细胞的选择性裂解
阅读：118发布：2024-01-24
专利汇可以提供细胞的选择性裂解专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了用于选择性裂解包含 微 生物 例如细菌的样品中的细胞的方法和装置。通过将样品在 碱 性条件下在非离子型 去污 剂中孵育而获得该选择性裂解。，下面是细胞的选择性裂解专利的具体信息内容。
1.一种选择性裂解包含或疑似包含微生物的样品内的动物细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含或疑似包含微生物的带有动物细胞的样品，
b)向所述样品中加入非离子型去污剂和缓冲液以获得具有约9.5或更高的pH的溶液，其中加入的去污剂和加入的缓冲液的体积与样品的体积之间的比例在2/1和1/10之间；并且其中所述非离子型去污剂以在0.1％和5％(w/v％或v/v％)之间的范围内的浓度存在；
c)将所述溶液孵育足够长的时间段以裂解所述动物细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是哺乳动物血液样品。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述血液样品是全血。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物是细菌。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物是真菌。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述孵育步骤c)进行30秒和10分钟之间。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述非离子型去污剂选自包括Nonidet P40、脱氧胆酸盐、Igepal CA 630和/或Triton-X 100的组。
8.根据权利要求1所述的方法，还包括将所述孵育的溶液离心并分离所述微生物的步骤。
9.根据权利要求1所述的方法，还包括在滤器上过滤所述孵育的溶液的步骤，所述滤器具有在所述滤器上截留微生物的孔径。
10.根据权利要求1所述的方法，还包括裂解所述微生物的步骤。
11.根据权利要求9所述的方法，还包括裂解所述微生物的步骤。
12.根据权利要求1所述的方法，还包括基于核酸的分子测定。
13.根据权利要求10所述的方法，还包括基于核酸的分子测定。
14.根据权利要求11所述的方法，还包括基于核酸的分子测定。
15.一种用于通过权利要求1所述的方法检测样品中的微生物的装置(1)，所述装置(1)包括：
用于接收体积低于40 ml的具有包含或者疑似包含微生物的动物细胞的样品流体的裂解室(2)，
与所述裂解室连接的，包含具有9.5或更高的pH的碱性缓冲液且包含非离子型去污剂的储存室(3)，或包含pH约9.5或更大的碱性缓冲液的储存室(31)和包含非离子型去污剂的储存室(32)，
与所述裂解室连接的用于过滤动物细胞裂解后的样品的滤器(4)，所述滤器(4)具有在所述滤器上截留细菌的孔径，和
用于测定DNA的存在的检测室(5)。
16.根据权利要求15所述的装置，其中所述碱性缓冲液具有大于9.0的pKa和/或所述非离子型去污剂是Triton X-100。
细胞的选择性裂解
发明领域
[0002] 发明背景
[0003] 分子诊断旨在快速检测样品例如血液中的微量病原体(通常是细菌)。然而血液是复杂的基质，且包含用于获得性免疫系统的白细胞(white blood cell)(白细胞(leukocyte))，用于运输氧的红细胞(red blood cell)(红细胞(erythrocyte))和用于伤口愈合的血小板(凝血细胞)。这使包含高量的细胞物质的样品例如全血中的病原体的直接检测变得复杂。
