通过细菌性来源的完整小细胞向哺乳动物细胞递送功能性核酸
阅读：344发布：2024-01-22
专利汇可以提供通过细菌性来源的完整小细胞向哺乳动物细胞递送功能性核酸专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且含有功能性核酸或编码功能性核酸的质粒的细菌性来源的完整小细胞在被靶向的 哺乳动物 细胞中能够分别降低耐药性、凋亡抗性和致瘤性。利用小细胞递送靶向有助于耐药性或细胞凋亡抗性等的 蛋白质 之转录物的功能性核酸的方法可以与化疗联合从而增加化疗的有效性。，下面是通过细菌性来源的完整小细胞向哺乳动物细胞递送功能性核酸专利的具体信息内容。
1.一种组合物，其包含(a)细菌性来源的完整小细胞，该完整小细胞包含功能性核酸分子或含有编码功能性核酸分子之片段的质粒，和(b)双特异性配体，其中所述功能性核酸分子靶向有助于对化疗药物产生耐药性之蛋白质的基因或转录物，并且其中所述双特异性配体将所述小细胞靶向到哺乳动物细胞。
2.根据权利要求1的组合物，其还包含(c)化疗药物，其中所述功能性核酸减少对该化疗药物的所述耐药性。
3.根据权利要求1或2的组合物，其中所述双特异性配体对所述小细胞上的表面成分和非吞噬性哺乳动物细胞上的表面成分具有特异性。
4.(a)细菌性来源的、包含功能性核酸分子或含有编码功能性核酸分子之片段的质粒的完整小细胞和(b)双特异性配体在制备药物中的用途，其中所述功能性核酸分子靶向有助于对化疗药物产生耐药性之蛋白质的基因或转录物，并且其中所述双特异性配体将所述小细胞靶向到哺乳动物细胞。
5.(a)细菌性来源的、包含功能性核酸分子或含有编码功能性核酸分子之片段的质粒的完整小细胞，(b)化疗药物和(c)双特异性配体用于治疗对所述化疗药物具有耐药性的恶性肿瘤的用途，其中所述功能性核酸分子靶向有助于对所述化疗药物产生耐药性之蛋白质的基因或转录物，并且其中所述双特异性配体将所述小细胞靶向到哺乳动物细胞。
6.根据权利要求5的用途，其中所述小细胞和所述化疗药物连续施用。
7.根据权利要求6的用途，其中所述小细胞在所述化疗药物之前施用。
8.根据权利要求4-7中任一项的用途，其中所述双特异性配体选自受体、酶、结合肽、融合/嵌合蛋白质和小分子。
9.根据权利要求4-8中任一项的用途，其中所述双特异性配体对所述小细胞上的表面成分和非吞噬性哺乳动物细胞上的表面成分具有特异性。
通过细菌性来源的完整小细胞向哺乳动物细胞递送功能性
核酸
[0001] 本 申 请 是 2005年 8月 25日 提 交 的 申 请 号 为 200580032557.2(PCT/IB2005/003614)之申请“通过细菌性来源的完整小细胞向哺乳动物细胞递送功能性核酸”
的分案申请。
的分案申请。
背景技术
[0002] 本发明涉及为实现有效向哺乳动物细胞递送功能性核酸而正在进行的努力。更具体的，本发明涉及使用细菌性小细胞载体向哺乳动物细胞递送功能性核酸。本发明对于消
除被靶向细胞中的耐药性(特别是在癌和AIDS疗法的情形下)、促进其中的细胞凋亡和抗
击其中的致瘤性方面具有特别的效用。
除被靶向细胞中的耐药性(特别是在癌和AIDS疗法的情形下)、促进其中的细胞凋亡和抗
击其中的致瘤性方面具有特别的效用。
[0003] 最近的进展已经突出地显示了各种向细胞引入功能性核酸的技术。例如，基于脂质体的转染方法可以递送外源产生的核酸。然而，这种外源性的方法有只能短暂发挥目标
抑制作用的缺点。此外，脂质体在体内是不稳定的。作为一种递送外源产生的核酸的选择，
载体可以递送编码内源性生成的功能性核酸的质粒。然而，对当前可用于此目的的病毒性
载体的安全性具有严重的关注。可例举的问题包括与野生型病毒的重组、插入和致癌潜能、
病毒诱导的免疫抑制、病毒载体携带大片段DNA的能力有限、减毒病毒毒性的逆转、重组体
病毒制备和分布的困难、低稳定性、和有害反应，比如由现有免疫性引起的炎性反应。避免
了这些问题的方法将在更安全和更有效递送功能性核酸方面提供明显的益处。
抑制作用的缺点。此外，脂质体在体内是不稳定的。作为一种递送外源产生的核酸的选择，
载体可以递送编码内源性生成的功能性核酸的质粒。然而，对当前可用于此目的的病毒性
载体的安全性具有严重的关注。可例举的问题包括与野生型病毒的重组、插入和致癌潜能、
病毒诱导的免疫抑制、病毒载体携带大片段DNA的能力有限、减毒病毒毒性的逆转、重组体
病毒制备和分布的困难、低稳定性、和有害反应，比如由现有免疫性引起的炎性反应。避免
了这些问题的方法将在更安全和更有效递送功能性核酸方面提供明显的益处。
[0004] 递送功能性核酸的有效方法对逆转耐药性应该会特别有益。哺乳动物细胞利用各种生物学过程以抵抗药物，这对于成功的癌治疗是主要的障碍。相似的，耐药性限制了HIV
治疗的效用，对于高效抗逆转录病毒治疗(HAART)尤其如此，该治疗是基于联合应用核苷
逆转录酶抑制剂(NRTIs)和蛋白酶抑制剂(PIs)或非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)。
治疗的效用，对于高效抗逆转录病毒治疗(HAART)尤其如此，该治疗是基于联合应用核苷
逆转录酶抑制剂(NRTIs)和蛋白酶抑制剂(PIs)或非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)。
[0005] 对化疗的临床肿瘤抗性可以是固有的或获得性的。固有抗性存在于未能对一线化疗产生反应的肿瘤诊断时期。获得性抗性发生在对初始治疗可能产生良好反应，但是在复
发时表现出抗性表型的肿瘤中。这样的肿瘤既对先前使用的药物又对新药物产生抗性，这
包括有不同结构和作用机制的药物。术语MDR(多药耐药性)描述了这种现象，其中肿瘤细
胞在暴露于单一药物后，对几种结构不相关的药物产生交叉抗性。
发时表现出抗性表型的肿瘤中。这样的肿瘤既对先前使用的药物又对新药物产生抗性，这
包括有不同结构和作用机制的药物。术语MDR(多药耐药性)描述了这种现象，其中肿瘤细
胞在暴露于单一药物后，对几种结构不相关的药物产生交叉抗性。
[0006] 多药耐药性的机制是复杂的并且是多因素的，这主要是由于癌细胞中高水平的基因组不稳定性和突变。典型的机制有药物失活、通过细胞膜泵排出药物、降低药物流入、
药物靶标的突变和启动细胞凋亡的失败(Bredel，2001；Chen et al.，2001；White and
McCubrey，2001；Sun et al.，2001)。
药物靶标的突变和启动细胞凋亡的失败(Bredel，2001；Chen et al.，2001；White and
McCubrey，2001；Sun et al.，2001)。
[0007] 药物排出是特别普遍的，并且可通过将药物从细胞内环境泵到细胞外环境的膜相关蛋白质的过表达产生。这样的泵通常是ATP结合盒(ABC)转运蛋白超家族的成员(Doige
et al.，1993)。P-糖蛋白(Pgp)是一个这样的实例，并且是多种癌细胞中对MDR起主要作用
的因素(Endicott et al.，1989；Litman et al.，2001)。其它的实例包括MDR相关蛋白质
(MRP；Cole et al.，1992)、乳腺癌耐药性蛋白质(BCRP；Litman et al.，2000)、和肺耐药性相关蛋白质(LRP；a major vault protein；Scheffer et al.，2000)。在癌细胞(Gottesman et al.，2002)和病原微生物(Van Bambeke et al.，2000)中已经鉴定了其它的多药物转运
蛋白。
et al.，1993)。P-糖蛋白(Pgp)是一个这样的实例，并且是多种癌细胞中对MDR起主要作用
的因素(Endicott et al.，1989；Litman et al.，2001)。其它的实例包括MDR相关蛋白质
(MRP；Cole et al.，1992)、乳腺癌耐药性蛋白质(BCRP；Litman et al.，2000)、和肺耐药性相关蛋白质(LRP；a major vault protein；Scheffer et al.，2000)。在癌细胞(Gottesman et al.，2002)和病原微生物(Van Bambeke et al.，2000)中已经鉴定了其它的多药物转运
蛋白。
[0008] 由细胞毒性剂和放射引起的肿瘤细胞对细胞凋亡(程序性细胞死亡)的抗性(Sellers and Fisher，1999)是另一种普遍的机制。这种机制通常涉及抗细胞凋亡蛋白质
比如B-细胞白血病蛋白质2(Bcl-2)、Bcl-XL、Bcl-W、A1/Bfl 1、Mcl-1的过表达，和p53蛋
白质的突变。尽管对于象Bcl-2的蛋白质是如何发挥它们的抗细胞凋亡作用的准确了解仍
然是不清楚的，但是在许多癌中所述蛋白质都被过表达，这些癌包括结肠直肠癌、前列腺癌
和乳腺癌(Hanada，et al.，1995；Bakhshi et al.，1985；Wanget al.，1996)。转录因子核因子κB(NF-κB)表达的增加也是肿瘤细胞获得化疗抗性的主要机制(Wang et al.，1999)。
比如B-细胞白血病蛋白质2(Bcl-2)、Bcl-XL、Bcl-W、A1/Bfl 1、Mcl-1的过表达，和p53蛋
白质的突变。尽管对于象Bcl-2的蛋白质是如何发挥它们的抗细胞凋亡作用的准确了解仍
然是不清楚的，但是在许多癌中所述蛋白质都被过表达，这些癌包括结肠直肠癌、前列腺癌
和乳腺癌(Hanada，et al.，1995；Bakhshi et al.，1985；Wanget al.，1996)。转录因子核因子κB(NF-κB)表达的增加也是肿瘤细胞获得化疗抗性的主要机制(Wang et al.，1999)。
[0009] 已经鉴定了对抗MDR的药物，比如阻滞P-糖蛋白作用的药物(List et al.，1993；Miller et al.，1991；Wishart et al.，1992)。然而，因为许多这样的药物结合患者的血
浆，不能到达它们的目的地(Ayesh et al.，1996a；Broxterman et al.，1987；Lehnert et al.，1996)并且对正常的细胞是有毒的，所以它们在临床试验中是无效的。同样已经尝试用
功能性核酸对抗MDR。然而，如上所述，为此目的的现有载体是不稳定的或者是有毒性的，或者它们有其它严重的安全问题，这阻碍了它们在人中的应用(Sioud，2004)。
浆，不能到达它们的目的地(Ayesh et al.，1996a；Broxterman et al.，1987；Lehnert et al.，1996)并且对正常的细胞是有毒的，所以它们在临床试验中是无效的。同样已经尝试用
功能性核酸对抗MDR。然而，如上所述，为此目的的现有载体是不稳定的或者是有毒性的，或者它们有其它严重的安全问题，这阻碍了它们在人中的应用(Sioud，2004)。
[0010] 因此，对递送可在靶细胞中降低耐药性、促进细胞凋亡和对抗致瘤性的功能性核酸的工具和方法有持续的需要。
发明概要
发明概要
[0011] 为处理这些和其它的需要，一方面，本发明提供递送功能性核酸的方法，其包括(a)提供包含功能性核酸分子或包含含有编码功能性核酸分子之片段的质粒的完整小细
胞，然后(b)让小细胞与靶哺乳动物细胞接触，使得哺乳动物细胞吞入小细胞。吞入小细胞
后，功能性核酸分子被释放到细胞质、转运到核中并由靶细胞表达。前述的质粒也可以包含
调节元件，比如可操纵连接到编码功能性核酸分子之片段上的启动子、终止子、增强子或信
号序列。如果质粒包含依赖于RNA聚合酶(pol)II或pol III的启动子，比如RNA III聚
合酶启动子人7SK、H1和U6，是特别有利的。此外，质粒可以包含报告元件，比如编码绿色
荧光蛋白的核酸片段。小细胞和哺乳动物细胞间的接触可以在体外或者在体内。
胞，然后(b)让小细胞与靶哺乳动物细胞接触，使得哺乳动物细胞吞入小细胞。吞入小细胞
后，功能性核酸分子被释放到细胞质、转运到核中并由靶细胞表达。前述的质粒也可以包含
调节元件，比如可操纵连接到编码功能性核酸分子之片段上的启动子、终止子、增强子或信
号序列。如果质粒包含依赖于RNA聚合酶(pol)II或pol III的启动子，比如RNA III聚
合酶启动子人7SK、H1和U6，是特别有利的。此外，质粒可以包含报告元件，比如编码绿色
荧光蛋白的核酸片段。小细胞和哺乳动物细胞间的接触可以在体外或者在体内。
[0012] 在本发明中，“功能性核酸”的范畴包含：siRNA分子，包括shRNA分子；miRNA分子、反义分子；和核酶分子。优选的是，该功能性核酸分子靶向促进耐药性、抑制细胞凋亡、或有助于致瘤表型的蛋白质的基因或转录物。特别有用的有助于耐药性的靶标包括ATP结
合盒转运蛋白比如P-糖蛋白、MDR-2、MDR-3、BCRP、APTl 1a和LRP。特别有用的有助于细
胞凋亡抗性的靶标包括Bcl-2(B细胞白血病/淋巴瘤)、Bcl-XL、A1/Bfl 1、黏着斑激酶和
p53突变蛋白质。其它有用的靶标有致癌蛋白质和突变肿瘤抑制子蛋白质。
合盒转运蛋白比如P-糖蛋白、MDR-2、MDR-3、BCRP、APTl 1a和LRP。特别有用的有助于细
胞凋亡抗性的靶标包括Bcl-2(B细胞白血病/淋巴瘤)、Bcl-XL、A1/Bfl 1、黏着斑激酶和
p53突变蛋白质。其它有用的靶标有致癌蛋白质和突变肿瘤抑制子蛋白质。
[0013] 另一方面，本发明提供克服耐药性或细胞凋亡抗性和治疗对象的恶性肿瘤的方法。该方法包括(a)提供包含功能性核酸分子或含有编码功能性核酸分子之片段的质粒的
完整小细胞，其中所述功能性核酸分子靶向促进耐药性的蛋白质的转录物，(b)让小细胞与
靶哺乳动物细胞接触，从而哺乳动物细胞吞入小细胞，和(c)向靶哺乳动物细胞递送化疗
药物。优选的是在步骤(a)和(b)之后实施步骤(c)，从而让功能性核酸在施用药物之前减
少对该药物的耐药性。药物可以通过任何的常规方法递送，但优选以完整的小细胞递送。
完整小细胞，其中所述功能性核酸分子靶向促进耐药性的蛋白质的转录物，(b)让小细胞与
靶哺乳动物细胞接触，从而哺乳动物细胞吞入小细胞，和(c)向靶哺乳动物细胞递送化疗
药物。优选的是在步骤(a)和(b)之后实施步骤(c)，从而让功能性核酸在施用药物之前减
少对该药物的耐药性。药物可以通过任何的常规方法递送，但优选以完整的小细胞递送。
[0014] 在本发明某些实施方案中，小细胞通过双特异性配体与靶哺乳细胞接触。该双特异性配体既对小细胞上的表面成分又对哺乳动物细胞上的表面成分比如受体具有特异性。
因此，该配体使小细胞与哺乳动物细胞结合，哺乳动物细胞将小细胞吞入，并且小细胞的有
效载荷被释放到哺乳动物细胞的细胞质中。在本发明其它实施方案中，使小细胞与具有吞
噬或胞吞能力的靶哺乳动物细胞接触。当靶细胞具有吞噬能力时，双特异性配体的应用是
任选的。
因此，该配体使小细胞与哺乳动物细胞结合，哺乳动物细胞将小细胞吞入，并且小细胞的有
效载荷被释放到哺乳动物细胞的细胞质中。在本发明其它实施方案中，使小细胞与具有吞
噬或胞吞能力的靶哺乳动物细胞接触。当靶细胞具有吞噬能力时，双特异性配体的应用是
任选的。
[0015] 在另一方面中，本发明提供一种组合物，其包含(i)完整的小细胞和(ii)其药用可接受载体，其中该小细胞含有功能性核酸分子或编码功能性核酸分子的质粒。所述功能
性核酸分子可以是shRNA或miRNA或其它siRNA分子、反义分子、或核酶分子。优选的是，
该功能性核酸分子靶向促进耐药性、抑制细胞凋亡或有助于致瘤表型的蛋白质的基因或转
录物。尤其有用的有助于耐药性的靶标包括ATP结合盒转运蛋白比如P-糖蛋白、MDR-2
和MDR-3。尤其有用的有助于细胞凋亡抗性的靶标包括Bcl-2(B细胞白血病/淋巴瘤)、
Bcl-XL、A1/Bfl 1、黏着斑激酶和p53突变蛋白质。其它有用的靶标是致癌蛋白质和突变肿
瘤抑制子蛋白质。所述质粒可以包含调节元件，比如可操纵连接到编码功能性核酸分子之
片段上的启动子、终止子、增强子或信号序列。此外，所述质粒可以包含报告元件。功能性
核酸分子可以包括多个RNA干扰序列，比如miRNA或shRNA，并且它们可以是共顺反子的或
由分开的启动子所表达，从而可能同时敲减与耐药性相关的多个靶标。在优选实施方案中，
7 8 9 10 11 12
所述组合物中每10、10、10、10 、10 或10 个小细胞含有少于一个污染的亲细胞。
性核酸分子可以是shRNA或miRNA或其它siRNA分子、反义分子、或核酶分子。优选的是，
该功能性核酸分子靶向促进耐药性、抑制细胞凋亡或有助于致瘤表型的蛋白质的基因或转
录物。尤其有用的有助于耐药性的靶标包括ATP结合盒转运蛋白比如P-糖蛋白、MDR-2
和MDR-3。尤其有用的有助于细胞凋亡抗性的靶标包括Bcl-2(B细胞白血病/淋巴瘤)、
Bcl-XL、A1/Bfl 1、黏着斑激酶和p53突变蛋白质。其它有用的靶标是致癌蛋白质和突变肿
瘤抑制子蛋白质。所述质粒可以包含调节元件，比如可操纵连接到编码功能性核酸分子之
片段上的启动子、终止子、增强子或信号序列。此外，所述质粒可以包含报告元件。功能性
核酸分子可以包括多个RNA干扰序列，比如miRNA或shRNA，并且它们可以是共顺反子的或
由分开的启动子所表达，从而可能同时敲减与耐药性相关的多个靶标。在优选实施方案中，
7 8 9 10 11 12
所述组合物中每10、10、10、10 、10 或10 个小细胞含有少于一个污染的亲细胞。
[0016] 在又一个方面中，本发明提供完整小细胞在制备药物中的应用，所述药物用于通过向细胞、组织或器官施用该药物来克服耐药性或促进细胞凋亡的方法中。在该药物中，所
述小细胞含有功能性核酸分子或编码功能性核酸分子的质粒，其中功能性核酸分子靶向促
进耐药性或抑制细胞凋亡的蛋白质的转录物。在此背景下所治疗的疾病可以是癌，例如，或
者获得性疾病，比如AIDS和结核病。
述小细胞含有功能性核酸分子或编码功能性核酸分子的质粒，其中功能性核酸分子靶向促
进耐药性或抑制细胞凋亡的蛋白质的转录物。在此背景下所治疗的疾病可以是癌，例如，或
者获得性疾病，比如AIDS和结核病。
[0017] 本发明对在癌和HIV背景下递送功能性核酸的常规方法和制剂作出了明显的改进，通过下述实现了这一点：(i)提供递送功能性核酸的安全和稳定的载体，(ii)对抗疾病
细胞中主要的耐药机制，(iii)降低与克服耐药性有关的毒副作用，和(iv)提供定向和包
装药物的载体，从而治疗疾病。
附图说明
细胞中主要的耐药机制，(iii)降低与克服耐药性有关的毒副作用，和(iv)提供定向和包
装药物的载体，从而治疗疾病。
附图说明
[0018] 图1显示各种治疗对人结肠癌细胞系Caco-2生存力的作用。X轴显示各种治疗(小细胞用“M”表示)，用条形图表示细胞生存百分率。每个条形图表示六个独立测量值的
平均值，并显示了平均值的标准偏差。
平均值，并显示了平均值的标准偏差。
[0019] 图2显示二重处理后人结肠癌(Caco-2)异种移植物在裸鼠(每组11只小鼠)中的消退，该二重处理采用(1)携带有shRNA编码质粒(抗-bcl2或抗-Mdr 1)的定向重组小
细胞和(2)包装有化疗药物伊立替康(Irinotecan)的定向小细胞。用于靶向结肠癌细胞的
双特异性抗体在一个臂上携带了针对鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)O-抗原的特异性，
在另一个臂上携带了针对人表皮生长因子受体(EGFR)的特异性。定向重组小细胞在第9
和23天经静脉注射，包装有伊立替康的定向小细胞在第15、18、29和32天经静脉提供。其
EGFR
它经静脉施用的对照处理包括：组1-只有肿瘤、组2-游离伊立替康、组3- 小细胞Irino、
EGFR EGFR EGFR
组4- 小细胞shRNA-MDR-1、组5- 小细胞shRNA-bcl-2、和组6- 小细胞shRNA-MDR-1以及随后的游离伊立替康。y轴显示肿瘤体积。对每个测量值都显示了SEM。
细胞和(2)包装有化疗药物伊立替康(Irinotecan)的定向小细胞。用于靶向结肠癌细胞的
双特异性抗体在一个臂上携带了针对鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)O-抗原的特异性，
在另一个臂上携带了针对人表皮生长因子受体(EGFR)的特异性。定向重组小细胞在第9
和23天经静脉注射，包装有伊立替康的定向小细胞在第15、18、29和32天经静脉提供。其
EGFR
它经静脉施用的对照处理包括：组1-只有肿瘤、组2-游离伊立替康、组3- 小细胞Irino、
EGFR EGFR EGFR
组4- 小细胞shRNA-MDR-1、组5- 小细胞shRNA-bcl-2、和组6- 小细胞shRNA-MDR-1以及随后的游离伊立替康。y轴显示肿瘤体积。对每个测量值都显示了SEM。
[0020] 图3显示二重处理后人结肠癌(Caco-2)异种移植物在裸鼠(每组11只小鼠)中的消退，该二重处理采用(1)携带有shRNA编码质粒(抗-bcl2或抗-Mdr 1)的定向重组
小细胞和(2)包装有化疗药物5-FU的定向小细胞。用于靶向结肠癌细胞的双特异性抗体
在一个臂上携带了针对鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)O-抗原的特异性，在另一个臂上
携带了针对人表皮生长因子受体(EGFR)的特异性。定向重组小细胞在第9和23天经静
脉注射，包装有5-FU的定向小细胞在第15、18、29和32天经静脉提供。其它经静脉施用
4
的对照处理包括：G1-只有肿瘤、G2-(对照)游离5-FU(5×10ng/gm小鼠体重～每只小鼠
6 EGFR EGFR EGFR
1×10ng)、G3(对照) 小细胞5-FU、G4(对照) 小细胞shRNA-MDR-1、G5(对照) 小细胞
EGFR CMV EGFR
shRNA-bcl-2、G6(对照) 小细胞shRNA-MDR-1以及随后 小细胞5-FU、G7(对照) 小细胞shRNA-无EGFR EGFR EGFR
义以及随后 小细胞5-FU、G8(对照) 小细胞shRNA-MDR-1以及随后游离5-FU、G9(实验)
EGFR EGFR EGFR
小细胞shRNA-MDR-1以及随后 小细胞5-FU和G10(实验) 小细胞shRNA-bcl-2以及随后 小细
胞5-FU。y轴显示肿瘤体积。对每个测量值都显示了SEM。
小细胞和(2)包装有化疗药物5-FU的定向小细胞。用于靶向结肠癌细胞的双特异性抗体
在一个臂上携带了针对鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)O-抗原的特异性，在另一个臂上
携带了针对人表皮生长因子受体(EGFR)的特异性。定向重组小细胞在第9和23天经静
脉注射，包装有5-FU的定向小细胞在第15、18、29和32天经静脉提供。其它经静脉施用
4
的对照处理包括：G1-只有肿瘤、G2-(对照)游离5-FU(5×10ng/gm小鼠体重～每只小鼠
6 EGFR EGFR EGFR
1×10ng)、G3(对照) 小细胞5-FU、G4(对照) 小细胞shRNA-MDR-1、G5(对照) 小细胞
EGFR CMV EGFR
shRNA-bcl-2、G6(对照) 小细胞shRNA-MDR-1以及随后 小细胞5-FU、G7(对照) 小细胞shRNA-无EGFR EGFR EGFR
