신규한 치료 방법

본 발명은 항-약물 항체, 특히 인자 VIII(FVIII)에 대한 항체를 발달시키는 포유동물 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 이러한 목적을 위해, 약물 항원(예: FVIII)의 존재하에 IDO 유도제(예: 제불라린)으로 생체외 치료한 자가 항원 제시 세포(특히 수지상 세포)의 용도에 관한 것이다.

항-약물 항체

혈우병 A(HA)는, 번역된 단백질의 발현 또는 응혈촉진 기능을 간섭하는 FVIII을 코딩하는 F8 유전자에서 다양한 돌연변이에 의해 유발된 X-염색체 연결된 출혈성 질환이다. FVIII은 간장 및 내피 혈관 베드에서 주로 발현된다. 충분한 응혈촉진 활성이 결핍되면, 혈우병 A 환자는, 나병율 및 사망율의 증가를 포함하는, 출혈 에피소드 및 이들의 후유증을 받기 쉽다. FVIII 데이터베이스는 현재 5,472개의 개인 사례 보고에 기초하여 2,015 특유의 FVIII 변이체를 동정한다. 점 돌연변이(66.5%), 결실(23.2%) 및 기타(복제, 다형, 삽입, 인델 및 복합체)의 이러한 광범위한 배열은 다양한 임상 결과를 유도한다. 환자는 혈장-유래 또는 재조합 FVIII로 급성(주문형) 또는 예방적으로 치료될 수 있다.

상당수의 환자는, 이들의 면역계가 정상 FVIII의 특정 서열에 대해 완전하게 내성으로 되지 않기 때문에 투여된 FVIII의 활성을 차단하는, "억제제"로서 불리우는 중화 항체를 형성한다. 억제제 개발은 현재 혈우병 환자에서 관찰된 가장 중요한 치료 합병증이다.

현재, 억제제가 형성되면, 근절을 위한 유일한 확실한 방법은 정기적 FVIII 주입에 의한 면역 관용 유도(ITI)이지만, 이러한 치료 전략은 환자의 10 내지 20%에서 실패한다.

항-약물 항체의 문제는 결함이 있는 혈우병으로 한정되지 않는다. 항-약물 항체는 다른 약물로 치료한 대상체에서 발달할 수 있다.

FVIII에 대한 면역 반응의 제1 단계는 항원 제시 세포(APC)에 의한 FVIII의 인식이라고 생각된다. APC에 의한 FVIII의 엔도사이토시스 후, FVIII은 작은 펩티드로 프로세싱되고, 이어서 FVIII-특이적 CD4+ T 세포에의 제시를 위해 세포 표면에서 MHC 부류 II 분자 상에 부하된다. 이들 T 세포의 활성화는 APC에 의해 제공된 추가의 신호를 필요로 한다. 이들 신호는 분자, 예를 들면, APC 및 CD28의 혈장 막 상의 CD40, CD80, CD83 및 CD86, 즉 T 세포 상의 CD154 및 CTLA-4 사이의 막-연관 상호작용이다. 이들 상호작용과 조합하여, APC는 IL-12 또는 IL-10 등의 사이토킨을 통해 T 세포로 신호전달한다. 신호의 조합은 활성화된 T 세포가 분화하는 방향을 결정한다. T 헬퍼 1(Th1) 세포는 일반적으로 세포독성 면역 반응, 즉 Th2 B-세포 매개된 항체 반응을 유도하고, 조절 T 세포는 B- 및 T 세포 반응을 억제함으로써 면역억제/관용을 유도할 수 있다. 최종적으로, 이들 FVIII-특이적 T 세포는 FVIII-특이적 B-세포를 활성화시키고 B-세포에서 면역글로불린 유전자의 친화성 돌연변이 및 부류-스위칭을 유도할 수 있다. 결과적으로, 항-FVIII 항체-분비 혈장 세포 및 순환 FVIII-특이적 기억 B-세포가 생성되고, 이는 FVIII에 재-노출될 때에 항체를 생산할 수 있다.

항원 제시 세포

항원 제시 세포(APC)는 이들의 표면 상에 주요 조직적합성 복합체(MHC)로 복합체화된 외래 항원을 나타내는 세포이고; 이들은 항원을 프로세싱하고 이들을 T 세포로 제시한다. APC는 프로페셔널 및 비-프로페셔널의 2개 범주로 분류된다: 프로페셔널 APC는 MHC 부류 II 분자를 발현하는 것들이다. 프로페셔널 APC에는 4개 주요 타입: 수지상 세포, 마크로파지, 특정 B-세포 및 특정 활성화된 상피 세포가 있다. APC와 T-세포와의 상호작용은 림프절에서 발생하고, APC는 주화성의 효과를 통해 지향된다. 수지상 세포는 다수의 공급원, 예를 들면, 골수(특히 조혈 골수 전구 세포) 및 혈액(특히 말초혈 단핵 세포, 이중 일부는 미성숙하고 CD34를 발현한다)으로부터 단리 및 돌연변이된다. 상황에 따라(예를 들면, CD80/86, CD40, 또는 억제 활성을 갖는 IDO1, PD-L1 또는 PD-L2 등의 공-자극인자의 발현 수준), 림프절에서 수지상 세포와 T 세포의 상호작용은 면역 또는 관용 반응을 유도할 수 있다. 따라서, 주요 상호작용은 IDO1을 발현하고 면역억제 사이토킨(예: IL-10 및 TGF-β)을 생성하는 DC를 수반하고, 이는 조절 표현형을 채용하는 T 세포를 유도한다. 이들의 순번에서 조절 T 세포는 이들의 미소환경에서 효과기 T 세포 또는 무손상 T 세포를 억제할 뿐만 아니라, 또한 미성숙 DC가 면역원성 DC가 아닌 관용유도 DC로 분화하는 것을 유도하여 관용유도 루프 반응을 생성한다.

IDO

IDO1, 인돌아민 2,3-디옥시게나제 1은, 실험 동물 및 인간에서 면역 관용을 유도하는데 있어서 중요한 역할을 갖는 것으로 공지된 트립토판 분해의 초기, 속도-제한 단계를 촉매하는 헴-함유 효소이다. IDO1의 주요 역할은, 예를 들면, 포유동물 임신 동안 명확하게 동정되어 있다. IDO1 수준은 증가하고, 이러한 방식에서 태아에 대한 면역 관용의 유도에 필수적이고, 마우스에서 IDO1의 실험적 억제는 이들의 모친과는 상이한 MHC 분자를 발현하는 태아의 거부를 가져오는 것으로 나타났다.

DC 또는 기타 항원 제시 세포에 의해 세포내에서 발현되는 경우, IDO1은, 면역 관용을 제공하는 T 세포 반응을 억제함으로써 천연 면역조절인자로서 기능한다.

제불라린

제불라린은, DNA 메틸화의 효과적 억제제인 2-(1)-피리미디논 환을 함유하는 시티딘 유사체이다. 제불라린은 PBS 중 37℃에서 pH 1.0에서 대략 44시간 및 pH 7.0에서 약 508시간의 반감기로 매우 안정하고, 약물의 경구 투여를 가능하게 한다. 실제로, 경구 투여된 제불라린은 누드 마우스에서 성장한 인간 방광 종양 세포에서 침묵 및 고메틸화된 p16의 탈메틸화 및 재활성화를 유발하는 것으로 나타났다. 제불라린은 또한, 고농도에서 독성이긴 하지만, 사용된 농도에서 시험관내 및 생체내에서 최소한으로 세포독성인 것으로 나타난다. 제불라린은 IDO1 유전자의 후성적 상승조절을 통해 존재하는 것으로 시사되어 있다.