[0004] 经典的检测方法包括在选择性培养基和/或带有指示剂的培养基上培养细菌。通常，在可进行鉴定之前，这些测定需要至少1或2天的培养步骤。
[0005] 对于基于PCR的方法，新鲜血液样品中细菌的量理论上是足够高以被检测的而无需进一步培养该样品内存在的细菌。然而，为实现微量细菌的早期检测，需要大体积的血液。特别是白细胞中的高量的DNA明显升高了基于DNA的检测方法中的背景。另外，血红蛋白中血红素的存在强烈降低了DNA聚合酶的活性。1微升的人血包含约4,000至11,000个白细胞和约150,000至400,000个血小板。血液中DNA的浓度在约30和60μg/ml之间。检测体积为10ml的全血中约10至100,000的细菌物种的存在是非常有挑战性的。
[0007] 除了干扰PCR反应本身，哺乳动物DNA的量增加样品的粘度。另外，来自裂解过的哺乳动物细胞的蛋白质和膜形成阻碍样品过滤的复合物。这对于微型装置特别成问题。进一步稀释已经大的样品体积导致不可接受的长的操作步骤。
[0008] 由于以上原因，所以需要去除血液样品中的人DNA的方法。
[0009] 在哺乳动物DNA存在下专门测定细菌DNA的方法是已知的。来自SIRSLab公司的TMLooxter 使用了富集样品中甲基化DNA的方法。由于细菌DNA是高度甲基化的，该方法促TM
使富集细菌DNA。来自Molzym公司的Molysis 使用了离液剂和去污剂来选择性裂解哺乳动物细胞。该裂解步骤之后为用不受该离液剂/去污剂影响的DNA酶消化。例如由RocheTM
商业化的替代性方法(Septifast )依赖于为防止非特异性结合人DNA和扩增人DNA而设计的PCR引物对。
使富集细菌DNA。来自Molzym公司的Molysis 使用了离液剂和去污剂来选择性裂解哺乳动物细胞。该裂解步骤之后为用不受该离液剂/去污剂影响的DNA酶消化。例如由RocheTM
商业化的替代性方法(Septifast )依赖于为防止非特异性结合人DNA和扩增人DNA而设计的PCR引物对。
[0010] US6,803,208描述了一种方法，其中在37℃下裂解掺杂细菌的血小板的高度稀释的悬浮液15分钟，随后在0.4μm滤器上过滤小量的裂解样品以目视检查截留在滤器上的细菌是可能的。然而该方法不允许在环境温度下处理大体积的样品。
[0011] 发明概述
[0013] 本发明的一个方面涉及用于选择性裂解包含或疑似包含微生物的样品中的真核细胞，特别是动物细胞的方法。该方法包括以下步骤：提供包含或疑似包含微生物的带有真核细胞，特别是动物细胞的样品，向该样品中加入非离子型去污剂和缓冲液以获得具有约9.5或更高的pH的溶液，和将该溶液孵育足够长的时间段例如30秒和10分钟之间，更优选2和6分钟之间以裂解所述真核细胞，特别是动物细胞。在具体实施方式中，可在15至
30℃下，更优选接近室温下进行裂解。
30℃下，更优选接近室温下进行裂解。
[0014] 在具体实施方式中，样品是哺乳动物血液样品例如全血。
[0015] 在其他具体实施方式中，微生物是细菌或真菌。
[0016] 根据具体实施方式，其中所加入的去污剂和所加入的缓冲液的体积与样品的体积之间的比例在2/1和1/10之间。
[0017] 在具体实施方式中，非离子型去污剂以在0.1％和5％(w/v％或v/v％)之间的范围内的浓度存在。
[0018] 在具体实施方式中，非离子型去污剂选自包含Nonidet、Brij、吐温、Igepal、还原型triton、辛基葡糖苷、cholaat和Triton的组。更优选的实例是Triton X-100、Nonidet P40、脱氧胆酸钠和或IgepalCA630。