义以及随后 小细胞5-FU、G8(对照) 小细胞shRNA-MDR-1以及随后游离5-FU、G9(实验)
EGFR EGFR EGFR
小细胞shRNA-MDR-1以及随后 小细胞5-FU和G10(实验) 小细胞shRNA-bcl-2以及随后 小细
胞5-FU。y轴显示肿瘤体积。对每个测量值都显示了SEM。
[0021] 图4显示进行二重处理后人乳腺癌(MDA-MB-468)异种移植物在裸鼠(每组11只小鼠)中的消退，该二重处理采用(1)携带有shRNA编码质粒(抗-MDR-1)的定向重组小
细胞和(2)包装有化疗药物阿霉素(doxorubicin)的定向小细胞。靶向乳腺癌细胞的双
特异性抗体在一个臂上携带了针对鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)O-抗原的特异性，在
另一个臂上携带了针对人EGFR的特异性。定向重组小细胞在第21天经静脉注射，包装有
Dox的定向小细胞在第27、34和41天经静脉提供。经静脉施用的处理包括：G1-只有肿瘤、
EGFR EGFR EGFR
G2(对照) 小细胞Dox、和G3(实验) 小细胞shRNA-MDR-1以及随后 小细胞Dox。y轴显示
肿瘤体积。对每个测量值都显示了SEM。
细胞和(2)包装有化疗药物阿霉素(doxorubicin)的定向小细胞。靶向乳腺癌细胞的双
特异性抗体在一个臂上携带了针对鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)O-抗原的特异性，在
另一个臂上携带了针对人EGFR的特异性。定向重组小细胞在第21天经静脉注射，包装有
Dox的定向小细胞在第27、34和41天经静脉提供。经静脉施用的处理包括：G1-只有肿瘤、
EGFR EGFR EGFR
G2(对照) 小细胞Dox、和G3(实验) 小细胞shRNA-MDR-1以及随后 小细胞Dox。y轴显示
肿瘤体积。对每个测量值都显示了SEM。
[0022] 图5显示给药方案对耐药性逆转和治疗效果的影响。在裸鼠中建立人结肠癌(Caco-2)异种移植物并施用以下静脉内处理：G1-只有肿瘤、G2(对照)游离伊立替康、
EGFR EGFR EGFR
G3(实验) 小细胞shRNA-MDR-1以及随后96小时后的 小细胞Irino、G4(实验) 小细胞
EGFR EGFR
shRNA-MDR-1以及随后120小时后的 小细胞Irino、和G5(实验) 小细胞shRNA-MDR-1以及随后
EGFR
144小时后的 小细胞Irino。用于靶向乳腺癌细胞的双特异性抗体在一个臂上携带针对
鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)O-抗原的特异性，在另一个臂上携带针对人EGFR的特异
性。y轴显示肿瘤体积。对每个测量值都显示了SEM。
EGFR EGFR EGFR
G3(实验) 小细胞shRNA-MDR-1以及随后96小时后的 小细胞Irino、G4(实验) 小细胞
EGFR EGFR
shRNA-MDR-1以及随后120小时后的 小细胞Irino、和G5(实验) 小细胞shRNA-MDR-1以及随后
EGFR
144小时后的 小细胞Irino。用于靶向乳腺癌细胞的双特异性抗体在一个臂上携带针对
鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)O-抗原的特异性，在另一个臂上携带针对人EGFR的特异
性。y轴显示肿瘤体积。对每个测量值都显示了SEM。
[0023] 图6显示给药方案对耐药性逆转和治疗效果的影响。在裸鼠中建立人结肠癌(Caco-2)异种移植物并施用以下静脉内处理：G1-只有肿瘤、G2(对照)游离5-FU、G3(实
EGFR EGFR EGFR
验) 小细胞shRNA-MDR-1以及随后96小时后的 小细胞5-FU、G4(实验) 小细胞shRNA-MDR-1
EGFR EGFR
以及随后120小时后的 小细胞5-FU、和G5(实验) 小细胞shRNA-MDR-1以及随后144小时
EGFR
后的 小细胞5-FU。用于靶向乳腺癌细胞的双特异性抗体在一个臂上携带针对鼠伤寒沙门
氏菌(S.typhimurium)O-抗原的特异性，在另一个臂上携带针对人EGFR的特异性。y轴显
示肿瘤体积。对每个测量值都显示了SEM。
EGFR EGFR EGFR
验) 小细胞shRNA-MDR-1以及随后96小时后的 小细胞5-FU、G4(实验) 小细胞shRNA-MDR-1
EGFR EGFR
以及随后120小时后的 小细胞5-FU、和G5(实验) 小细胞shRNA-MDR-1以及随后144小时
EGFR
后的 小细胞5-FU。用于靶向乳腺癌细胞的双特异性抗体在一个臂上携带针对鼠伤寒沙门
氏菌(S.typhimurium)O-抗原的特异性，在另一个臂上携带针对人EGFR的特异性。y轴显
示肿瘤体积。对每个测量值都显示了SEM。
[0024] 优选实施方案的详细说明
[0025] 本发明人已经发现，细菌性来源的完整小细胞可以安全和有效的向靶哺乳动物细胞中引入一定范围的功能性核酸中的任何种类，比如siRNA分子、miRNA分子、核酶或反义
核酸。在癌和HIV感染的特定情形下，本发明人已经发现通过完整小细胞将功能性核酸引
入靶细胞可以降低靶细胞中的耐药性或细胞凋亡抗性。
核酸。在癌和HIV感染的特定情形下，本发明人已经发现通过完整小细胞将功能性核酸引
入靶细胞可以降低靶细胞中的耐药性或细胞凋亡抗性。
[0026] 本发明人还发现，小细胞可以顺序转染同样的靶哺乳动物细胞，尤其是在体内，并且该小细胞可以向同样的靶哺乳动物细胞顺序递送一定范围的不同有效载荷。这些发现对
于任何大粒子(macroparticulate)递送载体是第一次，并且首次提供治疗复杂多因素疾
病象癌和HIV的方法，在这些疾病状况下需要向同一细胞递送不同的治疗有效载荷来达到
治疗效果。相似的，本发明人已经发现，与不同基因中多突变相关的耐药性的复杂问题可以
采用小细胞来解决，该小细胞将多个RNAi序列引入宿主细胞以对抗多个遗传性缺陷，并且
在小细胞介导的RNAi递送后并且留下足够的时间来敲减介导耐药性的蛋白质靶，可以对
原来对特定化疗药物具有抗性的癌细胞用包装有同样药物的小细胞进行有效的治疗。这是
首次在体内证明可有效地治疗用所有其它治疗方法都难以医治的癌症。发现有效治疗耐药
性癌细胞所需的、经小细胞递送的化疗药物的浓度低于独立药物治疗所需的浓度超过1000
倍。这是一个令人吃惊的发现，因为所有先前使用RNAi或耐药性介导蛋白质的抑制剂以逆
转耐药性的方法仍然需要可对哺乳动物对象引起严重毒性的药物浓度。因此，本发明方法，
即小细胞介导的RNAi递送之后进行小细胞介导的化疗药物给药具有没有严重毒性而有效
治疗癌症的潜力。
于任何大粒子(macroparticulate)递送载体是第一次，并且首次提供治疗复杂多因素疾
病象癌和HIV的方法，在这些疾病状况下需要向同一细胞递送不同的治疗有效载荷来达到
治疗效果。相似的，本发明人已经发现，与不同基因中多突变相关的耐药性的复杂问题可以
采用小细胞来解决，该小细胞将多个RNAi序列引入宿主细胞以对抗多个遗传性缺陷，并且
在小细胞介导的RNAi递送后并且留下足够的时间来敲减介导耐药性的蛋白质靶，可以对
原来对特定化疗药物具有抗性的癌细胞用包装有同样药物的小细胞进行有效的治疗。这是
首次在体内证明可有效地治疗用所有其它治疗方法都难以医治的癌症。发现有效治疗耐药
性癌细胞所需的、经小细胞递送的化疗药物的浓度低于独立药物治疗所需的浓度超过1000
倍。这是一个令人吃惊的发现，因为所有先前使用RNAi或耐药性介导蛋白质的抑制剂以逆
转耐药性的方法仍然需要可对哺乳动物对象引起严重毒性的药物浓度。因此，本发明方法，
即小细胞介导的RNAi递送之后进行小细胞介导的化疗药物给药具有没有严重毒性而有效
治疗癌症的潜力。
[0027] 此外，本发明人已经发现可以调整小细胞的血清型以克服对小细胞的宿主免疫反应。
[0029] I.定义
[0032] 单数形式“一个(种)”、“这”和“该”包括“多个(种)”、“这些”的涵义，除非上下文中另外清楚地指示。
[0033] “反义寡核苷酸”表示与特定基因转录物的部分互补的核酸分子，其可以与该转录物杂交并阻滞它的翻译。反义寡核苷酸可以包括RNA或DNA。
[0034] “生物分子序列”或“序列”表示多核苷酸或多肽序列的整体或部分。
[0035] 可以在本文中互换使用的“癌症”、“瘤”、“肿瘤”、“恶性肿瘤”和“癌”表示展现出异常生长表型的细胞或组织，该异常生长表型的特征在于明显丧失了对细胞增殖的控制。本发明的方法和组合物特别适用于癌前期的、恶性的、转移前的、转移的、和非转移的细胞。
[0036] “互补的”表示两个分子相互作用界面的拓扑相容性或它们互相匹配，比如功能性核酸分子和它的靶标。分子可被描述为是互补的，此外，接触界面特征是彼此互补的。
[0037] 在本文上下文中所用的“相应于”或“代表”，例如“相应于”或“代表”某基因的多核苷酸或序列，表示该多核苷酸的序列存在于该基因内或核酸基因产物、例如mRNA内。多核苷酸可以整个存在于基因染色体序列的外显子中，或多核苷酸序列的不同部分可以存在
于不同的外显子中，从而例如使得该邻接的多核苷酸序列存在于剪接前或剪接后的基因表
达产物mRNA中。
于不同的外显子中，从而例如使得该邻接的多核苷酸序列存在于剪接前或剪接后的基因表
达产物mRNA中。
[0038] “细胞因子”是一种通称，其表示由一种细胞群所释放的、作为细胞间介质作用于另一种细胞群的蛋白质。
[0039] “药物”表示任何生理学或药理学活性物质，其在动物尤其是哺乳动物和人中产生局部或全身性的作用。
[0041] “功能性核酸”表示一经引入宿主细胞，就特异的干扰蛋白质的表达的核酸分子。通常，功能性核酸分子具有通过与编码蛋白质的转录物直接作用来降低蛋白质表达的能
力。核酶、反义核酸和siRNA分子，包括shRNA分子、短RNAs(通常长度少于400个碱基)、
微-RNAs(miRNAs)组成典型的功能性核酸。
力。核酶、反义核酸和siRNA分子，包括shRNA分子、短RNAs(通常长度少于400个碱基)、
微-RNAs(miRNAs)组成典型的功能性核酸。
[0042] “基因”表示产生多肽或前体所必需的控制和编码序列的多核苷酸序列。该多肽可由全长编码序列或由编码序列的任何部分来编码。基因可以具有不间断的编码序列，或它
可以包含一个或多个内含子，并由适宜的剪接点结合。此外，在可影响表达产物的生物学活
性或化学结构、表达率、或表达控制方式的编码或非翻译区中，基因可以包含一个或多个修
饰。这样的修饰包括、但不限于一个或多个核苷酸的突变、插入、缺失和取代。在这点上，这样的被修饰基因可以被称为“天然”基因的“变体”。
可以包含一个或多个内含子，并由适宜的剪接点结合。此外，在可影响表达产物的生物学活
性或化学结构、表达率、或表达控制方式的编码或非翻译区中，基因可以包含一个或多个修
饰。这样的修饰包括、但不限于一个或多个核苷酸的突变、插入、缺失和取代。在这点上，这样的被修饰基因可以被称为“天然”基因的“变体”。
[0043] “宿主细胞”表示可以或已经被用作多核苷酸重组载体或其它多核苷酸转移的受体的细胞，其包括已经转染的原始细胞的后代。由于自然地、偶然地、或故意地突变，单细胞的后代在形态或基因组或总DNA补体上不必完全与原始亲代一致。
[0044] “杂交”表示多核苷酸序列通过碱基配对与互补序列结合的任何过程。
[0045] 在本文中可互换使用的“个体”、“对象”、“宿主”和“患者”表示任何期望进行诊断、处理、或治疗的哺乳动物对象。在一个优选实施方案中，所述个体、对象、宿主、或患者是人。其它的对象可包括、但不限于牛、马、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、灵长类动物和小鼠。
[0046] “标记物”表示能提供可检测信号的试剂，其直接或通过与信号产生系统的一个或多个另外成员的相互作用来提供可检测信号。可直接检测并且可能在本发明中使用
的标记物包括荧光标记物。特定的荧光团包括荧光素、若丹明、BODIPY、花青染料等。本
35 32 3
发明也考虑使用放射性同位素比如 S、p、H等作为标记物。同样可以利用比色标记物
比如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳)珠。例如，见美国专利
No.4,366,241、No.4,277,437、No.4,275,149、No.3,996,345、No.3,939,350、No.3,850,752和No.3,817,837。
的标记物包括荧光标记物。特定的荧光团包括荧光素、若丹明、BODIPY、花青染料等。本
35 32 3
发明也考虑使用放射性同位素比如 S、p、H等作为标记物。同样可以利用比色标记物
比如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳)珠。例如，见美国专利
No.4,366,241、No.4,277,437、No.4,275,149、No.3,996,345、No.3,939,350、No.3,850,752和No.3,817,837。
[0047] “寡核苷酸”表示包含例如约10个核苷酸(nt)到约1000nt的多核苷酸。本发明中应用的寡核苷酸优选为约10nt到约150nt。寡核苷酸可以是天然存在的寡核苷酸或合成
的寡核苷酸。寡核苷酸可以被修饰。
的寡核苷酸。寡核苷酸可以被修饰。
[0048] “小细胞”表示无核形式的细菌性细胞，其通过在二分裂期间对具有DNA分离的细胞分裂协调的干扰来产生。所述小细胞不同于在某些情形中自发产生并释放的其它小泡，
与小细胞相比，后者并不是由特定的基因重排或游离体基因的表达所致。对于实施本发明，
有完整细胞壁的小细胞(“完整的小细胞”)是理想的。
与小细胞相比，后者并不是由特定的基因重排或游离体基因的表达所致。对于实施本发明，
有完整细胞壁的小细胞(“完整的小细胞”)是理想的。
[0049] “被修饰的寡核苷酸”和“被修饰的多核苷酸”表示有一个或多个化学修饰的寡核苷酸或多核苷酸，所述化学修饰发生在碱基、糖部分、核苷间磷酸键中的所有或任意部分的
天然分子结构的分子水平上，还表示在这些位点处有加入取代或修饰组合的分子。核苷间
磷酸键可以是磷酸二酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧基甲酯、乙酰胺、氨基甲酸酯、硫醚、桥连磷酸酰胺酯、桥连亚甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸甲酯、二硫代磷酸酯、桥连硫代磷酸酯或砜核苷酸间键、或3’-3’、5’-3’、或5’-5’键、和这些相似键的组合。
磷酸二酯键可以用取代键替换，比如硫代磷酸酯、甲氨基、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、和胍，并且多核苷酸的核糖亚单位也可以被取代(例如，己糖磷酸二酯；肽核酸)。修饰可以是内
在的(单一或重复)或在寡核苷酸分子末端，并且可以包括向分子添加核苷间磷酸键，比如
脱氧核糖和磷酸修饰，其切割开或交联到相反链或相关的酶或其它蛋白质。术语“被修饰的
寡核苷酸”和“被修饰的多核苷酸”也包括含有对糖部分的修饰(例如，3’-取代的核糖核
苷酸或脱氧核糖核苷酸单体)的寡核苷酸或多核苷酸，其中任意一个通过5’-3’键结合到
一起。
天然分子结构的分子水平上，还表示在这些位点处有加入取代或修饰组合的分子。核苷间
磷酸键可以是磷酸二酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧基甲酯、乙酰胺、氨基甲酸酯、硫醚、桥连磷酸酰胺酯、桥连亚甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸甲酯、二硫代磷酸酯、桥连硫代磷酸酯或砜核苷酸间键、或3’-3’、5’-3’、或5’-5’键、和这些相似键的组合。
磷酸二酯键可以用取代键替换，比如硫代磷酸酯、甲氨基、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、和胍，并且多核苷酸的核糖亚单位也可以被取代(例如，己糖磷酸二酯；肽核酸)。修饰可以是内
在的(单一或重复)或在寡核苷酸分子末端，并且可以包括向分子添加核苷间磷酸键，比如
脱氧核糖和磷酸修饰，其切割开或交联到相反链或相关的酶或其它蛋白质。术语“被修饰的
寡核苷酸”和“被修饰的多核苷酸”也包括含有对糖部分的修饰(例如，3’-取代的核糖核
苷酸或脱氧核糖核苷酸单体)的寡核苷酸或多核苷酸，其中任意一个通过5’-3’键结合到
一起。
[0050] 短语“核酸分子”和术语“多核苷酸”表示任意长度的核苷酸的聚合形式，该核苷酸或者是核糖核苷酸或者是脱氧核糖核苷酸。它们包括单-、双-或多链的DNA或RNA、基因组DNA、eDNA、DNA-RNA杂交体、或包含嘌呤和嘧啶碱基或其它天然的、以化学或生化方法修饰
的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的主链可包含糖和磷酸基团(正如
在RNA或DNA中通常所见到的)、或被修饰的或取代的糖或磷酸基团。可选择的是，多核苷
酸的主链可包括合成亚单位比如亚磷酰胺的聚合物，因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯或
混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，比如甲基化的核苷
酸和核苷酸类似物、尿嘧啶(uracyl)、其它的糖连接基团比如氟核糖和硫代酯(thioate)
以及核苷酸支链。多核苷酸可以被进一步的修饰，比如与标记成分缀合。其它类型的修饰
包括加帽、用类似物取代一个或多个天然的核苷酸、和引入将多核苷酸附着于蛋白质、金属
离子、标记成分、其它的多核苷酸或固体支持物的方式。
的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的主链可包含糖和磷酸基团(正如
在RNA或DNA中通常所见到的)、或被修饰的或取代的糖或磷酸基团。可选择的是，多核苷
酸的主链可包括合成亚单位比如亚磷酰胺的聚合物，因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯或
混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，比如甲基化的核苷
酸和核苷酸类似物、尿嘧啶(uracyl)、其它的糖连接基团比如氟核糖和硫代酯(thioate)
以及核苷酸支链。多核苷酸可以被进一步的修饰，比如与标记成分缀合。其它类型的修饰
包括加帽、用类似物取代一个或多个天然的核苷酸、和引入将多核苷酸附着于蛋白质、金属
离子、标记成分、其它的多核苷酸或固体支持物的方式。
[0051] “药用可接受的”表示生理上的相容性。药用可接受的载体或赋形剂不消除所施用的组合物的生物活性，在化学上是惰性的，并且对其所施用的生物体是无毒的。
[0052] 在本文中可替换使用的“多肽”和“蛋白质”表示任何长度的氨基酸的聚合形式，其可包括翻译的、未翻译的、化学修饰的、生化修饰的、和衍生的氨基酸。多肽或蛋白质可以是天然的、重组的、或合成的，或这些形式的任意组合。此外，多肽或蛋白质可包括天然蛋白质或肽的片段。多肽或蛋白质可以是单分子或可以是多分子复合物。此外，这样的多肽或
蛋白质可具有被修饰的肽主链。该术语包括融合蛋白质，其包括具有异源氨基酸序列的融
合蛋白质、具有异源和同源前导序列的、有或没有N-末端甲硫氨酸残基的融合体、免疫标
记的蛋白质等等。
蛋白质可具有被修饰的肽主链。该术语包括融合蛋白质，其包括具有异源氨基酸序列的融
合蛋白质、具有异源和同源前导序列的、有或没有N-末端甲硫氨酸残基的融合体、免疫标
记的蛋白质等等。
[0053] “纯化的”表示从其天然环境中获取的化合物，其至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％没有它所天然关联的其它成分。
[0054] “核酶”表示具有酶活性的RNA分子，其能以核苷酸碱基序列特异性的方式反复切割其它的RNA分子。
[0055] “RNA干扰”(RNAi)表示基因表达(蛋白质合成)的序列特异性或基因特异性抑制，其由短的干扰性RNA(siRNA)、短-发夹RNA、短RNA或微-RNA介导。
[0056] “序列一致性”表示相似性或互补性的程度。可以是部分一致或完全一致。部分互补序列是至少部分抑制同样序列杂交到靶多核苷酸上的一种序列；它使用功能术语“基本
一致”来表示。对完全互补序列与靶序列杂交的抑制可以用杂交分析(DNA印迹或RNA印
迹、溶液杂交等)在低严格条件下来检测。基本一致序列或探针将竞争和抑制完全一致序
列或探针与靶序列在低严格条件下的结合(即杂交)。这并不是说低严格条件下是允许非
特异性结合的条件；低严格条件需要两个序列相互之间的结合是特异性(即，选择性)相互
作用。非特异性结合存在与否可用第二靶序列检验，该第二靶序列甚至缺少部分程度的互
补性(例如，少于约30％的一致性)；在缺少非特异性结合的情况，探针将不与第二非互补
靶序列杂交。
一致”来表示。对完全互补序列与靶序列杂交的抑制可以用杂交分析(DNA印迹或RNA印
迹、溶液杂交等)在低严格条件下来检测。基本一致序列或探针将竞争和抑制完全一致序
列或探针与靶序列在低严格条件下的结合(即杂交)。这并不是说低严格条件下是允许非
特异性结合的条件；低严格条件需要两个序列相互之间的结合是特异性(即，选择性)相互
作用。非特异性结合存在与否可用第二靶序列检验，该第二靶序列甚至缺少部分程度的互
补性(例如，少于约30％的一致性)；在缺少非特异性结合的情况，探针将不与第二非互补
靶序列杂交。
[0057] 在两个核酸或多肽序列的情况下，另外一种检查序列一致性的方式需要参考两个序列在进行比对以使指定区域有最大对应性性排比时相同的残基。正如在此使用的，“序列
一致性百分比”表示在比较窗对两个最佳比对序列进行比较所确定的值，其中对于两个序
列的最佳比对而言，在比较窗中多核苷酸序列的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相
比可包含添加或缺失(即，缺口)。所述百分比的计算是通过确定两个序列中出现相同核酸
碱基位置的数目，从而产生匹配位置的数目，并用匹配位置的数目除以比较窗中总的位置
数目并且结果乘以100，从而得到序列一致性百分比。
一致性百分比”表示在比较窗对两个最佳比对序列进行比较所确定的值，其中对于两个序
列的最佳比对而言，在比较窗中多核苷酸序列的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相
比可包含添加或缺失(即，缺口)。所述百分比的计算是通过确定两个序列中出现相同核酸
碱基位置的数目，从而产生匹配位置的数目，并用匹配位置的数目除以比较窗中总的位置
数目并且结果乘以100，从而得到序列一致性百分比。
[0058] “短干扰RNA”(siRNA)表示双链RNA分子，通常为约10到约30个核苷酸长，它们能够介导RNA干扰(RNAi)。正如在本文中所用的，术语siRNA包括短发夹RNAs，也被称作
shRNAs。
shRNAs。
