Cpf1检测体系检测活性。使用全波长酶标仪用于测量检测反应的荧光，监测荧光动力学，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，每5分钟检测一次，持续检测2小时。取检测30min荧光数值为反应值。其中SLC26A4中IVS7-2A>G切割检测如图4，该发明利用荧光法结果判定方案，可实现对SLC26A4突变位点超高灵敏度检测与分型。

[0083] 在胶体金试纸条检测中，在Cpf1检测体系中，依次加入各种组分。各组分混合均匀，在37℃反应30min。将20μL Cpf1切割产物与40μL胶体金试纸条缓冲液(4*SSC，2％BSA和0.05％Tween-20，pH 7.0)混合。将测试条浸入混合物中，反应3分钟后，进行拍照记录以及灰度值分析。灰度值分析结果如图6。

[0084] 实施例4：利用方案二对SLC26A4基因突变位点快速灵敏分型

[0085] 本实施例中，采用双crRNA系统，以SLC26A4基因的IVS7-2A>G的位点为范例，示范应用本发明的Cpf1检测试剂盒对耳聋致病位点分型。

[0086] 基于Cpf1根据crRNA与靶序列完全匹配程度会产生明显的切割信号，提出假设：针对IVS7-2A>G位点分别匹配野生型和突变型设计两条crRNA，即IVS7-2-A-crRNA和IVS7-2-G-crRNA，通过两条crRNA产生的切割信号判断检测样本类型，只有IVS7-2-A-crRNA有切割信号的样本为正常人样本，两条crRNA均有切割信号为携带者，只有IVS7-2-G-crRNA有切割信号为耳聋患者，检测结果见图7。基于此原理，我们并制备了如表7所示的crRNA。

[0087] 表7.SLC26A4基因特异性对照crRNA

[0088]

[0089] 在Cpf1检测体系中，依次加入各种组分。各组分混合均匀，在37℃反应30min。利用荧光检测判定Cpf1检测体系检测活性。使用全波长酶标仪用于测量检测反应的荧光，监测荧光动力学，其中激发波长为485nm，发射波长为520nm，每5分钟检测一次，持续检测2小时。取检测30min荧光数值为反应值。该发明利用荧光法结果判定方案，可实现对SLC26A4突变位点超高灵敏度检测与分型。

[0090] 在胶体金试纸条检测中，在Cpf1检测体系中，依次加入各种组分。各组分混合均匀，在37℃反应30min。将20μL Cpf1切割产物与40μL胶体金试纸条缓冲液(4*SSC，2％BSA和0.05％Tween-20，pH 7.0)混合。将测试条浸入混合物中，反应3分钟后，进行拍照记录以及灰度值分析。

[0091] 实施例5：对临床血液样品及组织样品的核酸进行SLC26A4基因突变位点的快速检测

[0092] 本实施例对临床血液样本或组织样品的核酸进行快速检测，所有样品及操作均在实验室中完成，本案例中样本为血液提取获得的DNA进行Cpf1检测。本实施例使用购自诺唯赞公司的快速核酸释放剂获得预处理的核酸。步骤如下：2μL待检测样品加入20μL核酸裂解液，常温静置3分钟，加入20μL中和液，混匀后进行下一步检测。

[0093] 利用本发明中RPA扩增引物SEQ NO.40到SEQ NO.45，参考RPA等温扩增操作步骤，对每个待检测样品取2μl进行RPA预扩增获取待检测样品。具体操作如下：

[0094] 25μL 2*Buffer，2μL RPA-F，2μL RPA-R，2.5μL乙酸镁，2μL DNA样品，加水补至50μL，混合均匀，于37℃反应20min,获得样品进行下一步核酸检测在Cpf1检测体系中，依次加入2μL Buffer、1μL Rnase Inhibitors、1μL Cpf1、1μL ssDNA DB reporter、5μL RPA sample、1μL crRNA和9μL H2O。各组分混合均匀，在37℃反应30min。

[0095] 本实施例中，利用方案二，将Cpf1切割产物进行胶体金试纸结果判定。将Cpf1切割产物，以1:2比例稀释到胶体金检测缓冲液中，随后插入本发明中胶体金试纸条，带并在室温下温育3分钟。判定试纸条检测结果并拍照保存并将胶体金试纸条检测结果进行灰度分析。结果显示，Cpf1胶体金试纸条能够实现对临床血液样品中SLC26A4基因多个耳聋相关突变位点的灵敏、快速、准确可视化检测。

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