국제공개공보 제WO2008/147283호는 자가-면역 장애 또는 질환, 또는 이식체 또는 유전자 치료학적으로 변형된 세포의 면역 거부의 치료용 의약을 제조하기 위한 제불라린의 용도를 개시하고, 여기서 치료는 IDO를 유도한다.

국제공개공보 제WO2012/087234호는 자가면역 장애 또는 질환, 또는 기관, 조직, 정상 세포 또는 유전자 치료학적으로 변형된 세포의 면역 거부를 앓고 있는 것의 치료를 위한, 각각이 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO)를 유도하는 적어도 2개의 화합물을 포함하는 조성물을 개시하고, 여기서 상기 IDO 유도인자는 상이한 작용 메카니즘을 갖고 IDO 수준에 대한 상승작용 효과를 가져온다. 이는 또한, (a) 단리된 세포를 적합한 배지에서 제공하는 단계, (b) 이러한 조성물을 첨가하는 단계, (c) 상기 단리된 세포를 조성물로 배양하는 단계 및 (d) IDO가 유도되는 세포 배양물을 수득하는 단계를 포함하는, 세포 배양물에서 IDO를 유도하는 방법을 개시한다. 이는 또한, 치료된 포유동물 또는 또 다른 포유동물로부터 유래된 세포를 치료되는 병태와 연관된 하나 이상의 항원의 존재하에 치료학적 유효량의 이러한 조성물로 먼저 생체외 치료한 다음, 치료된 세포를 치료되는 포유동물로 전달하는 것을 포함하는, 자가면역 장애 또는 질환을 갖거나, 기관, 조직, 정상 세포 또는 유전자 치료학적으로 변형된 세포의 면역 거부를 앓고 있는 포유동물을 치료하는 방법을 개시하고, 여기서 치료는 IDO를 유도한다.

도답카르(Dhodapkar)(2001)는, 미성숙 DC의 주사 후에 인간에서 효과기 T 세포의 기능의 항원-특이적 억제를 보고한다.

기아노우카키스(Giannoukakis)(2011)는 타입 1 당뇨병 환자에서 자가 관용원성 DC의 상 I(안전성) 연구를 보고한다.

니트비(Nittby)(2013)는 제불라린이 스트렙트옥소토신 치료된 당뇨병 랫트에서 췌장섬 동종이식의 장기 생존을 유도하는 보고이다.

상기 선행 문헌의 어느 것도 항-약물 항체를 발달시키는 대상체에 대한 치료에 관심이 없다.

본 발명은, 상기 지칭되는 ITI의 종래 방법에 반응하지 않는 대상체를 치료하는 방법의 필요성을 해결한다.

본 발명은, 항-약물 항체의 상승을 포함하는 약물 치료에 대한 면역 반응을 앓고 있거나 면역 반응에 감수성인 포유동물을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은, (a) 상기 포유동물로부터 수득한 항원 제시 세포를, 상기 약물 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프의 존재하에, 상기 항원 제시 세포에서 IDO를 유도하는 제제(agent)로 생체외 치료하는 단계 및 (b) IDO를 상기 항원 제시 세포에서 유도한 후, 상기 세포를 상기 포유동물에게 다시 전달하여 상기 약물에 대한 면역 관용(immune tolerance)을 확립하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 포유동물로부터 수득된 APC를 약물 또는 이의 단편을 함유하는 에피토프의 존재하에 상기 APC에서 IDO를 유도하는 제제로 생체외 치료하는 것을 포함하는 방법에 의해 세포 배양물에서 IDO를 유도하는 방법, 및 상기 방법에 의해 수득된, IDO가 유도된 APC를 제공한다.

본 발명은 또한, 항-약물 항체의 상승을 포함하는 약물 치료에 대한 면역 반응을 앓고 있거나 면역 반응에 감수성인 포유동물을 치료하고, 상기 방법에 따라 상기 세포를 상기 포유동물에게 다시 전달하여 약물에 대한 면역 관용을 확립하는 방법에 사용하기 위한 상술된 APC를 제공한다.

이론에 국한되지 않지만, 본 발명의 방법에 따라, 항-약물 항체를 발달시킨 대상체는, APC의 표현형을 관용원성인 것으로 왜곡하는, 제불라린(또는 기타 IDO 유도인자)로 치료된 자가 APC로 치료된다. 이들 관용원성 APC는 상응하는 약물 항원으로 생체외 프라이밍되고, 대상체에게 다시 전달된다. APC는 림프절 및 비장으로 이동하고, 여기서 이들은 다른 면역 세포에 대한 이들의 관용원성 효과(조절 T 세포 및 B-세포의 생성을 포함)를 발휘하여, 무손상 DC를 관용원성 분화에 대해 왜곡하는 조절 T-세포에 의한 관용원성 루프의 개시에 의해 약물에 대한 관용의 확립을 유도한다.

도 1은 시험관내에서 항원 난알부민에 대한 림파구 증식 반응에 미치는 다양한 조건하에 배양된 BMDC의 억제 효과를 나타낸다(실시예 1 참조).
도 2는 시험관내에서 항원 난알부민에 대한 T 세포 증식 반응에 미치는 다양한 조건하에 배양된 BMDC의 억제 효과를 나타낸다(실시예 2 참조).
도 3은 피하 접종 후에 제불라린 및 PGE ₂ 로 배양된 BMDC의 이동을 나타낸다(실시예 3 참조).
도 4는 다양한 조건하에 배양된 BMDC로 치료된 면역화된 랫트로부터 림프절 세포의 시험관내 재자극에 대한 증식 반응을 나타낸다(실시예 4 참조).
도 5는 제불라린을 사용한 BMDC의 치료가 시험관내에서 FVIII에 대하여 FVIII-프라이밍된 CD4+ T-세포의 재자극에 대한 증식 반응에 미치는 이들의 억제 효과를 증가시키는 것을 나타낸다(실시예 5 참조).
도 6은 THP-1 세포에서 IDO1 유전자 발현(mRNA 수준)에 미치는 아자시티딘의 효과를 나타낸다(실시예 8 참조).
도 7은 THP-1 세포에서 IDO1 유전자 발현(mRNA 수준)에 미치는 데옥시아자시티딘의 효과를 나타낸다(실시예 9 참조).

정의

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인돌아민 디옥시게나제" 또는 "IDO"는 IDO1(인돌아민 2,3-디옥시게나제, EC 1.13.11.52) 또는 IDO2(인돌아민-피롤 2,3 디옥시게나제-유사 1, EC 1.13.11.-)을 의미하고, 이들은 트립토판을 이화(catabolize)할 수 있고 APC에 의해 발현될 수 있는 2개의 상이한 단백질이다.

"제불라린"은, 또한 1-(β-D-리보푸라노실)-1,2-디하이드로피리미딘-2-온 또는 2-피리미돈-1-β-D-리보사이드로서 공지된, 2'- O - t -부틸디메틸실릴-3'- O -[(디-이소프로필아미노)(2-시아노에톡시)포스피노]-5'- O -(4,4'-디메톡시트리틸)-2(1H)-피리미디논-1-β-D-리보사이드를 의미한다.