[0059] 术语“治疗”、“处理”、“处置”等表示获得所需的药理学和/或生理上的效果。就完全或部分预防疾病或其症状而言，所述效果可以是预防性的，和/或就部分或完全稳定或治愈疾病和/或由疾病引起的副作用而言，所述效果可以是治疗性的。“治疗”包括任何对
哺乳动物、尤其是人的疾病的治疗，并包括：(a)预防对象中发生所述疾病或症状，该对象
可能易患该疾病或症状但仍然还没有被确诊；(b)抑制疾病症状，即，阻止它的发展；或(c)
减轻疾病症状，即，引起疾病或症状的消退。
哺乳动物、尤其是人的疾病的治疗，并包括：(a)预防对象中发生所述疾病或症状，该对象
可能易患该疾病或症状但仍然还没有被确诊；(b)抑制疾病症状，即，阻止它的发展；或(c)
减轻疾病症状，即，引起疾病或症状的消退。
[0060] II.功能性核酸通过小细胞的递送
[0061] 本发明在一方面提供向靶细胞递送功能性核酸的方法，其包括(a)提供完整的小细胞，该小细胞包含功能性核酸分子或含有编码功能性核酸分子的片段的质粒，随后，(b)
使小细胞与靶哺乳动物细胞接触，从而该哺乳动物细胞吞入小细胞。小细胞吞入之后，该功
能性核酸分子被释放到靶细胞的细胞质中或由靶细胞表达。如WO 2005/056749中所述，小
细胞可以通过双特异性配体与靶哺乳动物细胞接触。小细胞和靶哺乳动物细胞间的接触可
以在体外或体内进行。
使小细胞与靶哺乳动物细胞接触，从而该哺乳动物细胞吞入小细胞。小细胞吞入之后，该功
能性核酸分子被释放到靶细胞的细胞质中或由靶细胞表达。如WO 2005/056749中所述，小
细胞可以通过双特异性配体与靶哺乳动物细胞接触。小细胞和靶哺乳动物细胞间的接触可
以在体外或体内进行。
[0062] A.小细胞
[0063] 本发明的小细胞是无核形式的大肠埃希氏杆菌(E.coli)或其它的细菌细胞，它们通过在二分裂期间干扰伴随DNA分离的细胞分裂协同作用产生的。原核的染色体复制与
正常的二分裂相关，其涉及细胞中隔膜的形成。例如，在E.coli中，min基因比如minCD的
突变可消除细胞分离期间在细胞极中隔膜形成的抑制，这导致产生正常的子细胞和无核的
小细胞。见de Boer et al.，1992；Rasin & de Boer，1999；Hu&Lutkenhaus，1999；Harry，
2001。小细胞与在某些情形中自发产生和释放的其它小泡不同，并且，与小细胞相比，所述
小泡并没有特定的基因重排或游离体基因的表达。为实施本发明，有完整细胞壁的小细胞
(“完整的小细胞”)是理想的。
正常的二分裂相关，其涉及细胞中隔膜的形成。例如，在E.coli中，min基因比如minCD的
突变可消除细胞分离期间在细胞极中隔膜形成的抑制，这导致产生正常的子细胞和无核的
小细胞。见de Boer et al.，1992；Rasin & de Boer，1999；Hu&Lutkenhaus，1999；Harry，
2001。小细胞与在某些情形中自发产生和释放的其它小泡不同，并且，与小细胞相比，所述
小泡并没有特定的基因重排或游离体基因的表达。为实施本发明，有完整细胞壁的小细胞
(“完整的小细胞”)是理想的。
[0064] 除了min操纵子突变，无核的小细胞也可依照影响隔膜形成的一系列其它基因的重排或突变来产生，例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的divIVB1中。见Reeve and
Cornett，1975；Levin et al.，1992。小细胞也可依照参与细胞分裂/染色体分离的蛋白质
的基因表达水平干扰来形成。例如，minE的过表达导致极性分裂并产生小细胞。相似的，
无染色体的小细胞可因染色体分离缺陷产生，例如枯草芽孢杆菌中smc突变(Britton et
al.，1998)、枯草芽孢杆菌中spoOJ缺失(Ireton et al.，1994)、大肠埃希氏杆菌中mukB突
变(Hiraga et al.，1989)、和大肠埃希氏杆菌中parC突变(Stewart and D’Ari，1992)。
基因产物可以反式提供。当由高拷贝量质粒进行过表达时，例如，CafA可增强细胞分裂率
和/或抑制复制后的染色体分配(Okada et al.，1994)，导致形成链式细胞和无核小细胞
(Wachi et al.，1989；Okada et al.，1993)。所述小细胞可以从革兰氏阳性或革兰氏阴性
起源的任何细菌细胞进行制备。
Cornett，1975；Levin et al.，1992。小细胞也可依照参与细胞分裂/染色体分离的蛋白质
的基因表达水平干扰来形成。例如，minE的过表达导致极性分裂并产生小细胞。相似的，
无染色体的小细胞可因染色体分离缺陷产生，例如枯草芽孢杆菌中smc突变(Britton et
al.，1998)、枯草芽孢杆菌中spoOJ缺失(Ireton et al.，1994)、大肠埃希氏杆菌中mukB突
变(Hiraga et al.，1989)、和大肠埃希氏杆菌中parC突变(Stewart and D’Ari，1992)。
基因产物可以反式提供。当由高拷贝量质粒进行过表达时，例如，CafA可增强细胞分裂率
和/或抑制复制后的染色体分配(Okada et al.，1994)，导致形成链式细胞和无核小细胞
(Wachi et al.，1989；Okada et al.，1993)。所述小细胞可以从革兰氏阳性或革兰氏阴性
起源的任何细菌细胞进行制备。
[0065] 根据本发明，小细胞包含功能性核酸或编码期望被递送的功能性核酸的质粒。本发明的“功能性”核酸分子具有通过与编码蛋白质的转录物直接作用而降低该蛋白质表达
的能力。siRNA分子、核酶和反义核酸是典型的功能性核酸。
的能力。siRNA分子、核酶和反义核酸是典型的功能性核酸。
[0066] B.siRNA分子
[0067] 短干扰RNA(siRNA)分子可用于实施RNA干扰(RNAi)，一种转录后基因沉默机制。siRNA通常表示约10到约30个核苷酸长的双链RNA分子，并根据它们特异性干扰蛋白质
表达的能力来命名。优选siRNA分子为12到28个核苷酸长，更优选15到25个核苷酸长，
仍然更优选19到23个核苷酸长，最优选21到23个核苷酸长。因此，优选的siRNA分子是
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个核苷酸长。
表达的能力来命名。优选siRNA分子为12到28个核苷酸长，更优选15到25个核苷酸长，
仍然更优选19到23个核苷酸长，最优选21到23个核苷酸长。因此，优选的siRNA分子是
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个核苷酸长。
[0068] 一条链的长度指示了siRNA分子的长度。例如，描述为21个核糖核苷酸长(21-mer)的siRNA可包含两个互补的RNA链，它们退火在一起形成19个连续的碱基配对。
在每条链上两个余下的核糖核苷酸形成“突出端”。当siRNA包含两条不同长度的链时，由
较长链指定siRNA的长度。例如，包含21个核苷酸长的一条链和20个核苷酸长的另一链
的dsRNA构成21-mer。
在每条链上两个余下的核糖核苷酸形成“突出端”。当siRNA包含两条不同长度的链时，由
较长链指定siRNA的长度。例如，包含21个核苷酸长的一条链和20个核苷酸长的另一链
的dsRNA构成21-mer。
[0069] 包含突出端的siRNA是理想的。突出端可以在链的5’或3’末端。优选在RNA链的3’末端。突出端的长度可以变化，但是优选约1到约5个碱基，更优选约2个核苷酸长。
优选的是，本发明的siRNA将包括约2-4个碱基的3’突出端。更优选的是，该3’突出端是
2个核糖核苷酸长。甚至更优选的是，包含3’突出端的2个核糖核苷酸是尿苷(U)。
优选的是，本发明的siRNA将包括约2-4个碱基的3’突出端。更优选的是，该3’突出端是
2个核糖核苷酸长。甚至更优选的是，包含3’突出端的2个核糖核苷酸是尿苷(U)。
[0070] 根据本发明，术语siRNA包括短发夹RNAs(shRNAs)。shRNAs包括形成茎-环结构的单链RNA，其中的茎由包括双链siRNA的互补有义和反义链组成，所述的环是大小可变的
连接物。shRNAs的茎结构通常为约10到约30个核苷酸长。优选shRNA分子的茎为12到
28个核苷酸长，更优选15到25个核苷酸长，仍然更优选19到23个核苷酸长，最优选21到
23个核苷酸长。因此，优选的shRNA分子包括12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、
25、26、27、28或29个核苷酸长的茎。
连接物。shRNAs的茎结构通常为约10到约30个核苷酸长。优选shRNA分子的茎为12到
28个核苷酸长，更优选15到25个核苷酸长，仍然更优选19到23个核苷酸长，最优选21到
23个核苷酸长。因此，优选的shRNA分子包括12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、
25、26、27、28或29个核苷酸长的茎。
[0071] 本发明的siRNAs被设计成与靶核糖核苷酸序列相互作用，这意味着它们充分地与靶序列互补，从而与靶序列杂交。在一个实施方案中，本发明提供了siRNA分子，该siRNA
分子包含与靶核糖核苷酸序列或与靶核糖核苷酸序列的互补序列有至少70％、75％、80％、
85％或90％一致性的核糖核苷酸序列。优选该siRNA分子与靶核糖核苷酸序列或靶核糖核
苷酸序列的互补序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。最优选的是，siRNA与靶核苷酸序列或核糖核苷酸序列的互补序列有100％一致性。然而，相对
于靶而言由插入、缺失或单一点突变的siRNA分子也是有效的。
分子包含与靶核糖核苷酸序列或与靶核糖核苷酸序列的互补序列有至少70％、75％、80％、
85％或90％一致性的核糖核苷酸序列。优选该siRNA分子与靶核糖核苷酸序列或靶核糖核
苷酸序列的互补序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的一致性。最优选的是，siRNA与靶核苷酸序列或核糖核苷酸序列的互补序列有100％一致性。然而，相对
于靶而言由插入、缺失或单一点突变的siRNA分子也是有效的。
[0072] 帮助siRNA设计的工具是公众很容易获得的。例如，基于计算机的siRNA设计工具可以在因特网的www.dharmacon.com中获得。
[0073] C.核酶
[0074] 核酶是具有酶活性的RNA分子，它能够以核苷酸碱基序列特异性的方式重复地切割其它的RNA分子。这样的有酶促活性的RNA分子可被靶向于实际上任何的RNA转录物，
并在体外实现有效的切割。
并在体外实现有效的切割。
[0075] 目前已知有六种基本类型的天然存在的酶促活性RNAs。每一种都能够在生理条件下反式催化RNA磷酸二酯键的水解(并且由此可以切割其它的RNA分子)。通常，具有酶促
活性的多核苷酸通过首先结合到靶RNA上而发挥作用。这样的结合通过具有酶促活性的多
核苷酸的靶结合部分发生，该靶结合部分被保持密切接近该分子中用来切割靶RNA的酶促
部分。由此，该酶促活性多核苷酸首先识别、并随后通过互补碱基配对结合靶RNA，并且一旦与正确的位置结合，它就发挥酶促作用来切割靶RNA。这种对靶RNA关键性的切割将破坏它
指导所编码蛋白质合成的能力。在酶促活性多核苷酸已经结合和切割它的靶RNA之后，它
从那个RNA上被释放下来，并搜索另一个目标，于是可以重复地结合并切割新目标。
活性的多核苷酸通过首先结合到靶RNA上而发挥作用。这样的结合通过具有酶促活性的多
核苷酸的靶结合部分发生，该靶结合部分被保持密切接近该分子中用来切割靶RNA的酶促
部分。由此，该酶促活性多核苷酸首先识别、并随后通过互补碱基配对结合靶RNA，并且一旦与正确的位置结合，它就发挥酶促作用来切割靶RNA。这种对靶RNA关键性的切割将破坏它
指导所编码蛋白质合成的能力。在酶促活性多核苷酸已经结合和切割它的靶RNA之后，它
从那个RNA上被释放下来，并搜索另一个目标，于是可以重复地结合并切割新目标。
[0076] 核酶的酶促特性是有益处的。因为一个核酶分子就能够切割许多靶RNA分子，故核酶的有效浓度是非常低的。
[0077] 有用的核酶可以包括数种基元中的一种，包括锤头(Rossi et al.(1992))、发夹(Hampel and Tritz，(1989)，Hampel et al.(1990))、肝炎δ病毒基元(Perrotta and
Been(1992)，group I内含子(美国专利No.4,987,071))、与RNA引导序列相关的RNaseP
RNA(Guerrier-Takada etal.(1983))、和链孢霉VS RNA(Saville&Collins(1990)；Saville
&Collins(1991)；Collins&Olive(1993))。这些特定的基元并非限制性的，因为对本发明核
酶非常重要的仅仅是它具有与一个或多个靶RNA区域互补的特异性底物结合位点，并且它
在底物结合位点内或周围具有赋予该分子以RNA切割活性的核苷酸序列。
Been(1992)，group I内含子(美国专利No.4,987,071))、与RNA引导序列相关的RNaseP
RNA(Guerrier-Takada etal.(1983))、和链孢霉VS RNA(Saville&Collins(1990)；Saville
&Collins(1991)；Collins&Olive(1993))。这些特定的基元并非限制性的，因为对本发明核
酶非常重要的仅仅是它具有与一个或多个靶RNA区域互补的特异性底物结合位点，并且它
在底物结合位点内或周围具有赋予该分子以RNA切割活性的核苷酸序列。
[0078] 本发明的核酶可包含被修饰的寡核苷酸(例如，用于改善稳定性、靶向等)。编码核酶的核酸序列可以处在强组成型启动子控制之下，例如RNA聚合酶II或RNA聚合酶III
启动子，从而被转染的细胞将产生足够量的核酶从而破坏靶内源性信使并抑制翻译。
启动子，从而被转染的细胞将产生足够量的核酶从而破坏靶内源性信使并抑制翻译。
[0079] D.反义寡核苷酸
[0080] 本发明的反义寡核苷酸特异的与编码蛋白质的核酸杂交，并且干扰该蛋白质的转录或翻译。在一个实施方案中，反义寡核苷酸靶向DNA并干扰它的复制和/或转录。在另
一个实施方案中，反义寡核苷酸与RNA特异性的杂交，所述RNA包括前体mRNA和mRNA。这
样的反义寡核苷酸可影响例如RNA向蛋白质翻译位点的转位、由RNA翻译蛋白质、RNA的剪
接以产生一个或多个种类的mRNA和该RNA参加或促进的催化活性。这种干扰的总体效果
是调节、降低、或抑制靶蛋白质的表达。
一个实施方案中，反义寡核苷酸与RNA特异性的杂交，所述RNA包括前体mRNA和mRNA。这
样的反义寡核苷酸可影响例如RNA向蛋白质翻译位点的转位、由RNA翻译蛋白质、RNA的剪
接以产生一个或多个种类的mRNA和该RNA参加或促进的催化活性。这种干扰的总体效果
是调节、降低、或抑制靶蛋白质的表达。
[0081] 在基因内有几个位点可以利用来设计反义寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸可结合包含开放阅读框开放阅读框的翻译起始密码子(也称作起始密码子)的区域。在这点上，
“起始密码子”和“翻译起始密码子”通常表示此mRNA或基因中包含从翻译起始密码子起的
任一方向上(即，5’或3’)至少约25到至少约50个连续核苷酸的部分。
“起始密码子”和“翻译起始密码子”通常表示此mRNA或基因中包含从翻译起始密码子起的
任一方向上(即，5’或3’)至少约25到至少约50个连续核苷酸的部分。
[0082] 可发生反义相互作用的另一个位点是开放阅读框开放阅读框的终止密码子。术语“终止密码子区”和“翻译终止密码子区”通常表示这种mRNA或基因中包括从翻译终止密码
子起的任一方向上至少约25到至少约50个连续核苷酸的部分。
子起的任一方向上至少约25到至少约50个连续核苷酸的部分。
[0083] 开放阅读框或编码区同样可以被有效地靶向。开放阅读框通常被理解为表示翻译起始密码子和翻译终止密码子之间的区域。另一个靶区域是5’非翻译区，其是mRNA中从
翻译起始密码子起的5’方向上的部分。它包括mRNA的5’加帽位点和翻译起始密码子之
间的核苷酸或该基因上的相应核苷酸。
翻译起始密码子起的5’方向上的部分。它包括mRNA的5’加帽位点和翻译起始密码子之
间的核苷酸或该基因上的相应核苷酸。
[0084] 相似的，3’非翻译区可被用作反义寡核苷酸的靶标。该3’非翻译区是mRNA上从翻译终止密码子起3’方向的部分，并由此包括mRNA的翻译终止密码子和3’末端之间的核
苷酸或该基因的相应核苷酸。
苷酸或该基因的相应核苷酸。
[0085] 反义寡核苷酸也可靶向mRNA的5’帽区。所述5’帽包括通过5’-5’三磷酸酯键与该mRNA的5’-最末端残基连接的N7-甲基化鸟苷残基。5’帽区被视为包括5’帽结构
自身以及与该帽结构紧邻的最初50个核苷酸。
自身以及与该帽结构紧邻的最初50个核苷酸。
[0086] 尽管一些真核的mRNA转录物被直接翻译，但是它们许多都含有一个或多个内含子区，其在翻译之前从转录物中被切除。余下(因此被翻译的)外显子区被剪接在一起，从
而形成连续的mRNA序列。mRNA剪接位点，即，内含子-外显子接头，代表可能的靶区，它们
在异常剪接与疾病有关、或涉及特定mRNA剪接产物的生产过剩与疾病有关的情形下是非
常有用的。此外，由于重排或缺失引起的异常融合接头也有可能作为反义寡核苷酸的靶标。
而形成连续的mRNA序列。mRNA剪接位点，即，内含子-外显子接头，代表可能的靶区，它们
在异常剪接与疾病有关、或涉及特定mRNA剪接产物的生产过剩与疾病有关的情形下是非
常有用的。此外，由于重排或缺失引起的异常融合接头也有可能作为反义寡核苷酸的靶标。
[0087] 对于这些不同的靶位点，必需选择与靶多核苷酸充分互补的反义寡核苷酸。必须有足够程度的互补性或精确配对，从而在寡核苷酸和靶多核苷酸之间发生稳定和特异性的
结合。重要的是，反义寡核苷酸序列与它的靶多核苷酸序列之间不需要100％的互补来产
生特异性的杂交。当反义寡核苷酸与靶核苷酸的结合干扰靶多核苷酸的正常功能、导致丧
失作用，并且有足够程度的互补性来避免反义寡核苷酸与非靶序列在期望特异性结合的条
件(即在体内检测或治疗处理的情况下是生理条件、在体外检测的情况下是实施检测的条
件)下发生非特异性的结合时，反义寡核苷酸是可特异性杂交的。
结合。重要的是，反义寡核苷酸序列与它的靶多核苷酸序列之间不需要100％的互补来产
生特异性的杂交。当反义寡核苷酸与靶核苷酸的结合干扰靶多核苷酸的正常功能、导致丧
失作用，并且有足够程度的互补性来避免反义寡核苷酸与非靶序列在期望特异性结合的条
件(即在体内检测或治疗处理的情况下是生理条件、在体外检测的情况下是实施检测的条
件)下发生非特异性的结合时，反义寡核苷酸是可特异性杂交的。
[0088] 反义寡核苷酸可以是至少约8nt到至少约50nt长。在一个实施方案中，反义寡核苷酸可以是约12到约30nt长。
[0089] 根据本发明应用的反义寡核苷酸可很便利地和以常规方式通过众所周知的固相合成技术来制备。有几个厂商销售有关此合成的设备，厂商包括，例如，Applied
Biosystems(Foster City，CA)。在本领域已知的有关此合成的任何其它方式都可以补充或
替换使用。使用相似的技术制备寡核苷酸比如硫代磷酸酯和烷基化衍生物是众所周知的。
Biosystems(Foster City，CA)。在本领域已知的有关此合成的任何其它方式都可以补充或
替换使用。使用相似的技术制备寡核苷酸比如硫代磷酸酯和烷基化衍生物是众所周知的。
[0090] E.编码功能性核酸的核酸
[0091] 在本发明优选实施方案中，小细胞包括编码功能性核酸的核酸。例如，质粒可编码在哺乳动物靶细胞内表达的功能性核酸。这使得功能性核酸的内源性递送变成可能，这种
递送相对于外源性递送的短暂性而言具有优势。
递送相对于外源性递送的短暂性而言具有优势。
[0092] 因此，重组的完整小细胞可携带编码一个或多个目的在于沉默耐药性或细胞凋亡抗性基因的siRNA序列的质粒DNA。使用编码多个功能性核酸的小细胞，有可能治疗表达多
种耐药机制的细胞。不同的siRNA序列可从不同的启动子各自表达。例如，靶向Pgp mRNA
的siRNA可从U6启动子表达，靶向Bcl-2mRNA的siRNA可从HI启动子表达。这些多个表
达盒优选被携带于单个质粒上，但也可以在不同的质粒上。不同的siRNA序列也可从单个
启动子表达，其中重组质粒携带包含多个siRNA-编码序列的表达盒，它们是通过非编码多
核苷酸序列连在一起的。单个基因转录终止子可被置于整个表达盒的下游。
种耐药机制的细胞。不同的siRNA序列可从不同的启动子各自表达。例如，靶向Pgp mRNA
的siRNA可从U6启动子表达，靶向Bcl-2mRNA的siRNA可从HI启动子表达。这些多个表
达盒优选被携带于单个质粒上，但也可以在不同的质粒上。不同的siRNA序列也可从单个
启动子表达，其中重组质粒携带包含多个siRNA-编码序列的表达盒，它们是通过非编码多
核苷酸序列连在一起的。单个基因转录终止子可被置于整个表达盒的下游。
[0093] 在一个策略中，质粒以两个独立转录物的形式编码siRNA的有义和反义链，该两个独立转录物在靶细胞内表达之后将杂交形成功能性siRNA双链体。在另一个优选的策略
中，质粒编码一个或多个siRNA，其中每一个siRNA以单独转录物的形式表达，它们形成短
发夹RNA茎-环结构。可通过Dicer酶将发夹结构加工成功能性siRNA。
中，质粒编码一个或多个siRNA，其中每一个siRNA以单独转录物的形式表达，它们形成短
发夹RNA茎-环结构。可通过Dicer酶将发夹结构加工成功能性siRNA。
[0094] F.报告元件
[0095] 待通过本发明方法引入的核酸分子可包括报告元件。报告元件给它的重组宿主赋予了易于检测的表型或特征，通常是通过编码宿主原本不产生的多肽，该多肽一经表达就
可通过组织学或原位分析比如通过体内成像技术来检测。例如，根据本发明，由完整小细胞
递送的报告元件可编码在吞入宿主细胞中产生比色或荧光变化的蛋白质，这样的变化可通
过原位分析检测并且是转录活化的定量或半定量函数。这些蛋白质的例子是酯酶、磷酸酶、
蛋白酶和其它的酶，它们的活性产生可检测的发色团或荧光团。
可通过组织学或原位分析比如通过体内成像技术来检测。例如，根据本发明，由完整小细胞
递送的报告元件可编码在吞入宿主细胞中产生比色或荧光变化的蛋白质，这样的变化可通
过原位分析检测并且是转录活化的定量或半定量函数。这些蛋白质的例子是酯酶、磷酸酶、
蛋白酶和其它的酶，它们的活性产生可检测的发色团或荧光团。
[0096] 优选的实例是E.coli β-半乳糖苷酶，其通过切割成靛蓝底物-吲哚-β-D-半乳糖苷产生颜色的变化，以及荧光素酶，其氧化长链醛(细菌荧光素酶)或杂环羧酸(荧光
素)并伴随有光的释放。如Prasher et al.(1995)所述的编码水母(Aequorea victoria)
绿色荧光蛋白质(GFP)的报告元件在此情况中同样是有用的。两个已经公布的PCT申请
举例说明了GFP相关技术领域，即WO 095/21191(公开了编码238个氨基酸的GFP脱辅基
蛋白质的多核苷酸序列，包括从氨基酸65到67形成的发色团)和WO 095/21191(公开了