[0019] 在具体实施方式中，本文所用的碱性缓冲液具有大于9的pKa值。其实例是硼酸盐、碳酸盐、CAPS(N-环己基-3-氨基丙磺酸)、CAPSO(3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸)、CHES(2-(N-环己基氨基)乙磺酸)、焦磷酸盐和乙醇胺。特别的实例是碳酸钠。缓冲液应具有足够的缓冲能力以致于当与样品以根据本发明的比例混合时，最终溶液的pH为约9.5或更高。
[0020] 在具体实施方式中，该方法还包括将经孵育的溶液离心并分离微生物的步骤。
[0021] 在具体实施方式中，该方法还包括在滤器上过滤经孵育的溶液的步骤，该滤器具有在所述滤器上截留微生物的孔径(pore size)，例如具有小于0.7μm，更优选小于0.5μm的孔径的滤器。本发明的方法有助于过滤大体积的样品而没有酶或加热相关的处理步骤。
[0022] 在具体实施方式中，该方法还包括在根据本发明的选择性裂解后加入酸或酸性缓冲液以获得约7和9之间的pH的步骤，“中和步骤”。
[0023] 在具体实施方式中，上述方法之后是微生物检测。其实例是细胞计量术、显微术、PCR或培养。
[0024] 在具体实施方式中，上述方法之后是微生物裂解。
[0025] 在具体实施方式中，该方法还包括基于核酸的分子测定。
[0026] 本发明的另一方面涉及用于检测样品中微生物的装置(1)，包括：用于接收体积低于40ml，优选低于20ml且优选1和20ml之间的样品流体的裂解室(2)，与裂解室连接的，包含具有约9.5或更大的pH的碱性缓冲液且包含非离子型去污剂的储存室(3)，或包含pH约9.5或更大的碱性缓冲液的储存室(31)，包含非离子型去污剂的储存室(32)，与所述裂解室连接的用于过滤裂解后样品的滤器(4)，所述滤器具有在滤器上截留细菌的孔径，和用于测定DNA存在的检测室(5)。
[0027] 本文的碱性缓冲液通常具有高于9.5的pKa，因此最终溶液将具有约9.5或更高的pH，且非离子型去污剂通常是Triton X-100、脱氧胆酸钠、Nonidet P40和/或Igepal CA630。
[0028] 本发明中所述的方法允许选择性裂解样品中的白细胞和红细胞，而细菌和真菌保持完好(死亡的或存活的)。
[0029] 本发明中所述的方法使处理样品而不显著稀释该样品成为可能，且因此允许处理较大体积的样品。另外，不需要通过例如DNA酶来酶促降解DNA或使用加热，使得该方法与现有技术已知的方法相比复杂度较低。
[0030] 本发明中所述的方法产生具有低粘度和最小聚集的裂解样品，这使得在截留细菌的滤器上过滤大体积的裂解样品成为可能。可以约100-1000μl之间的体积在该滤器上进一步处理细菌，这使得处理大的样品体积以用于随后的步骤和在集成柱中完全自动进行所需要的操作例如中和和洗涤成为可能。
[0032] 附图简述
[0033] 图1示出了在根据本发明的方法的具体实施方式的不同pH值下选择性裂解之后的大体积血液的过滤效率。
[0034] 图2示出了在根据本发明的方法的具体实施方式的不同pH值下选择性裂解之后不同细菌的回收。
[0035] 图3示出了在根据本发明的方法的具体实施方式的不同孵育时间下选择性裂解之后不同细菌的回收。
[0036] 图4示出了通过根据本发明的选择性裂解人背景DNA的减少。
[0037] 图5和6分别示出了1ml和5ml全血中不同类型病原体的检测。
[0038] 图7示出了根据本发明的人工方法和装置实施的方法之间的对比。
[0039] 图8示出了根据本发明的方法与市售败血症检测试验的对比。
[0040] 图9示出了在根据本发明的选择性裂解和滤器捕集之后病原体的裂解。
[0041] 图10示出了当在根据本发明的选择性裂解和滤器捕集之后进行的与其他裂解方法相比的病原体裂解效率。
[0042] 图11示出了用于进行根据本发明的实施方式中所述的选择性裂解的装置的实施方式的图解概览。
[0043] 图12示出了包含本发明的实施方式中所述的选择性裂解单元的集成装置的实例。