유사체는 모 화합물로부터 화학적 구조가 상이한 분자, 예를 들면, 동족체(알킬 쇄의 길의 차이 등과 같이 화학적 구조의 증분이 상이함), 분자 단편, 하나 이상의 기능적 그룹이 상이한 구조, 이온화의 변화이다. 구조적 유사체는 종종 문헌[참조: Remington (The Science and Practice of Pharmacology, 19 ^th Edition (1995), chapter 28)]에 개시된 것들과 같은 기술로 정량적 구조 활성 관계(QSAR)를 사용하여 발견된다.

IDO 유도인자의 조합의 사용 후에 IDO 수준의 증가의 문맥에서 용어 "상승 효과"는, 단독으로 사용되는 경우에 IDO 유도인자 각각으로 달성된 IDO 수준의 합계(상기 합계는 통상 "부가 효과"로서 지칭된다)보다 높은(바람직하게는 유의적으로 높은) IDO 수준의 증가를 의미하는 것으로 의도된다.

포유동물

본 발명에 따르는 방법에 의해 치료될 수 있는 포유동물은 인간, 가축 및 사육 동물, 특히 인간을 포함한다. 예시적 가축은 고양이 및 개를 포함한다. 예시적 사육 동물은 말, 소, 양 및 염소를 포함한다.

APC

본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 APC는 IDO, 특히 IDO1을 발현하는 APC이다. 적합하게는, APC는, 예를 들면, 항원 특이적 조절 T 세포 또는 B-세포를 생성함으로써 관용원성 루프를 유도할 수 있다.

가장 적합하게는, APC는 수지상 세포(DC), 예를 들면, 골수-유래 수지상 세포(BMDC), CD34+ 조혈 전구 세포(특히, 말초혈에 존재하는 바와 같은)로부터 생성된 DC 또는 말초혈 단핵 세포(PBMC)로부터 유래된 DC이다. 증식할 수 있는 DC가 바람직하다. 이는 적절한 치료에 의해 증식하는 말초혈 단핵 세포(PBMC)로부터 유래된 DC를 유도한다[참조: Langstein, 1999].

본 발명의 또 다른 양태에서, APC는 DC와 공-배양된 간엽성 줄기 세포이다.

IDO 유도인자

본 발명에 따르는 방법에서 IDO를 유도하는 제제는 제불라린 또는 이의 유사체 또는 염을 포함한다. 본 발명에 따라 IDO 유도인자로서 사용될 수 있는 제불라린 유사체의 예는 2'-덱시제불라린, 5-플루오로-제불라린, 5-플루오로-2'-덱시제불라린, 5-클로로-제불라린, 5-클로로-2'-덱시제불라린, 5-브로모-제불라린, 5-브로모-2'-덱시제불라린, 5-요오도-제불라린, 5-요오도-2'-덱시제불라린, 5-메틸피리미딘-2-온, 5-Me-2'-데옥시제불라린, 또는 이의 모노, 디 또는 트리 포스페이트를 포함한다. 염의 예는 HBr 및 HCl 염 등의 강력한 유기 또는 무기산에 의해 형성될 수 있는 염을 포함한다.

IDO를 유도하는 추가의 제제는 기타 시티딘 유사체(예: 5-메틸시티딘, 아자시티딘 또는 데옥시아자시티딘), 히스톤 데아세틸라제 억제제(예: 발프로산 또는 이의 염, 예를 들면, 나트륨 발프로에이트, 트리코스타틴 A 또는 보리노스테이트(SAHA)), 비타민 D3 유사체(예: 칼시트리올), 인터페론 감마 유사체, 기타 인터페론(예: 인터페론 알파, 인터페론 B1 또는 인터페론-tau), tall 유사 수용체 리간드(예: DNA 올리고뉴클레오티드 또는 리포다당류를 함유하는 CpG), 고나도트로핀 수용체 신호전달 호르몬(예: 재조합 인간 고나도트로핀(rhCG) 또는 프로락틴), 프로스타글란딘 E2 유사체, IDO 안정화제(예: TGF-b 또는 IL-10), 가용성 CTLA4 접합체(예: CTLA4-Ig, 예를 들면, 아바타셉트) 및 글리코코르티코이드(예: 덱사메타손)를 포함한다. 따라서, IDO를 유도하는 제제는, 예를 들면, 아자시티딘 및 데옥시아자시티딘으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 둘 다 IDO를 유도하는 2종(또는 그 이상)의 제제가 사용될 수 있다. 한 가지 특정 실시형태에서, 2종의 IDO 유도 제제 중의 하나는 제불라린 또는 이의 유사체 또는 염이다. 적합하게는, 상기 2종(또는 그 이상)의 유도인자는 상승작용 효과를 야기하고, 예를 들면, 이들 2종(또는 그 이상)의 IDO 유도 제제는 상이한 작용 메카니즘을 갖는다. 상기 IDO 유도인자는 제불라린 또는 이의 유사체 또는 염, 기타 시티딘 유사체(예: 5-메틸시티딘, 아자시티딘 또는 데옥시아자시티딘), 히스톤 데아세틸라제 억제제(예: 발프로산 또는 이의 염, 예를 들면, 나트륨 발프로에이트, 트리코스타틴 A 또는 보리노스테이트(SAHA)), 비타민 D3 유사체(예: 칼시트리올), 인터페론 감마 유사체, 기타 인터페론(예: 인터페론 알파, 인터페론 B1 또는 인터페론-tau), tall 유사 수용체 리간드(예: DNA 올리고뉴클레오티드 또는 리포다당류 함유 CpG), 고나도트로핀 수용체 신호전달 호르몬(예: 재조합 인간 고나도트로핀(rhCG) 또는 프로락틴), 프로스타글란딘 E2 유사체, IDO 안정화제(예: TGF-b 또는 IL-10), 가용성 CTLA4 접합체(예: CTLA4-Ig, 예를 들면, 아바타셉트) 및 글리코코르티코이드(예: 덱사메타손)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다 . 언급될 수 있는 특정 조합은 (i) 제불라린 및 IFN-감마, (ii) IFN-감마 및 발프로산, (iii) 제불라린, IFN-감마 및 발프로산, (iv) 인간 융모막 고나도트로핀(hCG) 및 제불라린, (v) hCG 및 IFN-감마, (vi) 제불라린 및 IFN-A, (vii) 제불라린, IFN-감마 및 IFN-A, (viii) 제불라린, IFN-감마 및 TGF-베타, 및 (ix) 제불라린, IFN-감마, IFN-A, 및 TGF-베타를 포함할 수 있다. IDO를 유도하는 2종 이상의 제제는, 최적 효과에 적절할 수 있도록, 세포에 동시에, 순차로 또는 별도(적절한 시간 간격)로 투여할 수 있다.