对水母GFP脱辅基肽的cDNA进行的修饰，提供具有改变的荧光特性的肽)，并且Heim et
al.(1994)报告了突变GFP，其特征在于激发幅度有4到6倍的改善。
素)并伴随有光的释放。如Prasher et al.(1995)所述的编码水母(Aequorea victoria)
绿色荧光蛋白质(GFP)的报告元件在此情况中同样是有用的。两个已经公布的PCT申请
举例说明了GFP相关技术领域，即WO 095/21191(公开了编码238个氨基酸的GFP脱辅基
蛋白质的多核苷酸序列，包括从氨基酸65到67形成的发色团)和WO 095/21191(公开了
对水母GFP脱辅基肽的cDNA进行的修饰，提供具有改变的荧光特性的肽)，并且Heim et
al.(1994)报告了突变GFP，其特征在于激发幅度有4到6倍的改善。
[0097] 另一种类型的报告元件与使重组小细胞对毒素具有抗性的表达产物有关。例如，neo基因保护宿主抵抗抗生素G418的毒性水平，而编码二氢叶酸还原酶的基因赋予对氨甲
蝶呤的抗性，氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因赋予对氯霉素的抗性。
蝶呤的抗性，氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因赋予对氯霉素的抗性。
[0098] 用作报告元件的其它基因包括那些可转化宿主小细胞而表达区别性细胞表面抗原的基因，例如病毒包膜蛋白质比如HIV gp120或疱疹gD，它们很容易通过免疫分析进行
检测。
检测。
[0099] G.调节元件
[0100] 将通过本发明方法引入的核酸分子也可以具有可操纵连接到调节元件比如启动子、终止子、增强子和/或信号序列的期望编码片段。合适的启动子可具有组织特异性或甚
至肿瘤特异性，依治疗情况而定。
至肿瘤特异性，依治疗情况而定。
[0101] 当启动子在指定组织中被优先活化、因此在靶组织中有效启动可操纵连接的结构序列的表达时，该启动子是“组织特异性的”。组织特异性启动子的类型包括，例如：分别对于白蛋白和al-抗胰蛋白酶的肝细胞特异性启动子；弹性蛋白酶I基因控制区，其在胰腺
泡细胞中是有活性的；胰岛素基因控制区，其在胰腺β细胞中是有活性的；小鼠乳腺肿瘤
病毒控制区，其在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中是有活性的；髓鞘碱性蛋白基因控制区，其在脑的少突胶质细胞中是有活性的；和促性腺激素释放基因控制区，其在下丘脑细胞中是
有活性的。见Frain et al.(1991)、Ciliberto et al.(1985)、Pinkert et al.，(1987)、
Kelsey et al.(1987)、Swift et al.(1984)、MacDonald(1987)、Hanahan，(1985)、Lederet al.(1986)、Readhead et al.(1987)和Mason et al.(1986)。
泡细胞中是有活性的；胰岛素基因控制区，其在胰腺β细胞中是有活性的；小鼠乳腺肿瘤
病毒控制区，其在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中是有活性的；髓鞘碱性蛋白基因控制区，其在脑的少突胶质细胞中是有活性的；和促性腺激素释放基因控制区，其在下丘脑细胞中是
有活性的。见Frain et al.(1991)、Ciliberto et al.(1985)、Pinkert et al.，(1987)、
Kelsey et al.(1987)、Swift et al.(1984)、MacDonald(1987)、Hanahan，(1985)、Lederet al.(1986)、Readhead et al.(1987)和Mason et al.(1986)。
[0102] 启动子也包括在某些肿瘤细胞中或在肿瘤细胞自身中优先表达，和可用于根据本发明治疗不同癌的启动子。癌细胞特异性启动子的类别例举如下：针对黑素瘤的酪氨
酸酶启动子；针对乳腺癌的MUC1/Df3启动子；杂合myoD增强子/SV40启动子，其靶向横
纹肌肉瘤(RMS)的表达；癌胚抗原(CEA)启动子，其对CEA表达细胞比如结肠癌细胞具
有特异性；和针对非小细胞肺癌的己糖激酶II型基因启动子。见Hart(1996)，Morton &
Potter(1998)，Kurane et al.(1998)和Katabi et al.(1999)。
酸酶启动子；针对乳腺癌的MUC1/Df3启动子；杂合myoD增强子/SV40启动子，其靶向横
纹肌肉瘤(RMS)的表达；癌胚抗原(CEA)启动子，其对CEA表达细胞比如结肠癌细胞具
有特异性；和针对非小细胞肺癌的己糖激酶II型基因启动子。见Hart(1996)，Morton &
Potter(1998)，Kurane et al.(1998)和Katabi et al.(1999)。
[0103] 依赖于RNA聚合酶(pol)II或pol II的启动子是优选的启动子。特别优选的启动子是RNA III聚合酶启动子H1和U6。
[0104] 根据本发明，可使用信号序列实现表达产物的分泌或表达产物向特定细胞区室的定位。因此，经完整小细胞递送的治疗性多核苷酸分子可在适当的阅读框中包含信号序列，
从而通过吞入细胞或它的后代分泌目的表达产物，由此以与所选治疗一致的方式影响周围
的细胞。例举的信号序列包括描述于美国专利No.5,143,830的溶血素C-末端分泌序列、公
布于美国专利No.5,037,743的BAR1分泌序列，和描述于美国专利No.6,025,197的zsig32
多肽的信号序列部分。
从而通过吞入细胞或它的后代分泌目的表达产物，由此以与所选治疗一致的方式影响周围
的细胞。例举的信号序列包括描述于美国专利No.5,143,830的溶血素C-末端分泌序列、公
布于美国专利No.5,037,743的BAR1分泌序列，和描述于美国专利No.6,025,197的zsig32
多肽的信号序列部分。
[0105] H.功能性核酸的靶标
[0106] 本发明功能性核酸靶向于促进耐药性、抑制细胞凋亡或促进致瘤表型的蛋白质的基因或转录物。功能性核酸策略在这些背景下的成功应用已在本领域中实现，但没有
得益于小细胞载体。见，例如，Sioud(2004)、Caplen(2003)、Wu et al.(2003)、Nieth et al.(2003)、Caplen and Mousses(2003)、Duxbury et al.(2004)、Yague et al.(2004)、
Duan et al.(2004)。
得益于小细胞载体。见，例如，Sioud(2004)、Caplen(2003)、Wu et al.(2003)、Nieth et al.(2003)、Caplen and Mousses(2003)、Duxbury et al.(2004)、Yague et al.(2004)、
Duan et al.(2004)。
[0107] 有助于耐药性的蛋白质构成功能性核酸的优选靶标。所述蛋白质可参与获得性耐药性或固有耐药性。当患病细胞比如肿瘤细胞最初对药物有反应、但是在随后的治疗周期
中变成顽固性时，就获得了耐药性表型。涉及获得性耐药性的有用靶标包括ATP结合盒转
运蛋白比如P-糖蛋白(P-gp、P-170、PGY1、MDR1、ABCB1、MDR-相关蛋白、多药耐药性蛋白
1)、MDR-2和MDR-3。MRP2(多药耐药性相关蛋白)、BCR-ABL(断裂点簇区域-Abelson原
癌基因)、STI-571耐药性相关蛋白质、肺耐药性相关蛋白、环加氧酶-2、细胞核因子-κ、
XRCC1(X-线交叉互补组1)、ERCC1(切除交叉互补基因)、GSTP1(谷胱甘肽S-转移酶)、突
变β-微管蛋白、和生长因子比如IL-6是另外的涉及获得性耐药性的靶标。当先前未处理
的细胞未能对一种或多种药物作出反应时，耐药性表型是固有的。参与固有耐药性的蛋白
质实例是LRP(肺耐药性相关蛋白质)。
中变成顽固性时，就获得了耐药性表型。涉及获得性耐药性的有用靶标包括ATP结合盒转
运蛋白比如P-糖蛋白(P-gp、P-170、PGY1、MDR1、ABCB1、MDR-相关蛋白、多药耐药性蛋白
1)、MDR-2和MDR-3。MRP2(多药耐药性相关蛋白)、BCR-ABL(断裂点簇区域-Abelson原
癌基因)、STI-571耐药性相关蛋白质、肺耐药性相关蛋白、环加氧酶-2、细胞核因子-κ、
XRCC1(X-线交叉互补组1)、ERCC1(切除交叉互补基因)、GSTP1(谷胱甘肽S-转移酶)、突
变β-微管蛋白、和生长因子比如IL-6是另外的涉及获得性耐药性的靶标。当先前未处理
的细胞未能对一种或多种药物作出反应时，耐药性表型是固有的。参与固有耐药性的蛋白
质实例是LRP(肺耐药性相关蛋白质)。
[0108] 有用的靶标也包括参与细胞凋亡耐受性的蛋白质。这些包括Bcl-2(B细胞白血病/淋巴瘤)Bcl-XL、A1/Bfl 1、黏着斑激酶和p53突变蛋白质。
[0109] 有用的靶标还包括致癌基因和突变肿瘤抑制蛋白质。实例包括β-联蛋白、PKC-α(蛋白激酶C)、C-RAF、K-Ras(V12)、DP97Dead框RNA解旋酶、DNMT1(DNA转甲基酶
1)、FLIP(Flice-样抑制蛋白)、C-Sfc、53BPI、Polycomb组蛋白质EZH2(zeste同系物的增强
子)、ErbB1、HPV-16E5和E7(人乳头瘤病毒早期蛋白5和早期蛋白7)、Fortilin&MCI1P(骨
髓细胞白血病1蛋白)、DIP13α(DDC相互作用蛋白13a)、MBD2(甲基化CpG结合域)、
p21、KLF4(Kruppel-样因子4)、tpt/TCTP(翻译控制肿瘤蛋白)、SPK1&SPK2(鞘氨醇激
酶)、P300、PLK1(Polo-样激酶-1)、Trp53、Ras、ErbB1、VEGF(血管内皮生长因子)、和
BAG-1(BCL2-相关抗死亡基因1)。
1)、FLIP(Flice-样抑制蛋白)、C-Sfc、53BPI、Polycomb组蛋白质EZH2(zeste同系物的增强
子)、ErbB1、HPV-16E5和E7(人乳头瘤病毒早期蛋白5和早期蛋白7)、Fortilin&MCI1P(骨
髓细胞白血病1蛋白)、DIP13α(DDC相互作用蛋白13a)、MBD2(甲基化CpG结合域)、
p21、KLF4(Kruppel-样因子4)、tpt/TCTP(翻译控制肿瘤蛋白)、SPK1&SPK2(鞘氨醇激
酶)、P300、PLK1(Polo-样激酶-1)、Trp53、Ras、ErbB1、VEGF(血管内皮生长因子)、和
BAG-1(BCL2-相关抗死亡基因1)。
[0110] 在HIV感染方面靶标包括HIV-Tat、HIV-Rev、HIV-Vif、HIV-Nef、HIV-Gag、HIV-Env、LTR、CD4、CXCR4(趋化因子受体)和CCR5(趋化因子受体)。
[0111] 因为肿瘤细胞的异质性，大量不同的耐药性或细胞凋亡抗性路径在靶细胞中是可操纵的。因此，用于本发明方法的功能性核酸可能要求随着时间而改变。例如，如果在活组
织检查样品中发现有新的导致获得性耐药性的突变，可以设计特异性的siRNAs并使其在
合适的表达质粒上编码，将该质粒转化进入产生小细胞的细菌菌株，用来产生用于施用以
处理获得性耐药性的重组小细胞。
织检查样品中发现有新的导致获得性耐药性的突变，可以设计特异性的siRNAs并使其在
合适的表达质粒上编码，将该质粒转化进入产生小细胞的细菌菌株，用来产生用于施用以
处理获得性耐药性的重组小细胞。
[0112] III.克服耐药性和治疗疾病的方法
[0113] 在另一方面中，本发明提供在对象中克服耐药性和治疗疾病比如癌症或AIDS的方法。该方法包括(a)提供包含功能性核酸分子或含有编码功能性核酸分子之片段的质粒
的完整小细胞，其中所述功能性核酸分子靶向于促进耐药性蛋白质的基因或转录物，(b)使
该小细胞与靶哺乳动物细胞接触，由此哺乳动物细胞吞入小细胞，和(c)递送药物到靶哺
乳动物细胞。优选的是，在步骤(a)和(b)之后实施步骤(c)，从而允许功能性核酸在药物
施用前降低耐药性。药物的递送和功能性核酸的引入可以以任何顺序连续发生或同时进
行。
的完整小细胞，其中所述功能性核酸分子靶向于促进耐药性蛋白质的基因或转录物，(b)使
该小细胞与靶哺乳动物细胞接触，由此哺乳动物细胞吞入小细胞，和(c)递送药物到靶哺
乳动物细胞。优选的是，在步骤(a)和(b)之后实施步骤(c)，从而允许功能性核酸在药物
施用前降低耐药性。药物的递送和功能性核酸的引入可以以任何顺序连续发生或同时进
行。
[0114] 根据本发明，可通过任何常规的方法递送药物。例如，药物式可以通过口服、肠胃外(包括皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、和通过输注)、局部的、经皮的或通过吸入进行递
送。医学领域的技术人员可很容易地确定每种药的适宜递送方式和剂量。
送。医学领域的技术人员可很容易地确定每种药的适宜递送方式和剂量。
[0115] A.经小细胞的药物递送
[0116] 尽管药物递送可通过常规方法进行，但优选通过小细胞的递送。在这点上，发明人已经发现通过包装有不同有效载荷的定向完整小细胞，可以成功地重转染同一哺乳动物细
胞。例如，包装有编码siRNA的质粒的小细胞可以转染哺乳动物细胞，此后包装药物的小细
胞可将药物递送给同一哺乳动物细胞。这个发现是惊人的，并且表明在首轮转染和有效载
荷递送之后，与小细胞分解、有效载荷的内体释放和有效载荷逃逸至细胞内靶标的细胞内
过程仍然保持充分的功能。
胞。例如，包装有编码siRNA的质粒的小细胞可以转染哺乳动物细胞，此后包装药物的小细
胞可将药物递送给同一哺乳动物细胞。这个发现是惊人的，并且表明在首轮转染和有效载
荷递送之后，与小细胞分解、有效载荷的内体释放和有效载荷逃逸至细胞内靶标的细胞内
过程仍然保持充分的功能。
[0117] 药物可以包装在与功能性核酸或编码功能性核酸的质粒分开的小细胞中。可选择的是，药物可以包装在与功能性核酸分子或编码功能性核酸分子的质粒相同的小细胞中。
某些药物可以与核酸相互作用，于是排除将药物和核酸共包装在同一小细胞中。例如，已知
阿霉素与DNA会相互作用。
某些药物可以与核酸相互作用，于是排除将药物和核酸共包装在同一小细胞中。例如，已知
阿霉素与DNA会相互作用。
[0118] 优选的是，本发明的小细胞包含足够量的药物以发挥药物对靶细胞的生理或药理作用。同样优选的是，包含于小细胞内的药物对于小细胞而言是异源的、或外来的，这意味
着小细胞的亲代细菌细胞通常不产生该药物。
着小细胞的亲代细菌细胞通常不产生该药物。
[0119] 通过在含有小细胞的细胞外介质和小细胞细胞质之间建立药物浓度梯度，可将亲水性和疏水性药物包装在小细胞中。当细胞外介质比小细胞细胞质具有较高的药物浓度
时，药物自然地沿着这个浓度梯度移动进入小细胞细胞质。然而，当浓度梯度被逆转时，药
物不会移出小细胞。
时，药物自然地沿着这个浓度梯度移动进入小细胞细胞质。然而，当浓度梯度被逆转时，药
物不会移出小细胞。
[0120] 为使小细胞负载通常不溶于水的药物，开始时可将药物溶于合适的溶剂中。例如，可将紫杉醇溶解于1∶1混合的乙醇和聚氧乙烯蓖麻油甘油醚EL(聚乙氧基化蓖麻油)中，
接下来在PBS中稀释从而获得紫杉醇溶液，其中紫杉醇是部分溶解于水介质中，并且携带
有极小量的有机溶剂从而确保药物仍然保持在溶液中。小细胞可以在此最终介质中培育以
进行药物的负载。由此，发明人发现，甚至疏水性药物也可以扩散到小细胞细胞质中从而获
得高的和治疗上显著的细胞质药物载荷。这是没有预料到的，因为小细胞膜由疏水性磷脂
双层组成，本来预计其应会阻止疏水性分子扩散进细胞质。
接下来在PBS中稀释从而获得紫杉醇溶液，其中紫杉醇是部分溶解于水介质中，并且携带
有极小量的有机溶剂从而确保药物仍然保持在溶液中。小细胞可以在此最终介质中培育以
进行药物的负载。由此，发明人发现，甚至疏水性药物也可以扩散到小细胞细胞质中从而获
得高的和治疗上显著的细胞质药物载荷。这是没有预料到的，因为小细胞膜由疏水性磷脂
双层组成，本来预计其应会阻止疏水性分子扩散进细胞质。
[0121] 使小细胞负载药物的另一种方法涉及在亲代细菌细胞转录并翻译编码药物的核酸的条件下培养重组亲代细菌细胞，从而药物被释放到亲代细菌细胞的细胞质中。例如，编
码所需药物的细胞生物合成路径的基因簇可以被克隆并转移到能产生小细胞的亲代细菌
菌株中。基因簇的基因转录和翻译导致亲代细菌细胞的细胞质内药物的生物合成，由此使
药物填充细菌的细胞质。当亲代细菌细胞分裂并形成后代小细胞时，小细胞在它们的细胞
质中也包含了药物。可通过本领域已知的或上述的任何纯化小细胞的方法来纯化预包装的
小细胞。
码所需药物的细胞生物合成路径的基因簇可以被克隆并转移到能产生小细胞的亲代细菌
菌株中。基因簇的基因转录和翻译导致亲代细菌细胞的细胞质内药物的生物合成，由此使
药物填充细菌的细胞质。当亲代细菌细胞分裂并形成后代小细胞时，小细胞在它们的细胞
质中也包含了药物。可通过本领域已知的或上述的任何纯化小细胞的方法来纯化预包装的
小细胞。
[0122] 相似的，使小细胞负载药物的另一种方法涉及在小细胞内转录并翻译编码该药物的基因的条件下培养包含编码所述药物的表达质粒的重组小细胞。
[0123] B.药物
[0124] 可用于本发明的药物可以是任何生理上或药理学上的活性物质，其可以在动物、尤其是哺乳动物和人中产生所需的局部或全身性的作用。药物可以是无机或有机化合物，
包括、单并不限于肽、蛋白质、核酸、和小分子，其中的任何一种可以是已被表征的或未被表征的。它们可以是不同的形式，比如未改变的分子、分子复合物、药理学上可接受的盐，比
如盐酸盐、氢溴化物、硫酸盐、月桂酸盐、棕榈酸盐、磷酸盐、亚硝酸盐、硝酸盐、硼酸盐、乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、油酸盐、水杨酸盐、等。对于酸性药物，可以使用金属、胺或有机阳离子的盐，例如可以使用季铵盐。也可以使用药物的衍生物，比如碱、酯和酰胺。对于水不
溶性药物，可以以其水溶性衍生物的形式或其碱衍生物的形式使用，其中在任一情形下，或
者通过其递送，该药物被酶所转化，被机体pH所水解，或通过其它代谢过程，从而被转化为
原始治疗活性形式。
包括、单并不限于肽、蛋白质、核酸、和小分子，其中的任何一种可以是已被表征的或未被表征的。它们可以是不同的形式，比如未改变的分子、分子复合物、药理学上可接受的盐，比
如盐酸盐、氢溴化物、硫酸盐、月桂酸盐、棕榈酸盐、磷酸盐、亚硝酸盐、硝酸盐、硼酸盐、乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、油酸盐、水杨酸盐、等。对于酸性药物，可以使用金属、胺或有机阳离子的盐，例如可以使用季铵盐。也可以使用药物的衍生物，比如碱、酯和酰胺。对于水不
溶性药物，可以以其水溶性衍生物的形式或其碱衍生物的形式使用，其中在任一情形下，或
者通过其递送，该药物被酶所转化，被机体pH所水解，或通过其它代谢过程，从而被转化为
原始治疗活性形式。
[0125] 有用的药物包括化学治疗剂、免疫抑制剂、细胞因子、细胞毒性剂、核溶解化合物、放射性同位素、受体、和前体药物活化酶，其可以时天然发生的或通过重组方法产生。
[0126] 受典型多药耐药性影响的药物在本发明中有特别的利用价值，比如长春花属生物碱(例如，长春碱和长春新碱)、蒽环类物(例如，阿霉素和柔红霉素)、RNA转录抑制剂(例
如，放线菌素-D)和微管稳定化药物(例如，紫杉醇)。(Ambudkar et al.，1999)
如，放线菌素-D)和微管稳定化药物(例如，紫杉醇)。(Ambudkar et al.，1999)
[0127] 通常，癌化疗剂是优选的药物。有用的癌化疗药物包括氮芥、亚硝基脲、乙烯亚胺、链烷磺酸盐、四嗪、铂类化合物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗代谢物、叶酸类似物、蒽环类物、taxanes、长春花属生物碱、拓扑异构酶抑制剂和激素剂。化疗药物的实例是放线菌
素-D、左旋苯丙氨酸氮芥、Ara-C、阿那托唑、天门冬酰胺酶、BiCNU、必卡他胺、争光霉素、白消安、希罗达、卡铂、卡铂(Carboplatinum)、卡莫司汀、洛莫司汀(CCNU)、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、CPT-11、环磷酰胺、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、环磷酰胺(Cytoxan)、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、右丙亚胺、多西他赛、阿霉素、达卡巴嗪、表阿霉素、乙烯亚胺(Ethyleneimine)、依托泊苷、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟利坦、氟泰氮芥、吉西他滨、单克隆抗体Herceptin、六甲基胺(Hexamethylamine)、羟基脲、去甲柔毛霉素、异环磷酰胺、
伊立替康、罗氮芥、氮芥、苯丙氨酸氮芥、巯嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、曼托坦、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、氨羟二磷酸二钠、脱氧助间型霉素、普卡霉素、甲基苄肼、利妥希玛、类甾醇、链脲霉素、STI-571、链脲霉素、他莫昔芬、泰莫佐罗、替尼泊苷、四嗪(Tetrazine)、硫鸟嘌呤、噻替哌、托姆得司、拓扑替康、苏消安(Treosulphan)、曲麦克特、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春烯碱、依托泊苷、和卡培他滨。
素-D、左旋苯丙氨酸氮芥、Ara-C、阿那托唑、天门冬酰胺酶、BiCNU、必卡他胺、争光霉素、白消安、希罗达、卡铂、卡铂(Carboplatinum)、卡莫司汀、洛莫司汀(CCNU)、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、CPT-11、环磷酰胺、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、环磷酰胺(Cytoxan)、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、右丙亚胺、多西他赛、阿霉素、达卡巴嗪、表阿霉素、乙烯亚胺(Ethyleneimine)、依托泊苷、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟利坦、氟泰氮芥、吉西他滨、单克隆抗体Herceptin、六甲基胺(Hexamethylamine)、羟基脲、去甲柔毛霉素、异环磷酰胺、
伊立替康、罗氮芥、氮芥、苯丙氨酸氮芥、巯嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、曼托坦、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、氨羟二磷酸二钠、脱氧助间型霉素、普卡霉素、甲基苄肼、利妥希玛、类甾醇、链脲霉素、STI-571、链脲霉素、他莫昔芬、泰莫佐罗、替尼泊苷、四嗪(Tetrazine)、硫鸟嘌呤、噻替哌、托姆得司、拓扑替康、苏消安(Treosulphan)、曲麦克特、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春烯碱、依托泊苷、和卡培他滨。