[0044] 在不同的附图中，相同的参考标记表示相同或相似的元件。
[0045] 将参考具体实施方式并参考某些附图描述本发明，但是本发明不受其限制而仅受权利要求限制。权利要求书中的任何参考标记不应解释为限制范围。所述的附图仅是图解性的而非限制性的。在附图中，某些元件的尺寸可被放大且为了说明性目的未按比例绘制。当术语“包括(comprising)”用于本说明书和权利要求书中时，其不排除其他元件或步骤。
当表示单数名词时使用不定冠词或定冠词例如“a(一个)”或“an(一种)”、“the(该)”的情况下，这包括那个名词的复数，除非明确指出其他。
当表示单数名词时使用不定冠词或定冠词例如“a(一个)”或“an(一种)”、“the(该)”的情况下，这包括那个名词的复数，除非明确指出其他。
[0046] 另外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三及类似术语用于区分相似元件且不一定用于描述顺序性或时间性顺序。应当理解，在合适的情境下如此使用的术语是可互换的，且本文所述的本发明的实施方式能够以不同于本文所述或阐明的其他顺序实施。
[0047] 仅为有助于理解本发明而提供了以下术语或定义。这些定义不应解释为具有小于本领域普通技术人员理解的范围。
[0048] 实施方式详述
[0049] 本发明上下文中“血细胞”涉及血液中存在的哺乳动物细胞且包括红细胞(红细胞)、白细胞(白细胞)和血小板(凝血细胞)。
[0050] 本发明上下文中的“全血”涉及可能用抗凝剂处理的包含血浆和细胞的未处理的血液。
[0052] 本发明中的“真核的”涉及不包括真菌的任何类型的真核生物体，例如动物，特别是包含血液的动物，且包括无脊椎动物例如甲壳动物和脊椎动物。脊椎动物包括冷血动物(鱼、爬行动物、两栖动物)和温血动物(鸟类和哺乳动物)。哺乳动物特别包括灵长类且更特别地包括人。
[0053] 在样品(例如血液)中，当与保持完好的来自被收集样品的生物体中的真核细胞的百分比相比，该样品中保持完好的微生物细胞(例如细菌细胞)的百分比明显更高(例如，2、5、10、20、50、100、250、500或1000倍更多)时，获得本发明中使用的“选择性裂解”。
[0054] 本发明中使用的“微生物”涉及通常作为病原体的存在于已被收集样品的生物体中的细菌(革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，以及细菌孢子)和单细胞真菌例如酵母和霉菌。
[0055] 本发明的第一方面涉及用于选择性裂解包含或疑似包含微生物例如细菌的样品中的真核细胞，特别是动物细胞的方法。该方法的目标是增加用于检测样品中的微量细菌(即，每ml样品小于10000、1000、100或甚至更少的微生物)的试验的灵敏度。如在发明背景中解释的，来自样品中真核细胞特别是动物细胞的DNA干扰基于PCR的检测方法且该DNA与蛋白质和膜一起形成聚集物，这种聚集物增加了裂解后的粘度并对裂解样品的过滤具有显著影响。为解决该问题，选择性地裂解真核细胞特别是动物细胞，其中大部分的(即，大于20％、40％、60％、80％、90％或甚至大于95％)微生物保持存活，或如果被这种处理杀死，细菌DNA仍包含在细胞壁内。本发明所述的方法中，解决了以上提及的问题。
[0056] 本发明所述的方法特别适用于任何类型的样品，其中包含DNA的其他细胞，特别是来自其中微生物以病原体存在的宿主的细胞的存在阻碍了来自微生物，特别是细菌的DNA的检测。
[0057] 现在进一步阐述本发明所述的方法的实施方式，其中研究了哺乳动物血液样品中微量细菌的存在。
[0059] 可选择地，通过将来自静脉的血液直接收集在带有去污剂和缓冲液的管中对新鲜血液实施该方法。