포유동물로부터 APC의 수득

본 발명에 따라, DC 등의 APC는 먼저 포유동물로부터 수득된다. 한 가지 적합한 방법은 분리반출법(apheresis)(임의로 재조합 G-CSF의 표준 용량으로 미성숙 세포의 동원 후)에 의해 미성숙 PBMC를 수집하는 것이다. 또 다른 적합한 방법은 적혈구 세포의 용해 후에 저밀도 단핵구를 단리하기 위해 나코덴즈(Nycodenz) 원심분리를 사용하는 것이다. 증식하는 DC의 모집단을 수득하기 위해, 미성숙 CD34 ⁺ 세포는 항-CD34 MAb에 연결된 자기 비드를 사용하여 PBMC로부터 정제할 수 있다[참조: Dynal Biotech, Oslo, Norway]. CD34 ⁺ 세포 순도는 유세포 계수법에 의해 확인할 수 있다. 정제된 CD34 ⁺ 세포는 전형적으로 GM-CSF 및 IL-4를 사용한 치료에 의해 DC로 분화된다. 따라서, 전형적으로, 이들은, 임의로 5 내지 20ng/mL IL10 및 50ng/mL Flt-3L(R&D Systems)와 함께, 10% 자가 혈장 2mM 1-글루타민(JHR), 20-100ng/mL GM-CSF 200-1000U/m, IL-4(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 함유하는 셀그로(CellGro) 혈청-비함유 배지 또는 RPMI 배지에서 조직 배양 플라스크(Nunc, Roskilde, Denmark) 중에 1×10 ⁵ 세포/ml로 배양된다. 세포는 또한 태소 혈청 또는 인간 혈청 AB와 함께 배양할 수 있다. 배양물은 습윤화 5% CO ₂ 분위기에서 14일 동안 37℃로 유지할 수 있다. 세포 확장이 발생함에 따라, 배양 배지 및 사이토킨을 보충한다(예: 대략 4일마다).

일부 상황에서, 대상체의 골수로부터 BMDC를 단리할 수 있다. DC 세포 분화를 유도하고, CD34 ⁺ 세포에 대해 상기 기재된 바와 같이 세포를 확장시킬 수 있다.

IDO 유도인자(들) 및 항원에 대한 생체외 노출

12 내지 14일에서, 미성숙 DC를, 약물에 상응하는 항원 제제와 함께 IDO 유도인자 또는 이의 조합(예: 제불라린)에 노출시킬 수 있다. IDO 유도인자(또는 이의 조합)의 농도 및 노출 길이는 최적 IDO 유도를 위해 선택할 수 있다. 1μM 내지 1mM, 예를 들면, 50 내지 100μM의 농도가 예시된다.

IDO 유도인자 또는 이의 조합(예: 제불라린) 및 항원 제제를 함께 또는 별도로 DC에 첨가할 수 있다.

세포를 환자에게 투여할 때에 림프절로의 DC의 적절한 이동을 달성하기 위해, 세포는 대략 24시간 동안 프로스타글란딘 E2(농도 1 내지 10μM)로 전형적으로 처리하여 필요한 화학주성 수용체를 유도한다.

15일 내지 17일에서, DC를 수거하고, 배지에 현탁시키고, 사용을 위해 방출할 때까지 질소 액체에서 동결 저장할 수 있다.

전형적으로, 사용 전에 품질 조절 단계가 수행된다. 품질 조절은 IDO1의 생존성, 무균성 및 내독소 및 발현에 대한 시험을 포함해야 한다. 추가로, PD-L1, PD-L2, 주화성 수용체 CCR7의 발현, 공자극인자 CD80/CD86, CD40 및 MHC-II의 발현 수준이 고려되어야 한다. 이들 물질의 발현 수준은 DC가 관용원성인지의 지표이다.

대상체에 세포의 투여

세포는 다양한 경로, 예를 들면, 정맥내, 피하 또는 피내에 의해 포유동물에게 다시 투여할 수 있다. 세포를 함유하는 배지는 적합하게는 세포-보호 단백질로서 인간 알부민을 함유한다. 전형적으로, 1주 내지 격주 간격으로 1 내지 10회 용량으로 3-10×10 ⁶ 세포/용량의 양이 투여된다. 치료는 목적하는 관용이 달성될 때까지 연장될 수 있다.

항원

약물에 상응하는 항원 제제는 약물을 전체 또는 일부로서 함유할 수 있고, 상기 일부는 이의 단편을 함유하는 에피토프를 포함한다. 일반적으로, 정제된 항원이 사용될 것이다. 적합하게는, 약물에 상응하는 항원 제제는, 대상체에게 투여된 약물과 가능한 유사하다. FVIII의 경우에, 시판품[ReFacto AF, NovoSeven, Helixate NexGen, Kogenate Bayer, Advate, NovoEight, Nuwiq, Beriate, Beriate P, Feiba, Haemoctin, Hemofil, Monoclate-P, Octanate [LV], Optivate 및 Recombinate]을 포함하여 이러한 목적에 적합한 다양한 재조합 약물이 이용가능하다.

면역 반응 및 본 발명의 방법의 사용

일반적으로, 본 발명의 방법은, 면역 반응을 생성할 수 있는 임의의 약물, 예를 들면, 임의의 생물학적 약물(예: 단백질 약물)에 대한 항-약물 항체의 상승을 포함하여 면역 반응을 발달시키는 포유동물 대상체의 치료에 적합하다.

예시적 단백질 약물은 혈액 인자(FVIII 및 인자 IX 포함), 호르몬(인슐린 및 EPO 포함), 성장 인자(EGF, IGF, KGF, HGF 및 FGF 포함), 사이토킨(예: 인터류킨), 효소 등을 포함한다. 추가의 예는 GCSF 및 유사체, 예를 들면, 필그라스팀 및 이의 PEG화된 버젼(예: 페그필그라스팀) 및 인터페론(예: 인터페론 베타-1a)을 포함한다. 본 발명의 한 가지 바람직한 양태에서, 약물은 FVIII이다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 약물은 인자 IX이다.

생물학적 약물은 다당류 성분을 함유할 수 있다.

추가의 예시적 생물학적 약물은 조작된 단백질(예: 융합 및 키메라 단백질) 및 재조합 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 약물은 항체일 수 있다. 약물은, 예를 들면, 모노클로날 항체, 예를 들면, 인간화 또는 완전 인간 모노클로날 항체일 수 있다. 약물은 또한 면역글로불린의 단편을 포함하는 단백질 작제물일 수 있다. 용어 항체는 PEG화된 유사체 뿐만 아니라 항체-약물 접합체 및 항체-나노입자 접합체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 단일 경쇄 항체 또는 VHH를 포함하는 도메인 항체일 수 있다. 약물은 무손상 경쇄 면역글로불린, 또는 적어도 가변 도메인 및 적어도 일부의 경쇄 불변 영역 또는 ScFv를 포함하는 이의 단편으로 이루어질 수 있다. 약물은 중쇄 면역글로불린을 포함하지 않을 수 있다. 항체는 항-TNF-α 모노클로날 항체, 예를 들면, REMICADE™(infliximab), ENBREL™(etanercept), HUMIRA™(adalimumab), CIMZIA ^® (certolizumab pegol), SIMPONI ^® (golimumab; CNTO 148) 및 항-VEGF 항체(예: AVASTIN™(bevacizumab) 및 LUCENTIS™(ranibizumab))을 포함한다. 추가의 예는 HERCEPTIN™(trastuzumab), RITUXAN™(rituximab) 및 SOLIRIS™(eculizumab)을 포함한다.

본 발명의 방법은, 다수의 약물 치료 상황, 예를 들면, 출혈 장애(혈우병 A 및 B; 각각 FVIII 및 인자 IX의 결핍), 성장 인자 결핍(EGF, IGF, KGF, HGF, FGF 등의 결핍), 호르몬 결핍(인슐린, EPO의 결핍), 효소 대체 치료 및 염증 및 자가-면역 질환(항-TNF-α 모노클로날 항체)에서 항-약물 항체를 포함하는 약물에 대한 면역 반응을 발달시키는 포유동물 대상체의 치료에 적합하다.