[0128] 有用的癌化疗药物也包括烷化剂比如噻替哌和环磷酰胺；烷基磺酸盐比如白消安、二丙胺磺酯和哌泊舒凡；氮丙啶比如苯并多巴(Benzodopa)、卡波醌、四甲尿烷亚
胺和乌瑞替哌；乙撑亚胺和甲基蜜胺(methylamelamines)，包括六甲基蜜胺、三亚乙
基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚
乙基硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥比如苯丁酸氮芥、萘氮
芥、Cholophosphamide、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧化氮芥
(mechlorethamine oxide hydrochloride)、苯丙氨酸氮芥、新氮芥(Novembiehin)、苯芥
胆甾醇、松龙苯芥、三芥环磷酰胺、尿嘧啶氮芥；硝基脲比如Cannustine、氯脲霉素、福泰氮芥、罗氮芥、尼莫司汀和雷诺氮芥；抗生素比如阿克拉霉素、放线菌素C、Authramycin、氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C(Cactinomycin)、加里刹霉素、Carabicin、去甲柔红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、二乙氧醋酰阿霉素、6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸、
阿霉素、表阿霉素、去羟阿霉素、Idambicin、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加拉霉素、橄榄霉素、培来霉素、Potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲霉素、杀结核菌素、羟胺苯丁酰亮氨酸、新制癌菌素和正定苯酰肼；抗代谢物比如甲氨蝶呤和
5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物比如二甲叶酸、氨甲叶酸、蝶酰三谷氨酸和曲麦克特；嘌呤
类似物比如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫唑鸟嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物比如环胞苷、氮杂
胞苷、6-氮杂尿苷、氟脲己胺、阿糖胞苷、双去氧尿苷、多西氟尿啶、山嵛阿糖啶、氟尿苷和
5-FU；雄激素比如卡鲁睾酮、羟甲雄酮丙酸酯、环硫雄醇、Rnepitiostane和睾内酯；抗肾上腺物质比如氨鲁米特、曼托坦和腈环氧雄烷；叶酸补充剂比如frolinic acid、醋葡内酯、
aldophosphamide glycoside、氨基乙酰丙酸、胺苯吖啶、百垂布西、比生群(Bisantrene)、依达曲沙、Defofamine、秋水仙胺、地吖醌、Elfornithine、醋酸羟哔咔唑、环氧甘醚、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、氯尼达明、丙双脒腙、二羟蒽二酮、蒙匹胺醇、二胺硝吖啶、脱氧助间型霉素、蛋氨氮芥、吡喃阿霉素、足叶草肼酸、2-乙肼、甲基苄肼、 丙亚胺、西佐喃
(Sizofrran)、锗螺胺、细格孢氮杂酸、三亚胺醌、2，2′，2″-三氯三乙基胺、乌拉坦、长春地辛、达卡巴嗪、甘露醇氮芥、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、Gacytosine、阿拉伯糖苷(″Ara-C″)、环磷酰胺、噻替派、taxoids，例如，紫杉醇( Bristol-Myers
Squibb Oncology，Princeton，NJ)和Doxetaxel( Rhone-Poulenc Rorer，
Antony，France)、苯丁酸氮芥、吉西他滨、6-硫鸟嘌呤、巯基嘌呤、甲氨蝶呤；铂类似物比如顺铂和卡铂、长春花碱、铂、依托泊苷(VP-16)、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春烯碱、异长春花碱、Novantrone、替尼泊苷、柔红霉素、氨基蝶呤、卡培他滨、伊本膦酸钠、CPT-11、拓扑异构酶抑制剂RFS 2000、二氟甲基鸟氨酸(DMFO)、视黄酸、埃斯培拉霉
素、卡培他滨；和上面任何一种的药物可接受的盐、酸或衍生物。同样包括抗-激素剂，其
作用在于调节或抑制激素对肿瘤的作用，比如抗-雌激素物质，包括例如他莫昔芬、雷洛昔
芬、芳香化酶抑制剂4(5)-咪唑、4羟基他莫昔芬、曲奥昔芬、那洛西芬、奥那斯酮和涛瑞米
芬(Fareston)；和抗-雄激素物质比如氟利坦、尼鲁米特、比卡鲁胺、醋酸亮氨和性瑞林；和上面任何一种的药物可接受的盐、酸或衍生物。
胺和乌瑞替哌；乙撑亚胺和甲基蜜胺(methylamelamines)，包括六甲基蜜胺、三亚乙
基蜜胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚
乙基硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥比如苯丁酸氮芥、萘氮
芥、Cholophosphamide、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧化氮芥
(mechlorethamine oxide hydrochloride)、苯丙氨酸氮芥、新氮芥(Novembiehin)、苯芥
胆甾醇、松龙苯芥、三芥环磷酰胺、尿嘧啶氮芥；硝基脲比如Cannustine、氯脲霉素、福泰氮芥、罗氮芥、尼莫司汀和雷诺氮芥；抗生素比如阿克拉霉素、放线菌素C、Authramycin、氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C(Cactinomycin)、加里刹霉素、Carabicin、去甲柔红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、二乙氧醋酰阿霉素、6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸、
阿霉素、表阿霉素、去羟阿霉素、Idambicin、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加拉霉素、橄榄霉素、培来霉素、Potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲霉素、杀结核菌素、羟胺苯丁酰亮氨酸、新制癌菌素和正定苯酰肼；抗代谢物比如甲氨蝶呤和
5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物比如二甲叶酸、氨甲叶酸、蝶酰三谷氨酸和曲麦克特；嘌呤
类似物比如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫唑鸟嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物比如环胞苷、氮杂
胞苷、6-氮杂尿苷、氟脲己胺、阿糖胞苷、双去氧尿苷、多西氟尿啶、山嵛阿糖啶、氟尿苷和
5-FU；雄激素比如卡鲁睾酮、羟甲雄酮丙酸酯、环硫雄醇、Rnepitiostane和睾内酯；抗肾上腺物质比如氨鲁米特、曼托坦和腈环氧雄烷；叶酸补充剂比如frolinic acid、醋葡内酯、
aldophosphamide glycoside、氨基乙酰丙酸、胺苯吖啶、百垂布西、比生群(Bisantrene)、依达曲沙、Defofamine、秋水仙胺、地吖醌、Elfornithine、醋酸羟哔咔唑、环氧甘醚、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、氯尼达明、丙双脒腙、二羟蒽二酮、蒙匹胺醇、二胺硝吖啶、脱氧助间型霉素、蛋氨氮芥、吡喃阿霉素、足叶草肼酸、2-乙肼、甲基苄肼、 丙亚胺、西佐喃
(Sizofrran)、锗螺胺、细格孢氮杂酸、三亚胺醌、2，2′，2″-三氯三乙基胺、乌拉坦、长春地辛、达卡巴嗪、甘露醇氮芥、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、Gacytosine、阿拉伯糖苷(″Ara-C″)、环磷酰胺、噻替派、taxoids，例如，紫杉醇( Bristol-Myers
Squibb Oncology，Princeton，NJ)和Doxetaxel( Rhone-Poulenc Rorer，
Antony，France)、苯丁酸氮芥、吉西他滨、6-硫鸟嘌呤、巯基嘌呤、甲氨蝶呤；铂类似物比如顺铂和卡铂、长春花碱、铂、依托泊苷(VP-16)、异环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、长春新碱、长春烯碱、异长春花碱、Novantrone、替尼泊苷、柔红霉素、氨基蝶呤、卡培他滨、伊本膦酸钠、CPT-11、拓扑异构酶抑制剂RFS 2000、二氟甲基鸟氨酸(DMFO)、视黄酸、埃斯培拉霉
素、卡培他滨；和上面任何一种的药物可接受的盐、酸或衍生物。同样包括抗-激素剂，其
作用在于调节或抑制激素对肿瘤的作用，比如抗-雌激素物质，包括例如他莫昔芬、雷洛昔
芬、芳香化酶抑制剂4(5)-咪唑、4羟基他莫昔芬、曲奥昔芬、那洛西芬、奥那斯酮和涛瑞米
芬(Fareston)；和抗-雄激素物质比如氟利坦、尼鲁米特、比卡鲁胺、醋酸亮氨和性瑞林；和上面任何一种的药物可接受的盐、酸或衍生物。
[0129] 有用的药物也包括细胞因子。这样的细胞因子的实例有淋巴因子、单核因子、和传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素比如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素、和牛生
长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素比如卵泡刺激素(FSH)、甲状腺刺激素(TSH)、和黄体生成素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长
因子；促乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和-β；mullerian-inhibiting substance；
小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；activin；血管内皮生长因子；整联蛋白；促血小板生成素(TPO)；神经生长因子比如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGFs)比如TGF-α和
TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨生成诱导因子；干扰素比
如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSFs)比如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨
噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(GCSF)；白细胞介素(ILs)比如IL-1、IL-1a、IL-2、
IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15；肿瘤坏死因子比如TNF-α或TNF-β；和其它的多肽因子，包括LIF和kit ligand(KL)。如本文中所用，术语细胞因子
包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物活性对等
物。
长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素比如卵泡刺激素(FSH)、甲状腺刺激素(TSH)、和黄体生成素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长
因子；促乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和-β；mullerian-inhibiting substance；
小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；activin；血管内皮生长因子；整联蛋白；促血小板生成素(TPO)；神经生长因子比如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGFs)比如TGF-α和
TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨生成诱导因子；干扰素比
如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSFs)比如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨
噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(GCSF)；白细胞介素(ILs)比如IL-1、IL-1a、IL-2、
IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15；肿瘤坏死因子比如TNF-α或TNF-β；和其它的多肽因子，包括LIF和kit ligand(KL)。如本文中所用，术语细胞因子
包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物活性对等
物。
[0130] 药物可以是前体药物，随后通过前体药物活化酶被活化，该酶可以转变象肽酰化学治疗剂的前体药物成为活性抗癌药物。见，例如，WO88/07378、WO 81/01145、美国专利
No.4,975,278。通常，酶成分包括任何能以转化前体药物成为它的更具活性的细胞毒性形
式的方式作用于前体药物的酶。
No.4,975,278。通常，酶成分包括任何能以转化前体药物成为它的更具活性的细胞毒性形
式的方式作用于前体药物的酶。
[0131] IV.将小细胞导向特定哺乳动物细胞
[0132] 在本发明的一个方面中，经由双特异性配体将小细胞导向靶哺乳动物细胞，正如在WO 2005/056749中所述。对小细胞和哺乳动物细胞成分都具有特异性的双特异性配体
引起小细胞与哺乳动物细胞结合，从而使小细胞被哺乳动物细胞吞入，和哺乳动物细胞产
生功能性核酸分子。这种定向递送方法可以在体内或体外实施，或既在体内又在体外实施。
引起小细胞与哺乳动物细胞结合，从而使小细胞被哺乳动物细胞吞入，和哺乳动物细胞产
生功能性核酸分子。这种定向递送方法可以在体内或体外实施，或既在体内又在体外实施。
[0133] 在双特异性配体、小细胞和哺乳动物细胞之间的接触可以以大量不同的方式发生。对于体内递送，施用已附着有所述双特异性配体的小细胞是优选的。由此，当双特异性
配体靶向的小细胞在体内到达靶细胞时，小细胞、双特异性配体和靶细胞发生接触。可选择
的是，双特异性配体和小细胞可在体内分别施用。
配体靶向的小细胞在体内到达靶细胞时，小细胞、双特异性配体和靶细胞发生接触。可选择
的是，双特异性配体和小细胞可在体内分别施用。
[0134] 在双特异性配体、小细胞和哺乳动物细胞之间的接触也可以在体外一个或多个培育期间发生。在一个实施方案中，三种成分同时在一起培育。可选择的是，可以实施逐步式
的培育。在一个逐步式方法的实例中，首先一起培育小细胞和双特异性配体以形成双特异
性配体定向的小细胞，其随后与靶细胞一起培育。在另一个实例中，双特异性配体首先与靶
细胞一起培育，接下来与小细胞一起培育。一个或多个体外培育和体内施用的组合也可以
使双特异性配体、小细胞和哺乳动物靶细胞相互接触。
的培育。在一个逐步式方法的实例中，首先一起培育小细胞和双特异性配体以形成双特异
性配体定向的小细胞，其随后与靶细胞一起培育。在另一个实例中，双特异性配体首先与靶
细胞一起培育，接下来与小细胞一起培育。一个或多个体外培育和体内施用的组合也可以
使双特异性配体、小细胞和哺乳动物靶细胞相互接触。
[0135] 发明人发现，靶向递送方法可广泛地应用于一定范围的哺乳动物细胞，包括通常对小细胞的特异性附着和胞吞耐受的细胞。例如，在一个臂上具有抗-O-多糖特异性并在
另一个臂上具有抗-HER2受体、抗-EGF受体或抗雄激素受体特异性的双特异性抗体配体有
效的使小细胞与一定范围的非吞噬靶细胞上各自的受体结合。这些细胞包括肺、卵巢、脑、
乳腺、前列腺和皮肤癌细胞。此外，有效的结合先于每个非吞噬细胞对小细胞的快速胞吞作
用。
另一个臂上具有抗-HER2受体、抗-EGF受体或抗雄激素受体特异性的双特异性抗体配体有
效的使小细胞与一定范围的非吞噬靶细胞上各自的受体结合。这些细胞包括肺、卵巢、脑、
乳腺、前列腺和皮肤癌细胞。此外，有效的结合先于每个非吞噬细胞对小细胞的快速胞吞作
用。
[0136] 本发明的靶细胞包括任何待引入功能性核酸的细胞。理想的靶细胞的特征在于其表达有细胞表面受体，该受体一旦结合配体就促进胞吞作用。优选的靶细胞是非吞噬的，这
意味着细胞不是专门的吞噬细胞，比如巨噬细胞、树突细胞和天然杀伤(NK)细胞。优选的
靶细胞也是哺乳动物细胞。
意味着细胞不是专门的吞噬细胞，比如巨噬细胞、树突细胞和天然杀伤(NK)细胞。优选的
靶细胞也是哺乳动物细胞。
[0137] 在本发明的靶向递送方法中可用的配体包括任何与靶细胞上表面成分和小细胞上表面成分结合的试剂。优选的是，靶细胞上的表面成分是受体，尤其是能介导胞吞的受
体。配体可包括多肽和/或碳水化合物成分。抗体是优选的配体。例如，携带对于细菌源
完整小细胞上的表面成分和对于靶哺乳动物细胞上的表面成分具有双重特异性的双特异
性抗体可有效地用于在体外和体内将小细胞靶向到靶哺乳动物细胞。可用的配体也包括受
体、酶、结合肽、融合/嵌合蛋白质和小分子。
体。配体可包括多肽和/或碳水化合物成分。抗体是优选的配体。例如，携带对于细菌源
完整小细胞上的表面成分和对于靶哺乳动物细胞上的表面成分具有双重特异性的双特异
性抗体可有效地用于在体外和体内将小细胞靶向到靶哺乳动物细胞。可用的配体也包括受
体、酶、结合肽、融合/嵌合蛋白质和小分子。
[0138] 根据两个基本原则来选择特定的配体：(i)与完整小细胞表面上的一个或多个结构域特异性结合和(ii)与靶细胞表面上的一个或多个结构域特异性结合。因此，配体优选
具有携带有对于细菌源完整小细胞表面结构有特异性的第一臂和携带对于哺乳动物细胞
表面结构有特异性的第二臂。第一和第二臂中的每一个可以是多价的。优选的是，每一个
臂是单特异性的，即使是多价的。
具有携带有对于细菌源完整小细胞表面结构有特异性的第一臂和携带对于哺乳动物细胞
表面结构有特异性的第二臂。第一和第二臂中的每一个可以是多价的。优选的是，每一个
臂是单特异性的，即使是多价的。
[0139] 对于与细菌源小细胞的结合，期望的是配体的一个臂对亲代细菌细胞上的脂多糖的O-多糖成分有特异性。其它可用于配体结合的小细胞表面结构包括外膜上的细胞表面
暴露多肽和碳水化合物，比如菌毛(pilli)、菌毛(fimbrae)和鞭毛细胞表面暴露的肽片
段。
暴露多肽和碳水化合物，比如菌毛(pilli)、菌毛(fimbrae)和鞭毛细胞表面暴露的肽片
段。
[0140] 对于与靶细胞的结合，配体的一个臂对哺乳动物细胞的表面成分有特异性。这样的成分包括细胞表面蛋白质、肽和碳水化合物，无论它们是已被表征的或未被表征的。细胞
表面受体，尤其是那些能活化受体介导的胞吞作用的细胞表面受体，是用于导向的期望细
胞表面成分。这样的受体如果在靶细胞表面上过表达的话，将对靶向待处理的细胞赋予额
外的选择性，由此降低向非靶细胞递送的可能性。
表面受体，尤其是那些能活化受体介导的胞吞作用的细胞表面受体，是用于导向的期望细
胞表面成分。这样的受体如果在靶细胞表面上过表达的话，将对靶向待处理的细胞赋予额
外的选择性，由此降低向非靶细胞递送的可能性。
[0141] 举例来说，通过选择特异性结合所期望细胞上的细胞表面受体基元的配体，可以靶向肿瘤细胞、转移性细胞、脉管系统细胞，比如内皮细胞和平滑肌细胞、肺细胞、肾细胞、血细胞、骨髓细胞、脑细胞、肝细胞等等，或者任何所选细胞的前体细胞。细胞表面受体的
实例包括癌胚抗原(CEA)，其在大多数结肠、直肠、乳腺、肺、胰腺和胃肠道癌中被过表达
(Marshall，2003)；调蛋白受体(HER-2、neu或c-erbB-2)，其经常在乳房、卵巢、结肠、肺、前列腺和子宫颈癌中被过表达(Hung et al.，2000)；表皮生长因子受体(EGFR)，其在包括乳
房、头和颈、非小细胞肺和前列腺的实体瘤的范围内被高度表达(Salomon et al.，1995)；
去唾液酸糖蛋白受体(Stockert，1995)；运铁蛋白受体(Singh，1999)；丝抑蛋白酶复合物
受体，其在肝细胞上表达(Ziady et al.，1997)；成纤维细胞生长因子受体(FGFR)，其在胰
腺导管腺癌细胞上被过表达(Kleeff et al.，2002)；血管内皮生长因子受体(VEGFR)，其
用于抗血管生成基因疗法(Becker et al.，2002和Hoshida et al.，2002)；叶酸受体，其
在90％非粘液性卵巢癌中被选择性的过表达(Gosselin and Lee，2002)；细胞表面多糖包
被(Batra et al.，1994)；碳水化合物受体(Thurnher et al.，1994)；和聚合免疫球蛋白受体，其可用于递送基因到呼吸道上皮细胞并且对于肺疾病、比如囊性纤维化病具有吸引力
(Kaetzel et al.，1997)。
实例包括癌胚抗原(CEA)，其在大多数结肠、直肠、乳腺、肺、胰腺和胃肠道癌中被过表达
(Marshall，2003)；调蛋白受体(HER-2、neu或c-erbB-2)，其经常在乳房、卵巢、结肠、肺、前列腺和子宫颈癌中被过表达(Hung et al.，2000)；表皮生长因子受体(EGFR)，其在包括乳
房、头和颈、非小细胞肺和前列腺的实体瘤的范围内被高度表达(Salomon et al.，1995)；
去唾液酸糖蛋白受体(Stockert，1995)；运铁蛋白受体(Singh，1999)；丝抑蛋白酶复合物
受体，其在肝细胞上表达(Ziady et al.，1997)；成纤维细胞生长因子受体(FGFR)，其在胰
腺导管腺癌细胞上被过表达(Kleeff et al.，2002)；血管内皮生长因子受体(VEGFR)，其
用于抗血管生成基因疗法(Becker et al.，2002和Hoshida et al.，2002)；叶酸受体，其