[0060] 因此，用缓冲液或非离子型去污剂补充新鲜的血液样品或保存的样品。缓冲液或其浓度的选择被选择为用于补偿所提供的血液样品的缓冲能力并获得约9.5或高于9.5，更特别地在9.5和11.5之间，甚至更特别地在9.5和10.5之间的pH。大于11.5的pH值适合更强健的生物体例如革兰氏阳性细菌和真菌。同样地充分浓缩缓冲液以向样品中加入至多样品体积的200％、150％、100％、50％、20％或10％的缓冲液体积以获得所需要的pH变化。
[0061] 本发明上下文中合适缓冲液通常具有大于9、大于9.5或甚至大于10的pKa，且包括硼酸盐、碳酸盐、CAPS、CAPSO、CHES、焦磷酸盐、乙醇胺和在以上提及的pH范围内具有最佳缓冲能力的其他通常使用的缓冲液。
[0062] 合适的去污剂是非离子型去污剂，其一方面仅对真核细胞，特别是动物细胞具有裂解作用，且另一方面对DNA和蛋白质具有增溶作用。
[0063] 非离子型去污剂的实例是烷基葡糖苷、Brij35(C12E23聚氧乙烯二醇十二烷基醚)(15、7)、Brij58(C16E20聚氧乙烯二醇十二烷基醚)(16)、Genapol(13至19)、glucanids例如MEGA-8、-9、-10、辛基葡糖苷(12、6)、Pluronic F127、Triton X-100(C14H22O(C2H4O)n)(13、4)、Triton X-114(C24H42O6)(12、4)、吐温20(聚山梨醇20)(16、7)和吐温80(聚山梨醇80)(15)Nonidet P40脱氧胆酸钠、还原型Triton X-100和或Igepal CA630。非离子型去污剂的特别优选的实例是Triton-X100。
[0064] 去污剂的最有效浓度取决于不同的去污剂，但通常在0.1％和5％之间的范围内，更特别地在0.1％和1％之间的范围内。取决于去污剂(固体或液体)，％分别指w/v％或v/v％。
[0065] 在缓冲液和去污剂存在下，在10至30℃的温度下，更优选室温附近，在10分钟内，优选在30秒和10分钟之间且更优选在约1至3、1-5、1-8、2-6或1-10分钟内进行血液样品的孵育。
[0066] 根据本发明的方法具有优点：在低于30℃的温度下，在10分钟以下获得选择性裂解。因此，通常可在环境温度下实施该方法而不需要加热样品。
[0067] 任选地，裂解后，通过在中和步骤中加入酸或酸性缓冲液使裂解样品的pH变成中性值(即，在7和9之间)。发现中性pH的裂解样品可储存更长的时间(多至1、2、6、12或甚至24小时)而不进一步裂解细菌细胞且没有裂解样品的流体性质的显著变化。
[0068] 本发明的方法中研究的另一个参数是裂解后血液样品的流体性质的评价。这可通过检验可通过0.22μm滤器过滤的裂解的血液的体积来测定。根据本发明的方法允许过滤通过向1体积的样品中加入1体积的缓冲液/去污剂溶液稀释的至少2、5、7.5或甚至10ml的全血。
[0069] 通常，根据本发明的方法包括这样的步骤，其中通常通过离心或过滤从样品中分离完好的细菌细胞。在具体实施方式中，通过使裂解样品经过具有1μm以下的孔径的滤器例如具有0.4或0.22μm的市售滤器截留通常具有0.5和10μm之间的大小的细菌来从样品中分离完好的细菌。对于样品的过滤，存在各种各样的市售装置，例如这样的滤器，其适合安装在注射器上以可在裂解后通过对注射器的活塞人工施压使注射器内的流体流经滤器。
[0070] 此后，可研究滤器上细菌(或真菌)的存在。在具体实施方式中，通过PCR研究微生物的存在。为了该目的，可将细菌(或真菌)从滤器上洗掉并为了PCR扩增进一步处理细菌(或真菌)。可选择地，用裂解缓冲液清洗滤器以释放微生物中的DNA，其进一步用于PCR反应。
[0071] 其他检测步骤可通过细胞计量术、显微镜、PCR或培养实施。