임상 개발 및 승인된 제품에서 생물학적 단백질 치료약의 광범위한 목록은 문헌[참조: 2013 PhARMA report "Biologics" - http://www.phrma.org/sites/default/files/pdf/biologics2013.pdf - 이는 100개 이상의 질환을 표적화하는 907개 생물제제의 상세를 제공한다.]에 개시되어 있다. 이 문헌은 이의 전체가 참조로서 도입된다. 본 발명은 면역 반응을 치료된 대상체에서 발달시키는 다른 생물학적 치료제 뿐만 아니라 이들에 대해 사용될 수 있다.

잇점

본 발명은, 적어도 일부 실시형태에서, 하기 잇점 중의 하나 이상을 제공할 것으로 기대된다:

* 예를 들면, 혈액에서 감소된 항-약물 항체 수준에 의해 측정된 바와 같이, 약물에 대한 면역 관용의 성공적 상승, 또는 약물에 대한 면역 불관용의 감소;

* 개개 대상체에 적합한 약물에 대한 맞춤형 반응. 예를 들면, 각각의 혈우병 A 환자는 이들 자신의 FVIII 결손 및 HLA 등의 기타 유전학에 기초하여 천연 FVIII에 대해 고유한 반응을 가질 것이다. 따라서, 본 발명의 자가 접근법은 환자의 APC를 관용원성으로 되게 할 수 있다;

* 필요한 농도에서 낮은 독성으로 양성 효과;

* 치료 섭생의 개시 후에 유용한 관용의 달성까지 상당히 신속한 시간.

실시예

재료 및 방법

면역화에 사용하기 위한 DC의 제조

르위스 랫트를 마취시키고, 대퇴골 및 경골을 제거한다. 이어서, 골은 이들을 1분 동안 70% 에탄올에 침지시킴으로써 소독한다. 골의 양 말단을 멸균 시저로 절단하고, 20-게이지 니들을 갖는 5mL 시린지를 사용하여 골수를 수세하고 BMDC-배지(2% v/v 정상 르위스 랫트 혈청, 10mM HEPES, 100U/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신 및 50μM 2-머캅토에탄올이 보충된 RPMI 1640)에 현탁시킨다. BMDC-배지에서 1회 세척한 후, 적혈구 세포를 용해시키고, 골수 세포를 BMDC-배지에서 2회 세척한 다음, 70-μm 세포 스트레이너에 통과시킨다.

골수 세포(3.5×10 ⁶ )은 재조합 랫트 (rr)GM-CSF(5ng/mL) 및 rrIL-4(5ng/mL)가 보충된 5mL BMDC-배지에서 T25 세포 배양 플라스크에서 37℃ 및 5% CO ₂ 로 배양한다. 3일차에, rrGM-CSF(5ng/mL) 및 rrIL-4(5ng/mL)가 보충된 5mL BMDC-배지를 각 플라스크에 첨가한다. 5일차에, 배지 및 비-부착 세포를 흡인시키고, rrGM-CSF(5nm/mL), rrIL-4(5ng/mL) 및 제불라린(50μM)을 함유하는 5mL 신선한 BMDC-배지로 대체한다. 또한, rrIL-10(5ng/mL)를 여기서 첨가할 수 있다. 7일차에, 클러스터에서 성장하는 비-부착 세포 및 반-부착 세포는 플라스크를 온화하게 탭핑하거나 수세하여 수거하고, 원심분리하고, rrGM-CSF(2.5ng/mL) 및 제불라린(50μM)만을 함유하는 신선한 BMDC-배지에 분산시키고, 신선한 T25 배양 플라스크(2-3.5×10 ⁶ /5mL)에서 계대배양한다. 7일차에 반부착 BMDC로부터 비부착 BMDC를 분리하는 경우에, 비부착 BMDC는 계대배양 개시후 3 내지 4시간에서 수거하고, 신선한 T75 배양 플라스크로 옮긴다. 8일차에, 프로스타글란딘 E2(PGE ₂ )(1-3μM)을 플라스크에 첨가할 수 있다(케모카인 수용체(CCR7)의 상향조절을 위해, 이에 의해 BMDC가 림프절로 이동할 수 있음). 또한, BMDC는 항원을 플라스크에 첨가하여 항원으로 펄스할 수 있다. 9일차에, 세포는 플라스크를 온화하게 탭핑하거나 수세하여 수거한다. 이어서, 랫트에게 접종될 세포를 PBS에서 광범위하게 세척한다(2 내지 3회). 세척 후, 세포(1-5×10 ⁶ )를 0.2mL PBS에 재현탁시키고, 랫트 대퇴부에 피하 접종한다. 시험관내 증식 반응 검정에서 시험될 BMDC는 배양물로 첨가 전에 20Gy로 조사한다.

실시예 1 내지 4에서, 난알부민(OVA)을 모델 항원으로 사용했다.

실시예 5에서, 인자 VIII(FVIII)을 항원으로 사용했다.

억제 효과의 평가를 위한 시험관내 증식 반응 검정

르위스 랫트는, 꼬리 기부를 완전 프로인트 보조제에서 유화시킨 100㎍ OVA로 1회(실시예 1 내지 4), 또는 2주 간격으로 150IU/kg 재조합 인간 FVIII으로 2회(실시예 5) 면역화시켰다. 서혜부 림프절을 면역화 7일 후에 면역화된 랫트로부터 단리했다. 표준 증식 반응 검정은, 자극인자로서 전체 림프절 세포 모집단(실시예 1 및 4)(100000/웰)을 사용하거나, 조사된(20Gy) 상승작용 DC(10000/웰(실시예 2) 또는 5000/웰(실시예 5))를 갖는 단리된 CD4 ⁺ T 세포(50000/웰)를 사용하여, 150μL/웰의 전체 용적(10% v/v 열 불활성화된 태소 혈청, 10mM HEPES, 100U/mL 페니실린, 100㎍/mL 스트렙토마이신 및 50μM 2-머캅토에탄올이 보충된 RPMI 1640)으로 96-웰 플레이트에서 수행했다. CD4 ⁺ T 세포(≥98% 순도)를 생성하기 위해, 림프절 세포를 항체 칵테일로 염색하고, CD4 ⁺ T 세포는 자기 비드를 사용하여 음성 선별에 의해 단리했다. 상승작용 르위스 DC를 생성하기 위해, 무손상 비장 세포를 단리하고, 적혈구 세포의 용해 후에 14.5% 니코덴즈 상에서 원심분리했다. 저밀도 비장 세포를 구배 계면으로부터 단리하고, 이들로부터 OX62 ⁺ DC는 자기 비드를 사용하여 양성 선별에 의해 단리했다. 프라이밍된 림프구는 배양물에 OVA(100㎍/mL)(실시예 1 내지 4) 또는 FVIII(1㎍/mL)(실시예 5)을 첨가하여 자극시켰다. 음성 대조군은 배지 단독(OVA 또는 FVIII 없음)으로 설정했다.

37℃에서 5% CO ₂ 하에 3일 후, 배양물을 0.5μCi의 [3H]티미딘으로 최종 8시간 동안 펄스시켰다. 이어서, 세포를 유리-섬유 필터에 수거하고, 표준 신틸레이션 공정을 사용하여 T 세포 증식의 척도로서 [3H]티미딘 도입을 측정했다. 실험은 3회 또는 6회 반복하여 수행했고, 결과는 분당 계수(cpm)±표준 편차(SD)로 표시했다.

증식 반응에 대한 BMDC의 억제 효과를 평가하기 위해, 조사된(20Gy), BMDC(10000/웰(실시예 1 및 2) 또는 5000/웰(실시예 5))를 증식 반응 검정에 첨가했다.