在90％非粘液性卵巢癌中被选择性的过表达(Gosselin and Lee，2002)；细胞表面多糖包
被(Batra et al.，1994)；碳水化合物受体(Thurnher et al.，1994)；和聚合免疫球蛋白受体，其可用于递送基因到呼吸道上皮细胞并且对于肺疾病、比如囊性纤维化病具有吸引力
(Kaetzel et al.，1997)。
[0142] 优选的配体包括抗体和/或抗体衍生物。正如本文中所用，术语“抗体”包括通过在体外或体内产生免疫原性反应而获得的免疫球蛋白分子。术语“抗体”包括多克隆、单特
异性和单克隆抗体，以及抗体衍生物，比如单链抗体片段(scFv)。可用于本发明的抗体和抗
体衍生物可通过重组DNA技术获得。
异性和单克隆抗体，以及抗体衍生物，比如单链抗体片段(scFv)。可用于本发明的抗体和抗
体衍生物可通过重组DNA技术获得。
[0143] 野生型抗体具有4条多肽链，两条同样的重链和两条同样的轻链。两种类型的多肽链具有恒定区，其在同类的抗体中不发生改变或极少改变，还具有可变区。对于特定的抗
体而言可变区是独特的，并且包括识别特异性表位的抗原结合域。最直接涉及抗体结合的
抗原结合域的部位是“互补决定区”(CDRs)。
体而言可变区是独特的，并且包括识别特异性表位的抗原结合域。最直接涉及抗体结合的
抗原结合域的部位是“互补决定区”(CDRs)。
[0144] 术语“抗体”也包含抗体衍生物，比如保留特异性结合抗原的能力的抗体片段。这样的抗体片段包括Fab片段(包含抗原结合域和包括轻链和由二硫键桥连的重链部分的
片段)、Fab’(包括含有Fab和通过铰链区的重链额外部分的单抗原结合域的抗体片段)、
F(ab’)2(在重链铰链区由链间二硫键连接的两个Fab’分子)、双特异性Fab(具有两个抗
原结合域的Fab分子，其中的每一个抗原结合域可以针对不同的表位)、和scFv(由氨基酸
链连接在一起的抗体单一轻链和重链的可变抗原结合决定区)。
片段)、Fab’(包括含有Fab和通过铰链区的重链额外部分的单抗原结合域的抗体片段)、
F(ab’)2(在重链铰链区由链间二硫键连接的两个Fab’分子)、双特异性Fab(具有两个抗
原结合域的Fab分子，其中的每一个抗原结合域可以针对不同的表位)、和scFv(由氨基酸
链连接在一起的抗体单一轻链和重链的可变抗原结合决定区)。
[0145] 当抗体、包括抗体片段构成配体的全部或部分时，它们优选是人源性的或经修饰而适于在人中应用。所谓的“人化的抗体”在本领域中是周知的。见，例如，Osbourn et al.，
2003。它们已经经过遗传操纵和/或体外处理进行了修饰，以降低它们在人中的抗原性，。
使抗体人化的方法描述于，例如，美国专利No.6,639,055、No.5,585,089和No.5,530,101
中。在最简单的情况中，通过将来自小鼠mAb的已知为互补决定区(CDRs)的抗原结合环
移植到人IgG中来形成人化抗体。见，Jones et al.，1986、Riechmann et al.，1988和
Verhoeyen et al.，1988。然而，高亲和性人化抗体的产生通常需要从小鼠亲代mAb所谓的
框架区(FRs)转移一个或多个额外的残基。同样现在已经开发出几种人化技术的变型。见
Vaughan et al.，1998。
2003。它们已经经过遗传操纵和/或体外处理进行了修饰，以降低它们在人中的抗原性，。
使抗体人化的方法描述于，例如，美国专利No.6,639,055、No.5,585,089和No.5,530,101
中。在最简单的情况中，通过将来自小鼠mAb的已知为互补决定区(CDRs)的抗原结合环
移植到人IgG中来形成人化抗体。见，Jones et al.，1986、Riechmann et al.，1988和
Verhoeyen et al.，1988。然而，高亲和性人化抗体的产生通常需要从小鼠亲代mAb所谓的
框架区(FRs)转移一个或多个额外的残基。同样现在已经开发出几种人化技术的变型。见
Vaughan et al.，1998。
[0146] 不是人化抗体的人抗体也可以用在本发明中。它们对于它们各自的抗原具有高亲和性，并且通常是从非常大的，单链可变片段(scFvs)或Fab噬菌体展示文库中获得的。见
Griffiths et al.，1994、Vaughan et al.，1996、Sheet et al.，1998、de Haard et al.，
1999和Knappik et al.，2000。
Griffiths et al.，1994、Vaughan et al.，1996、Sheet et al.，1998、de Haard et al.，
1999和Knappik et al.，2000。
[0147] 有用的配体也包括双特异性单链抗体，其通常是可变轻链部分经连接分子通过共价方式连接到相应可变重链部分所形成的重组多肽。见美国专利No.5,455,030、
No.5,260,203和No.4,496,778。双特异性抗体也可通过其它方法制备。例如，可通过化学
连接具有不同特异性的完整抗体或抗体片段来建立化学异缀合物。见Karpovsky et al.，
1984。然而，这样的异缀合物很难以可重复方式制备并且至少是常规单克隆抗体的两倍大。
双特异性抗体也可以通过二硫化物交换来形成，其涉及酶切割和抗体片段的再联合。见
Glennie et al.，1987。
No.5,260,203和No.4,496,778。双特异性抗体也可通过其它方法制备。例如，可通过化学
连接具有不同特异性的完整抗体或抗体片段来建立化学异缀合物。见Karpovsky et al.，
1984。然而，这样的异缀合物很难以可重复方式制备并且至少是常规单克隆抗体的两倍大。
双特异性抗体也可以通过二硫化物交换来形成，其涉及酶切割和抗体片段的再联合。见
Glennie et al.，1987。
[0148] 因为Fab和scFv片段是单价的，它们对靶结构通常只有很低的亲和性。因此，从这些成分所制备的优选配体被设计成为二聚、三聚或四聚缀合物从而增加应用的亲和性。
见Tomlinson和Holliger，2000、Carter，2001、Hudson和Souriau，2001和Todorovska et
al.，2001。可通过化学和/或遗传交联而形成这样的缀合物结构。
见Tomlinson和Holliger，2000、Carter，2001、Hudson和Souriau，2001和Todorovska et
al.，2001。可通过化学和/或遗传交联而形成这样的缀合物结构。
[0149] 本发明的双特异性配体优选在每个末端是单特异性的，即，在一个末端对小细胞上的单成分具有特异性，在另一个末端对靶细胞上的单成分具有特异性。配体的一个或两
个末端可以是多价的，例如，以所谓二联体(diabodies)、三联体(triabodies)和四联体
(tetrabodies)的形式。见Hudson和Souriau，2003。二联体是通过两个scFvs非共价结
合形成的双价二聚物，产生两个Fv结合位点。同样地，三联体是通过三个scFvs形成三价
的三聚物而获得的，产生三个结合位点，四联体是通过四个scFvs形成四价的四聚物而获
得的，产生四个结合位点。
个末端可以是多价的，例如，以所谓二联体(diabodies)、三联体(triabodies)和四联体
(tetrabodies)的形式。见Hudson和Souriau，2003。二联体是通过两个scFvs非共价结
合形成的双价二聚物，产生两个Fv结合位点。同样地，三联体是通过三个scFvs形成三价
的三聚物而获得的，产生三个结合位点，四联体是通过四个scFvs形成四价的四聚物而获
得的，产生四个结合位点。
[0150] 对哺乳动物细胞上的受体具有特异性的几种人化的、人的、和小鼠的单克隆抗体和其片段已经被批准用于人的治疗用途，并且属于此列的物质快速增加。见Hudson和
TM
Souriau，2003。能用来形成双特异性配体一个臂的这种抗体的实例对HER2：Herceptin ；
司徒曼布(Trastuzumab)具有特异性。
TM
Souriau，2003。能用来形成双特异性配体一个臂的这种抗体的实例对HER2：Herceptin ；
司徒曼布(Trastuzumab)具有特异性。
[0151] 抗体可变区也可以与广泛的蛋白质结构域融合。与人免疫球蛋白结构域比如IgG1CH3的融合既添加了质量又促进了二聚化作用。见Hu etal.，1996。与人Ig铰链-Fc区
的融合可以增加效应物的功能。同样，与来自多聚体蛋白的异源蛋白结构域的融合可促
进多聚化作用。例如，已经应用短scFv与短的两亲性螺旋相融合来生产小抗体。见Pack
和Pluckthun，1992。可以使用来自形成杂二聚物(比如fos/jun)的蛋白质的结构域产
生双特异性分子(Kostelny et al.，1992)，另一方面可通过工程学策略比如“knobs into
holes”(Ridgway et al.，1996)设计均二聚结构域形成杂二聚物。最后，可以选择既提供
多聚化作用又提供另外的功能、例如抗生物素蛋白的融合蛋白质配偶体。见Dubel et al.，
1995。
的融合可以增加效应物的功能。同样，与来自多聚体蛋白的异源蛋白结构域的融合可促
进多聚化作用。例如，已经应用短scFv与短的两亲性螺旋相融合来生产小抗体。见Pack
和Pluckthun，1992。可以使用来自形成杂二聚物(比如fos/jun)的蛋白质的结构域产
生双特异性分子(Kostelny et al.，1992)，另一方面可通过工程学策略比如“knobs into
holes”(Ridgway et al.，1996)设计均二聚结构域形成杂二聚物。最后，可以选择既提供
多聚化作用又提供另外的功能、例如抗生物素蛋白的融合蛋白质配偶体。见Dubel et al.，
1995。
[0152] V.送递到有吞噬或胞吞能力的细胞
[0153] 本发明还提供了通过使细菌来源的小细胞与有吞噬或胞吞能力的哺乳动物细胞接触而进行的递送。能够以细胞内细菌性病原体的方式吞入亲代细菌细胞的这种哺乳动
物细胞可以同样地吞入小细胞，该小细胞将它们的有效载荷释放到哺乳动物细胞的细胞质
中。这种递送方法可以无需使用靶向配体而实现。
物细胞可以同样地吞入小细胞，该小细胞将它们的有效载荷释放到哺乳动物细胞的细胞质
中。这种递送方法可以无需使用靶向配体而实现。
[0154] 多种机制可能涉及特定类型细胞吞入小细胞的过程，并且在这点上本发明不依赖于任何特定的机制。例如，吞噬是一种被详细描述过的过程，其中巨噬细胞和其它的吞噬细
胞(比如嗜中性粒细胞)通过延伸伪足覆盖颗粒物的表面直至完全包围颗粒物的方式来摄
取颗粒物。尽管被描述为“非特异性”的吞噬，但是已经证明在该过程中涉及特异性受体。
见Wright&Jong(1986)、Speert et al.(1988)。
胞(比如嗜中性粒细胞)通过延伸伪足覆盖颗粒物的表面直至完全包围颗粒物的方式来摄
取颗粒物。尽管被描述为“非特异性”的吞噬，但是已经证明在该过程中涉及特异性受体。
见Wright&Jong(1986)、Speert et al.(1988)。
[0155] 因此，一种形式的吞噬涉及表面配体和位于伪足膜的配体-受体之间的相互作用(Shaw and Griffin，1981)。认为这个由特异性受体介导的附着步骤被认为依赖于细菌表
面粘附素。关于较少毒力的细菌，比如非产肠毒素的E.coli，在缺少吞噬细胞受体的表面配
体的情况下也可以发生吞噬作用。例如见Pikaar et al.(1995)。因此，本发明包括但不限
于与它们的亲代细菌细胞特性一致地拥有或缺少表面粘附素并且被吞噬细胞(即，“具吞噬
能力”的宿主细胞)吞入的小细胞的用途，其中所述吞噬细胞中噬中性粒细胞和巨噬细胞是
哺乳动物中的主要类型。
面粘附素。关于较少毒力的细菌，比如非产肠毒素的E.coli，在缺少吞噬细胞受体的表面配
体的情况下也可以发生吞噬作用。例如见Pikaar et al.(1995)。因此，本发明包括但不限
于与它们的亲代细菌细胞特性一致地拥有或缺少表面粘附素并且被吞噬细胞(即，“具吞噬
能力”的宿主细胞)吞入的小细胞的用途，其中所述吞噬细胞中噬中性粒细胞和巨噬细胞是
哺乳动物中的主要类型。
[0156] 另一种吞入过程是胞吞，通过这个过程胞内病原体比如沙门氏菌属(Salmonella)、埃希氏菌属(Escherichia)、志贺氏菌属(Shigella)、幽门螺杆菌属
(Helicobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)和乳酸杆菌属(Lactobacilli)属的种进入哺
乳动物上皮细胞并且在那里进行复制。这方面的两种基本机制是网格蛋白依赖性受体介导
的胞吞作用，也被称作“有被小窝胞吞作用”(Riezman，1993)，和不依赖于网格蛋白的胞吞作用(Sandvig&Deurs，1994)。当具吞入能力的细胞发挥胞吞作用(即，“具胞吞能力”的宿
主细胞)吞入根据本发明的小细胞时，可以涉及两者之一或两者都涉及。典型的具胞吞能
力的细胞是乳腺上皮细胞、在胃肠道中的肠细胞、胃上皮细胞、肺上皮细胞、尿道和膀胱上
皮细胞。
(Helicobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)和乳酸杆菌属(Lactobacilli)属的种进入哺
乳动物上皮细胞并且在那里进行复制。这方面的两种基本机制是网格蛋白依赖性受体介导
的胞吞作用，也被称作“有被小窝胞吞作用”(Riezman，1993)，和不依赖于网格蛋白的胞吞作用(Sandvig&Deurs，1994)。当具吞入能力的细胞发挥胞吞作用(即，“具胞吞能力”的宿
主细胞)吞入根据本发明的小细胞时，可以涉及两者之一或两者都涉及。典型的具胞吞能
力的细胞是乳腺上皮细胞、在胃肠道中的肠细胞、胃上皮细胞、肺上皮细胞、尿道和膀胱上
皮细胞。
[0157] 当不使用靶向配体而实现向具吞入能力的哺乳动物细胞进行的投递时，所考虑的应用特性将影响所用小细胞的细菌来源的选择。例如，沙门氏菌属、埃希氏菌属、志贺氏菌
属的菌种带有由胃肠道中肠细胞上的介导胞吞的受体所识别的附着素，并且适于递送有效
作用于结肠癌细胞的药物。相似的，带有对胃上皮细胞有特异性的附着蛋白的、源自幽门螺
杆菌的小细胞可用于针对胃癌细胞的递送。对于施用带有由肺上皮细胞上受体识别的附着
素、源自假单胞菌属菌种的完整小细胞，吸入或吹入是理想的方法。对带有对尿道和膀胱上
皮细胞具有特异性的附着素的、源自乳酸杆菌属细菌的小细胞可能非常适于将药物经尿道
内递送至尿道或膀胱癌。
属的菌种带有由胃肠道中肠细胞上的介导胞吞的受体所识别的附着素，并且适于递送有效
作用于结肠癌细胞的药物。相似的，带有对胃上皮细胞有特异性的附着蛋白的、源自幽门螺
杆菌的小细胞可用于针对胃癌细胞的递送。对于施用带有由肺上皮细胞上受体识别的附着
素、源自假单胞菌属菌种的完整小细胞，吸入或吹入是理想的方法。对带有对尿道和膀胱上
皮细胞具有特异性的附着素的、源自乳酸杆菌属细菌的小细胞可能非常适于将药物经尿道
内递送至尿道或膀胱癌。
[0158] VI.制剂
[0159] 本发明在其范围内包括组合物或制剂，其中包含(a)完整的小细胞和(b)为此的药用可接受载体，其中所述小细胞包含功能性核酸分子或含有编码功能性核酸分子的片段
的质粒。功能性核酸分子可以是本文中描述的那些siRNAs、shRNAs、核酶或反义分子中的
任何一种。功能性核酸分子也可以由本文中描述的另一种核酸比如质粒编码。编码功能性
核酸的核酸可以具有本文中描述的任何调节元件或报告元件。
的质粒。功能性核酸分子可以是本文中描述的那些siRNAs、shRNAs、核酶或反义分子中的
任何一种。功能性核酸分子也可以由本文中描述的另一种核酸比如质粒编码。编码功能性
核酸的核酸可以具有本文中描述的任何调节元件或报告元件。
[0160] 所述制剂任选包含如本文中所描述的药物。优选的是，该制剂的小细胞包含药物。可选择的是，小细胞可以包含核酸分子，比如质粒，其编码所述药物。
[0161] 含小细胞制剂优选每107个小细胞包含少于约1个污染的亲代细菌细胞，更优选8 9
每10 个小细胞包含少于约1个污染的亲代细菌细胞，甚至更优选每10 个小细胞包含少于
10
约1个污染的亲代细菌细胞，仍然更优选每10 个小细胞包含少于约1个污染的亲代细菌
11
细胞和最优选每10 个小细胞包含少于约1个污染的亲代细菌细胞。
每10 个小细胞包含少于约1个污染的亲代细菌细胞，甚至更优选每10 个小细胞包含少于
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约1个污染的亲代细菌细胞，仍然更优选每10 个小细胞包含少于约1个污染的亲代细菌
11
细胞和最优选每10 个小细胞包含少于约1个污染的亲代细菌细胞。
[0162] 所述制剂也任选包含用于将小细胞靶向至靶细胞的双特异性配体。小细胞和配体可以是本文中所述的任何类型。因此，小细胞包含编码功能性核酸的核酸并且优选双特异
性配体能结合到小细胞的表面成分和靶哺乳动物细胞的表面成分。
性配体能结合到小细胞的表面成分和靶哺乳动物细胞的表面成分。
[0163] 使用一个或多个药用可接受载体或赋形剂，本发明的基本由小细胞以及任选地药物和双特异性配体组成的制剂(即，包含这样的小细胞、药物和配体以及其它不会不适当
干扰组合物的核酸或药物递送质量的组分的制剂)可以用常规方式来制备。
干扰组合物的核酸或药物递送质量的组分的制剂)可以用常规方式来制备。
[0164] 该制剂可以是单位剂型的形式，例如，在安瓿或小瓶中，或在多剂量容器中，其中添加或不添加防腐剂。制剂可以是溶液、悬液、或在油或水性载体中的乳液，并且可以包含
制药药剂，比如悬浮、稳定和/或分散剂。合适的溶液是与接受者的血液等渗的，其实例有
盐水溶液、林格氏溶液和葡萄糖溶液。可选择的，所述制剂可以是冻干粉末形式，可以用合
适的赋形剂，例如灭菌的无热源水或生理盐水重建。该制剂也可以是贮库制剂的形式。这
样的长效制剂可以通过植入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射施用。
制药药剂，比如悬浮、稳定和/或分散剂。合适的溶液是与接受者的血液等渗的，其实例有
盐水溶液、林格氏溶液和葡萄糖溶液。可选择的，所述制剂可以是冻干粉末形式，可以用合
适的赋形剂，例如灭菌的无热源水或生理盐水重建。该制剂也可以是贮库制剂的形式。这
样的长效制剂可以通过植入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射施用。
[0165] A.施用途径
[0166] 本发明的制剂可经不同途径施用到哺乳动物身体的不同位点，从而实现所期望的局部或全身性的疗效。例如，可通过口服施用、通过向体腔施用该制剂、通过吸入或吹入、或通过胃肠外、肌内、静脉内、门静脉内(intraportal)、肝内、腹膜、皮下、肿瘤内、或皮内施用来完成递送。施用的方式和部位依赖于靶细胞的位置。例如，可以通过吸入性递送被靶向
的小细胞来有效地靶向囊肿性纤维化细胞。相似的，可以经静脉内递送定向小细胞而更有
效地治疗转移肿瘤。经腹膜内递送靶向小细胞可以治疗原发性卵巢癌。
的小细胞来有效地靶向囊肿性纤维化细胞。相似的，可以经静脉内递送定向小细胞而更有
效地治疗转移肿瘤。经腹膜内递送靶向小细胞可以治疗原发性卵巢癌。
[0167] B.纯度
[0168] 本发明的小细胞基本上没有污染的亲代细菌细胞。因此，本发明的含小细胞制剂7 8
优选每10 个小细胞包含少于约1个污染的亲代细菌细胞，更优选每10 个小细胞包含少于
9
约1个污染的亲代细菌细胞，甚至更优选每10 个小细胞包含少于约1个污染的亲代细菌
10 11
细胞，仍然更优选每10 个小细胞包含少于约1个污染的亲代细菌细胞和最优选每10 个
小细胞包含少于约1个污染的亲代细菌细胞。
优选每10 个小细胞包含少于约1个污染的亲代细菌细胞，更优选每10 个小细胞包含少于
9
约1个污染的亲代细菌细胞，甚至更优选每10 个小细胞包含少于约1个污染的亲代细菌
10 11
细胞，仍然更优选每10 个小细胞包含少于约1个污染的亲代细菌细胞和最优选每10 个
小细胞包含少于约1个污染的亲代细菌细胞。
[0169] 纯化小细胞的方法在本领域是公知的和描述于PCT/IB02/04632。一种这样的方法是交叉流过滤(进料流与膜表面平行；Forbes，1987)和死端式过滤(进料流垂直于膜表
面)的组合。任选的是，可以在过滤组合之前进行低离心力下的差速离心，从而去除一部分
细菌细胞，并由此对上清液富集小细胞。
面)的组合。任选的是，可以在过滤组合之前进行低离心力下的差速离心，从而去除一部分
细菌细胞，并由此对上清液富集小细胞。
[0170] 另一种纯化方法使用在生物相容性介质中的密度梯度离心。离心后，从梯度中收集小细胞带，并且任选对小细胞进行后续轮的密度梯度离心以使纯度达到最大值。该方法
还可以包括对含小细胞样品实施差速离心的预备步骤。当以低离心力实施时，差速离心将
移去一部分亲代细菌细胞，由此对上清液富集小细胞。
还可以包括对含小细胞样品实施差速离心的预备步骤。当以低离心力实施时，差速离心将
移去一部分亲代细菌细胞，由此对上清液富集小细胞。
[0171] 特别有效的纯化方法使用细菌丝状体从而增加小细胞纯度。因此小细胞纯化方法可包括步骤(a)将含小细胞样品置于诱导亲代细菌细胞产生丝状体形式的条件下，接下来
(b)过滤样品从而获得纯化的小细胞制备物。
(b)过滤样品从而获得纯化的小细胞制备物。
[0172] 也可以组合已知的小细胞纯化方法。一种非常有效的方法组合如下：
[0173] 步骤A：对小细胞差速离心，产生细菌细胞培养物。这个可以2000g进行约20分钟的步骤除去了大多数的亲代细菌细胞，同时使小细胞留在上清液中。
[0174] 步骤B：使用等渗和无毒性密度梯度介质进行密度梯度离心。这个步骤将小细胞与包括亲代细菌细胞在内的许多污染物分离开，并使小细胞的损失最少。优选的是，在纯化
方法中重复这个步骤。
方法中重复这个步骤。
[0175] 步骤C：通过0.45μm滤器进行交叉流过滤，以进一步减少亲代细菌细胞的污染。
[0176] 步骤D：压力诱导残余亲代细菌细胞的丝状体。这可以通过将小细胞悬液置于几种压力诱导环境条件中的任一种下来实现。
[0177] 步骤E：抗生素处理杀死亲代细菌细胞。
[0178] 步骤F：交叉流过滤以去除小的污染物，比如膜泡、膜片段、细菌碎片、核酸、介质成分等，并浓缩小细胞。可使用0.2μm滤器将小细胞与小污染物分离开，并可使用0.1μm滤器浓缩小细胞。
[0179] 步骤G：死端式过滤以除去丝状的死细菌细胞。在这个步骤中可以使用0.45μm的滤器。
[0180] 步骤H：从小细胞制备物去除内毒素。抗脂质A包被的磁性珠可用于这个步骤。
[0181] C.施用方案
[0182] 通常，可以以例行测试确定的合适剂量使用本文中公开的制剂，从而获得最佳的生理效果，同时使任何潜在的毒性最小化。可以根据多种因素，包括患者的年龄、体重、性
别、医疗状况；待治疗病症的严重性、施用途径以及患者的肾和肝功能选择给药方案。
别、医疗状况；待治疗病症的严重性、施用途径以及患者的肾和肝功能选择给药方案。
[0183] 最为精确地获得在具有最小副作用和最大功效的范围内的小细胞和药物浓度可能需要基于靶位点和靶细胞获得小细胞和药物的动力学方案。当确定治疗方案的最佳浓度