[0072] 可在一个装置(图11中所图解示出的)中进行样品的裂解，微生物的过滤和检测。因此，本发明的一个方面涉及装置(1)，其包括：用于接收体积为1和10ml之间的样品流体的裂解室(2)，与裂解室(2)连接的，包含碱性缓冲液及上述表面活性剂的储存室(3)，或包含上述碱性缓冲液的储存室(31)和包含上述表面活性剂的储存室(32)。在装置内，裂解室与滤器(4)连接以在裂解后过滤样品从而将微生物截留在滤器上。该装置还包括从滤器中去除微生物并在隔开的室中裂解这些微生物的通道。可选择地，该装置还包括用于在滤器上裂解微生物的设备，和将裂解细菌或真菌细胞的DNA从滤器转移到隔开的室中的通道。该装置还可包含DNA纯化和检测室(5)以测定DNA的存在。通常，检测室是PCR模块。
[0073] 图12中示出了其中进行选择性裂解和随后的DNA纯化和鉴定的装置的实例。
[0074] 体现本发明的系统和方法的其他布置将对于本领域技术人员是明显的。
[0076] 实施例1
[0077] pH对过滤的影响
[0078] 该实验的目标是评价缓冲液的pH对过滤效率的影响。如通过使用本领域技术人员已知的常规技术测量最终溶液的pH确认的，缓冲能力是足够在最终溶液中获得相似pH的。
[0079] 缓冲液包含：
[0080] 1M硼酸钠，pH9.0+1％Triton X-100
[0081] 1M硼酸钠，pH9.5+1％Triton X-100
[0082] 1M碳酸钠，pH10.0+1％Triton X-100
[0083] 1M碳酸钠，pH10.3+1％Triton X-100
[0084] 1M碳酸钠，pH10.8+1％Triton X-100
[0085] 将1ml的缓冲液与1ml的全血混合并孵育3分钟。此后，加入中和缓冲液并使用真空过滤设置通过直径25mm和具有0.45μm孔径的尺寸选择滤器过滤混合物。测量阻塞前能够通过滤器的血液体积。图1中示出了结果。该实验表明，为获得足够分析低浓度病原体的滤过的血液体积，最终pH值应为约9.5或更高。
[0086] 实施例2
[0087] 表明了缓冲液的pH对选择性裂解血细胞后完好病原体(大肠杆菌(E.coli))的回收的影响。
[0088] 所使用的缓冲液包含：
[0089] 1M硼酸钠，pH9.0+1％Triton X-100
[0090] 1M硼酸钠，pH9.5+1％Triton X-100
[0091] 1M碳酸钠，pH10.0+1％Triton X-100
[0092] 1M碳酸钠，pH10.5+1％Triton X-100
[0093] 将相同量的细菌掺入到1ml血液中。用以上提及的缓冲液处理该体积3分钟。此后，离心(10min，4000g)血液以收集完好的细菌。使用标准的碱裂解方法裂解细菌并使用Qiagen离心柱(QiaAmp血液微型试剂盒)纯化DNA。使用实时PCR对DNA量定量。图2中示出了结果。
[0094] 以上提及的附图示出了作为选择性裂解缓冲液的pH的函数的细菌回收。在低pH值下，白细胞DNA不被降解且抑制PCR反应。在高pH值下，细菌开始在选择性裂解期间被裂解，且其未被回收。
[0095] 实施例3
[0096] 孵育时间对病原体回收的影响。
[0097] 该实验表明血液与根据本发明的选择性裂解缓冲液的延长孵育对完好病原体的回收的影响。将固定数量的细菌铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)掺入到血液中。将1ml的掺杂的血液与1ml的选择性裂解缓冲液(1M碳酸钠pH10.0+1％Triton X-100)混合并孵育1、2、3、5、7或10分钟。此后，加入1ml的中和缓冲液。通过离心(4000g下10min)收集病原体并洗涤细菌沉淀。最后，通过标准的碱裂解来裂解细胞，接下来使用QiaAmp血液微型试剂盒纯化DNA。通过实时PCR测量回收的DNA的量。结果示出在图3中并表明优选孵育进行30秒和10分钟之间。
[0098] 实施例4