BMDC는, T 세포 증식에 대해 강력한 억제 효과를 갖는 효소 유도성 일산화질소 신타제(iNOS)를 발현한다. BMDC에서 iNOS의 발현은, 활성화된 증식 T 세포로부터 방출되는 인터페론 감마에 의해 유도된다. 본 발명자들은 주로 우리의 실험에서 iNOS의 억제 효과에는 흥미가 없다. 사실, 억제 효과는 매우 강력하기 때문에, 우리는 억제가 iNOS 활성에만 기인했음을 보장하기 위해 L-NIL(N ⁶ -(1-이미노에틸)-L-리신 디하이드로클로라이드), iNOS의 선택적 억제제를 첨가함으로써 효소적 iNOS 억제제를 차단한다.

THP-1 세포에서 IDO1의 유도

THP-1 세포를 적절한 수의 T75 플라스크로부터 수거했다. 세포를 부르커 챔버에서 계수하고, 0.4% 트립판 블루로 염색했다. 각 실험을 위해 적절한 수의 세포를 새로운 튜브에 옮기고, 실온(RT)에서 1200rpm으로 5분 동안 원심분리했다. 상청액을 버리고, 5% FBS를 갖는 신선한 RPMI를 첨가하여 2×10 ⁵ 세포/mL의 세포 농도를 수득한다. 화합물은, 5개의 상이한 최종 농도가 세포 첨가 후에 수득되도록 6-웰 플레이트에서 5개의 별개 웰에 첨가했다. 대조군은 세포가 첨가된 6-웰 플레이트 중의 하나의 웰에 첨가했다. 웰당 1×10 ⁶ 세포를 파종하여 웰당 5mL의 전체 용적을 달성했다. 세포는 96시간 동안 5% CO ₂ 에서 37℃로 배양했다. 96시간 후, 검정을 중지하고, 세포는 RNA의 단리를 위해 용해시켰다.

RNA 추출 및 RT-qPCR에 의한 유전자 발현의 정량화

전체 RNA는, 제조업자의 지시에 따라, RNA RNeasy 미니 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 THP-1 세포로부터 추출했다. 수퍼스크립트 ^R VILO ^TM RT-키트(Thermo Fisher)를 사용하여 1㎍의 전체 RNA를 cDNA로 역전사시키고, qPCR을 수행했다. 인간 IDO1 유전자의 증폭에 사용된 프라이머는 5'-TTGTTCTCATTTCGTGATGG-3'(전방; 서열번호 1) 및 5'-TACTTTGATTGCAGAAGCAG-3'(역방; 서열번호 2)이었다. 인간 HPRT1의 내인성 참조 유전자의 증폭에 사용된 프라이머는 5'-CTAATTATGGACAGGACTGAAC-3'(전방; 서열번호 3) 및 5'-AGCAAAGAATTTATAGCCCC-3'(역방; 서열번호 4)이었다. 요약하면, RT-qPCR은, 10μL PowerUp SYBR 그린 마스터 혼합물, 0.5μM의 각 프라이머, 4㎕ 희석된 cDNA(IDO1의 증폭용) 및 1.5㎕ 희석된 cDNA(HPRT1의 증폭용)으로 이루어진 20㎕ 반응물에서 수행했다. 하기 열 프로파일: 2분 동안 50℃에서 UDG 배양, 이어서 5분 동안 95℃에서 변성, 이어서 15초 동안 94℃에서, 30초 동안 58℃에서 및 30초 동안 60℃에서 45사이클을 갖는 iCycler iQ 실시간 검출 시스템(Stratagene, Mx3000P, La Jolla, CA, USA)을 사용하여 PCR 생성물의 열사이클링 및 실시간 검출을 수행했다. 증폭 후, 용융 곡선 분석을 수행했다. RT-qPCR 실험은 항상 삼중으로 작동시켰다. IDO1은 △Ct 방법을 사용하여 2개 HPRT1 참조 유전자의 기하 평균으로 정규화했다. 그룹내 비교는 △Ct 방법을 사용하여 하나의 대조군 샘플에 대해 정규화했다.

실시예 1 - 제불라린(PEG ₂ 의 존재 또는 부재)로 배양한 BMDC는 시험관내에서 림프절 세포의 증식 반응을 억제한다

랫트는 완전 프로인트 보조제에서 유화시킨 100㎍ OVA로 꼬리 기부에서 면역화시켰다. 면역화 7일 후에, 서혜부 림프절을 단리했다. 림프절 세포(LN 세포, 전체 림프절 모집단)을 96-웰 플레이트(웰당 100000)에서 배양하고, PEG ₂ 의 존재 또는 부재하에 제불라린(50μM)로 배양한 조사된 (20Gy) BMDC(웰당 10000)의 첨가 또는 첨가 없이 3일 동안 OVA(100㎍/mL)로 자극시키거나 비자극시켰다(대조군, OVA 없음). 억제 효과가 iNOS 활성에만 기인했음을 보장하기 위해, iNOS 억제제 L-NIL(0.01mg/mL)를 일부 웰에 첨가했다. 37℃에서 5% CO ₂ 하에 3일 후, 배양물을 0.5μCi의 [3H]티미딘으로 최종 8시간 동안 펄스시켰다.

결과는 6승 웰의 평균±SD로 표시한다(도 1).

결과는, 비율 1:10으로 시험관내에 첨가되는 경우, 정의된 항원 난알부민에 대한 면역 림프절 세포의 증식 반응의 완전한 억제를 입증한다. PGE ₂ 의 존재하에 DC의 배양물은 이 효과를 감소시키지 않는다. iNOS 억제제 L-NIL의 존재하에 림프절 세포 반응의 제한된 증가에 기반하여, 첨가된 DC 효과의 단지 약간의 부분은, 시험관내에서 T 림프구 반응성의 강력한 일시적 억제를 가능하게 하는 것으로 공지된 기타 환경하에 있는 효소 iNOS의 발현에 기인하는 것 같다. 이 결과는, 생성된 DC가 시험관내에서 단백질 항원에 대한 림프절 세포의 반응을 억제시키는 능력을 나타내는 것을 확인시켜 준다.

실시예 2 - 제불라린(PEG ₂ 의 존재 또는 부재하)으로 배양한 BMDC는 시험관내에서 T 세포의 증식 반응을 억제시킨다

랫트는 완전 프로인트 보조제에서 유화시킨 100㎍ OVA로 꼬리 기부에서 면역화시켰다. 면역화 7일 후에, CD4 ⁺ 세포를 서혜부 림프절로부터 단리했다. 또한, CD4 ⁺ T 세포(웰당 50000)를 96-웰 플레이트에서 OX62 ⁺ DC(무처리 대조군 르위스 랫트의 비장으로부터 단리됨)(웰당 10000)와 함께 공-배양하고, PGE ₂ 의 존재 또는 부재하에, 제불라린(50μM)으로 배양한 BMDC(웰당 10000)의 첨가 또는 첨가 없이 3일 동안 OVA(100㎍/mL)로 재-자극시키거나 비-자극시켰다(대조군, OVA 없음). 억제 효과가 iNOS 활성에만 기인했음을 보장하기 위해, iNOS 억제제 L-NIL(0.01mg/mL)를 일부 웰에 첨가했다. 5% CO ₂ 하에 37℃에서 3일 후, 배양물을 0.5μCi의 [3H]티미딘으로 최종 8시간 동안 펄스시켰다.

결과는 6승 웰의 평균±SD로 표시한다(도 2).