时，可以考虑小细胞或药物的分布、平衡和消除。当联合使用时，可以调整小细胞和药物的
剂量，以达到所需的效果。
时，可以考虑小细胞或药物的分布、平衡和消除。当联合使用时，可以调整小细胞和药物的
剂量，以达到所需的效果。
[0184] 此外，所述制剂的施用剂量可以使用药物动力学/药效学模型系统进行最优化。例如，可以选择一个或多个给药方案，并且可以使用药物动力学/药效学模型确定一个或
多个给药方案的药物动力学/药效学特征。接下来，可以基于特定药物动力学/药效学
特征选择可以达到期望的药物动力学/药效学反应的一个施用给药方案。见，例如，WO
00/67776。
多个给药方案的药物动力学/药效学特征。接下来，可以基于特定药物动力学/药效学
特征选择可以达到期望的药物动力学/药效学反应的一个施用给药方案。见，例如，WO
00/67776。
[0185] 特别地，在几周的过程中可以每周至少一次地施用该制剂。在一个实施方案中，在几周到几个月的过程中每周至少一次施用该制剂。
[0186] 更具体地，可以每天至少一次施用该制剂，进行约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天。可选择的是，可以每天约一次、每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、
26、27、28、29、30或31天或更多天约一次地施用该制剂。
26、27、28、29、30或31天或更多天约一次地施用该制剂。
[0187] 可选择地，可以每周约一次、每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周或更多周约一次地施用该制剂。可选择的是，可每周至少一次地施用该制剂，进
行约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周或更多周。
行约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周或更多周。
[0188] 可选择的是，可每月约一次、每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更多月约一次地施用该制剂。
[0189] 可以以每天单次剂量施用该制剂，或以每天2、3、或4次分开的剂量形式施用每天的总剂量。
[0190] 在药物之前施用小细胞的方法中，可以在施用小细胞之后的从几分钟到几小时的任何时间进行药物的施用。可选择地，可以在施用小细胞之后从几小时到几天、可能几周到
多达几月的任何时间施用药物。
多达几月的任何时间施用药物。
[0191] 更具体地，可在施用药物之前至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时施用小细胞。此外，可在施用药物之前至少约1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 或
31天施用小细胞。在又一个实施方案中，可在施用药物之前至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周或更多周的时间施用小细胞。在进一步的实施方案中，在施用药物之前至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12月施用小细胞。
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 或
31天施用小细胞。在又一个实施方案中，可在施用药物之前至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周或更多周的时间施用小细胞。在进一步的实施方案中，在施用药物之前至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12月施用小细胞。
[0192] 在另一个实施方案中，在施用药物之后施用小细胞。小细胞的施用可在施用药物之后从几分钟到几个小时的任何时间进行。可选择的，可以在药物施用之后在从几个小时
到几天、可能几周至多达几月的任何时间施用小细胞。
到几天、可能几周至多达几月的任何时间施用小细胞。
[0193] 以下实施例仅用于举例说明，而不是限制，并且提供对本发明更完全的理解。这些实施例证明了可有效在体内治疗耐药性肿瘤细胞，该治疗是通过(1)施用带有被设计用来
降低或消除耐药性编码基因表达的RNAi序列的靶向重组小细胞，和(2)施用靶向的、带有
使癌细胞致敏的药物的包装药物的小细胞。
降低或消除耐药性编码基因表达的RNAi序列的靶向重组小细胞，和(2)施用靶向的、带有
使癌细胞致敏的药物的包装药物的小细胞。
[0194] 实施例1.抗-MDR1和抗-bcl-2shRNA表达质粒和重组小细胞的纯化
[0195] 依下述产生携带编码shRNA序列(Mdr 1或bcl-2)的质粒的重组小细胞。在此研究中使用的Mdr1 shRNA序列(5’-TCGAAAGAAACCAACTGTCAGTGTA gagtactgTACACTGACAG
TTGGTTTCTTTTTTT-3’)(SEQ ID NO：1)在Wu etal.，2003中有描述，所用的bcl-2shRNA序
列(5’-TCGATGTGGATGACTGAGTACCTGAgagtactgTCAGGTACTCAGTCATCCACATTTTT-3’)(SEQ ID
NO：2)在Wacheck et al.，2003中有描述。合成各自的shRNA序列，并被单独亚克隆进入
质粒IMG-800(Imgnex Corp.，San Diego，CA，美国)，使得所述序列可以自质粒U6启动子被
表达。该质粒带有pUC复制起点，其能使得质粒在细菌细胞中具有高拷贝数。对重组质粒
测序以确保shRNA序列是正确的并且对于自U6启动子的表达是符合读框的。将重组质粒
转化进入S.typhimurium minCDE-突变菌株中，并按U.S.10/602,201的描述纯化携带有该
质粒的小细胞。重组小细胞被分别命名为小细胞shRNA-MDR1和小细胞shRNA-bcl2。
TTGGTTTCTTTTTTT-3’)(SEQ ID NO：1)在Wu etal.，2003中有描述，所用的bcl-2shRNA序
列(5’-TCGATGTGGATGACTGAGTACCTGAgagtactgTCAGGTACTCAGTCATCCACATTTTT-3’)(SEQ ID
NO：2)在Wacheck et al.，2003中有描述。合成各自的shRNA序列，并被单独亚克隆进入
质粒IMG-800(Imgnex Corp.，San Diego，CA，美国)，使得所述序列可以自质粒U6启动子被
表达。该质粒带有pUC复制起点，其能使得质粒在细菌细胞中具有高拷贝数。对重组质粒
测序以确保shRNA序列是正确的并且对于自U6启动子的表达是符合读框的。将重组质粒
转化进入S.typhimurium minCDE-突变菌株中，并按U.S.10/602,201的描述纯化携带有该
质粒的小细胞。重组小细胞被分别命名为小细胞shRNA-MDR1和小细胞shRNA-bcl2。
[0196] 实施例2.靶向受体的重组小细胞介导的shRNA质粒向耐药性癌细胞的递送和耐药性逆转的体外证明
[0197] 尽管针对一定范围的不同耐药性编码转录物的siRNAs已经显示在体外可逆转癌细胞的耐药性，但是关键的障碍是将siRNAs靶向递送到癌细胞，尤其是在体内。纯化携带
有抗-MDR1 shRNA质粒(小细胞shRNA-MDR1)和针对无义RNA序列的对照shRNA(小细胞shRNA-无
义)的重组小细胞，并制备携带有抗-S.typhimurium O-抗原和抗人EGFR特异性的双特异
性抗体，将其附着到重组小细胞上，其描述于专利申请Wo2005/056749中。定向重组小细胞
EGFR EGFR
被命名为 小细胞shRNA-MDR-1和 小细胞shRNA-无义。同样制备包装有化疗药物5-FU和伊立
EGFR EGFR
替康的小细胞，并按上述靶向，其分别被命名为 小细胞5-FU和 小细胞Irino。
有抗-MDR1 shRNA质粒(小细胞shRNA-MDR1)和针对无义RNA序列的对照shRNA(小细胞shRNA-无
义)的重组小细胞，并制备携带有抗-S.typhimurium O-抗原和抗人EGFR特异性的双特异
性抗体，将其附着到重组小细胞上，其描述于专利申请Wo2005/056749中。定向重组小细胞
EGFR EGFR
被命名为 小细胞shRNA-MDR-1和 小细胞shRNA-无义。同样制备包装有化疗药物5-FU和伊立
EGFR EGFR
替康的小细胞，并按上述靶向，其分别被命名为 小细胞5-FU和 小细胞Irino。
[0198] 选择对伊立替康和5-FU具有高度耐药性的人结肠癌细胞系Caco-2(ATCC)用于此体外研究，从而首先确定是否靶向EGFR的重组小细胞可成功递送shRNA质粒到癌细胞，其
次确定抗-MDR-1 siRNA的表达是否可逆转耐药性并使Caco-2细胞对靶向EGFR和包装药
6
物的小细胞敏感。以3×10 个细胞/瓶的量接种Caco-2细胞到含有10％加强型小牛血清
的极限必需培养基中并在37℃、5％CO2条件下培育3小时。
次确定抗-MDR-1 siRNA的表达是否可逆转耐药性并使Caco-2细胞对靶向EGFR和包装药
6
物的小细胞敏感。以3×10 个细胞/瓶的量接种Caco-2细胞到含有10％加强型小牛血清
的极限必需培养基中并在37℃、5％CO2条件下培育3小时。
[0199] 用(a)EGFR小细胞shRNA-MDR-1和(b)EGFR小细胞shRNA-无义处理细胞。包括有不接受任何10
处理的对照瓶。以每瓶10 个细胞的浓度加入小细胞，将所有的瓶培育72小时。用胰蛋
4
白酶消化来自每个处理的细胞，并以1×10 个细胞/ml/孔的量接种到24孔板中，在37℃、
5％CO2条件下培育3小时。随后将对照的未处理细胞用(6孔/处理)(a)游离伊立替康
EGFR EGFR
(25μM)、(b)游离5-FU(25μM)、(c) 小细胞Irino、和(d) 小细胞5-FU培育。
处理的对照瓶。以每瓶10 个细胞的浓度加入小细胞，将所有的瓶培育72小时。用胰蛋
4
白酶消化来自每个处理的细胞，并以1×10 个细胞/ml/孔的量接种到24孔板中，在37℃、
5％CO2条件下培育3小时。随后将对照的未处理细胞用(6孔/处理)(a)游离伊立替康
EGFR EGFR
(25μM)、(b)游离5-FU(25μM)、(c) 小细胞Irino、和(d) 小细胞5-FU培育。
[0200] 经EGFR小细胞shRNA-MDR-1处理的Caco-2细胞用(6孔/处理)(a)CMV小细胞5-FU(非特异性靶向，因为该双特异性抗体靶向于巨细胞病毒上的表面蛋白)、(b)游离的伊立替康、
EGFR EGFR EGFR
(c)游离的5-FU、(d) 小细胞Irino、和(e) 小细胞5-FU培育。随后经 小细胞shRNA-无义
EGFR
处理的Caco-2细胞用 小细胞5-FU处理。
EGFR EGFR EGFR
(c)游离的5-FU、(d) 小细胞Irino、和(e) 小细胞5-FU培育。随后经 小细胞shRNA-无义
EGFR
处理的Caco-2细胞用 小细胞5-FU处理。
[0201] 将所有细胞进一步培养72小时，接下来根据制造厂的使用说明采用CellTiter96 AQueous单溶液细胞增殖分析(Promega Corp.，Madison，WI，美国)进行比色MTT细胞增
殖检测(Cory et al.，1991)。在490nm处读取比色测量值。
殖检测(Cory et al.，1991)。在490nm处读取比色测量值。
[0202] 结果显示(图1)Caco-2细胞对针对结肠癌的一线化疗药物(即，伊立替康和EGFR EGFR EGFR
5-FU)有高度的耐药性。此外，在接受 小细胞Irino、 小细胞5-FU和 小细胞shRNA-MDR-1
EGFR EGFR EGFR
处理后细胞仍然有耐药性。接受双重处理，即 小细胞shRNA-MDR-1接着 小细胞Irino或
小细胞5-FU处理的细胞显示这种处理在逆转耐药性上非常成功，并且在单一组合处理之后
EGFR EGFR
观察到＞50％的细胞死亡。相对比而言， 小细胞shRNA-无义接着 小细胞5-FU的双重处理
对耐药性没有影响，这表明在Caco-2细胞中抗-MDR-1shRNA的表达具体地负责耐药性的逆
EGFR
转。 小细胞shRNA-MDR-1以及随后游离伊立替康或5-FU的组合处理对耐药性的逆转也有效
用，但是程度较低，细胞存活降低～30％。这个数据还表明，与在细胞外环境中提供的游离
药物相比，经靶向受体和包装药物的小细胞递送化疗药物可以递送更有效浓度的细胞内药
物。
5-FU)有高度的耐药性。此外，在接受 小细胞Irino、 小细胞5-FU和 小细胞shRNA-MDR-1
EGFR EGFR EGFR
处理后细胞仍然有耐药性。接受双重处理，即 小细胞shRNA-MDR-1接着 小细胞Irino或
小细胞5-FU处理的细胞显示这种处理在逆转耐药性上非常成功，并且在单一组合处理之后
EGFR EGFR
观察到＞50％的细胞死亡。相对比而言， 小细胞shRNA-无义接着 小细胞5-FU的双重处理
对耐药性没有影响，这表明在Caco-2细胞中抗-MDR-1shRNA的表达具体地负责耐药性的逆
EGFR
转。 小细胞shRNA-MDR-1以及随后游离伊立替康或5-FU的组合处理对耐药性的逆转也有效
用，但是程度较低，细胞存活降低～30％。这个数据还表明，与在细胞外环境中提供的游离
药物相比，经靶向受体和包装药物的小细胞递送化疗药物可以递送更有效浓度的细胞内药
物。
[0203] 这个结果表明(a)shRNAs可以有效的经靶向受体的重组小细胞递送到非吞噬性哺乳动物细胞，(b)编码功能性核酸(shRNA)的质粒逃脱了其中小细胞发生裂解的细胞内
器官，(c)质粒被转运到哺乳动物细胞核，在那里shRNA被表达，(d)shRNA有效的降解编码
多药耐药性蛋白质MDR-1的mRNA，(e)同样的哺乳动物细胞可接受下一轮的受体靶向小细
胞，所述小细胞现在携带药物而替代质粒，(f)双重处理方案，即，靶向受体的小细胞介导的shRNA递送以及随后靶向受体的小细胞介导的化疗药物递送可非常有效地逆转非吞噬性哺
乳动物细胞的耐药性。
器官，(c)质粒被转运到哺乳动物细胞核，在那里shRNA被表达，(d)shRNA有效的降解编码
多药耐药性蛋白质MDR-1的mRNA，(e)同样的哺乳动物细胞可接受下一轮的受体靶向小细
胞，所述小细胞现在携带药物而替代质粒，(f)双重处理方案，即，靶向受体的小细胞介导的shRNA递送以及随后靶向受体的小细胞介导的化疗药物递送可非常有效地逆转非吞噬性哺
乳动物细胞的耐药性。
[0204] 实施例3.体内证明使用本发明的方法即靶向受体的小细胞介导的shRNA递送接着靶向受体的小细胞介导的药物递送的双重处理实现了使肿瘤退化的效果
[0205] 这个实施例证明可使用受体定向小细胞反转体内癌细胞耐药性。
[0206] 纯化S.typhimurium minCDE衍生的小细胞并使用化疗药物伊立替康进行包装。在9
BSG溶液中离心7×10 个小细胞，去除上清液并将小细胞再悬浮在940μl BSG和60μl伊
立替康溶液中(1mg/ml；溶解于无菌蒸馏水中)。将悬液在37℃旋转培育过夜以使伊立替
康扩散到小细胞细胞质中。随后如下所述通过搅动细胞超滤滤洗掉非特异性附着到小细胞
外表面的过量的伊立替康。根据使用说明用超滤滤膜盘(聚醚砜；分子量截留值300kDa；
Millipore)装配Amicon搅动超滤细胞仪8010(Millipore，Billerica，MA，美国)。用灭菌
蒸馏水洗细胞三次，接着用BSG再洗三次。随后向细胞补充9ml新鲜的BSG并加入1ml包
装有伊立替康的小细胞的溶液。细胞被保持在10psi压力下，搅拌直到体积缩减到5ml并
最后加入5ml BSG。继续进行超滤直到体积再次降到5ml。进行这样的缩减/超滤过程6
次，从而能彻底清洗包装伊立替康的小细胞外表面。在最后的超滤期间，体积降到1ml并将
样品转移到无菌Eppendorf离心管中，接着以13,200rpm离心10分钟，从而沉淀包装伊立
替康的小细胞。
BSG溶液中离心7×10 个小细胞，去除上清液并将小细胞再悬浮在940μl BSG和60μl伊
立替康溶液中(1mg/ml；溶解于无菌蒸馏水中)。将悬液在37℃旋转培育过夜以使伊立替
康扩散到小细胞细胞质中。随后如下所述通过搅动细胞超滤滤洗掉非特异性附着到小细胞
外表面的过量的伊立替康。根据使用说明用超滤滤膜盘(聚醚砜；分子量截留值300kDa；
Millipore)装配Amicon搅动超滤细胞仪8010(Millipore，Billerica，MA，美国)。用灭菌
蒸馏水洗细胞三次，接着用BSG再洗三次。随后向细胞补充9ml新鲜的BSG并加入1ml包
装有伊立替康的小细胞的溶液。细胞被保持在10psi压力下，搅拌直到体积缩减到5ml并
最后加入5ml BSG。继续进行超滤直到体积再次降到5ml。进行这样的缩减/超滤过程6
次，从而能彻底清洗包装伊立替康的小细胞外表面。在最后的超滤期间，体积降到1ml并将
样品转移到无菌Eppendorf离心管中，接着以13,200rpm离心10分钟，从而沉淀包装伊立
替康的小细胞。
[0207] 按上述和美国公开专利申请No.2004-0265994中所述构建双特异性抗体。简要地说，将抗-S.typhimurium脂多糖(Biodesign，Saco，Maine，美国)和抗-人表皮生长因子
受体(EGFR)小鼠单克隆抗体(Oncogene Research Products，Cambridge，MA，USA)经每个
单克隆抗体的Fc片段连接到纯化的重组蛋白质A/G上。选择抗-EGFR单克隆抗体，因为异
种移植的细胞是人结肠癌细胞(Caco-2)，已知其在细胞表面上过表达EGFR(Nyati et al.，
2004)。
受体(EGFR)小鼠单克隆抗体(Oncogene Research Products，Cambridge，MA，USA)经每个
单克隆抗体的Fc片段连接到纯化的重组蛋白质A/G上。选择抗-EGFR单克隆抗体，因为异
种移植的细胞是人结肠癌细胞(Caco-2)，已知其在细胞表面上过表达EGFR(Nyati et al.，
2004)。
[0208] 将纯化的重组蛋白质A/G(Pierce Biotechnology，Rockford，IL，USA)在免疫纯结合缓冲液(Pierce Biotechnology)中稀释到终浓度100μg/ml，将0.5ml的所述溶液与每
种各20μg/ml的抗-S.typhimurium LPS和抗-人EGFR单克隆抗体的预混溶液在4℃培育
过夜。随后如下所述除去未结合到蛋白质A/G的过量抗体。温柔地混合 蛋
白质G溶液(包被有共价偶联到磁性颗粒表面的重组蛋白质G的 [2.8μm]；
Dynal Biotech，Oslo，挪威)并将100μl该溶液转移到Eppendorf离心管中。该管被置于
Dynal MPC-S(磁性颗粒浓缩器，S型)从而固定珠，去除上清液。将该珠再悬浮在含0.1M
磷酸钠缓冲液的0.5ml清洗液中(pH 5.0)。重复固定珠和清洗的步骤三次。将包含蛋白
质A/G-双特异性抗体混合物的溶液加到珠中并在室温下温柔混合培育40分钟。将该管静
置于MPC-S上以固定珠，用移液管移去蛋白质A/G-双特异性抗体。这个步骤去除了未结合
的过量单克隆抗体，并提供了含有经它们的Fc片段连接到蛋白质A/G上的双特异性抗体的
溶液。在室温下将重组小细胞与蛋白质A/G-双特异性抗体培育1小时，从而用抗体经它的
抗-LPS Fab区包被小细胞。
种各20μg/ml的抗-S.typhimurium LPS和抗-人EGFR单克隆抗体的预混溶液在4℃培育
过夜。随后如下所述除去未结合到蛋白质A/G的过量抗体。温柔地混合 蛋
白质G溶液(包被有共价偶联到磁性颗粒表面的重组蛋白质G的 [2.8μm]；
Dynal Biotech，Oslo，挪威)并将100μl该溶液转移到Eppendorf离心管中。该管被置于
Dynal MPC-S(磁性颗粒浓缩器，S型)从而固定珠，去除上清液。将该珠再悬浮在含0.1M
磷酸钠缓冲液的0.5ml清洗液中(pH 5.0)。重复固定珠和清洗的步骤三次。将包含蛋白
质A/G-双特异性抗体混合物的溶液加到珠中并在室温下温柔混合培育40分钟。将该管静
置于MPC-S上以固定珠，用移液管移去蛋白质A/G-双特异性抗体。这个步骤去除了未结合
的过量单克隆抗体，并提供了含有经它们的Fc片段连接到蛋白质A/G上的双特异性抗体的
溶液。在室温下将重组小细胞与蛋白质A/G-双特异性抗体培育1小时，从而用抗体经它的
抗-LPS Fab区包被小细胞。
[0209] 用于此实施例的小鼠购自Animal Resources Centre，Perth，WA，澳大利亚，并且所有的动物实验是依据实验室动物管理和应用指南并且经过动物伦理委员会批准来实施
的。在NSW农业认可的小动物中心在EnGeneIC Pty Ltd(Sydney，NSW，澳大利亚)实施这
些实验。人结肠癌细胞(Caco-2，ATCC)在组织培养中在补充有5％小牛血清(GIBCO-BRL
Life Technologies，Invitrogen Corporation，Carlsbad，加拿大，美国)和谷氨酰胺
(Invitrogen)的RPMI 1640培养基中在95％空气和5％CO2的加湿大气、37℃条件下生长。
将50μl无血清培养基加上50μl减少了生长因子的matrigel(BD Biosciences，Franklin
6
Lakes，NJ，美国)中的1×10 个细胞用23-号注射针经皮下注射到每个小鼠肩胛骨之间。每
周两次用电子数字测径器(Mitutoyo，日本，精度达0-001)测量肿瘤，并根据公式长(mm)×
2 3 3 3
宽 (mm)×0.5＝体积(mm)计算肿瘤平均体积。一旦肿瘤体积达到50mm 和80mm 之间则
开始各个处理，小鼠被随机分到8个不同的组，每个组中11只小鼠。
的。在NSW农业认可的小动物中心在EnGeneIC Pty Ltd(Sydney，NSW，澳大利亚)实施这
些实验。人结肠癌细胞(Caco-2，ATCC)在组织培养中在补充有5％小牛血清(GIBCO-BRL
Life Technologies，Invitrogen Corporation，Carlsbad，加拿大，美国)和谷氨酰胺
(Invitrogen)的RPMI 1640培养基中在95％空气和5％CO2的加湿大气、37℃条件下生长。
将50μl无血清培养基加上50μl减少了生长因子的matrigel(BD Biosciences，Franklin
6
Lakes，NJ，美国)中的1×10 个细胞用23-号注射针经皮下注射到每个小鼠肩胛骨之间。每
周两次用电子数字测径器(Mitutoyo，日本，精度达0-001)测量肿瘤，并根据公式长(mm)×
2 3 3 3
宽 (mm)×0.5＝体积(mm)计算肿瘤平均体积。一旦肿瘤体积达到50mm 和80mm 之间则
开始各个处理，小鼠被随机分到8个不同的组，每个组中11只小鼠。
[0210] 各个组接受以下处理：组1(对照)不接受处理。组2(对照)，静脉注射游离的伊4 5
立替康(1.2×10ng/gm小鼠体重～每只小鼠2.4×10ng)。包括这个对照是为了证实肿瘤