[0099] 通过根据本发明的选择性裂解降低人背景
[0100] 本方法中真核细胞DNA，更具体地白细胞DNA的量的减少是重要的，因为当存在时，其将抑制接下来的检测病原体DNA或RNA的PCR反应。为检测残留背景DNA的量，用根据本发明的选择性裂解方法处理不同的血液样品并使用RNA酶P检测试剂盒(Applied Biosystems)分析PCR反应中白细胞DNA的量。将这些样品的Ct值与从存在全部白细胞DNA的200μl血液全血样品中获得的那些Ct值进行比较。从文献中已知来自于200μl全血的人DNA是PCR反应可耐受而不抑制病原体DNA扩增的背景DNA的最大量。图4中示出了不同PCR反应的结果。
[0101] 该图示出了根据本发明的方法(1M碳酸钠pH10.0+1％Triton X-100)的1ml处理的血液样品和200μl全血参考样品的人背景的量的差异。处理了不同的样品且以单独的数据点示出了PCR结果。这些结果表明与200μl全血参考样品相比，根据本发明处理的1ml的样品中的背景DNA的量低得多(＝更高的Ct值)。该结果证明当使用根据本发明的方法时有效且充分地去除了样品中的白细胞DNA。
[0102] 实施例5
[0103] 该实施例的目的是阐明通过使用根据本发明的方法检测来自全血的不同类型的病原体。将不同类型的病原体，革兰氏阴性菌(铜绿假单胞菌)、革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌(S.aureus))和真菌(白色念珠菌(C.albicans))一起混合到1ml血液中。用选择性裂解缓冲液(1ml的1M碳酸钠pH10.0+1％TX-100溶液)处理血液样品3min，接下来中和pH并使用具有足够小以截留所有细胞的孔的尺寸选择滤器过滤。清洗滤器以去除残留的抑制剂例如血红蛋白和白细胞DNA。此后，根据标准的碱裂解方法裂解细胞并使用Qiagen血液微型试剂盒纯化DNA。
[0104] 通过实时PCR检测病原体DNA；Ct值是DNA量的量度。为了定量，将小份的掺杂的血液样品涂布在血琼脂平板上以获得CFU计数。图5中提供的数据表明检测来自全血的低数目的病原体是可能的。参考样品包含于小体积的PBS缓冲液中的相同数目的细菌，直接裂解这些细菌，随后纯化DNA并使用实时PCR定量。参考测量和来自血液的实际的富集实验提供了相似的Ct值，因此说明高的回收率。阴性对照(无细菌的血液)表明无PCR信号。
[0105] 该测定允许使用较大体积的血液。实验设置与之前的实施例相同但血液的量增至5ml。参考样品包含与5ml血液样品相同数目的病原体但细胞留在小体积的PBS中并被直接裂解。图6中示出了结果。
[0106] 该实验表明从大体积的血液中回收低数目的病原体的可能性。数据表明回收的病原体DNA的浓度与参考相同。因此可得出结论：大部分的病原体在选择性裂解期间保持完好且白细胞DNA的减少对防止抑制病原体PCR是有效的。
[0107] 实施例6
[0108] 根据本发明的选择性裂解法可以多种方式实施，包括但不限于人工程序和其中通过根据本发明的装置实施该方法的程序(集成程序)。本实施例比较了该集成程序和人工程序。人工程序需要人工吸取和离心步骤，而集成程序使用能够进行全部所需操作的微量流体柱体(micro-fluidic cartridge)和尺寸选择滤器。基础生化方法是相似的：使用1M碳酸钠+1％Triton X-100溶液选择性裂解白细胞和红细胞，然后3分钟后进行中和步骤。下一步，将混合物离心(人工)或过滤(集成)并洗涤细胞且最后通过标准碱裂解程序释放DNA。在最后的步骤中，使用Qiagen血液微型试剂盒纯化DNA并通过实时PCR检测DNA。
以下图7中可找到集成程序和人工程序的结果。获得了相当的结果，表明该结果独立于测定的实施形式。