이들 결과는 혼합된 DC가 순수한 CD4 ⁺ T 림프구의 반응을 실제로 억제시킬 수 있음을 입증한다(≥98%, B 림프구 또는 비-림프구 세포의 최소 오염과 함께). 이는, 이들이 세포용해 효과기 세포의 면역 반응을 실행하고 항체 생성 B-세포가 항체의 생산을 실행하는 것을 보조하는데 있어서 중심 역할을 담당하기 때문에 이들 T 세포를 억제하기 위해 특히 중요하다. 이러한 시험관내 실험에서 활성화 비장 OX62 ⁺ DC는 순수한 T 림프구에 대한 항원을 제시하기 위해 첨가되어야 함에 유의한다. 이 경우에 본 발명의 억제 DC는 이들 활성화 DC의 활성을 억제한다.

실시예 3 - 제불라린 및 PEG ₂ 로 배양된 BMDC는 피하 접종후 유입 림프절로 이동한다

랫트는 완전 프로인트 보조제에서 유화시킨 100㎍ OVA로 꼬리 기부에서 면역화시켰다. 5일 후, 랫트를 대퇴부에서 제불라린(50μM) 및 PGE ₂ 로 배양한 2×10 ⁶ CFSE-염색된 BMDC로 피하 접종했다. 서혜부 림프절을 BMDC 접종 72시간 후에 단리하고, 저밀도 림프절 세포는 밀도 원심분리에 의해 단리했다. 단리된 저밀도 세포로부터의 샘플은 CFSE-양성 BMDC의 검출을 위해 FACSCalibur로 분석했다.

결과는 도 3에 제시되어 있다.

관용원성 DC의 생체내 효과에 대한 중요한 특징은 이들이 접종 부분을 유입하는 림프절로 이동할 수 있는데 필요한 수용체를 나타내는 것이다. 이는 이러한 타입의 주요 수용체(CCR7)의 발현을 증강시키는 DC의 PGE ₂ 치료의 역할이다. 이들 결과는 억제 DC가 유입 림프절로 실제로 이동하는 것을 나타낸다.

실시예 4 - 제불라린(PGE ₂ 의 존재 또는 부재하에)으로 배양한 BMDC로 치료한 면역화된 랫트의 림프절 세포는 시험관내에서 재자극에 대한 감소된 증식 반응을 발현한다.

랫트는 완전 프로인트 보조제에서 유화시킨 100㎍ OVA로 꼬리 기부에서 면역화시켰다. 동시에, 일부 랫트에게 대퇴부에서 피하 접종에 의해 PGE ₂ 의 존재 또는 부재하에 제불라린(50μM)으로 배양한 2×10 ⁶ BMDC를 제공했다. 면역화 7일 후, 서혜부 림프절을 단리했다. 림프절 세포(LN 세포, 전체 림프절 모집단)을 96-웰 플레이트(웰당 100000)에서 배양하고, 3일 동안 OVA(100㎍/mL)로 재자극시켰다. 억제 효과가 iNOS 활성에만 기인했음을 보장하기 위해, iNOS 억제제 L-NIL(0.01mg/mL)를 일부 웰에 첨가했다. 5% CO ₂ 하에 37℃에서 3일 후, 배양물을 0.5μCi의 [3H]티미딘으로 최종 8시간 동안 펄스시켰다.

결과는 6승 웰의 평균±SD로 표시한다(도 4).

이들 생체내 결과는 DC가, 이들을 동일한 림프절로 유입되더라도 상이한 부위에서 면역화와 동시에 접종하는 경우, 림프절 림프구의 반응성을 억제시키는 것을 입증한다. 억제 효과는 iNOS 활성에 기인하지 않았다.

실시예 5 - 제불라린을 사용한 BMDC의 치료는 시험관내에서 FVIII에 대한 FVIII-프라이밍된 CD4+ T-세포의 재자극에 대한 증식 반응에 미치는 이들의 억제 효과를 증가시킨다.

랫트는 2주 간격으로 1㎍ LPS와 혼합된 150IU/kg 인간 FVIII(Advate)로 꼬리 기부에서 피하 2회 면역화시켰다. 면역화 7일 후, CD4 ⁺ T 세포를 서혜부 유입 림프절로부터 단리했다. CD4 ⁺ T 세포(웰당 50000)를 96-웰 플레이트에서 OX62 ⁺ DC(무처리 대조군 르위스 랫트의 비장으로부터 단리됨)와 함께 공-배양하고, 제불라린("Zeb")(50μM)의 존재 또는 부재하에 배양한 1:100 비율(BMDC:T 세포, 웰당 500 BMDC) 또는 1:10 비율(BMDC:T 세포, 웰당 5000 BMDC)로 반부착("Semiadh") 또는 비부착("Nonadh") BMDC의 첨가와 함께 또는 첨가 없이 3일 동안 FVIII(Advate, 1㎍/mL)로 재-자극시키거나 무자극시켰다. 기록된 억제 효과가 iNOS 활성에만 기인했음을 보장하기 위해, iNOS 억제제 L-NIL(0.01mg/mL)를 일부 웰에 첨가했다. 5% CO ₂ 하에 37℃에서 3일 후, 배양물을 0.5μCi의 [3H]티미딘으로 최종 8시간 동안 펄스시켰다.

결과는 퍼센트 자극 지수로서 표시한다. 자극 지수(자극된 증식 반응으로 나눈 FVIII-자극된 증식 반응)을 각 샘플에 대해 계산했다. BMDC 무첨가 웰에 대한 자극 지수는 100%로서 간주했다. 결과는 삼승 웰의 평균±SD로서 표시한다(도 5).

이들 결과는 혼합된 DC가 시험관내에서 FVIII을 사용한 재자극에 대해 FVIII-프라이밍된 CD4 ⁺ T 림프구(B 림프구 또는 비-림프구 세포의 최소 오염과 함께)의 증식 반응을 실제로 억제시킬 수 있음을 입증한다. 또한, 이들 결과는 제불라린을 사용한 DC의 치료가 이들 억제 효과를 증가시키는 것을 입증한다.

실시예 6 - 시험관내에서 유도된 IDO1을 발현하는 수지상 세포의 정맥내 전달에 의한 인간 FVIII으로 면역화시킨 랫트에서 유도된 면역 반응의 억제

성인 랫트로부터 골수 세포의 수확 후, 미성숙 수지상 세포로의 분화는 GM-CSF 및 IL-4에서 세포를 배양함으로써 유도한다. IDO1-발현 관용원성 랫트 수지상 세포는 제불라린 단독 또는 INF-감마와 제불라린의 조합 또는 기타 IDO-유도인자(INF-알파, 발프로산, TGF-베타)를 사용한 미성숙 수지상 세포의 치료에 의해 시험관내에서 생성된다.

성인 랫트는, 인간 FVIII에 대한 검출가능한 T-세포 및 B-세포 면역 반응을 유도하는 것으로 공지된, 2주 간격으로 1㎍ LPS와 혼합된 150IU/kg 인간 FVIII으로 2회 정맥내 면역화시킨다. 한 그룹의 랫트에서, 인간 FVIII으로 부하한 시험관내-생성된 관용원성 상승작용 DC의 3개 용량을 정맥내 투여하고, 이는 최종 면역화 1주 이후에 개시한다. 대조군 그룹의 랫트는 유사하게 면역화시키지만, 수지상 세포의 임의의 정맥내 전달을 제공하지 않는다. 동물은 ELISA로 인간 FVIII에 대한 항체에 대해 및 T-세포 증식(티미딘 도입 검정), 및 ELISA로 사이토킨 생산(IL-2, IL-4, IL-5, IL-17, INF-감마, TNF-알파 및 IL-6)에 대한 검정에 의해 항-인간 FVIII T-세포 반응성에 대해 모니터링한다.