细胞耐受该药物的体外结果。组3(对照)，EGFR靶向的、包装伊立替康的小细胞(被命名
EGFR EGFR EGFR
为 小细胞Irino)。组4(对照)， 小细胞shRNA-MDR-1。组5(对照)， 小细胞shRNA-bcl-2。组EGFR EGFR EGFR
6(对照)， 小细胞shRNA-MDR-1接着游离伊立替康。组7(试验)， 小细胞shRNA-MDR-1接着
EGFR EGFR
小细胞Irino。组8(试验)， 小细胞shRNA-bcl-2接着 小细胞Irino。通过HPLC的伊立替康
8 8
定量研究显示5×10 个小细胞包装了～80ng的药物。在第9和23天实施接受5×10 个
小细胞的所有小细胞处理和shRNA处理。在第15、18、29和32天实施所有的药物处理。这
允许在shRNA和药物处理之间有6天的间隔，从而确保有足够的时间进行shRNA的细胞内
和核的递送、基因表达和抑制耐药性介导蛋白质即MDR-1或bcl-2的表达。
立替康(1.2×10ng/gm小鼠体重～每只小鼠2.4×10ng)。包括这个对照是为了证实肿瘤
细胞耐受该药物的体外结果。组3(对照)，EGFR靶向的、包装伊立替康的小细胞(被命名
EGFR EGFR EGFR
为 小细胞Irino)。组4(对照)， 小细胞shRNA-MDR-1。组5(对照)， 小细胞shRNA-bcl-2。组EGFR EGFR EGFR
6(对照)， 小细胞shRNA-MDR-1接着游离伊立替康。组7(试验)， 小细胞shRNA-MDR-1接着
EGFR EGFR
小细胞Irino。组8(试验)， 小细胞shRNA-bcl-2接着 小细胞Irino。通过HPLC的伊立替康
8 8
定量研究显示5×10 个小细胞包装了～80ng的药物。在第9和23天实施接受5×10 个
小细胞的所有小细胞处理和shRNA处理。在第15、18、29和32天实施所有的药物处理。这
允许在shRNA和药物处理之间有6天的间隔，从而确保有足够的时间进行shRNA的细胞内
和核的递送、基因表达和抑制耐药性介导蛋白质即MDR-1或bcl-2的表达。
[0211] 结果表明(图2)了在对照组(组1-6)和试验组(组7和8)之间肿瘤平均体积的显著对比。试验组的肿瘤体积被快速地稳定下来，并且在每组11个动物中有大部分显示
出明显的稳定化。相反，所有不同对照组的肿瘤平均体积继续增加，并且在异种移植物建立
后第36天终止试验，因为对照动物患病非常严重。另一方面，试验的动物是健康的并且没
有显示任何处理的毒副作用。使用一种方式ANOVA的数据统计学分析显示，与对照组1-6
相比，试验组(7和8)有非常高的显著性(ρ＝0.0004)。这个结果首次证明了shRNA的靶
向体内递送可解决癌症中的严重耐药性问题。该结果也证明本发明具有广泛的应用，因为
耐药性的两种机制上不同的方法，即过表达的膜相关蛋白质泵(MDR-1)和细胞质抗细胞凋
亡蛋白质(bcl-2)，均可以在体内耐药性癌细胞中被负调节。进行另一轮用靶向受体的、包
装化疗药物的小细胞处理同一细胞可有效治疗这样的肿瘤。
出明显的稳定化。相反，所有不同对照组的肿瘤平均体积继续增加，并且在异种移植物建立
后第36天终止试验，因为对照动物患病非常严重。另一方面，试验的动物是健康的并且没
有显示任何处理的毒副作用。使用一种方式ANOVA的数据统计学分析显示，与对照组1-6
相比，试验组(7和8)有非常高的显著性(ρ＝0.0004)。这个结果首次证明了shRNA的靶
向体内递送可解决癌症中的严重耐药性问题。该结果也证明本发明具有广泛的应用，因为
耐药性的两种机制上不同的方法，即过表达的膜相关蛋白质泵(MDR-1)和细胞质抗细胞凋
亡蛋白质(bcl-2)，均可以在体内耐药性癌细胞中被负调节。进行另一轮用靶向受体的、包
装化疗药物的小细胞处理同一细胞可有效治疗这样的肿瘤。
[0212] 实施例4.使用本发明的方法即小细胞介导的shRNA递送接着小细胞介导的药物递送的双重处理实现肿瘤退化功效的又一体内证明
[0213] 还已知结直肠癌对另一种一线化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)有高度的耐药性，本实施例显示本发明的方法不但能在体内逆转耐药性而且能让肿瘤稳定/退化。
[0214] 如上所述，从S.typhimurium minCDE-突变株获得小细胞并用梯度离心/丝状体化/过滤/内毒素去除步骤进行纯化。相似地，各自从S.typhimurium minCDE-重组株获
得并纯化携带有shRNA质粒、shRNA-MDR-1、shRNA-bcl-2和shRNA-无义的重组小细胞。按
照实施例3中有关伊立替康的描述，用化疗药物5-FU包装已被纯化的空小细胞。使用HPLC
分析确定包装于小细胞内的5-FU的浓度。
得并纯化携带有shRNA质粒、shRNA-MDR-1、shRNA-bcl-2和shRNA-无义的重组小细胞。按
照实施例3中有关伊立替康的描述，用化疗药物5-FU包装已被纯化的空小细胞。使用HPLC
分析确定包装于小细胞内的5-FU的浓度。
[0215] 如实施例3中所述构建包含抗-人EGFR和抗-S.typhimurium O-抗原双重特异10
性的双特异性抗体。用双特异性抗体在室温下培育重组小细胞(10 )1小时，从而用所述抗
体经它的抗-O-抗原Fab区包被小细胞。
性的双特异性抗体。用双特异性抗体在室温下培育重组小细胞(10 )1小时，从而用所述抗
体经它的抗-O-抗原Fab区包被小细胞。
[0216] 在Balb/c裸鼠中建立Caco-2癌细胞异种移植物并且一旦肿瘤体积达到50mm3和3
80mm 之间时，将小鼠随机分为10组(n＝11只小鼠/组)。10个静脉内处理包括：(a)G1-只
4 6
有肿瘤的对照。G2(对照)，游离的5-FU(5×10ng/gm小鼠体重～每只小鼠1×10ng)。包
括这个对照是为了证实肿瘤细胞耐受该药物的体外结果。组3(对照)，EGFR靶向的、包装
EGFR EGFR
5-FU的小细胞(被命名为 小细胞5-FU)。组4(对照)， 小细胞shRNA-MDR-1。组5(对照)，
EGFR EGFR CMV
小细胞shRNA-bcl-2。组6(对照)， 小细胞shRNA-MDR-1接着 小细胞5-FU。CMV抗体被靶向于
EGFR
巨细胞病毒上的表面蛋白质，这作为非特异性靶向的对照。组7(对照)， 小细胞shRNA-无义
EGFR EGFR EGFR
接着 小细胞5-FU。组8(对照)， 小细胞shRNA-MDR-1接着游离的5-FU。G9(试验)， 小
EGFR EGFR EGFR
细胞shRNA-MDR-1接 小细胞5-FU。G10(试验)， 小细胞shRNA-bcl-2接 小细胞5-FU。在第9
和23天实施shRNA处理，在第15、18、29和32天实施药物处理。这允许在shRNA和药物处
理之间有6天的间隔，从而确保有足够的时间进行shRNA的细胞内和核的递送、基因表达和
抑制耐药性介导蛋白质即MDR-1或bcl-2的表达。
80mm 之间时，将小鼠随机分为10组(n＝11只小鼠/组)。10个静脉内处理包括：(a)G1-只
4 6
有肿瘤的对照。G2(对照)，游离的5-FU(5×10ng/gm小鼠体重～每只小鼠1×10ng)。包
括这个对照是为了证实肿瘤细胞耐受该药物的体外结果。组3(对照)，EGFR靶向的、包装
EGFR EGFR
5-FU的小细胞(被命名为 小细胞5-FU)。组4(对照)， 小细胞shRNA-MDR-1。组5(对照)，
EGFR EGFR CMV
小细胞shRNA-bcl-2。组6(对照)， 小细胞shRNA-MDR-1接着 小细胞5-FU。CMV抗体被靶向于
EGFR
巨细胞病毒上的表面蛋白质，这作为非特异性靶向的对照。组7(对照)， 小细胞shRNA-无义
EGFR EGFR EGFR
接着 小细胞5-FU。组8(对照)， 小细胞shRNA-MDR-1接着游离的5-FU。G9(试验)， 小
EGFR EGFR EGFR
细胞shRNA-MDR-1接 小细胞5-FU。G10(试验)， 小细胞shRNA-bcl-2接 小细胞5-FU。在第9
和23天实施shRNA处理，在第15、18、29和32天实施药物处理。这允许在shRNA和药物处
理之间有6天的间隔，从而确保有足够的时间进行shRNA的细胞内和核的递送、基因表达和
抑制耐药性介导蛋白质即MDR-1或bcl-2的表达。
[0217] 结果表明(图3)了在对照组(组1-8)和试验组(组9和10)之间肿瘤平均体积的显著对比。试验组的肿瘤体积在每组11只动物中有大部分显示出明显的稳定化。相反，
所有不同对照组的肿瘤平均体积继续增加，并且在异种移植物建立后的第36天终止试验，
因为对照动物患病非常严重。另一方面，试验动物是健康的并且没有显示该处理的任何毒
副作用。使用单因素ANOVA的数据统计学分析显示与对照组1-8相比，试验组(9和10)有
非常高的显著性(p＝0.0008)。
所有不同对照组的肿瘤平均体积继续增加，并且在异种移植物建立后的第36天终止试验，
因为对照动物患病非常严重。另一方面，试验动物是健康的并且没有显示该处理的任何毒
副作用。使用单因素ANOVA的数据统计学分析显示与对照组1-8相比，试验组(9和10)有
非常高的显著性(p＝0.0008)。
[0218] 实施例5.使用本发明的方法在阿霉素耐药性人乳腺癌细胞中实现肿瘤退化的体内证明
[0219] 本发明人已经显示，人乳腺腺癌细胞系MDA-MB-468对阿霉素非常敏感，并且经静EGFR
脉内用 小细胞Dox处理的小鼠异种移植物得到稳定/退化。
脉内用 小细胞Dox处理的小鼠异种移植物得到稳定/退化。
[0220] 在此实施例中，在组织培养中培养MDA-MB-468细胞并用渐增浓度的Dox进行处理从而发展Dox耐药性克隆。已充分认识到这样的药物处理在体外和体内上调多药耐药性蛋
白质比如MDR-1和bcl-2的表达。获得几个Dox耐药性克隆，其中一个被用来在Balb/c裸
EGFR EGFR
鼠中建立异种移植物。静脉处理组(n＝11只小鼠/组)包括G2- 小细胞Dox和G3-
EGFR
小细胞shRNA-MDR-1接着 小细胞Dox。G1小鼠是只有肿瘤的对照。在第21天实施shRNA处
理，在第27、34和41天实施药物处理。
白质比如MDR-1和bcl-2的表达。获得几个Dox耐药性克隆，其中一个被用来在Balb/c裸
EGFR EGFR
鼠中建立异种移植物。静脉处理组(n＝11只小鼠/组)包括G2- 小细胞Dox和G3-
EGFR
小细胞shRNA-MDR-1接着 小细胞Dox。G1小鼠是只有肿瘤的对照。在第21天实施shRNA处
理，在第27、34和41天实施药物处理。
[0221] 结果显示(图4)在G3小鼠中EGFR小细胞shRNA-MDR-1接着EGFR小细胞Dox的处理非常EGFR
有效地逆转癌细胞中的Dox耐药性并且肿瘤被稳定化。用 小细胞Dox(G2)处理的对照显
示肿瘤细胞对Dox有非常高的耐药性并且肿瘤快速生长。
有效地逆转癌细胞中的Dox耐药性并且肿瘤被稳定化。用 小细胞Dox(G2)处理的对照显
示肿瘤细胞对Dox有非常高的耐药性并且肿瘤快速生长。
[0222] 实施例6.给药方案对耐药性逆转和疗效的影响的体内证明
[0223] 这个实施例证明给药方案对反转耐药性和疗效的影响。在靶向受体的、包装药物的小细胞之前有足够的时间允许有效递送shRNA到肿瘤细胞将改善此结果。进行时程试
EGFR
验，其中在携带有Caco-2细胞异种移植物的裸鼠中经静脉施用 小细胞shRNA-MDR-1。在分开
EGFR
的组中(n＝11只小鼠/组)，在 小细胞shRNA-MDR-1处理后的96小时(G3)、120小时(G4)
EGFR
或144小时(G5)对小鼠给予 小细胞Irino。G1和G2是只有肿瘤和游离伊立替康(～
5 8
2.4×10ng/剂)的对照。以5×10/剂的量施用小细胞，每剂含有包装于小细胞内的～
80ng伊立替康，其施用的剂量比施用游离药物低3,000倍。结果显示(图5)在允许shRNA
EGFR
表达的时间以及随后在144小时(G5)施用 小细胞Irino之间有明显的相关性，这最有效
地逆转了耐药性并获得明显的疗效。
EGFR
验，其中在携带有Caco-2细胞异种移植物的裸鼠中经静脉施用 小细胞shRNA-MDR-1。在分开
EGFR
的组中(n＝11只小鼠/组)，在 小细胞shRNA-MDR-1处理后的96小时(G3)、120小时(G4)
EGFR
或144小时(G5)对小鼠给予 小细胞Irino。G1和G2是只有肿瘤和游离伊立替康(～
5 8
2.4×10ng/剂)的对照。以5×10/剂的量施用小细胞，每剂含有包装于小细胞内的～
80ng伊立替康，其施用的剂量比施用游离药物低3,000倍。结果显示(图5)在允许shRNA
EGFR
表达的时间以及随后在144小时(G5)施用 小细胞Irino之间有明显的相关性，这最有效
地逆转了耐药性并获得明显的疗效。
[0224] 实施例7.给药方案对逆转耐药性和疗效的影响的又一体内证明
[0225] 这个实施例证明在实施例6中观察到的给药方案的影响是广泛适用的。
[0226] 用相同的对照和试验组重复实施例6中描述的试验，只是G2接受游离的6 EGFR 9
5-FU(1×10ng/剂)，而在G3、G4和G5中用 小细胞5-FU实施第二处理。以1×10/剂的量
施用小细胞，每剂携带有～80ng的5-FU，即比在G2小鼠中施用的游离药物量低～12,500
倍。
5-FU(1×10ng/剂)，而在G3、G4和G5中用 小细胞5-FU实施第二处理。以1×10/剂的量
施用小细胞，每剂携带有～80ng的5-FU，即比在G2小鼠中施用的游离药物量低～12,500
倍。
[0227] 结果显示(图6)，在施用EGFR小细胞shRNA-MDR-1之后144小时施用EGFR小细胞5-FU(G5)导致了耐药性逆转和疗效的最大效用。在有效治疗这些高度耐药性肿瘤所需药物浓度方面，本发明的潜力是明显的，因为与游离伊立替康和5-FU的治疗相比，小细胞携带的药物
分别低3,000倍和12,500倍。如在图5和6中所见，游离药物对肿瘤生长没有影响。
分别低3,000倍和12,500倍。如在图5和6中所见，游离药物对肿瘤生长没有影响。
[0228] 参考文献
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[0385] 以下内容对应于母案申请的原始权利要求书：
[0386] 1.一种组合物，其包含(a)完整小细胞，该完整小细胞包含功能性核酸分子或含有编码功能性核酸分子的片段的质粒，和(b)由此的药用可接受载体，其中所述功能性核
酸分子靶向有助于耐药性、细胞凋亡抗性或致瘤性的蛋白质的转录物。
酸分子靶向有助于耐药性、细胞凋亡抗性或致瘤性的蛋白质的转录物。
[0387] 2.根据项1的组合物，其中所述质粒包含可操纵地连接到编码功能性核酸的所述片段上的调节元件。
[0388] 3.根据项2的组合物，其中所述调节元件是依赖于RNA聚合酶的启动子。
[0389] 4.根据项3的组合物，其中所述启动子是RNA聚合酶III启动子H1或U6或7SK或RNA聚合酶II启动子CMV立即早期启动子。
[0390] 5.根据项1的组合物，其中所述功能性核酸是siRNA、shRNA或miRNA分子，它们靶向有助于耐药性的蛋白质的转录物。
[0391] 6.根据项1的组合物，其中所述功能性核酸是靶向有助于耐药性之蛋白质的转录物的反义分子。
[0392] 7.根据项1的组合物，其中所述功能性核酸分子是靶向有助于耐药性之蛋白质的转录物的核酶。
[0393] 8.根据项1的组合物，其中所述功能性核酸分子靶向于P-糖蛋白、MDR-2或MDR-3的转录物。
[0394] 9.根据项1的组合物，其中所述功能性核酸分子靶向于MRP2、BCR-ABL、STI-571耐药性相关蛋白质、肺耐药性相关蛋白质、环加氧酶-2、核因子κ、XRCC1、ERCC1、GSTP1、突变β-微管蛋白、或生长因子的转录物。
[0395] 10.根据项1的组合物，其中所述功能性核酸分子靶向有助于细胞凋亡抗性的蛋白质的转录物。
[0396] 11.根据项10的组合物，其中所述功能性核酸分子靶向于Bcl-2、Bcl-XL、A1/Bfl1、黏着斑激酶或p53蛋白质的转录物。
[0397] 12.根据项1的组合物，其中所述功能性核酸分子靶向有助于致瘤性的蛋白质的转录物。
[0398] 13.根据项12的组合物，其中所述功能性核酸分子靶向β-联蛋白、PKC-α、C-RAF、K-Ras、DP97Dead框RNA解旋酶、DNMT1、FLIP、C-Sfc、53BPI、Polycomb组蛋白质EZH2、ErbB1、HPV-16E5和E7、Fortilin&MCI1P、DIP13α、MBD2、p21、KLF4、tpt/TCTP、SPK1&SPK2、P300、PLK1、Trp53、Ras、ErbB1、VEGF、或BAG-1的转录物。
[0399] 14.根据项1的组合物，其中所述质粒编码多个功能性核酸分子。
[0400] 15.根据项14的组合物，其中所述质粒还包含针对于每个被编码的功能性核酸分子的启动子。
[0401] 16.根据项1的组合物，还包含药物。
[0402] 17.根据项16的组合物，其中所述功能性核酸分子靶向有助于对所述药物之耐药性的蛋白质的转录物。
[0403] 18.根据项16的组合物，其中所述药物被包装在完整小细胞中。
[0404] 19.根据项18的组合物，其中所述功能性核酸分子或质粒以及所述药物被包装在同一小细胞内。
[0405] 20.根据项1的组合物，还包含双特异性配体。
[0406] 21.根据项20的组合物，其中所述双特异性配体包含对小细胞表面结构具有特异性的第一臂和对非吞噬性哺乳动物细胞表面受体具有特异性的第二臂。
[0407] 22.根据项21的组合物，其中所述小细胞表面结构是所述小细胞表面上的脂多糖的O-多糖成分。
[0408] 23.根据项21的组合物，其中所述哺乳动物细胞表面受体能活化所述小细胞的受体介导的胞吞作用。
[0409] 24.根据项20的组合物，其中所述双特异性配体包括抗体或抗体片段。
[0410] 25.根据项1的组合物，其中所述组合物中每107个小细胞包含少于约1个污染的亲代细菌细胞。
[0411] 26.根据项1的组合物，其中所述组合物中每108个小细胞包含少于约1个污染的亲代细菌细胞。
[0412] 27.根据项1的组合物，其中所述组合物中每109个小细胞包含少于约1个污染的亲代细菌细胞。
[0413] 28.根据项1的组合物，其中所述组合物中每1010个小细胞包含少于约1个污染的亲代细菌细胞。
[0414] 29.根据项1的组合物，其中所述组合物中每1011个小细胞包含少于约1个污染的亲代细菌细胞。
[0415] 30.一种递送功能性核酸的方法，包括(a)提供包含下述的完整小细胞：(i)功能性核酸分子或(ii)含有编码功能性核酸分子的片段的质粒，和随后(b)让所述小细胞与靶
哺乳动物细胞接触，使得所述哺乳动物细胞吞入所述小细胞，由此所述功能性核酸被释放
到靶细胞的细胞质中。
哺乳动物细胞接触，使得所述哺乳动物细胞吞入所述小细胞，由此所述功能性核酸被释放
到靶细胞的细胞质中。
[0416] 31.根据项30的方法，其中所述功能性核酸由靶细胞表达。
[0417] 32.根据项30的方法，其中所述小细胞包含含有可操纵地连接到所述片段上的调节元件的质粒。
[0418] 33.根据项31的方法，其中所述调节元件是依赖于RNA聚合酶的启动子。
[0419] 34.根据项33的方法，其中所述启动子是RNA III聚合酶启动子H1或U6。
[0420] 35.根据项30的方法，其中所述小细胞和所述哺乳动物细胞之间的接触发生在体外。
[0421] 36.根据项30的方法，其中所述小细胞和所述哺乳动物细胞之间的接触发生在体内。
[0422] 37.根据项30的方法，其中所述功能性核酸分子是靶向有助于耐药性之蛋白质的转录物的siRNA分子。
[0423] 38.根据项30的方法，其中所述功能性核酸分子是靶向有助于耐药性之蛋白质的转录物的反义分子。
[0424] 39.根据项30的方法，其中所述功能性核酸分子是靶向有助于耐药性之蛋白质的转录物的核酶。
[0425] 40.根据项30的方法，其中所述功能性核酸分子靶向P-糖蛋白、MDR-2或MDR-3的转录物。
[0426] 41.根据项30的方法，其中所述功能性核酸分子靶向MRP2、BCR-ABL、STI-571耐药性相关蛋白质、肺耐药性相关蛋白质、环加氧酶-2、核因子κ、XRCC1、ERCC1、GSTP1、突变β-微管蛋白或生长因子的转录物。
[0427] 42.根据项30的方法，其中所述功能性核酸分子靶向有助于细胞凋亡抗性的蛋白质的转录物。
[0428] 43.根据项42的方法，其中所述功能性核酸分子靶向Bcl-2、Bcl-XL、A1/Bfl 1、黏着斑激酶或p53蛋白质的转录物。
[0429] 44.根据项30的方法，其中所述功能性核酸分子靶向有助于致瘤性的蛋白质的转录物。
[0430] 45.根据项44的方法，其中所述功能性核酸分子靶向β-联蛋白、PKC-α、C-RAF、K-Ras、DP97Dead框RNA解旋酶、DNMT1、FLIP、C-Sfc、53BPI、Polycomb组蛋白质EZH2、ErbB1、HPV-16E5和E7、Fortilin&MCI1P、DIP13α、MBD2、p21、KLF4、tpt/TCTP、SPK1&SPK2、P300、PLK1、Trp53、Ras、ErbB1、VEGF、或BAG-1的转录物。
[0431] 46.根据项30的方法，其中所述质粒编码多个功能性核酸分子。
[0432] 47.根据项46的方法，其中所述质粒还包含针对每个被编码的功能性核酸分子的启动子。
[0433] 48.根据项30的方法，还包括递送药物到所述靶哺乳动物细胞的步骤(c)。
[0434] 49.根据项48的方法，其中所述功能性核酸分子靶向有助于对所述药物之耐药性的蛋白质的转录物。
[0435] 50.根据项48的方法，其中所述药物被包装在完整小细胞中。
[0436] 51.根据项50的方法，其中所述功能性核酸分子或质粒以及所述药物被包装在同一小细胞内。
[0437] 52.根据项48的方法，其中在步骤(a)和(b)之后实施步骤(c)。
[0438] 53.根据项48的方法，其中在实施步骤(b)同时递送所述药物。
[0439] 54.根据项30的方法，其中步骤(b)中使双特异性配体与所述完整小细胞和所述靶哺乳动物细胞接触，使得(i)所述双特异性配体引起所述小细胞与所述哺乳动物细胞相
结合。
结合。
[0440] 55.根据项54的方法，其中所述靶哺乳动物细胞是非吞噬细胞。
[0441] 56.根据项54的方法，其中所述双特异性配体包含对小细胞表面结构具有特异性的第一臂和对非吞噬哺乳动物细胞表面受体具有特异性的第二臂。
[0442] 57.根据项56的方法，其中所述小细胞表面结构是所述小细胞表面上的脂多糖的O-多糖成分。
[0443] 58.根据项56的方法，其中所述哺乳动物细胞表面受体能活化所述小细胞的受体介导的胞吞作用。
[0444] 59.根据项54的方法，其中所述双特异性配体包含抗体或抗体片段。
[0445] 60.根据项30的方法，其中所述哺乳动物细胞有吞噬或胞吞能力。
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