以下图7中可找到集成程序和人工程序的结果。获得了相当的结果，表明该结果独立于测定的实施形式。
[0109] 实施例7
[0110] 在该实施例中，相对于市售方法，即MolYsis Complete试剂盒(Molzym)，检验(benchmark)根据本发明的方法。该试剂盒使用了离液剂和去污剂来选择性裂解哺乳动物细胞。该裂解步骤之后是用不受该离液剂/去污剂影响的DNA酶消化。
[0111] 对于该实验，用不同浓度的金黄色葡萄球菌掺杂1ml的血液样品。按实施例5中所述处理1ml血液，并用MolYsis试剂盒根据厂家说明处理另外的1ml。图8中绘制了Ct值对细胞浓度的图，且Ct值表明不添加酶或离液盐时根据本发明的方法至少与已知的MolYsis试剂盒一样有效。
[0112] 实施例8
[0113] 在选择性裂解血细胞并在尺寸选择滤器上富集病原体细胞后，采用碱裂解实现在滤器上同时裂解不同病原体以制备可用于PCR分析的DNA。
[0114] 图9示出了在集成柱体上实施碱裂解程序的结果。用106金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌的细胞掺杂1ml的血液。在选择性裂解血细胞并在滤器上富集病原体细胞后，使用在95℃孵育10min的200μl的包含200mM NaOH、0.5％SDS的溶液进行碱裂解以在滤器中获得对病原体的完全裂解。用20μl的1M柠檬酸溶液中和包含病原体DNA的洗脱液，并使用QIAamp DNA/血液微型试剂盒纯化。作为对照样品，在实验台上裂解每种6
病原体的10 细胞，并如上所述地中和并纯化。
病原体的10 细胞，并如上所述地中和并纯化。
[0115] 为了优化并检验碱裂解程序，选择白色念珠菌(Candida albicans)作为模型系统，因为这些酵母细胞因其难以裂解的硬质细胞壁而被熟知。图10比较了碱裂解程序(使用50mM NaOH、0.25％SDS结合热处理)和其他裂解方法，即高强度超声(HiFU)处理和商购试剂盒(BD GeneOhm裂解试剂盒)。对于碱裂解和商购试剂盒裂解，使用离心分别将样品从1ml浓缩至160μl和100μl。对于HiFU，使用了2ml细胞溶液，没有之前的离心。裂解后，通过离心去除样品中的未裂解的细胞和碎片。将1μl的粗裂解液用作PCR输入。
[0116] NaOH和SDS的组合对裂解比每种单独的化合物更有效。任何一种化合物的浓度增加不会进一步增加裂解效率。无加热孵育步骤的碱裂解明显更低效。可通过在95℃孵育2min增加裂解效率，然而，为了将测定整合入柱体，在70℃下孵育更长的时间是优选的。
[0117] 对于碱性裂解，将细胞重悬在100μl的包含50mM NaOH和0.25％SDS的裂解溶液中。随后将样品在70℃孵育10min，迅速冷却至室温并通过加入30μl的500mM Tris-HCl，pH7.0(产生终浓度为150mM的Tris，即NaOH浓度的3倍)来中和。
[0118] 对于粗裂解产物PCR，通过离心(5min，14,000g)去除样品中的未裂解的细胞和碎片。将1μl的上清液加入到25μl的PCR反应中。PCR检测基于靶向rRNA基因的Taqman PCR测定(Apollo)。使用500nM正向引物和300nM反向引物和FAM-BHQ1标记的探针(所有寡核苷酸由Biolegio BV定制合成)，在Taqman Universal主混合物(Applied Biosystems)中进行PCR反应。在Biorad CFX实时PCR系统中进行PCR反应。在95℃下10min的初始加热步骤以活化热启动聚合酶之后，使用50个循环的95℃下持续15sec和60℃下持续1min来扩增。在每个循环中的60℃步骤期间检测荧光信号。用Biorad CFX软件进行数据分析。
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