3개 용량의 IDO1-발현 수지상 세포는 시험관내에서 검정된 인간 FVIII에 대해 T-세포 반응을 억제하고 인간 FVIII에 대한 항체 반응을 억제할 것으로 예상된다. IFN-감마 및 제불라린 또는 또 다른 IDO1-유도인자의 조합의 억제 효과는 IFN-감마 및 각 유도인자의 조합에 의한 IDO1 유도에 미치는 상승작용 효과에 기인하여 보다 강력할 것으로 예상된다. 또한, INF-감마에 의한 수지상 세포에서 트립토판의 고친화성 전달인자의 유도(Bhutia, 2015)는 이러한 고친화성 전달인자를 발현할 수 없는 면역 T-세포에 미치는 보다 강력한 억제 효과를 유발해야 한다.

실시예 7 - FVIII 항체(억제제)를 발달시킨 혈우병 A의 성인 환자의 T-세포의 반응성에 미치는 IDO1-발현 자가 수지상 세포의 억제 효과의 시험관내 입증

CD34 ⁺ PBMC는 FVIII에 대한 항체(억제제)를 발달시킨 성인 혈우병 A 환자로부터 단리한다. 세포를 SCF, Flt3L과 함께 배양하여 시험관내에서 확장시키고, GM-CSF 및 IL-4에 의해 미성숙 DC로 분화시킨다. 미성숙 DC를 FVIII으로 부하하고, 각각 제불라린 단독(50μM), 또는 INF-감마 및 제불라린 또는 INF-알파, 또는 발프로산 또는 TGF-베타의 조합에 3일 동안 노출시켜 IDO1 및 관용원성 기능의 발현을 유도한다.

생성된 관용원성 DC의 시험 일에, 자가 CD4 ⁺ T-세포 및 단핵구를 말초혈로부터 별도로 단리하고, 자기 비드 분리에 의해 정제한다(≥95%). 시험관내에서 FVIII에 대한 환자의 T-세포 반응성은 FVIII을 제시하기 위해 5,000 단핵구의 존재하에 0, 0.01, 0.1, 0.3 및 1㎍/mL의 농도로 50,000 CD4 ⁺ T-세포를 FVIII에 노출시킴으로써 검정한다. T-세포 증식 반응은 3 내지 6일 배양 기간의 최종 8시간 동안 ³ H-티미딘 도입에 의해 측정한다. 배양 배지로의 사이토킨(IL2, IL4, IL5, IL6, IL17, IFN-감마, TNF-알파)의 방출은 ELISA로 검정한다. IDO1-발현 DC의 영향에 의한 트레그(Treg) 내로 T-세포의 형질전환의 유도는 FOX-P3 ⁺ CD4 ⁺ 세포의 빈도 및 수를 측정함으로써 FACS에서 검정한다.

생성된 관용원성 DC는 CD4 ⁺ T-세포 증식 반응 및 사이토킨의 이들의 생산/방출을 억제할 것으로 예상된다. Th2 타입 사이토킨의 강력한 억제의 입증은 Th2의 억제를 통해 B-세포 반응의 억제 효과의 가능한 메카니즘을 나타내고, DC가 생체내에서 항-FVIII 항체 생산에 미치는 억제 효과를 가져야 함을 예측할 것이다.

실시예 8 - 아자시티딘을 사용한 THP-1 세포에서 IDO1의 유도

"THP-1 세포에서 IDO1의 유도"하의 공정을 표 1에 기재된 최종 농도가 수득되도록 수행했다.

상기 기재된 바와 같이, RNA 추출 및 RT-qPRC에 의한 유전자 발현의 정량화 후, 샘플 1 내지 6을 사용하여 IDO1 유전자 발현의 유도를 조사했다.

결과는 또한 도 6에 제시되어 있다. 이 결과는 5-아자시티딘 단독이 IDO1 유전자 발현을 최대 23배 증가시키는 것을 나타낸다. 최고 수준의 IDO 유도는 1μM 농도의 5-아자시티딘에서 관찰되었다.

실시예 9 - 데옥시아자시티딘을 사용한 THP-1 세포에서 IDO1의 유도

"THP-1 세포에서 IDO1의 유도"하의 공정을 표 3에 기재된 최종 농도가 수득되도록 수행했다.

상기 기재된 바와 같이, RNA 추출 및 RT-qPRC에 의한 유전자 발현의 정량화 후, 샘플 7 내지 12를 사용한 IDO1 유전자 발현의 유도를 조사했다.

이 결과는 또한 도 7에 제시되어 있다. 이 결과는 5-아자-2'-데옥시시티딘 단독이 IDO1 유전자 발현을 최대 101배 증가시키는 것을 나타낸다. 최고 수준의 IDO 유도는 10μM 농도의 데시타빈에서 관찰되었다.

참조 문헌

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Bhutia, Y. et al., Biochim Biophys Acta , 2015 , 1848, 453-462

약어

HA 혈우병 A

ITI 면역 관용 유도

DC 수지상 세포

APC 항원 제시 세포

IDO 인돌아민 디옥시게나제

L-NIL N ⁶ -(1-이미노에틸)-L-리신 디하이드로클로라이드

MHC 주요 조직적합성 복합체

IFN 인터페론

DNA 데옥시리보핵산

PBS 인산염-완충 식염수

BMDC 골수-유래 수지상 세포

PBMC 말초혈 단핵 세포

OVA 난알부민

CFSE 카복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르

FVIII 인자 VIII

iNOS 유도성 일산화질소 신타제

sc 피하

hCG 인간 융모막 고나도트로핀

EGF 상피 성장 인자

HGF 간세포 성장 인자

KGF 각화세포 성장 인자

TGF 조직 성장 인자

TGF-b TGF-베타

TNF 종양 괴사 인자

G-CSF 과립구 콜로니 자극 인자

GM-CSF 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자

EPO 에리트로포이에틴

Ig 면역글로불린

IFN-A 인터페론 알파

MAb 모노클로날 항체

rr 랫트 재조합

FACS 형광 활성화된 세포 선별

TNF-알파 종양 괴사 인사-알파

Flt3L FMS-유사 티로신 키나제 3 리간드

SCF 줄기 세포 인자

μ 마이크로

ELISA 효소-연결된 면역흡착 검정

Tregs 조절 T-세포

IL 인터류킨

iv 정맥내

FBS 태소 혈청

RNA 리보핵산

HAc 아세트산

LN 림프절

SD 표준 편차

명세서 및 하기 특허청구범위 전반에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다", 및 "포함한다" 및 "포함하는" 등의 변형태는 언급된 정수, 단계, 정수 그룹 또는 단계 그룹의 포함을 의미하는 것으로 이해되지만, 임의의 기타 정수, 단계, 정수 그룹 또는 단계 그룹의 배제를 의미하는 것은 아니다.

본원에서 언급된 모든 특허 및 특허원은 이들의 전체가 참조로서 도입된다.

SEQUENCE LISTING <110> Idogen AB <120> Novel treatment method <130> IPA170920-GB <150> GB1504701.2 <151> 2015-03-19 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ttgttctcat ttcgtgatgg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tactttgatt gcagaagcag 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ctaattatgg acaggactga ac 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 agcaaagaat ttatagcccc 20